JPH10506103A

JPH10506103A - ４−アルコキシ−ｎ−アセチルノイラミン酸の合成

Info

Publication number: JPH10506103A
Application number: JP8506565A
Authority: JP
Inventors: アヴラハムリアヴ; ラーゲンエフハードグレイヴ; シェリーブリストン; グレゴリーエイターナー
Original assignee: オクラホマメディカルリサーチファンデーション
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 1998-06-16
Anticipated expiration: 2015-07-21
Also published as: DE69509903D1; DK0775152T3; CA2195872A1; NO305757B1; ATE180488T1; JP3947218B2; US5556963A; WO1996004291A1; NO970462D0; AU3103395A; NO970462L; GR3030713T3; EP0775152B1; EP0775152A1; DE69509903T2; ES2131841T3; AU685312B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の、改良された合成方法に関するものである。本発明の方法によれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸のＣ−１及びＣ−２を最初にアルキル化し、その後、Ｃ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基をケタール形成により保護する。得られた保護されたアルキルエステルアルキルケトシドのＣ−４位を、その後アルキル化し、それにより、Ｃ−４ヒドロキシル基の水素がアルキル基により置換されて、アルコキシ基が形成される。脱保護は、Ｃ−８及びＣ−９のケタール基の除去及びＣ−１及びＣ−２のアルキル基の除去により達成され、それにより、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成本発明は、ウイルス診断アッセイ(viral diagnostic assay)に有用な化合物の改良された合成方法に関するものである。より具体的には、本発明は、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の改良された合成方法に関するものである。本発明の背景病院への訪問の最も共通の理由は、感染症である。ウイルスが、他の全ての微生物の組合せの群より一層、これらの感染の原因となるものである。ウイルスにより引き起こされる種々の感染の全てのもののうち、呼吸器系ウイルス（インフルエンザＡ及びＢ；パラインフルエンザ１、２及び３；呼吸器系多核ウイルス；及びアデノウイルス）が、概して、最も流行しているものである。インフルエンザウイルスの致死性は、紀元前４３０年程も前にアテネの疫病の際に発見された（LangmuirらのNew Engl ．J．Medicine，313（1985）1027）。インフルエンザは、急性の呼吸器系統の病気の原因の１番であり、米国の年間死亡原因の５番目にあたる。つまり、ウイルス感染(virus and viral infection)の診断方法の開発が益々重要となってきている。ウイルス感染の急速診断は、また、良好な医学的診療に不可欠なものとなってきている。数種のウイルスは、製造可能な抗体に対する限定的な抗原をもつ。従って、イムノアッセイが、ビリオンの存在の測定に幅広く使用されている。幅広い群のビリオン測定を望む場合、ウイルスの特定の成分を検出することが可能である。例えば、インフルエンザウイルスは、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）活性を有する表面グリコプロテインを表現する。ノイラミニダーゼ酵素により、２−ケトシド結合したＮ−アセチルノイラミン酸（またシアル酸として知られる Neu5Ac）を含む基質が加水分解される。Neu5Acは、９個の炭素原子を有する主鎖、カルボキシル基及びＮ−アセチル基からなる。一般構造、及び炭素原子を表す番号システムを以下に示す。ノイラミニダーゼ活性をもつビリオンをNeu5Acの色素性又は蛍光性グリコシドを用いてインキュベートすれば、酵素によって色素性又は蛍光性アグリコンが基質から切断され、かつ、その反応生成物によりビリオンの存在が示されるであろう。酵素と該酵素の色素性基質との反応によりウイルスの存在を検出する方法の１つは、米国特許第5,252,458 号に記載されており、該文献の記載は、本明細書に含まれるものとする。インフルエンザノイラミニダーゼの直接測定のアッセイは、Yolkenらによって開発された（J ．