JPH10505821A - Ｉ型糖尿病の検出および処置のためのプロインスリンペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による、免疫学的応答を調節するプロインスリンペプチド化合物を開示する。本発明の化合物は好ましくは、プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に由来する。プロインスリンペプチド化合物を含有する薬学的組成物もまた、開示される。本発明のプロインスリンペプチド化合物に対する免疫学的応答が、被験体におけるＩ型糖尿病の指標として使用され得る。従って、本発明は、プロインスリンペプチド化合物を使用するＩ型糖尿病についての診断アッセイを提供する。プロインスリンペプチド化合物を投与することによって、被験体におけるＩ型糖尿病の発症または進行を阻害するための方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉ型糖尿病の検出および処置のためのプロインスリンペプチド化合物発明の背景 Ｉ型、またはインスリン依存性糖尿病（本明細書ではDM-Iともいう）は、ヒト 、 よびEisenbarth,G.(1990)Ann.Rev.Immunol．8:647-679）。大部分の主要組織適 合複合体（MHC）のクラスII抗原の特定のハプロタイプ（すなわち、ヒト中のHLA -DR3、HLA-DR4およびHLA-DQ3.2（例えば、Platz.P.ら(1981)Diabetologia 21:10 8-115；Todd,J.ら(1987)Nature 329:599-604を参照のこと）；バイオブリーディ ング（BB）ラット中のRT1^u（例えば、Colle,E.(1990)Clin.Immunol．& Immunopa thol．57:1-9；Parfrey,N.A.ら(1989)Crit.Rev.Immunol．9:45-65を参照のこと ）および非肥満糖尿病（NOD）マウス中のH-2g⁷（例えば、Kikutani,H.およびMak ino,S．Adv.Immunol.(Dixon,F.J.編)、285-323頁、New York、NY：Academic Pre ss,Inc.,1992を参照のこと）と会合したDM-Iに対する遺伝子感受性が存在する。 DM-Iの病状は、インスリン分泌β細胞に特異的に標的化された免疫細胞を含む膵 臓小島の進行性炎症性浸潤（すなわち、インスリン炎）からなる（例えば、Bott azzo,G.F.ら(1985)N.Eng.J.Med．313:353-360；Foulis,A.K.ら(1991)J.Pathol．165 :97-103；Hanenberg,H.ら(1991)Diabetologia 32:126-134を参照のこと）。 この病状は、不確定の期間（数か月から数年）にわたって発症する。 Ｉ型糖尿病の発症が、遺伝的素因、環境の影響、およびさらなる未定義の補因 子を含む複雑な関係の結果として起こることが明らかとなった。DM-Iの病状を理 解する試みにおいて、最も解かりにくい情報の断片は、刺激自己抗原の定義、お よび細胞または体液媒介自己反応性が最初の事象であるかどうかである。小島細 胞の細胞質および表面抗原（すなわち、ICA、ICSA）に対して指向される血清自 己抗体、インスリン（IAA）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）は、 糖尿病前症のおよび新たに診断された糖尿病のヒトおよび動物中に見出され得る （例えば、Rowley,M.ら(1992)Diabetes 41:548-551；Palmer,J.ら(1983)Science 222:1337-9；MacLaren,N.ら(1988)Diabetes 38:534-538；Baekkeskov,S.ら(199 0)Nature 347:151-156；Velleso,L.A.ら(1993)Diabetologia 36:39-46を参照の こと）。不幸にも、これらの抗原に対する抗体力価と糖尿病の臨床開始との間の 相互関係は、首尾良く予測できない。さらに、多数の他のβ細胞抗原が、小島が 破壊されるように曝露される（例えば、69kd小島細胞自己抗原（ICA69）（Pietr opaolo,M.ら(1993)J.Clin.Invest．92:359-371）、38kdおよび62kdインスリン分 泌顆粒タンパク質（Roep,B.O.ら(1991)Lancet 337:1439-1441；Brudzynski,K.ら (1992)J.Autoimm．5:453-463）ならびに前小島（Harrison,L.C.ら(1992)J.Clin. Invest．89:1161-65；Harrison,L.ら Advances in Endocrinology & Metabolism （Mazzaferri,E.L.ら編）、35-94頁、St.Louis,MO；Mosby-Year Book,1990）。 しかし、これらの抗原に対する細胞および／または体液性免疫応答が、進行する 小島細胞の損傷を引き起こすのか、または単にその結果であるのかどうかは明ら かではない。要するに、発病の機構の免疫学的性質および糖尿病誘発性発作を誘 導する正確な抗原は、まだ明らかではない。 米国において、50万人を超える人々が、インスリン依存性糖尿病を患っている 。1921年以前には、DM-Iを発症した人々は、診断後１年を超えて生存することは 期待されなかった。罹患個体は、異常炭水化物代謝の結果として慢性高血粧症の 臨床徴候（例えば、過度の喉の渇きおよび排尿、急速な体重の損失）を被る。一 旦インスリンが精製され、そして投与されると、糖尿病の生存見込みが劇的に増 加した。しかし、DM-Iは、急性疾病を予防し、そして長期の合併症の危険を低減 するための一生の処置を必要とする慢性疾患である。食事制限および毎日のイン スリン注射は、患者にとって厄介であり得、それゆえ受諾が減少され、そして合 併症（例えば、白内障、網膜症、緑内障、腎臓疾患および循環器系疾患）の処置 が一般に行われている。 従って、Ｉ型糖尿病のより効果的な処置が、特に単に症状を処置するよりはむ しろ疾患の自己免疫の基礎に取り組む治療において、必要とされる。さらに、持 続および臨床的に無症状においてDM-Iの「糖尿病前症」期が長期である場合、治 療介入のための１つの重要な機会は、この期間の間である。しかし、この糖尿病 前症期の人々を同定し得る有効な診断アッセイはない。糖尿病に罹りやすい個体 において初期または高まった(mounting)β細胞異常の同定を可能にする方法が必 要とされ、そして疾患プロセスにおける初期処置を可能にし、これは一生のイン スリン依存を防止することに役立ち得る。発明の要旨 本発明は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するプロイン スリンペプチド化合物に関する。１つの実施態様において、本発明のプロインス リンペプチド化合物は、Ｔ細胞による免疫学的応答を刺激する。例えば、DM-Iを 有するヒトは、非糖尿病コントロールのヒトよりも本明細書に記載の特定のプロ インスリンペプチドに応答する多数の循環Ｔ細胞を有する。従って、刺激プロイ ンスリンペプチド化合物に対する被験体の免疫学的応答は、DM-Iの指標として使 用され得る。別の実施態様において、本発明のプロインスリンペプチド化合物は 、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を阻害する。本発明はさらに、 Ｉ型糖尿病被験体におけるプロインスリンに対するＴ細胞応答を阻害するか、ま たは防止するために本発明のプロインスリンペプチド化合物を使用することを包 含する治療方法および予防方法を提供する。 好適な実施態様において、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞からの免疫学的応答を調 節するプロインスリンペプチド化合物は、プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドと の間の接合部にわたるプロインスリン領域に由来する。別の実施態様において、 プロインスリンペプチド化合物は、この領域由来のプロインスリンペプチドの改 変形態である。このような改変形態としては、天然のペプチドの特定の構造的お よび機能的特徴をいまだ保持する天然のプロインスリンアミノ酸配列と比較して 、アミノ酸置換を有するペプチドが挙げられる。本発明の範囲内のプロインスリ ンペプチド化合物の他の改変形態としては、末端または側鎖共有結合性修飾（co vaIent modifications）を有するペプチドならびにペプチドアナログおよび模倣 物が挙げられる。このような改変プロインスリンペプチドは、ペプチドの改変特 性（例えば、安定性、溶解性、免疫原性など）について選択され得る。本発明の プロインスリンペプチド化合物は、被験体への投与に適する薬学的組成物に取り 込まれ得る。 本発明の別の局面は、被験体からの生物学的サンプルにおいて、本発明のプロ インスリンペプチド化合物に対する免疫学的活性を検出することにより、被験体 におけるＩ型糖尿病の指標を検出する方法に関する。 本発明のさらに別の局面は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞により免疫学的応答を 調節するプロインスリンペプチド化合物を被験体に投与することにより、被験体 におけるＩ型糖尿病の発症または進行を阻害する方法に関する。図面の簡単な説明 図１は、インスリン（ジスルフィド結合により連結されるＡ＋Ｂ鎖）およびＣ ペプチドへの酵素切断の前に、プロインスリンの構造に関してMHCクラスII（RTI .B/D）結合モチーフを包含する合成ペプチドの位置の模式図である。結合モチー フは、プロセッシングの間に部位特異的エンドプロテアーゼにより切断される１ つの塩基性対（Arg-Arg）残基を含有するプロインスリン中のＢ鎖およびＣ鎖の アミノ酸にわたる。 図2A〜Cは、抗MHCクラスII抗体（参照のため、APCおよび培地でインキュベー トしたGAP₄₁₂Ｔ細胞に対する平均cpmは、850±297であり；GAD₅₂₀は74±30であ り；そしてPIは1763±181である）の存在下または非存在下での、GAD₄₁₂（パネ ルＡ）、GAD₅₂₀（パネルＢ）およびPI（パネルＣ）ペプチドに特異的なＴ細胞の 増殖のグラフ表示である。 図３は、コンカナバリンＡでの72時間の刺激後の細胞表面抗原のPIペプチド特 異的Ｔ細胞株発現のフローサイトメトリープロフィールである。各一次抗体につ いてのヒストグラムおよび陽性発現のパーセント（括弧内）を、10,000個の細胞 のFACScan分析により作製した。発明の詳細な説明 本発明は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するプロイン スリンペプチド化合物およびDM-Iを検出し、そして処置するためのこのような化 合物の使用に関する。（用語Ｉ型糖尿病、インスリン依存性糖尿病およびDM-Iは 、本出願にわたって交換可能に使用される。）本発明は、少なくとも一部、本発 明のプロインスリンペプチドに特異的なＴ細胞が、非糖尿病コントロールの循環 に おいてよりも非常にかなり頻繁に、DM-Iを有するヒトの循環に存在するという発 見に基づく。さらに、本発明のプロインスリンペプチドに特異的なＴ細胞クロー ンは、実験的に未使用の（naive）遺伝学的に適切な動物に移入される場合に、 糖尿病を引き起こし得る。これらのデータは、DM-Iの発症の間に冒された特異的 自己抗原ペプチドであるペプチドが由来するプロインスリン領域と一致する。従 って、プロインスリンペプチド化合物を用いるDM-Iの診断、治療および予防に関 する方法が提供される。 Ｉ プロインスリンペプチド化合物 本発明の１つの局面は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞からの免疫学的応答を調節 するプロインスリンペプチド化合物に関する。本明細書で使用される用語「プロ インスリンペプチド化合物」とは、プロインスリン（すなわち、天然のプロイン スリンの領域のアミノ酸配列を有するペプチド）由来のペプチドならびにこのよ うなペプチドの改変形態を包含することが意図される。これらの改変形態として は、天然のプロインスリン配列に比較してアミノ酸置換を有するが、特定の構造 的および機能的特徴を保持するペプチド、共有結合性修飾（例えば、末端または 側鎖修飾）を有するペプチド、ペプチドアナログおよび模倣物ならびにペプチド が由来する領域内のプロインスリンに相同である他のタンパク質由来のペプチド が挙げられる。 本発明のプロインスリンペプチド化合物は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞からの 免疫学的応答を調節し得る。用語「調節」とは、免疫学的応答の刺激または阻害 のいずれかを包含することが意図される。従って、本発明の種々の実施態様にお いて、ペプチド化合物は、「刺激性ペプチド化合物」（すなわち、Ｉ型糖尿病被 験体のＴ細胞からの免疫学的応答を刺激する化合物）または「阻害性ペプチド化 合物」（すなわち、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞からの免疫学的応答を阻害する化 合物）であり得る。用語「阻害性ペプチド化合物」とは、天然のプロインスリン ペプチド（または他の類似の刺激性ペプチド化合物）に対するＴ細胞応答を阻害 するペプチドを包含することが意図される。 インスリンの未プロセス（すなわち、未熟）およびプロセス（すなわち、成 熟）形態の模式図を、図１に示す。本明細書で使用される用語「プロインスリン 」とは、タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端まで隣接して連結したＢ鎖 、ＣペプチドおよびＡ鎖のアミノ酸残基（図１のアミノ酸残基25〜110）を含有 するインスリンの未熟形態をいう。正常なプロセッシングの際、プロインスリン は、Ｂ鎖とＣペプチドとの間、およびＣペプチドとＡ鎖との間の接合部で切断さ れて、成熟Ｂ鎖およびＡ鎖を生成する。用語「プレプロインスリン」とは、プロ インスリン配列に加えてＢ鎖のアミノ末端に隣接して連結したリーダー配列（図 １のアミノ酸残基１〜24）を含有するインスリンの未熟形態をいう。プレプロイ ンスリンの正常なプロセッシングの際に、リーダー配列は、Ｂ鎖から切断される 。プロインスリンのコード配列全体は、プレプロインスリン内に含まれるので、 プロインスリンの特定の領域由来であるとして本明細書中に記載のペプチドはま た、プレプロインスリンの等価な領域由来であり得ることが理解され得る。 本発明の好適なプロインスリンペプチド化合物は、プロインスリンのＢ鎖とＣ ペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に由来する。このような 領域由来のペプチドを、図１に模式図で説明する（「合成PIペプチド」と名称す る）。ヒトプレプロインスリンの完全なヌクレオチド配列および完全なアミノ酸 配列を、それぞれ配列番号１および２に示す（Bell,G.ら(1979)Nature 282:525- 527；Sures,I.ら(1980)Science 208:57-59もまた参照のこと）。配列番号２のア ミノ酸配列番号を用いると、ヒトプロインスリンのＢ鎖はアミノ酸残基25〜54に 対応し、そしてＣペプチドはアミノ酸残基57〜87に対応する（残基55〜56のジペ プチドは、プロセッシングの間にプロインスリンから切断される）。従って、本 明細書で使用される「プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の接合部にわた る」プロインスリンの領域とは、少なくとも連結残基30〜33を含有する、Ｂ鎖と Ｃペプチドとの両方のアミノ酸残基を含む領域をいう。この接合部にわたる好適 な領域は、位置約47〜位置約63のアミノ酸残基を含む。 本発明の１つの実施態様において、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞からの免疫学的 応答を調節するプロインスリンペプチド化合物は、「刺激性プロインスリンペプ チド化合物」である。用語「刺激性プロインスリンペプチド化合物」は、Ｔ細胞 応答（例えば、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生）を刺激するペプチ ド化合物を包含することが意図される。好ましくは、刺激性プロインスリンペプ チド化合物は、上記のように、プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の接合 部にわたるプロインスリンの領域に同一である。特に好適な刺激ペプチド化合物 は、ヒトプロインスリンに由来する。１つの実施態様において、ペプチドは以下 のアミノ酸配列を含有する： ここで、（Xaa）および（Zaa）（これらは存在してもしなくてもよい）は、アミ ノ酸残基を表し、ｎおよびｍは、１〜15の整数であり、Y₁は水素またはアミノ誘 導基であり、そしてY₂は水素またはカルボキシ誘導基である。好適には、ペプチ ドは、約10個〜35個のアミノ酸長（すなわちｎ＋ｍが３〜28である）である。よ り好適には、ペプチドは、約10個〜20個のアミノ酸長（すなわちｎ＋ｍが３〜13 である）である。さらにより好適には、ペプチドは、約12個〜17個のアミノ酸長 （すなわちｎ＋ｍが５〜10である）である。 特に好適な実施態様において、ヒトプロインスリン由来の刺激性ペプチド化合 物は、次のアミノ酸配列を含有する：Y₁-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-( Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y₂（配列番 号４）、これは配列番号２に示すようにヒトプレプロインスリンのアミノ酸残基 47〜64に対応する。 ヒトプロインスリン由来のペプチド化合物に加えて、他の種由来のプロインス リンの等価領域由来の刺激性プロインスリンペプチド化合物が、本発明に包含さ れる。例えば、ラットプロインスリンＩの等価領域（例えば、残基47〜63）由来 のプロインスリンペプチドは、次のアミノ酸配列を含有する：Gly-Phe-Phe-Tyr- (Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Val-Glu-(Glu/Asp)-Pro-Gln- Val（配列番号５）。ラットプロインスリンIIの等価領域由来の刺激プロインス リンペプチドは、次のアミノ酸配列を含有する：Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pr o-Met-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Val-Glu-(Glu/Asp)-Pro-Gln-Val（配列番 号６）。（ラットプロインスリンＩおよびII遺伝子の完全なヌクレオチド配列お よび完全なアミノ酸配列は、Lomedico,P.ら(1979)Cell 18:545-558に開示されて いる）。他の種のプロインスリンのアミノ酸配列もまた、当該分野で公知であり 、そしてプロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの接合部にわたる領域に同一な類 似の刺激性プロインスリンペプチドを設計するために使用され得る（例えば、Pe rler,F.ら(1980)Cell 20:555-566は、ヒヨコプレプロインスリン遺伝子の配列を 開示し；Watt V.M.ら(1985)J.Biol.Chem．260:10926-29は、モルモットプレプロ インスリン遺伝子の配列を開示する）。 本発明のプロインスリンペプチド化合物は、化学合成技術および組換えDNA技 術を包含する、任意の適切なペプチド合成法により調製され得る。好適には、ペ プチドは化学的に合成される。化学的にペプチドを合成する方法は、当該分野で 周知である（例えば、Bodansky,M．Principles of Peptide Synthesis，Springe r Verlag，Berlin(1993)およびGrant,G.A．（編）Synthetic Peptides：A User' s Guide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)を参照のこと）。自動化ペ プチド合成機は、市販されている（例えば、Advanced ChemTech Model 396；Mil ligen/Biosearch 9600）。宿主細胞におけるペプチドをコードするDNAの組換え 発現によりペプチドを合成する方法は、当該分野で周知である（例えば、Sambro okら(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Ha rbor Laboratory Pressを参照のこと）。 天然のプロインスリンの特定の領域（例えば、好適にはプロインスリンのＢ鎖 −Ｃペプチド接合部にわたる領域）に同一であるアミノ酸配列を有するプロイン スリンペプチド化合物に加えて、本発明は、プロインスリンの天然の領域に「実 質的に類似」であるプロインスリンペプチド化合物もまた包含する。プロインス リンの天然の領域に実質的に類似するペプチド化合物は、刺激性（すなわち、Ｉ 型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を刺激する化合物）あるいは阻害性 （すなわち、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を阻害する化合物） であり得る。プロインスリンの特定の領域（例えば、プロインスリンのＢ鎖−Ｃ ペプチド接合部にわたる領域）と「実質的に類似」すると本明細書中に記載され ているペプチド化合物は、天然のペプチドの特定の構造的および機能的特徴を保 持するが、１つまたはそれ以上のアミノ酸の位置での特定の領域内の天然のプロ インスリンアミノ酸配列と異なる（すなわち、アミノ酸の置換による）ペプチド を包含する。例えば、天然のプロインスリンペプチドに実質的に類似する刺激性 ペプチドは、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞によるＴ細胞応答を刺激する能力を保持 するが、一方、天然のプロインスリンペプチドに実質的に類似する阻害性ペプチ ドは、主要組織適合複合体（MHC）分子に結合する能力を保持するが、Ｉ型糖尿 病被験体のＴ細胞によるＴ細胞応答を刺激する能力を欠損する。 抗原性ペプチドが、次の３つのアミノ酸の位置のカテゴリーから本質的になる ことが、当該分野で十分に容認される：１）ペプチドとMHC分子との相互作用に 必要な位置（本明細書では「MHC接触残基」という）、２）ペプチドとＴ細胞レ セプター（TCR）複合体との相互作用に必要で、それによりＴ細胞活性化を刺激 する位置（本明細書では「TCR接触残基」という）および３）MHC接触またはTCR 接触のいずれにも重要でない「中立」位置（例えば、Rothbard,J.B.およびGefte r,M.L.(1991)Ann.Rev.Immunol．9:527-565；Jorgensen,J.L.ら(1992)Ann.Rev.Im munol．10:835-873；Rothbard,J.B.およびTaylor,W.R.(1988)EMBO J．7:93-100 ；DeLisi C.およびBerzofsky,J.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 82:7048；Berz ofsky,J.ら(1988)Immunological Reviews、5〜31頁、Copenhagen,Denmark：Munk sgaard；Margalit,H.ら(1987)J.Immunol．138:2213-2229；O'Sullivan,D.ら(199 0)J.Immunol．145:1799-1808；Corr,M.ら(1993)J.Exp.Med．178:1877-1892；Fal k,K.ら(1994)Immunogenetics 39:230-242；Sidney,J.ら(1994)J.Immunol．152:4 516-4525；Chicz,R.M.ら(1993)J.Exp.Med．178:27-47；Kropshofer,H.ら(1992)J .Exp.Med．175:1799-1803を参照のこと）。 従って、１つまたはそれ以上の中立位置でアミノ酸置換を有するが、重要なMH C接触残基およびTCR接触残基を保持する、天然の刺激性プロインスリンペプチド と実質的に類似の刺激ペプチド化合物は、ペプチドがMHC分子を結合する能力お よびＴ細胞応答を刺激する能力の両方を保持するように選択され得る。さらにま たはあるいは、刺激性ペプチド化合物は、置換がペプチドのＴ細胞応答を刺激す る能力を変化しない限り、MHC接触および／またはTCR接触に関与する１つまたは それ以上の位置でのアミノ酸置換を有し得る（例えば、MHCおよび／またはTCR接 触位置での保存性アミノ酸の置換が、許容され得る）。 上記の改変刺激性ペプチド化合物とは対照的に、MHC分子に結合する能力を保 持するが、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を刺激する能力を欠損 する天然のプロインスリンペプチドに実質的に類似の阻害性ペプチド化合物が、 選択され得る。従って、これらの阻害性ペプチド化合物は、ペプチドがＴ細胞応 答を刺激し得ないが、重要なMHC接触残基を保持する（または重要なMHC接触位置 で許容される保存性アミノ酸の置換を有する）ように、重要なTCR接触残基でア ミノ酸置換を有し、その結果、ペプチドはなおMHC分子を結合し得る。阻害性ペ プチド化合物はまた、中性位置で置換を有し得る。 天然のプロインスリン配列から変化された刺激性ペプチドまたは阻害性ペプチ ドは、天然のプロインスリンペプチド内のアミノ酸残基を置換し、そして所望の 刺激活性または阻害活性を有するペプチドを選択することにより、調製され得る 。例えば、プロインスリンペプチドのアミノ酸残基は、他の残基で系統的に置換 され得、そして置換されたペプチドは、次いで免疫学的応答に対するこのような 置換の効果を評価するための標準アッセイにおいて試験され得る。代表的には、 機能活性を保持するために、保存性アミノ酸の置換が作製される。本明細書で使 用される用語「保存性アミノ酸の置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する アミノ酸残基で置き換えられる置換を包含することが意図される。類似の側鎖を 有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されており、これは塩基性 側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパ ラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン 、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例 えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ ン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン 、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、ト リプトファン、ヒスチジン）を包含する。