Infectious Diseases，142（1980）516-523 ）。Yolkenは、Neu5Acの４−メチルウンベリフェリル-２−ケトシドを蛍光性基質として使用して、少量の培養ウイルスを含む配合物中、及びインフルエンザウイルスに感染したボランティアの人の鼻洗浄試験体群中のノイラミニダーゼ活性を測定した。Yolkenは、“インフルエンザノイラミニダーゼの検出のための蛍光酵素アッセイの首尾良い開発により、適切な予防及び治療的関与の規定に備えるのに十分早いインフルエンザ診断の診療手段が講じられるであろう”と示唆している。Yolkenによれば、比色アッセイ(colorimetric assay)は、臨床適用での感度が不十分なものであった。対照的に、Yolkenは、蛍光アッセイは、臨床サンプル中ののインフルエンザノイラミニダーゼを検出するのに適したものであり得るとしている。 Pachuckiらは、Neu5Acの4-メチルウンベリフェリル-2- ケトシドを、インフルエンザ患者から集めた臨床試験体において試験した(J ．Clinical Microbiology, 26（1988）2664-2666)。その低感度性のために、そのアッセイは、ノイラミニダーゼを臨床試験体において直接的及び素早く検出するのに有用なものではなかった。しかしながら、そのアッセイにより、組織培養体の摂取後２５時間で９１％のウイルス陽性分離物が確認された。改質されたNeu5Ac基質の使用により、ノイラミニダーゼアッセイの特異性が高まり得る。シアル酸では、Ｃ−４（上記構造参照）が、酵素−基質相互作用の重要な役割を果たすと思われる。更に、唾液腺細菌ウイルスがノイラミニダーゼ活性を示すことが知られているので(VarkiらのJ ．Biol．Chem.，258（1983）12465 -12471)、これらの不本意な相互作用を除去するのが必須である。４−メトキシ −Neu5Acのケトシドは、細菌シアリダーゼに対して抵抗性のものであるが、ウイルスシアリダーゼにより素早く切断されることが、すでに知られている（BeauらのEur ．J．Biochem.，106（1980）531-540）。４−メトキシNeu5Acの合成は文献（KuhnらのLiebigs Ann ．Chem.，636（1960 ）164-173；Beau らのCarbohydr ．Res.，65（1978）1-10；BeauらのCarbohydr ． Res .，67（1978）65-77）に記載されている。しかしながら、文献記載の手順は、適切に保護されたNeu5Ac誘導体の直接アルキル化に基づくものではなく、かつ、より多くの工程を包含している。また、この方法は、シアン化水素酸等の有害物質の使用を必要としているので、商業的に実用的なものでない。直接メチル化の手順は、ＰＣＴの国際公開公報WO 91/09972(1991年７月11日）に記載されている。この方法によれば、Neu5Acのメチルエステルメチルケトシド (Neu5Ac-MEMK)を、tert- ブチルジメチルシリル(TBMS)クロライド、イミダゾール、及び、触媒量の４−ジメチルアミノピリジンを用いて、６５℃で処理して、 9-0-TBMS-Neu5Ac-MEMKを得る。この化合物を、アセトン及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸モノ水和物を用いて室温で処理することにより、9-0-TBMS-7,8- イソプロピリデン-Neu5Ac-MEMKが生じ、その後、それを、ジアゾメタン／トリフルオロボレートを用いてエーテル中で０℃で処理して、対応する４−メトキシ誘導体を得る。この化合物を、テトラブチル−アンモニウムフルオリドを用いたＴＨＦ中での処理、その後の水酸化ナトリウムでのアルカリ分解及び希塩酸／Dowex5 0(H⁺)での酸水解により脱保護(deprotected)して、４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得る。この方法は、収率が低く、かつ毒性及び爆発性のジアゾメタン、気体試薬の使用を必要とする。本発明の概要本発明により、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４−アルコキシ −Neu5Ac）の首尾良い簡単な合成を提供する。この方法は、素早くかつ簡単にスケールアップすることができる。その方法によれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸をＣ−１及びＣ−２についての２段階の工程によりアルキル化（好ましくはメチル化）して、アルキルエステルアルキルケトシド（好ましくはメチルエステルメチルケトシド）を得る。アルキルエステルアルキルケトシドのＣ−８及びＣ−９に位置するビシナルヒドロキシル基を、その後、ケタールの形成により保護する。ケタールは、アルキルエステルアルキルケトシドをアセトン及び触媒を用いて処理することにより形成する。保護されたアルキルエステルアルキルケトシドを、その後、Ｃ−４位についてアルキル化し、それにより、Ｃ−４ヒドロキシル基の水素をアルキル基で置換して、Ｃ−４位にアルコキシ基を形成する。Ｃ−８及びＣ−９に形成されたケタール基を、酢酸を用いた処理により除去する。最終的な脱保護は、Ｃ−１及びＣ−２のアルキル基を、アルカリ処理及びその後の酸水解により除去することにより行う。本発明の目的は、ウイルス検出用診断方法に有用な基質の合成方法を提供することである。本発明の他の目的は、実用的で、首尾良い、コスト的に有効な、４ −アルコキシ−Neu5Acの製造方法を提供することである。本発明の他の目的は、素早くスケールアップすることができる４−アルコキシ−Neu5Acの合成方法を提供することである。本発明の他の目的は、保護されたアルキルエステルアルキルケトシドのＣ−４をアルキル化して、Ｃ−４にアルコキシ基を形成することを含む、４−アルコキシ−Neu5Acの合成方法を提供することである。本発明の更に他の目的は、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、以下の工程を含む該方法を提供することである： (a) Ｃ−１にアルキルエステル及びＣ−２にアルキルケトシドを有するＮ−アセチルノイラミン酸誘導体のＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (b) 工程(a)により保護された誘導体のＣ−４をアルキル化して、Ｃ−４にアルコキシ基を形成する工程；及び (c) 工程(b)によりアルキル化された、保護された誘導体を、Ｃ−８及びＣ− ９のケタール除去及びＣ−１及びＣ−２のアルキル基除去により脱保護して、４ −アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を形成する工程。本発明の更に他の目的は、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、以下の工程を含む該方法を提供することである： (a) Ｎ−アセチルノイラミン酸のＣ−１のカルボン酸基及びＣ−２のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のアルキルエステルアルキルケトシドを形成する工程； (b) アルキルエステルアルキルケトシドのＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ZnCl₂及びF eCl₃からなる群から選択された酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (c) 工程(b)の保護されたアルキルエステルケトシドのＣ−４のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｃ−４にアルコキシ基を形成する工程；及び (d) 工程(c)の生成物のＣ−８及びＣ−９に形成されたケタール基を除去し、かつＣ−１及びＣ−２のアルキル基を除去して、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得る工程。本発明の更に他の目的は、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、４−アルコキシ基が４−メトキシ基又は４−エトキシ基であり、以下の工程を含む該方法を提供することである： (a) Ｎ−アセチルノイラミン酸のＣ−１のカルボン酸基を、トリフルオロ酢酸及びカチオン交換樹脂からなる群から選択された触媒の存在下でメチル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルを形成する工程； (b) Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルのＣ−２のヒドロキシル基を、有効量の塩化アセチルの存在下でメチル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルメチルケトシドを形成する工程； (c) メチルエステルメチルケトシドのＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＺｎＣｌ₂及びＦｅＣｌ₃からなる群から選択された酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (d) 保護されたアルキルエステルケトシドのＣ−４のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｃ−４にメトキシ基又はエトキシ基を形成する工程（該アルキル化は、約０℃〜約３０℃の温度で約１０分〜約２４時間行われる）；及び (e) Ｃ−８及びＣ−９に形成されたケタール基を、酢酸を用いた処理により除去し、かつＣ−１及びＣ−２のメチル基をアルカリ処理及びその後の酸水解により除去して、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（該４−アルコキシ基は４−メトキシ基又は４−エトキシ基である）を得る工程。