他の一般的に好適な置換は、小側鎖（ 例えば、アラニンまたはグリシン）を有する別の残基でのアミノ酸残基の置き換 えを包含する。例えば、配列番号５に示す刺激性ラットプロインスリンペプチド のプロインスリンペプチドアナログのパネルは、例えば、以下に示すペプチドの パネルのようにペプチド中にアラニン置換を含むように合成される： 他の抗原性ペプチドを用いる研究は、アラニン残基での重要でないアミノ酸残基 の置換が、十分に許容されることを示している（例えば、ペプチドは、MHC分子 を結合する能力を保持する；Jardetzkyら(1990)EMBO J．9:1797-1803を参照のこ と）。アミノ酸置換されたペプチドは、上記に記載の自動化化学合成のような標 準技術により調製され得る。 ペプチドのMHC分子を結合する能力および／またはＴ細胞応答を刺激する能力 に対するアミノ酸置換の効果は、免疫学的応答を評価するための標準アッセイに おいて試験される。好適には、プロインスリン特異的Ｔ細胞クローンまたはハイ ブリドーマが、これらのアッセイに使用される。Ｔ細胞クローンは、実施例１お よび３に記載のように調製され得る。Ｔ細胞ハイブリドーマは、標準方法により （例えば、ポリエチレングリコールを用いてプロインスリンペプチド特異的Ｔ細 胞クローンとTcRαβ^-胸腺腫（例えば、BW5147細胞株）とを融合することにより ）Ｔ細胞クローンから調製され得る。プロインスリン特異的Ｔ細胞の抗原特異性 は、プロインスリンペプチドを用いる従来の（routine）刺激および抗原特異的 インターロイキン-2（IL-2）産生のアッセイにより、モニターされる。IL-2産生 の標準アッセイにおいて、培養上清は、IL-2依存性細胞株（例えば、HT-2細胞） を用いるバイオアッセイにおいて、IL-2の存在についてアッセイされる。上清は 、24時間HT-2細胞に添加され、次いで³H-チミジン（³H-TdR）の存在下でさらに1 2時間〜14時間インキュベートされ、その後、細胞が採集され、そして³H-T dRの取り込みが測定される。他の適切なIL-2のアッセイ（例えば、酵素結合免疫 吸着アッセイ）が、当該分野で周知である。 アミノ酸置換ペプチドを評価するための１つのアッセイにおいて、プロインス リンペプチド特異的Ｔ細胞クローンおよび／またはハイブリドーマを直接刺激す る置換ペプチドの能力が、評価される。プロインスリン特異的Ｔ細胞クローンお よび／またはハイブリドーマは、代表的には0.5μg/ml〜20μg/mlの間の濃度範 囲における、アミノ酸置換を有するプロインスリンペプチドアナログのパネルに よる刺激について試験される。プロインスリン特異的Ｔ細胞クローンおよび／ま たはハイブリドーマを活性化する能力を保持する刺激性ペプチド化合物は、上記 のように、クローンまたはハイブリドーマによるIL-2産生を刺激するそれらの能 力に基づいて選択される。 アミノ酸置換ペプチドを評価するための別のアッセイにおいて、抗原存在細胞 の表面上のMHC分子に結合するために野生型プロインスリンペプチドと競合する 置換ペプチドの能力が、評価される。各置換プロインスリンペプチドアナログは 、野生型プロインスリンペプチドおよびプロインスリン特異的Ｔ細胞クローンま たはハイブリドーマの添加前に、照射抗原が存在する細胞で（例えば、２時間） プレインキュベートされる。適切な期間（例えば、24時間）後、上清が採集され 、そして上記のようにIL-2の存在についてアッセイされる。競合インヒビターは 、Ｔ細胞クローンまたはハイブリドーマによるIL-2産生を阻害するその能力によ り同定され、この競合インヒビターは、刺激性プロインスリンペプチドにより通 常誘導される。さらに、阻害性ペプチド化合物は、直接刺激アッセイおよび競合 阻害アッセイの結果の組み合わせに基づいて選択され得、例えば、Ｔ細胞応答を 直接刺激する能力を欠損するが、天然のプロインスリンペプチドに対するＴ細胞 応答を競合的に阻害する能力を保持する阻害ペプチド化合物が、選択される。MH C分子に結合する野生型および置換ペプチドの能力もまた、結合アッセイにおい て標識ペプチドおよび精製MHC分子を用いて直接評価され得る（例えば、平衡透 析、カラム結合アッセイなど、例えば、Sette,A．(1987)Nature 328:395-399に 記載される）。 動物研究（実施例１および２にさらに記載される）に基づいて、本発明の好適 なプロインスリンペプチド化合物の推定MHC結合モチーフは、次のアミノ酸配列 を含有する：(Ser/Thr)-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-(Glu/Asp)（配列番号17）、ここ でXaaは任意のアミノ酸を表す。用語「MHC結合モチーフ」とは、ペプチドのMHC 分子の抗原性結合部位への結合を可能にする、ペプチド（または全タンパク質の 領域）内に存在するアミノ酸残基のパターンをいう。すなわち、特定のMHC分子 に対する結合モチーフは、フラグメントのMHC分子への結合に必要なペプチドフ ラグメントの重要なアミノ酸残基を定義する。本発明の好適なプロインスリンペ プチドが由来する、Ｂ鎖−Ｃペプチド接合部にわたるプロインスリンの領域（例 えば、アミノ酸残基47〜63）は、２つのこれらの推定MHC結合モチーフを含有す る：Thr51-Glu57およびSer54-Asp60。MHC結合にこれらの残基が含まれることは 、これらの位置でアミノ酸置換（例えば、アラニン置換）を含有するプロインス リンペプチドのパネルを調製することにより、直接評価され得る。Thr51、Ser54 、Glu57およびAsp60を除いて完全にアラニンからなるさらなるペプチドもまた、 試験され得る。従って、プロインスリンペプチドのMHC結合モチーフを評価する ためのペプチドのパネルの例は、以下に挙げられる： これらのペプチドの活性は、上記の直接Ｔ細胞刺激アッセイおよび／または競合 阻害アッセイにおいて評価され得、ペプチドのMHC結合能力における(Ser/Thr)-( Glu/Asp)モチーフの含有を評価し得る。 アミノ酸置換プロインスリンペプチドに加えて、本発明は、他の修飾を有する プロインスリンペプチド化合物もまた包含する。例えば、ペプチドのアミノ末端 またはカルボキシ末端が修飾され得る。用語「アミノ誘導基」（例えば、上記式 中のY₁）は、本発明のペプチド化合物のアミノ末端修飾を包含することが意図さ れる。N-末端修飾の例としては、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリー ルアルキル、およびアシル基が挙げられる。好適なN-末端修飾は、アセチル化 である。N-末端残基は、とりわけポリエチレングリコール（例えば、テトラエチ レングリコールカルボン酸モノメチルエーテル）、ピログルタミン酸、スクシノ イル、メトキシスクシノイル、ベンゾイル、フェニルアセチル、2-、3-、または 4-ピリジルアルカノイル、アロイル、アルカノイル（アセチルおよびシクロアル カノイル（例えば、シクロヘキシルプロパノイル）、アリールアルカノイル、ア リールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカ ルボニル、アルキルオキシカルボニル（カルバメートキャップ）、およびシクロ アルコキシカルボニルのようなアミノ酸以外の種々の部分に連結され得る。 用語「カルボキシ誘導基」（例えば、上記式中のY₂）は、本発明のペプチド化 合物のカルボキシ末端修飾を包含することが意図される。Ｃ末端の修飾の例とし ては、カルボキシ末端アミドまたはアルコール（すなわち、還元形態として）を 形成するためのＣ末端残基のカルボニル炭素の修飾が挙げられる。一般的に、Ｃ 末端残基上のカルボニル炭素に共有結合したアミド窒素は、２つの置換基を有し 、これらのそれぞれは、水素、アルキルまたはアルキルアリール基（置換または 非置換）であり得る。好適には、Ｃ末端は、アミド基（例えば、-CONH₂、-CONHC H₃、-CONHCH₂C₆H₅または-CON(CH₃)₂）であるが、2-、3-、または4-ピリジルメチ ル、2-、3-、または4-ピリジルエチル、カルボン酸、エーテル、カルボニルエス テル、アルキル、アリールアルキル、アリール、シクロヘキシルアミド、ピペリ ジンアミドおよび他の単置換または二置換アミドであってもよい。Ｃ末端残基に 連結され得る他の部分としては、ピペリジン-4-カルボン酸またはアミドおよび シスまたはトランス-4-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸またはアミドが挙げら れる。 さらに、重要でないアミノ酸残基（例えば、「中立」残基）の１つ以上の側鎖 の修飾は、ペプチドの機能を変更することなく許容され得る。アミノ酸側鎖また は末端残基の共有結合性修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基と、選択された側 鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤との反応によりペプチド中に導入 し得る。代表的な側鎖の修飾例を、以下にさらに記載する： システイン残基は、通常、α-ハロアセテート（および対応するアミン）、例 えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル誘導 体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基はまた、ブロ モトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-（5-イミドゾイル）プロピオン酸、ク ロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジ スルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、ｐ-クロロメルクリ安息香酸、2- クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ- 1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化され得る。 ヒスチジン残基は、pH 5.5〜7.0でジエチルピロカーボネートとの反応により 誘導体化される。なぜなら、この薬剤はヒスチジン側鎖に対して比較的特異的で あるからである。パラブロモフェナシルブロミドもまた有用である；反応は、好 ましくは、pH 6.0で0.1Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。 リジン残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無 水物と反応する。これらの薬剤との誘導体化は、リジン残基の電荷を逆転させる 効果を有する。α-アミノ基を含有する残基の誘導体化に適する他の試薬は、イ ミドエステル(imodoester)（例えば、メチルピコリンイミデート；ピリドキサー ルリン酸；ピリドキサール；クロロホウ素水素化物；トリニトロベンゼンスルホ ン酸(trinitobenzensulfonic acid)；Ｏ-メチルイソ尿素；2,4-ペンタンジオン ）；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応を包含する。 アルギニン残基は、１つまたはいくつかの通常の試薬、とりわけ、フェニルグ リオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒド リンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、そのグアニジン 官能基の高いPK_aのために、アルカリ性条件で反応を行うことが必要である。さ らに、これらの試薬は、リジン群ならびにアルギニンのε-アミノ基と反応し得 る。 チロシン残基自体の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラ ニトロメタンとの反応によりチロシン残基にスペクトル標識を導入することに特 に興味を持って、広範に研究されてきた。最も一般的には、Ｎ-アセチルイミダ ゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ-アセチルチロシル(ty rosyl)種および3-ニトロ誘導体を形成させる。チロシン残基は¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉ を用いてヨウ素化され、ラジオイムノアッセイにおいて使用するための標識タン パ ク質を調製する。上記のクロラミンＴ法が適している。 カルボキシル側鎖（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、カルボジイミド （R'-N-C-N-R'）、例えば、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリニル-（4-エチル ）カルボジイミドまたは1-エチル-3-（4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カル ボジイミド(1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-demethylpentyl)carbodiimide)との反応 により選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残 基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギン残基およびグルタミン残 基に変換される。 グルタミン残基およびアスパラギン残基は、しばしば、対応するグルタミン酸 残基およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は 、穏和な酸性条件下で脱アミド化される。いずれかの形態のこれらの残基は、本 発明の範囲内である。 他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはト レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジ ン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（T.E．Creighton（1983）Protei ns; Structure and Molecular Properties，W.H．Freeman & Co.，San Francisc o，79-86頁）。 共有結合性修飾ペプチド（例えば、末端または側鎖が修飾されたペプチド）の 活性は、上記の直接的なＴ細胞刺激アッセイおよび／または競合阻害アッセイに おいて評価され得る。 本発明のプロインスリンペプチド化合物はまた、天然のプロインスリンペプチ ドのペプチドアナログおよびペプチド模倣体を包含する。用語「ペプチドアナロ グ」または「ペプチド模倣体」は、化合物が天然のプロインスリンペプチドの構 造を模倣するように結合した側鎖からなる化合物をいう。「残基」は、アミド結 合またはアミド結合模倣体によってペプチド化合物内に取り込まれたアミノ酸ま たはアミノ酸模倣体をいう。ペプチド模倣体およびペプチドアナログを設計する ためのアプローチは、当該分野では公知である。例えば、Farmer，P.S．Drug De sign（E.J．Ariens編）Academic Press，New York，1980、第10巻、119-143頁； Ball，J.B.およびAlewood，P.F．(1990)J．Mol．Recognition ３:55；Morgan， B.A.およびGainor，J.A．(1989)Ann．Rep．Med．Chem．24：243-252；およびFre idinger，R.M．(1989)Trends Pharmacol．Sci．10：270を参照のこと。 「アミノ酸模倣体」は、天然に存在するアミノ酸以外に、ペプチドの機能（例 えば、ペプチドとMHC分子との相互作用）を有意な程度に逆に妨げることなく、 ペプチド化合物内の特定のアミノ酸に対する置換体としてコンホメーション的お よび機能的に作用する部分を示す。ある環境において、アミノ酸模倣体での置換 は、ペプチドの特性（例えば、ペプチドとMHC分子との相互作用）を実際増強し 得る。アミノ酸模倣体の例としては、Ｄ-アミノ酸が挙げられる。１つ以上のＤ- アミノ酸で置換したプロインスリンペプチド化合物は、周知のペプチド合成手順 を用いて作製され得る。Ｄ-アミノ酸でのアミノ酸置換の効果は、Ｌ-アミノ酸の 置換についての上記のアッセイを用いて試験され得る。ペプチドのMHC結合能に 対するＤ-アミノ酸置換の効果について、他の抗原性ペプチドを用いる研究は、M HC接触の重要な位置での単一のＤ-アミノ酸置換は、典型的に、MHC分子に対する ペプチドの親和性を減少させるが、これらの位置以外でなされるＤ-アミノ酸置 換は比較的十分に許容されることを示した。例えば、GaetaらによるPCT公開公報 第WO92/02543号を参照のこと。 本発明のペプチドアナログまたはペプチド模倣体は、アイソスター(isostere) を包含する。本明細書中で使用される用語「アイソスター」は、第２の配列を置 換し得る２つ以上の残基の配列をいう。なぜなら、この第１の配列の立体コンホ メーションが第２の配列に特異的な結合部位に適合するからである。この用語は 、当業者に周知のペプチドの骨格の改変（すなわち、アミド結合模倣体）を特に 包含する。このような改変は、アミド窒素、α-炭素、アミドカルボニルの修飾 、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失または骨格架橋を包含する。いくつかの ペプチド骨格の改変は公知であり、このような改変はΨ[CH₂S]、Ψ[CH₂NH]、Ψ[ CSNH₂]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH₂]およびΨ[(E)または(Z)CH=CH]を包含する。上記で 使用された用語体系において、Ψはアミド結合が存在しないことを示す。アミド 基を置換する構造は、括弧内に示される。アイソスターの他の例は、１つ以上の ベンゾジアゼピン分子で置換されるペプチドを含む（例えば、James，G.L.ら(19 93)Science 260：1937-1942を参照のこと）。 他の可能な改変として、Ｎ-アルキル（またはアリール）置換（Ψ[CONR]）、 ラクタムおよび他の環状構造を構築するために架橋する骨格、またはレトローイ ンベルソ(retro-inverso)アミノ酸取り込み（Ψ[NHCO]）が挙げられる。「イン ベルソ」によるは、Ｌ-アミノ酸の配列をＤ-アミノ酸で置換することを意味し、 そして「レトロ−インベルソ」または「エナンチオ−レトロ」によるは、アミノ 酸配列の反転すること（「レトロ」）およびＬ-アミノ酸をＤ-アミノ酸で置換す ることを意味する。例えば、元のペプチドがThr-Ala-Tyrである場合、レトロ改 変形態はTyr-Ala-Thrであり、インベルソ形態はthr-ala-tyrであり、そしてレト ロ−インベルソ形態はtyr-ala-thrである（小文字はＤ-アミノ酸をいう）。元の ペプチドと比較して、レトロ−インベルソペプチドは、反転した骨格を有してい るが、側鎖は元来の空間コンホメーションを実質的に保持しており、トポロジー 的に、元のペプチドと密接に類似しかつ選択されたMHC分子と結合し得るレトロ −インベルソ異性体を生じる。Goodmanら、「Perspectives in Peptide Chemist ry」283-294頁(1981)を参照のこと。また、「レトロ−インベルソ」ペプチドの さらなる記載について、Sistoによる米国特許第4,522,752号も参照のこと。 本発明のプロインスリンペプチドの改変された形態は、Ｌ-アミノ酸またはＤ- アミノ酸の置換、終末端または側鎖の共有結合性修飾、ならびにペプチドアナロ グおよびペプチド模倣体を含み、これらは、ペプチドの物理的または化学的特性 の所望の変更（例えば、安定性、溶解性、生体利用性の増加、免疫原性の増加ま たは減少など）について選択され得る。 本発明の好ましいペプチド化合物は、プロインスリンの領域に由来するか、ま たはプロインスリン由来のペプチドの改変形態であるが、ペプチドが由来する領 域内でプロインスリンに相同である他のタンパク質由来のペプチドもまた、Ｉ型 糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するために有用であり得ること が、当業者により理解される。例えば、本発明のペプチド化合物は、Ｂ鎖−Ｃペ プチド接合部にわたるプロインスリンの領域（例えば、プロインスリンのアミノ 酸47〜63）に相同である領域を有するタンパク質に由来し得る。自己抗原に対し て自己免疫応答を導く病理学的事象の開始を説明する１つの仮説は、自己抗原は 、被験体が曝されてきた環境的抗原または微生物抗原を模倣するということであ る。 従って、この環境的抗原または微生物抗原は、自己破壊的な免疫エレメントを活 性化する免疫化刺激物質として作用する。従って、Ｂ鎖−Ｃペプチド連結部にわ たるプロインスリンの領域（例えば、プロインスリンのアミノ酸47〜63）のアミ ノ酸配列を、他のタンパク質（例えば、潜在的な環境的抗原または微生物抗原） のアミノ酸配列と比較して、相同性領域を有するタンパク質を同定し得る。別の タンパク質のこのような相同領域由来のペプチド、または、本明細書中に記載の ように改変されたそれらの改変ペプチドはまた、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞によ る免疫学的応答を調節（例えば、刺激または阻害）するために有用であり得る。 II．薬学的組成物 本発明のプロインスリンペプチド化合物は、薬学的投与に適する組成物中に処 方され得る。薬学的組成物は、典型的に、プロインスリンペプチド（または上記 に記載されるその改変形態）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。好まし い実施態様において、薬学的組成物は、プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの 間の接合部にわたるプロインスリンの領域に同一であるかまたは実質的に類似す るプロインスリンペプチド化合物を包含する。好ましくは、プロインスリンペプ チドは、ヒトプロインスリンに由来する。 本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与 に適合する、任意のまたはすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤お よび抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。薬学 的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において 周知である。任意の従来の媒体または薬剤がこの活性化合物と適合しない場合を 除き、組成物におけるその使用が考慮される。補助的な活性化合物もまた、組成 物中に取り込まれ得る。 本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するよう処方される 。例えば、非経口、経皮または皮下的適応のために使用される溶液または懸濁液 は、以下の成分を包含し得る：滅菌された希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩 水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ ールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチル パラ ベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレ ート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン 酸塩またはリン酸塩および張度(tonicity)を調節するための薬剤（例えば、塩化 ナトリウムまたはデキストロース））。pHは、酸または塩基（例えば、塩酸また は水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプ ラスチックから作られるアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数の用量 バイアルを包含し得る。 注射使用に適する薬学的組成物は、滅菌した水溶液（水溶性の場合）または、 分散物、および注射可能な滅菌した溶液または分散物の用時調製のための滅菌し た粉末を包含する。静脈内投与について、適切なキャリアは、生理学的食塩水、 静菌水、Cremophor EL^TM（BASF，Parsippany，NJ）またはリン酸緩衝化生理食塩 水（PBS）を包含する。すべての場合において、組成物は、無菌でなくてはなら ず、そして容易に注射できるような程度に流動的であるべきである。組成物は、 製造および保存条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌ま たはカビ）の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒ま たは分散媒体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、 プロピレングリコール、および溶液性のポリエチレングリコールなど）、および それらの適切な混合物を含有する）であり得る。妥当な流動性は、例えば、レシ チンのようなコーティング剤の使用、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維 持、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の防止は、種々の 抗菌剤および抗カビ剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ア スコルビン酸、チメロサールなど）により達成され得る。多くの場合において、 等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マニトール、ソルビトール）、 塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸 収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼ ラチン）を組成物中に含むことによって生じさせ得る。 滅菌した注射可能な溶液は、必要量の活性化合物（すなわち、プロインスリン ペプチドまたはその誘導体）を適切な溶媒中に、上記に列挙した成分の１つまた はそれらの組合せで取り込み、必要に応じて、その後、濾過滅菌することにより 調製され得る。一般的に、分散物は、基本的な分散媒体および上記に列挙した成 分のからの必要とされる他の成分を含有する滅菌したビヒクル中に活性化合物を 取り込むことによって調製される。滅菌した注射可能な溶液を調製するための滅 菌した粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥である。 これらによって、前記の濾過滅菌したその溶液から活性成分プラス任意の付加的 な所望の成分の粉末が得られる。 経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それら は、ゼラチンカプセル内に包まれ得るかまたは錠剤に打錠され得る。経口療法投 与の目的のために、活性化合物は賦形剤で取り込まれ得、そして錠剤、トローチ 、またはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に適合する結合剤、および／ま たはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセ ル、トローチなどは、以下の任意の成分または同様の性質の化合物を含み得る： バインダー（例えば、微晶質のセルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン） ；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリ モゲル(Primogel)、またはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マ グネシウムまたはステロート(Sterote)）；滑剤(glidant)（例えば、コロイド状 二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味 剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味剤）。 ある実施態様において、活性化合物は、身体から急速に排出されないように化 合物を保護するキャリア（例えば、放出制御処方物）とともに調製される。これ らには、移殖およびマイクロカプセル化送達システムを含む。生分解性、生体適 合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコー ル酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。 このような処方物の調製方法は、当業者には明らかである。この物質はまた、Al za Corporation and Nova Pharmaceuticals，Inc.より市販され、入手可能であ る。リポソームの懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感 染細胞に対して標的化されるリポソームを含む）はまた、薬学的に受容可能なキ ャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載 されるように、当業者に公知な方法に従って調製され得る。例えば、リポソーム 処方物は、適切な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン 、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、お よびコレステロール）を無機溶媒中に溶解し、次いで溶媒をエバポレートし、乾 燥した脂質の薄いフィルムを容器の表面に残すことによって調製され得る。次い で、インバリアント鎖(invariant chain)のタンパク質またはペプチドの水溶液 を容器内に入れる。次いで、容器を手で振り回し、容器の側面から脂質物質を離 し、そして脂質凝集体を分散させる。これによって、リポソームの分散物を形成 させる。 容易な投与および画一的な投薬のために投薬単位形態(dosage unit form)で経 口または非経口組成物を処方することは、特に好都合である。本明細書中で使用 される投薬単位形態は、処置される被験体について投薬単位として適する物理的 に分けられた単位をいう；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同で、所 望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明 のこの投薬単位形態の仕様は、(a)活性化合物および達成されるべき特定の治療 効果の独特の特性、および(b)個体の処置のためのこのような活性化合物を調合 する当該分野の固有の限界に直接依存することにより指示される。 １つの実施態様において、薬学的組成物は、免疫寛容を生じる量の本発明のプ ロインスリンペプチド化合物を含有する。本明細書中で使用される用語「免疫寛 容を生じる量」は、被験体において、ペプチド化合物、あるいは関連ペプチドま たはペプチドが由来するタンパク質（例えば、プロインスリン）に対する応答性 を誘導しない十分な量のペプチド化合物を含むことが意図される。機構によって 限定されることを意図しないが、化合物に対する非応答性は、化合物に特異的な Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導、抗原に特異的なＴ細胞の欠失（例えば、破壊 ）、またはＴサプレッサ細胞巡回の誘導に起因し得る。被験体に非応答性を誘導 するために必要な、化合物の免疫寛容を生じる量は、使用するペプチド化合物の 特定の形態、投与経路、被験体の病状などに依存して変化するようである。ヒト Ｉ型糖尿病のモデルとして当該分野で受け入れらている動物モデル（例えば、バ イオブリーディングラットまたはNODマウス）は、特定のペプチド化合物、投与 経路などをテストし、本発明のペプチド化合物の免疫寛容を生じる適切な量を 決定するために使用され得る。 III．被験体におけるDM-Iの指標を検出するための方法 本発明のプロインスリンペプチド化合物は、被験体のＩ型糖尿病の指標を検出 するアッセイにおいて使用され得る。実施例３においてさらに詳細に記載するよ うに、ヒトＩ型糖尿病被験体由来の生物学的サンプルは、非糖尿病コントロール ヒト由来の生物学的サンプルが示す以上に、本発明のプロインスリンペプチドに 対して指向する免疫学的活性が増加していることを示す。従って、本発明の刺激 性プロインスリンペプチド化合物に対して指向する免疫学的活性は、被験体のＩ 型糖尿病の指標として検出され得る。 本発明は、被験体のＩ型糖尿病の指標を検出するための方法を提供する。この 方法は、以下の工程を包含する a)被験体から生物学的サンプルを得る工程； b)Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を刺激するプロインスリンペ プチド化合物とサンプルを接触させる工程；および c)被験体のＩ型糖尿病の指標としてプロインスリンペプチド化合物に対して、 サンプル中の免疫学的活性を検出する工程。 この方法において使用に適するプロインスリンペプチド化合物は、本明細書中 前記に詳細に記載した刺激性化合物を含む。好ましくは、プロインスリンペプチ ド化合物は、上記のように、プロインスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の接合部 にわたるプロインスリンの領域に同一であるか、または実質的に類似している。 ヒト由来の生物学的サンプル中のDM-Iの指標を検出するためには、好ましくは、 プロインスリンペプチド化合物は、ヒトプロインスリンに由来する。 典型的に、本方法で使用される生物学的サンプルは、被験体由来の血液サンプ ルまたはその部分分画物（例えば、有核細胞（例えば、リンパ球）または血清） であるが、免疫学的活性を含み得る任意の適切な生物学的サンプルが使用され得 る。血液サンプル、または他の生物学的サンプルは、標準的技術により被験体か ら得られ得る。さらに、血液サンプルは、（例えば、有核細胞、血清などを得る ために）標準的技術により分画され得る。 本方法の１つの実施態様において、検出される免疫学的活性は、プロインスリ ンペプチド化合物に対するＴ細胞の応答である。例えば、被験体由来の血液サン プルからの末梢血単核細胞、または精製Ｔ細胞は、本化合物の存在下で培養され 得る。本化合物に対するＴ細胞の応答を誘導する十分な時間の後、本化合物に対 するＴ細胞の応答性を測定する。Ｔ細胞の応答性は、例えば、Ｔ細胞増殖の測定 （例えば、標準的なトリチウム化チミジンの取り込みによる）またはサイトカイ ンの産生により評価され得る（以下にさらに記載される）。 Ｔ細胞の応答性を測定する前に、あるいはその代わりに、プロインスリンに特 異的なＴ細胞クローンを、生物学的サンプルから調製し得、そして定量化し得る （例えば、実施例３参照）。生物学的サンプル中のプロインスリン特異的Ｔ細胞 の頻度は、限界希釈分析（例えば、Sabbaj，Sら(1992)J．Clin．Immunol．12：2 16-224に記載されるように）によって測定され得る。あるいは、プロインスリン 特異的Ｔ細胞の頻度は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ（hprt）クローンアッセイ（Allegretta，M.ら(1990)Science 247：719-721 ；およびLodge，P.ら(1994)Neurology 44（増刊第２版）:A147）を用いて測定さ れ得る。このクローンアッセイの技術の重要な特徴は、このシステムにより検出 されるＴ細胞は、クローニング前に目的の抗原に対する応答において複数回のイ ンビボでの刺激を受けていたと考えられることである。従って、インビボで行わ れ得る試験を利用することにより、被験体におけるＴ細胞特異性およびクローン 活性の正確な情況を反映していると考えられる。この結果は非糖尿病コントロー ルと比較し得る。 Ｔ細胞増殖の測定の代わりに、またはそれに加えて、Ｔ細胞サイトカイン産生 が、プロインスリンペプチド化合物に対する免疫学的活性の指標として測定され 得る。Ｔ細胞サイトカイン産生は、例えば、特定のサイトカイン（例えば、イン ターロイキン−２[IL-2]、インターフェロン−γ[IFN-γ]、および腫瘍壊死因子 ／リンホトキシン[TNF/LT]のような前炎症性サイトカイン）に特異的な標準的な 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または放射免疫アッセイ（RIA）によりアッ セイされ得る。本方法の限定しない例において、被験体由来の末梢血単核球細胞 のバルク培養（５×10⁶細胞）を、プロインスリンペプチドを含有する適切な培 地中で開始する。バルク培養の開始の７日後、IL-2（Ｔ細胞増殖因子として）を 添加し、次いで３〜４日毎に交換する。培養開始後14日で、細胞を採集し、そし て48時間、IL-2を含まない新鮮培地中で２×10⁶細胞／mlに調節する。48時間後 、上清を採集して、サイトカインの存在についてアッセイする。培養は、例えば 、４週間まで維持され得、上清は定期的にサイトカイン産生についてモニターさ れる。上清は、アッセイまで凍結され得る。サイトカインレベルをアッセイする ためのキットは、市販されている（例えば、IL-2についてのELISAは、Genzymeか ら入手可能である：TNF/LTについてのELISAは、R & D Systemsから入手可能であ る；INF-γについてのRIAは、Centocorから入手可能である）。さらに、この結 果は非糖尿病コントロールと比較し得る。 被験体のＩ型糖尿病の指標を検出する方法の別の実施態様において、本方法に より検出される免疫学的活性は、プレプロインスリンペプチド化合物に対する抗 体結合である。免疫グロブリンを含有する生物学的サンプル（例えば、血清）は 、被験体から得られ得、そしてプロインスリンペプチド化合物と接触させて、プ ロインスリンペプチドに特異的な抗体がサンプル中に存在するか否かを測定し得 る。標準的方法（例えば、ELISAおよびRIA）を用いて、プロインスリンペプチド 化合物に特異的な抗体の存在を検出し得る。 IV．被験体におけるDM-Iの発症または進行を阻害するための方法 本発明の別の局面は、被験体のＩ型糖尿病の発症または進行を阻害するための 方法に関する。この方法は、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調 節する本発明のプロインスリンペプチド化合物を被験体に投与する工程を包含す る。被験体は、Ｉ型糖尿病に苦しみ得るか、糖尿病の「糖尿病前症」期であり得 るか、または糖尿病の発症に対して感受性であり得る（例えば、被験体はＩ型糖 尿病の遺伝的素因を有する）。機構により限定されることを意図しないが、被験 体のDM-Iの発症または進行は、本明細書中に記載のペプチド化合物を使用して、 例えば、病因性Ｔ細胞を枯渇させるか、病因性Ｔ細胞のアネルギーを誘導するか 、または小島細胞の破壊の進行を阻害するために特定のサプレッサ循環を刺激す ることによって阻害し得る。 １つの実施態様において、本発明の刺激性プロインスリンペプチド化合物は、 上記に詳細に記載されるように、Ｉ型糖尿病の発症または進行を阻害するために 被験体に投与される。他の自己免疫系における研究により、インビトロで抗原特 異的なＴ細胞の応答を刺激するペプチドを使用して、インビボでＴ細胞の免疫寛 容を誘導し得ることが示された。例えば、実験的な自己免疫性脳炎（EAE）にお いて、MHC分子への結合能力を保持するミエリンに基づくタンパク質の改変ペプ チドは、疾患の発症の前または後に投与される場合、インビボでＴ細胞を刺激す る能力を増加させ、EAE誘導を妨げ得る（例えば、Wraith，D.C.ら(1989)Cell 59 ：247-255；Smilek，D.ら(1991)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：9633-9637を 参照のこと）。さらに、ネコの主要アレルゲンFed dIに対する末梢Ｔ細胞の免疫 寛容性は、免疫優勢なＴ細胞エピトープを発現するFed dIペプチドの皮下注入(s ubcutaneous)により誘導され得る（例えば、Briner，T.J.ら(1993)Proc．Natl． Acad．Sci．USA 90：7608-7612を参照のこと）。従って、本発明の刺激性プロイ ンスリンペプチドは、免疫寛容を生じる量のペプチドを投与すること、および／ または免疫寛容を生じる投与経路によってペプチドを投与することによって、Ｉ 型糖尿病被験体のＴ細胞の応答性を調節するために使用され得る。免疫寛容を生 じる好ましい投与経路は、皮下注入（例えば、Brinerら、前出を参照のこと）、 経口投与（例えば、Whitacre，C.ら(1991)J．Immunol．147：2155-2163を参照の こと）、および胸腺内注入（例えば、Posselt，A.M.ら(1992)Science 256：1321 -1324）である。 さらに、本発明の刺激性ペプチド化合物（例えば、改変プロインスリンペプチ ドまたはプロインスリンに相同である環境的抗原もしくは微生物抗原由来の改変 ペプチド）は、DM-Iの発症に対して感受性または素因を有する個体をワクチン投 与するために有用であり得る。適切なペプチド化合物は、適当なビヒクル中で、 自己攻撃的免疫学的エレメントを枯渇させるため、および／または保護的な免疫 応答を生じるために、自己組織と交差反応しない改変ペプチド化合物として感受 性の個体に投与され得る。 別の実施態様において、上記に詳細に記載される、本発明の阻害性ペプチド化 合物は、Ｉ型糖尿病の発症または進行を阻害するために被験体に投与される。他 の自己免疫系における研究により、阻害性ペプチド、例えばMHCブロックペプチ ド（すなわち、MHC分子と結合する能力を保持するが、Ｔ細胞応答を刺激しない ペプチド）を用いて、自己免疫応答を妨止し、および／または処置し得ることが 示されている。このアプローチの成功例としては、EAEの処置（例えば、Wauben, M.H.ら(1992)J．Exp．Med．176：667-677；Sakai，K.ら(1989)Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 86：9470-9474を参照のこと）、アジュバント関節炎（Waubenら、 前出）およびNODマウスにおける糖尿病（例えば、Hurtenbach，U.ら(1993)J．Ex p．Med．177：1499-1504を参照のこと）が挙げられる。 本発明のペプチド化合物は、インビボでの薬学的投与に適切な生体適合性の形 態で被験体に投与される。このことにより、本化合物の形態は、いかなる毒性効 果よりも薬剤の治療効果は価値があることを意味する。用語「被験体」は、Ｉ型 糖尿病に感受性である生きている生物（例えば、哺乳動物および、特に、ヒト） を包含することを意図する。本明細書中に記載の化合物の投与は、治療的に活性 な量、単独または別の治療化合物との組合せ、および薬学的受容可能なキャリア を含む任意の薬理学的形態であり得る。 本発明の化合物の治療有効量の投与は、投薬量および期間で、所望される結果 を達成するに十分な量として定義される。例えば、所望される結果は、DM-Iの少 なくと１つの徴候の阻害、疾患の進行の緩慢化もしくは停止または他の望ましい 臨床結果を包含する。本化合物の治療有効量は、個体の疾患の段階、年齢、性別 および体重のような要因、および個体における所望される応答を誘導する本化合 物の能力によって変化し得る。投薬療法(regimen)は、最適な治療応答を提供す るように調節され得る。例えば、組成物は一度に投与される得るか、または数回 に分割された用量で、期間にわたり毎日投与され得る。用量は、治療状況の緊急 度(exigency)によって指示されるように比例して減少され得る。組成物中の活性 化合物の濃度は、吸収、不活性化、および本化合物の排出速度、ならびに当業者 に公知の他の要因に依存する。投薬値はまた、軽減されるべき病状の重篤度によ って変化することに留意すべきである。あらゆる特定の被験体について、特定の 投薬療法を、個体の要求および組成物の投与の実施者またはその監督者の専門的 判断に従い期間にわたって調節するべきであり、本明細書中に記載される投薬量 範囲は、単なる例示に過ぎず、そして特許請求の範囲に記載の組成物の範囲およ び実施を制限することを意図しないことが、理解されるべきである。 化合物は、予防処置および／または治療処置のために投与され得る。治療適用 では、化合物は、この疾患および／またはその合併症の徴候を軽減するためか、 またはそれらを少なくと部分的に阻止するために十分な量で、既に疾患を患って いる被験体に投与される。このことを達成するために十分な量を、「治療有効的 用量」という。この使用に有効な量は広範に変化し得るが、本明細書中に記載の 化合物の系統的な治療投薬量の限定しない例は、70kgの被験体について１日あた り0.1mg〜約2,000mgのペプチドにわたる投薬量である。さらに典型的には、１日 あたり約0.5mg〜約700mgのペプチドの投薬量である。予防適用では、化合物は、 被験体自身の免疫調節能力を増強するために十分な量で、疾患に対して感受性被 験体、またはそうでなければ疾患に対して危険な状態の被験体に投与される。こ のような量は、「予防有効用量」として本明細書中に示される。さらに、この使 用のために有効な量は広範に変化するが、本明細書中に記載の化合物の系統的な 予防投薬量の限定しない例は、70kgの被験体について１日あたり0.1mg〜約500mg のペプチドにわたる投薬量である。さらに典型的には、１日あたり約0.5mg〜約2 00mgのペプチドの投薬量である。 化合物は、所望の結果を達成するに適する従来の様式で投与され得る。例えば 、１つの実施態様において、薬剤は静脈内に投与される。別の実施態様において 、薬剤は経口的に投与される。さらに他の実施態様において、薬剤は、皮下に、 胸腺内に、筋肉内にまたは腹腔内に投与される。投与経路に依存して、薬剤は、 酵素の作用、酸および化合物を不活性化し得る他の天然の条件の作用から薬剤を 保護するために、および／または化合物を緩慢な放出処方形式で送達するために 物質中にコートされ得る。 特定のペプチド化合物、投薬量、キャリア、投与経路などの有効性は、ヒトＩ 型糖尿病の十分に特徴づけられた動物モデルにおいて評価され得る。この場合、 これらの動物モデルにおけるポジティブな結果は、ヒトにおける効力を予測する 。好ましい動物モデルとしては、バイオブリーディングラット（例えば、Parfre y, N.A.ら(1989)Crit．Rev．Immunol．９：45-65；Logothetopoulous，L.ら(198 4)Diabetes 33：33-36を参照のこと）およびNODマウス（例えば、Kikutani，H. ら Adv．Immunol．(F.J．Dixon編)285-323頁、New York NY：Academic Press，1 922参照）が挙げられる。 本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これにより限定すると解 釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用されているすべての参考文献 、特許および公開特許公報の内容は、本明細書によって参考として援用される。実施例１： プロインスリンペプチド特異的Ｔ細胞クローンはインスリン炎を誘導 する Ｉ型糖尿病 （インスリン依存性糖尿病とも称される）は、ヒトおよび動物に おいて生じる自己免疫疾患であり、膵臓のインスリンを分泌する小島β細胞の破 壊によって特徴づけられる。ヒトにおける疫学研究は、ヒトMHCのHLA-DR3、DR-4 、および-DQ3.2クラスII対立遺伝子に関連する強力な遺伝的素因を明らかにして きた（例えば、Wolf,E.ら（1983）Diabetologia 24:224-230；Platz,P.ら（1981 ）Diabetologia 21:108-115；Warram,J.ら（1994）Jos1in's Diabetes Mellitus ，R.Kahn および G.Weir（編）、Philadelphia，PA，Lea & Febiger，201-215頁 ；およびTait,B.D.ら（1991）Bailliere's Clin．Endocrinol．& Metab．5:211- 228）。このことは、これらの特異的MHCクラスII分子の情況において、病因性膵 臓自己免疫原とＴリンパ球に対する抗原提示との間の有意な関連を示唆している 。 本実施例において、ラットMHCクラスII(RT1.B^l)結合モチーフは、２つの小島 β細胞成分（酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）およびインス リン前駆体ホルモンであるプロインスリン（PI））における潜在的な自己反応性 CD4⁺Ｔ細胞エピトープを予測するために使用された。結合モチーフを含有するGA DおよびPIの17アミノ酸長のペプチドフラグメントを合成し、そしてペプチド特 異的MHCクラスIIで制限されるDA(RP)ラット（MHCタイプRT.1A^uB/D^lE/C^a）由来の CD4⁺Ｔ細胞株を生成するために使用した。一旦樹立されると、ラット小島GADお よびPIに特異的なDA(RP)由来のＴ細胞株を、養子的に（adoptively）実験に未使 用な（naive）DA(RP)ラットに移入した。移入した10日後、プロインスリン特異 的Ｔ細胞を受けたラットではインスリン炎が生じたが、GAD特異的Ｔ細胞を 受けたラットではインスリン炎は観察されなかった。病因性PIペプチド特異的Ｔ 細胞は、CD4⁺/CD8^-あり、TH₁様サイトカインを抗原に対する応答で分泌する。従 って、本実施例は、プロインスリンのペプチドフラグメントに特異的なＴ細胞に よる自己免疫性インスリン炎の新規な抗原特異的モデルを提供する。 本実施例において以下の方法論を使用した。 材料および方法動物。 MHCタイプRT1.1A^uB^lD^lE/C^aを有する、DA(RP)ラットをこれらの研究にお いて使用した。このラット系統は、自発的にインスリン炎も糖尿病も生じない。 DA(RP)系統ラットは、Heinz Kunz博士（Department of Pathology，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA）から当初得られ、そして繁殖コロニーはAnima l Research Facility of the Dartmouth Medical School，Lebanon，NHにおいて 維持された。雄および雌の両方のDA(RP)ラットを50〜70日齢の間で実験において 使用した。全ての手順および動物の世話は、Natsional Institutes of Healthの 実験室動物の厚生における手引きに従った。MHC クラスII結合モチーフペプチドの合成。 結合モチーフを含有するPIおよびG ADペプチドの配列を、RapidAmide Multiple Peptide Synthesis（RaMPS）システ ム（NEN-Dupont．Wilmington，DE）を用いる標準的なF-moc化学によって合成し た。MHCクラスII制限Ｔ細胞は、典型的に13〜25の間のアミノ酸長のペプチドを 認識する（Zamvil，S.ら（1986）Nature 324:258-260；Wraith，D.C.ら（1989） Cell 59:247-255）として、GADおよびPIペプチドをモチーフのそれぞれの末端で ４〜６アミノ酸を伸長し、そして合成して17アミノ酸長のペプチドを合成した（ GAD₄₁₂、GAD₅₂₀、およびPIと名付けた）。さらに、ペプチドのＮ末端をアセチル 化し、αヘリックス形成およびMHC相互作用を促進させた（Mains,R.ら(1983)Tre nds Neurosci.6:229-235）。ペプチド特異的Ｔ細胞株の生成および養子免疫細胞移入。 個々のＴ細胞株をGA D₄₁₂、GAD₅₂₀、およびPIペプチドに対して生成した。Ｔ細胞株を開始するために 、 ペプチドを、５mg/ml H37RA（DIFCO，Detroit，MI）を補充した完全Freund'sア ジュバント（CFA）中に乳化し、そして200μgペプチドの最終濃度でDA(RP)ラッ トの後肢の肉趾に皮内注入した。９日後ラットをフルオタン（Fluothane）麻酔 （Ayerst Laboratories，New York，NY）により屠殺し、膝窩リンパ節を得た。 リンパ節を鉗子を用いて単細胞懸濁液へ機械的に分離し、リン酸緩衝化生理食塩 水（PBS）で２回洗浄し、そして50μg/mlペプチドを有する開始培地中に再懸濁 した。開始/増殖培地は、RPMI 1640、１％自系性のラット血清、５％NCTC-109（ Bio Whittaker Products，Walkersville，MD）、２mM グルタミン、100U/ml ペ ニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、100μg/ml ファンギゾン（ICN Biom edicals，Costa Mesa，CA）、および５×10^-5M 2-メルカプトエタノール（Sigma ，St．Louis，MO）からなった。３日後、Ｔ-リンパ芽球を、Histopaque-1.077（ Sigma）を用いる密度遠心分離によって、回収し、PBSで２回洗浄し、そして10％ ウシ胎児血清およびコンカナバリン-Ａで刺激された脾臓細胞由来でIL-2が豊富 な上清（supernate）の５％を含有する培地に再懸濁した。ペプチド特異的Ｔ細 胞株は、インビトロにおけるペプチドでの刺激の開始の７〜10日後に静止状態に なることを可能にし、次いで照射胸腺細胞（2000ラド）および20μg/mlペプチド で再刺激した。 養子免疫細胞移入研究のために、抗GADおよび抗PIT細胞を、ペプチド（20μg/ ml）または細胞分裂促進性レクチンのコンカナバリン-Ａ（５μg/ml）のいずれ かで、実験に未使用なレシピエントへの静脈内（i.v.）注入の前の72時間、刺激 した。ペプチド特異的Ｔ細胞の静脈内移入（25〜120×10⁶の濃度範囲にわたる） の10日後、ラットをエーテル麻酔下で屠殺し、膵臓を得た。組織を10％ホルマリ ンで固定し、パラフィンに包埋し、薄片に切り（６ミクロン）、ガラスに載せ、 そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。抗原特異性およびペプチド特異的Ｔ細胞株のMHC制限。 ペプチド特異的Ｔ細胞 株を回収し、そしてペプチド（５〜20μg/ml）、抗原提示細胞（APC）として照 射（2000ラド）胸腺細胞（５×10⁵/ウェル）、OX-3、OX-6、またはOX-17（抗RT1 .BおよびD）抗体、あるいはW3/25（抗CD4）、OX-8（抗CD8）抗体を伴うかまた は伴わないで72時間、三連で同時培養（５〜７×10⁴/ウェル）した。これは最後 の18時間の³Hチミジン（0.5μCi/ウェル）でのパルスを包含した。³Hチミジンの 取り込みを液体シンチレーション計数（Wallac，Gaithersburg，MD）によって測 定し、そして結果を三連の培養の刺激指数±１標準偏差（SD）として表した。ペプチド特異的Ｔ細胞サイトカイン産生プロフィール。 プロインスリン特異的 Ｔ細胞を、PIペプチドに対して応答するサイトカイン産生について試験した。イ ンターロイキン2（IL-2）およびインターロイキン4（IL-4）のプロインスリンペ プチド特異的レベルをIL-2依存性HT-2細胞を用いるバイオアッセイで測定し、そ してIFN-γ産生をラットIFN-γに特異的なELISA（GIBCO BRL，Gaithersburg，MD ）で測定した。簡単に述べると、上清の100μlアリコートを、IL-2およびIL-4ア ッセイについては40時間、およびIFN-γについては72時間で、PI特異的Ｔ細胞、 PIペプチド、APC＋抗MHCクラスII抗体のインビトロ培養物から回収した。インタ ーロイキン-2含有上清を１×10³個のHT-2細胞とともに48時間培養し、これは培 養の最後の12時間の³H-チミジンでのパルスを包含した。インターロイキン-4含 有上清を、IL-2レセプター抗体（PC61.5.3，ATCC，Rockville，MD）でプレイン キュベートした１×10³個のHT-2細胞とともに培養した。48時間後、HT-2細胞を 採集し、そして液体シンチレーション計数により、³H-チミジンの取り込みを測 定した。ペプチド特異的Ｔ細胞株のフローサイトメトリーアッセイ。 PI特異的およびGA D-特異的Ｔ細胞を、20μg/mlのペプチドまたは５μg/mlコンカナバリンＡで、表 面抗原発現の測定の前の72時間刺激した。１×10⁶個の抗PIT細胞のサンプルをそ れぞれ一次抗体（OX-19（CD5）；W3/25（CD4）；OX-8（CD8）；R7.3（αβＴ細 胞レセプター）；OX-3、OX-6、OX-17（RT1.BおよびRT1.D）；OX-22（CD45RC）； 12.5〜20μg/mlの腹水由来のタンパク質；Harlan Bioproducts for Science，In dianapolis，IN）で30分間氷上で染色し、２回洗浄し、次いでフルオレセインイ ソチオシアネート（FITC）結合ヤギ抗マウスF(ab)'₂抗体（Cappel-Originon Tek nika，West Chester，PA）とともに30分間氷上でインキュベートし、２ 回洗浄し、そして１％パラホルムアルデヒド/PBSで固定した。コントロール染色 は、一次抗体の代わりにIgG1イソ型コントロール抗体（MOPC21，Sigma，St.Loui s，MO）で染色した細胞、さらに非染色細胞および二次抗体のみで染色した細胞 からなった。細胞をFacScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson，Lincoln Park，NJ）で分析した。RINm5F インスリノーマ細胞。 RINm5Fインスリノーマ細胞（Gadzar，A.ら（1980 ）Proc．Natl.Acad．Sci．USA 77:3519-3523）を、Iowa State UniversityのWal ter Hsu博士から得た。RIN細胞を、10％熱不活性化したウシ胎児血清（Hyclone ）、100μg/mlのストレプトマイシン、100U/mlのペニシリン、および２mMのL-グ ルタミン（Bio Whittaker）を補充したRPMI 1640培地中で培養した。枯渇した（ exhausted）RIN細胞上清を増殖の５日後（RIN細胞の50〜70％コンフルエント） 、回収した。上清を遠心分離し、滅菌濾過し、そしてPI特異的Ｔ細胞アッセイに おいて使用するまで-20℃で保存した。RIN細胞上清を、インビトロでPI特異的T 細胞に対して20％v/v濃度に添加した。 結果 MHCクラスII結合モチーフを含有するプロインスリン（PI）およびGADペプチド を合成および使用してＴ細胞株を生成した。表Ｉは、合成PIおよびGADペプチド のアミノ酸配列を挙げる。図１は、ラットプレプロインスリン、MHCクラスII結 合モチーフのアミノ酸配列、ならびにインスリンおよびC-ペプチドの切断産物の 間の最も近い関係の図を示す。 プロインスリン特異的およびGAD特異的Ｔ細胞株を、静脈内尾静脈(tail vein) 注入によってDA(RP)ラットに養子免疫細胞移入した。ペプチド特異的Ｔ細胞の移 入の10日後、脾臓を得、そしてヘマトキシリンおよびエオシンでの染色によって 組織病理の兆候について試験した。GAD₄₁₂、またはGAD₅₂₀特異的Ｔ細胞（範囲＝ 3.0〜12.0×10⁷細胞/ラット）を受けたラットの脾臓では、未処置の脾臓に比べ て検出可能なインスリン炎が観察されなかった。対照的に、3.0〜7.0×10⁷Ｔ細 胞/ラット（PIペプチドに特異的）の静脈内投与で、全てのDA(RP)ラット（n＝18 ）においてインスリン炎を生じた。PI特異的Ｔ細胞の移入の10日後で、１匹のラ ット当たりの脾臓切片当たりの小島の平均炎症性インボルブメントは40±６％（ 脾臓切片当たり21％〜62％におよぶ）であった。脾臓切片内で、小島インボルブ メントの重篤度は、インボルブメントが見られないから、小島周辺の炎症（目立 つインスリン炎）までおよんだ。免疫組織化学的アッセイによって、PI誘導性イ ンスリン炎が、ラットにおいてCD4⁺Ｔ細胞およびマクロファージ、遅延型の過敏 感性に典型的な浸透、および自己免疫応答から主になることが示された。 GADおよびPI特異的Ｔ細胞株の表現型特徴および機能的特徴を、抗原特異性お よびMHC制限を決定するために研究した。図２は、抗GADおよび抗PIT細胞株につ いての³H-チミジン取り込みアッセイの結果、ならびにそれらのMHCクラスII制限 パターンを示す。刺激指数（S.I.）を、コントロールウェル（培地のみ）の平均 cpmで割った実験サンプルの平均cpmとして定義する。³H-チミジン取り込みアッ セイを、インビトロにおけるペプチドでの二次刺激の際に、各株の細胞について ２〜３回繰り返した。GADおよびPI特異的Ｔ細胞は、それらのそれぞれのペプチ ドに応答し、そしてクラスII結合モチーフを含有する他のペプチドと交差反応し なかった。S-E結合モチーフを含有する両方のGADＴ細胞株の増殖は、抗RTI.B抗 体（Ox-3、およびOx-6）の添加によって阻害されたが、抗RTI.D（Ox-17）抗体の 添加によっては阻害されなかった（図２、パネルＡ：GAD₄₁₂；パネルＢ：GAD₅₂₀ ）。20μg/mlのPIペプチドに対するPI特異的Ｔ細胞の増殖は、RTI.B（54％〜67 ％）およびRTI.D（22〜25％）分子個々に対する抗体によって部分的に阻害され 得、そしてRTI.BおよびD抗体をともに添加することによって有意に阻害され得た （＞90％）（図２、パネルＣ）。抗MHCクラスII抗体のこの阻害効果は、使用し た抗原提示細胞（APC）供給源（すなわち、DA(RP)またはRTI.B/D¹同種Lewis系統 ラット）に関係なく同じパターンに従った。さらに、PI特異的Ｔ細胞は、ラット インスリノーマ細胞株（RINm5F）由来のインスリン/プロインスリンを含有する 上清に応答して増殖し、そしてこの増殖は、抗RTI.B抗体の添加によってブロッ クされた。GAD特異的およびPI特異的細胞増殖は、CD4に対するモノクローナル抗 体によって阻害された（abrogated）が、CD8によっては阻害されず、このことは 、CD4陽性Ｔ細胞のみがGADおよびPIペプチドに対して応答したことを示している 。 PI特異的Ｔ細胞を、MHCクラスII細胞ブロック抗体を伴うかまたは伴わないで 、インビトロにおけるPIペプチドに応答するサイトカイン産生についてモニター した。PI特異的Ｔ細胞は、増殖を阻害するMHCクラスIIに対する抗体の存在下で あっても、PIペプチドに応答して著しい量のIL-2およびIL-4の両方を分泌した。 さらに、ラットIFN-γに特異的なELISA（GIBCO）によって測定されるように、PI 特異的Ｔ細胞はPIペプチド単独に応答してIFN-γを分泌した（22.5±0.2ng/ml） 。個々のクラスII抗体（Ox-3およびOx-17）を組み合わせたPIペプチドに応答す るI FN-γ産生は、23.8±0.3ng/mlの平均であり、次いで、PIペプチドに応答する³H チミジン取り込みがOx-3およびOx-17をともに添加することにより顕著に阻害さ れた培養物においては、12.5±0.2ng/mlに低下した（図２、Ｃ）。 Ｔ細胞株の細胞表面抗原発現を、FACScan（Becton-Dickinson）を用いるフロ ーサイトメトリーアッセイによって測定し、図３に示す。PI特異的Ｔ細胞株はTc Rαβに陽性であり、優勢にCD4⁺/CD8^-表現型であり、そしてCD45RCの発現はほと んどなかった（＜１％）。GAD₄₁₂およびGAD₅₂₀株に特異的な細胞によって示され た細胞表面表現型は、同様であった。小数のCD8⁺細胞のPI特異的Ｔ細胞株の枯渇 （磁気ビーズ；DYNAL，Lake Success，NYを用いた）は、残りのCD4⁺/CD8^-細胞が PIペプチドに活発に応答する能力を妨害せず、かつCD4⁺細胞のインスリン炎の養 子免疫細胞移入能力も阻害しなかった。それゆえ、DA(RP)ラットにおいて、PIペ プチドフラグメントに特異的なCD4⁺Ｔ細胞は、全てのペプチドで活発な、抗原特 異的CD4⁺Ｔ細胞増殖が生じる場合でも、インスリン炎の養子免疫細胞移入を、比 較のGADペプチドに特異的なＴ細胞よりも媒介し得るようである。 GADおよびPI特異的Ｔ細胞株のインビボでの抗原特異性の持続性を評価するた めに、GADまたはPI特異的Ｔ細胞のいずれかで注入したラットから移入の18日後 脾臓を取り出した。PI特異的細胞で注入したラット由来の脾臓細胞は、³H-チミ ジン取り込みによって測定したように、PIペプチドに特異的に応答する能力を示 したが、GADについては示さなかった（PIペプチドに応答する抗PIＴ細胞株の刺 激指数（S.I.）＝41.9対GADに対する応答＝1.9）同様に、GAD特異的Ｔ細胞で注 入したラット由来の脾臓細胞は、GADペプチドに対して著しく増殖することが見 出された（S.I.＝21.6）が、PIペプチドに対しては見出されなかった（S.I.＝1. 3）。さらに、PI特異的Ｔ細胞を受けたラットの小島は、10日後よりも18日後に より重篤なインスリン炎を示した（63±10％小島のインボルブメント）。GAD特 異的Ｔ細胞で注入したラット由来の膵臓は、移入の18日後もインスリン炎の兆候 を示さなかった。 特に興味深いことは、プロインスリンにおいて同定される病因性Ｔ細胞エピト ープが、インスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の内因性切断部位におよぶことが 見出されたことである。プロインスリンからインスリンＢ鎖およびＣペプチドへ の正常な酵素プロセッシング下では、２つの重複する結合モチーフ（表１に示す ような）を含む正確な領域が切断され、その結果２つのモチーフが破壊される（ 図１を参照のこと）。プロインスリンの上記の領域は、小島β細胞またはプロイ ンスリンが代替の様式でプロセスされる小島β細胞の近接部位でのみ有意な量で 完全体（intact）で存在した。これらの結果は、病因性Ｔ細胞エピトープが、そ の後の正常な酵素プロセシングの間に分解される分子の部分に位置し得ることを 示している。プロインスリンが膵臓小島のβ細胞において高濃度で見出されてい るので、個々の分解産物（すなわち、インスリンおよびＣ−ペプチド）ではなく この分子が、Ｉ型糖尿病病因性において自己抗原として作用し得ることが可能で ある。ほとんど99％のプロインスリンがβ細胞顆粒からの調節された放出経路に よってインスリンになることが運命づけられる。しかし、残りのプロインスリン は、構成的な放出経路に沿って分泌小胞中に運ばれる（Sizonenko，S.ら（1991 ）Biochem．J．278:621-625；Sizonenko，S.ら（1993）Diabetes 42：933-936； Hutton，J.C.ら（1989）Diabetologia 32:271-281；Halban，P.A.ら（1991）Dia betologia 34:767-778）。Ｉ型糖尿病の臨床兆候に関連する興味深いこととして 、循環プロインスリンレベルが、非糖尿病患者よりも近年診断された糖尿病患者 において、２倍を超えて高くあり得ることが見出された（Heaton,D.ら（1988）D iabetologia 31:182-184；Heding，L.ら（1981）Acta．Med．Scand．Suppl．656 :509）。 本実施例において、GADおよびPIペプチドの両方を使用することが、首尾良く ペプチド特異的Ｔ細胞株（その大部分が、インビトロでそれらのそれぞれのペプ チドの認識がCD4⁺またはMHCクラスIIに制限されていた）を生成するために可能 であった。PI特異的およびGAD特異的Ｔ細胞の両方が、移入後、脾臓において少 なくとも３週間永続し、そしてそれらの抗原特異性を保持することが見出された 。しかし、養子免疫細胞移入実験は、PI特異的Ｔ細胞のみがインビボでインスリ ン炎を媒介し得ることが明らかになった。脾臓細胞のGADに対する応答は、イン スリン炎が検出可能になる前に生じ、そしてこのことはNODマウスにおける自己 免疫インスリン炎の病因性におけるGADの役割を示唆している（Kaufman，D.L.ら (1993)Nature 366:69-72；Tisch，R.ら（1993）Nature 366:72-75を参照のこと ） が、本研究は、選択されたGADペプチドに特異的なラットＴ細胞は、小島障害を 生じないことを見出した。本研究は、プロインスリン反応性Ｔ細胞がインスリン 炎を生じるに十分であることを示すことによって、GAD以外の別の潜在的に有意 な自己抗原を同定した。BBラットにおいて、２〜３週間でインスリン炎が糖尿病 を進行することが示されている（Colle，E．(1990)Clin.Immunol.Immunopathol ．57:1-9）。Ｉ型糖尿病を伴うヒトおよびマウスにおける循環インスリンレベル が、95％を超える小島が破壊されるまで有意に減少しないことから（Katz,J.D. ら（1993）Cell 74:1089-1100）、PI特異的Ｔ細胞が与えられたラットにおいて 延長された期間のインスリン炎および血液グルコースレベルをモニターする研究 を進めて、小島が炎症性細胞によって漸増して関与されるように、明白な糖尿病 がその後生じたかどうかを決定した。 実施例２： プロインスリンペプチド特異的Ｔ細胞クローンは、BBラットにおけ る糖尿病を誘導する 実施例１に記載した実験と同様の実験において、（Lewis×WF）F1、BB(DP)、 およびBB(DR)ラットをＴ細胞株産生のために免疫し、プロインスリンペプチドが RT1^uハプロタイプを有するラットにおいてもまた免疫原性であるかどうかを決定 した。実施例１に記載のRT¹ラットのように、全てのRT1^uおよびRT1^l/uラットが 応答した。F1ハイブリッド、およびBB(DR)ラットの両方で、プロインスリンペプ チドに対する活発で（vigorous）、抗原特異的で優勢なCD4⁺細胞株を生成した。 BB(DP)は同様に応答した。次いで、抗PI細胞を実験未使用の動物に養子免疫細胞 移入し、そして動物におけるインスリン炎の発生および成熟した糖尿病を評価し た。抗PI細胞の非特異的な糖尿病誘発性の性質に対するネガティブコントロール は、以下を含んだ：ミエリン塩基性タンパク質に特異的な同系間の細胞株の3000 万個の細胞が与えられたBB(DR)ラット（これは糖尿病およびEAEを発生しない） 、およびGADに特異的な同様の数のＴ細胞が与えられたラット（これは、インス リン炎も糖尿病も発生しない）。 これらの研究の結果を以下の表IIにまとめる。 （Lewis×WF）F1抗PI細胞株を同じF1タイプの実験に未使用なラットに注入す ると、いくつかの動物において軽度のインスリン炎を生じたが、糖尿病にはなら なかった。しかし、BB(DR)抗PI細胞株の養子免疫細胞移入、（およびその後、BB (DR)ラットから同様にして由来する他の抗PIT細胞株）は、BB(DR)または糖尿病 前症BB(DP)ラットの両方において、明らかなインスリン依存性糖尿病が発症した 。BB(DP)およびBB(DR)ラットの両方について、細胞移入は抗PI細胞を得たマウス においてのみ糖尿病を導いた；細胞が与えられなかった同腹子、または抗GAD細 胞を融合した同腹子は、注入時の後30日以上正常であった。従って、本実施例は 、PI特異的Ｔ細胞は、遺伝的に適切なレシピエントに移入される場合、糖尿病を 誘導するに十分であることを示している。 実施例３： プロインスリンペプチド反応性Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病ヒトの循環系 に存在する 本実施例では、ヒトプロインスリンペプチドに対して反応性のＴ細胞が糖尿病 個体に存在するかどうかを示すために、Ｉ型糖尿病個体および非糖尿病コントロ ール個体由来の末梢血を研究した。末梢血はＩ型糖尿病個体（n＝９）および非 糖尿病の年齢が釣り合ったコントロール（n＝８）から得た。リンパ球は、標準 的な密度遠心分離によって得、そしてヒトプロインスリンペプチド（10μg/ml） または破傷風変性毒素ペプチド(tetanus toxoid peptide)(10μg/ml)の存在下で 培養した。ペプチドのアミノ酸配列は以下のようである： 抗原特異的クローンを生成するために、２×10⁵細胞/ウェルを96ウェルプレート で培養し、一方抗原特異的株を生成するために、５×10⁶細胞/ウェルを24ウェル プレートで培養した。両方とも自己血清を含有する培地中で10〜14日間の培養で あった。培養期間の７〜14日後、インターロイキン2を含有する培地を補足した 。細胞培養開始の14日後、抗原特異的増殖アッセイを行った。ここでＴ細胞株お よびクローンを、適切なペプチドおよび照射した自己白血球を伴うかまたは伴わ ないで4.5日間培養し、最後の12時間の³H-チミジンでのパルスを包含した。これ らのデータを以下の表IIIにまとめる。 抗原特異的増殖の測定として³Hチミジン取り込みによって決定されるように、 プロインスリン反応性Ｔ細胞株（８または９）およびクローン（９のうち９）(1 00％)が、Ｉ型糖尿病患者において検出されたが、８のうちの２（25％）の非糖 尿病コントロールのみが、末梢血由来のプロインスリン反応性Ｔ細胞を示した。 全ての被験体は回復した抗体応答について予測されるように、破傷風変性毒素に 反応性のＴ細胞を有することが見出された。従って、本実施例は、プロインスリ ン反応性Ｔ細胞株およびクローンが、ヒトＩ型糖尿病患者の末梢血から生成され 得るが、このような株およびクローンは非糖尿病コントロールの末梢血からは容 易に生成されないことを示している。等価物 当業者は、本明細暑中に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物 を認識し、そして単に日常の実験を用いて確認し得る。このような等価物は以下 の請求の範囲によって包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ // Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/26 ＡＤＰ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリフィン， アン シー. アメリカ合衆国 ニューハンプシャー 03756， レバノン，ワン メディカル センター ドライブ （番地なし），ダー トマウス−ヒッチコック メディカル セ ンター

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するプロインスリンペ プチド化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。 ２．請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記化合物がプロインスリンのＢ 鎖とＣペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に同一であるかま たは実質的に類似する、薬学的組成物。 ３．請求項２に記載の薬学的組成物であって、前記化合物がヒトプロインスリン に由来する、薬学的組成物。 ４．請求項３に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が式： ここで、XaaおよびZaaは、存在し得るかまたは存在し得ず、アミノ酸残基を表し 、ｎおよびｍは１〜15の整数であり、Y₁は水素またはアミノ誘導基であり、Y₂は 水素またはカルボキシ誘導基である、を含有するアミノ酸配列を含有する、薬学 的組成物。 ５．請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が10〜35アミノ酸長で ある、薬学的組成物。 ６．請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が10〜20アミノ酸長で ある、薬学的組成物。 ７．請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が12〜17アミノ酸長で ある、薬学的組成物。 ８．請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化合物がアミノ酸配列： を含有する、薬学的組成物。 ９．請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記化合物がプロインスリンペプ チドの改変形態である、薬学的組成物。 １０．請求項１に記載の薬学的組成物であって、免疫寛容を生じる量のプロイン スリンペプチド化合物を含む、薬学的組成物。 １１．被験体においてＩ型糖尿病の指標を検出するための方法であって、以下の 工程； ａ）被験体から生物学的サンプルを得る工程； ｂ）Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を刺激するプロインスリン ペプチド化合物と該サンプルを接触させる工程；および ｃ）該サンプルにおける該プロインスリンペプチド化合物に対する免疫学的活 性を、該被験体におけるＩ型糖尿病の指標として検出する工程、 を包含する、方法。 １２．請求項１１に記載の方法であって、前記化合物がプロインスリンのＢ鎖と Ｃペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に同一であるかまたは 実質的に類似する、方法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、前記化合物がヒトプロインスリンに由 来する、方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、前記化合物が式： ここで、XaaおよびZaaは、存在し得るかまたは存在し得ず、アミノ酸残基を表し 、ｎおよびｍは１〜15の整数であり、Y₁は水素またはアミノ誘導基であり、Y₂は 水素またはカルボキシ誘導基である、を含有するアミノ酸配列を含有する、方法 。 １５．請求項１１に記載の方法であって、前記検出される免疫学的活性が、前記 プロインスリンペプチド化合物に応答するＴ細胞である、方法。 １６．請求項１１に記載の方法であって、前記検出される免疫学的活性が、前記 プロインスリンペプチド化合物に結合する抗体である、方法。 １７．被験体におけるＩ型糖尿病の発症または進行を阻害するための方法であっ て、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するプロインスリンペ プチド化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。 １８．請求項１７に記載の方法であって、前記化合物がプロインスリンのＢ鎖と Ｃペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に同一であるかまたは 実質的に類似する、方法。 １９．請求項１７に記載の方法であって、前記化合物がヒトプロインスリンに由 来する、方法。 ２０．請求項１７に記載の方法であって、前記化合物が式： ここで、XaaおよびZaaは、存在し得るかまたは存在し得ず、アミノ酸残基を表し 、ｎおよびｍは１〜15の整数であり、Y₁は水素またはアミノ誘導基であり、Y₂は 水素またはカルボキシ誘導基である、を含有するアミノ酸配列を含有する、方法 。 ２１．被験体におけるＩ型糖尿病の発症または進行を阻害するための医薬品を製 造するための、Ｉ型糖尿病被験体のＴ細胞による免疫学的応答を調節するプロイ ンスリンペプチド化合物の使用。 ２２．請求項２１に記載の使用であって、前記化合物がプロインスリンのＢ鎖と Ｃペプチドとの間の接合部にわたるプロインスリンの領域に同一であるかまたは 実質的に類似する、使用。 ２３．請求項２１に記載の使用であって、前記化合物がヒトプロインスリンに由 来する、使用。 ２４．請求項２１に記載の使用であって、前記化合物が式： ここで、XaaおよびZaaは、存在し得るかまたは存在し得ず、アミノ酸残基を表し 、ｎおよびｍは１〜15の整数であり、Y₁は水素またはアミノ誘導基であり、Y₂は 水素またはカルボキシ誘導基である、を含有するアミノ酸配列を含有する、使用 。 ２５．請求項２４に記載の使用であって、前記化合物が10〜35アミノ酸長である 、使用。 ２６．請求項２４に記載の使用であって、前記化合物が10〜20アミノ酸長である 、使用。 ２７．請求項２４に記載の使用であって、前記化合物が12〜17アミノ酸長である 、使用。 ２８．請求項２１に記載の使用であって、前記化合物がアミノ酸配列： を包含する、使用。 ２９．請求項２１に記載の使用であって、前記化合物がプロインスリンの改変形 態である、使用。 ３０．請求項２１に記載の使用であって、免疫寛容を生じる量のプロインスリン ペプチド化合物を含む、使用。 ３１．アミノ酸配列： ここで、Xaaは任意のアミノ酸を表す、 を有するペプチド。 ３２．アミノ酸配列： ３３．アミノ酸配列： ３４．アミノ酸配列： を有するペプチド。 ３５．以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド化合物：