本発明の他の目的、利点、特色及び特徴は、以下の記載及びクレームを参照すればより明らかとなるであろう。本発明の詳細な記載本明細書に記載の方法により、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）のＣ−４ヒドロキシル基を特定的にアルキル化して、４−アルコキシ基を形成する方法を提供する。具体的には、本明細書に記載の方法により、以下の一般式を有する４ −アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の、改良された製造方法を提供する：（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基である）。高級アルキル基（即ち、Ｒが３〜６個の炭素原子を含む場合）は、線状、分枝状、及び環状異性体を含んでいてもよい。好ましくは、Ｒは、１〜４個の炭素原子を含むアルキル基であり；より好ましくは、Ｒは、１又は２個の炭素原子を含むアルキル基であり；更に好ましくは、Ｒはメチルである。Ｃ−４のアルコキシ基についての特異性は、Neu5Ac分子内の反応基の保護及びその後の脱保護によりもたらされる。更なる反応特異性は、反応条件の調節によりもたらされる。本明細書に記載の反応機構により、簡単でコスト的に有効な４−アルコキシ−Neu5Ac が高収率で得られる方法を提供する。この手順を容易にスケールアップして、商業的な量の４−アルコキシ−Neu5Acを、高コストとなることなく提供することができる。以下により詳細に記載したような一般的に好ましい反応体を用いる、４ −アルコキシ−Neu5Acの一般的な合成を以下の反応機構において説明する（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基である）。出発材料Neu5Ac(1)は商業的に入手可能である（MediHerb Inc.，4540 S．Nava jo#1，Englewood，Co．80110）。また、それは、Kim らのJ ．Am．Chem．Soc.，1 10（1988）6481に記載され、かつ以下の化学反応式により説明される手順を用いて、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン及びピルビン酸から酵素的に合成することができる：酵素反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターすることができ、かつその生成物は、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。本発明では、Neu5AcのＣ−１のカルボキシレート基及びＣ−２のヒドロキシル基を最初に、アルキル化により保護する。Ｃ−１及びＣ−２の基のアルキル化は、好ましくはメチル化であるが、エチル化、プロピル化及びブチル化であってもよい。本発明の好ましい実施態様では、Neu5Acを、２段階の工程で、アルキルエステルアルキルケトシドに転化する。更に好ましくは、この２段階のアルキル化は、メチルエステルメチルケトシド(3)を形成するための２段階の好ましいメチル化工程を包含する。この第１メチル化段階では、Ｃ−１カルボキシル基を無水メタノールを用いて酸触媒の存在下でメチル化する。適切な触媒としては、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びカチオン交換樹脂がある。適切なカチオン交換樹脂は、Dowex 50(H⁺)及びAmberlyst 15(H⁺)等である。（第１メチル化段階でのメタノール系塩化アセチルの使用は、一般に、それにより、塩化アシル誘導体等の望ましくない副生成物が生じ得るので推奨されない。）第２の好ましいメチル化段階では、Ｃ−２ヒドロキシル基を、メタノール系塩化アセチルの使用によりメチル化する。第２段階でのメタノール系塩化アセチルの使用により、このメチル化を達成するためにDowex 50(H⁺)樹脂を用いる従来の方法において通常生じていた、メチルケトシドの望ましくない加水分解が低減される。２段階のアルキル化により一層良い収率が得られる。なぜなら、第１段階後の作業(work-up)によりアルキル化の間に生じる水の除去が可能となるからである。水の存在は、それにより、新しく形成されたグリコシド結合の開裂が促進されるため、望ましくない。本発明では、塩化アセチルを第２段階において使用した場合、メチル化の間に生じた水が塩化アセチルと反応して、酢酸及び無水ＨＣｌが生じ、それにより、加水分解が低減又は除去される。第２アルキル化段階からのDowex 樹脂の除去により、処理時間及びコストが低減され、かつ収率が改良される。なぜなら、Dowex 樹脂の乾燥は、不適切に行われるとアルキル化収率を低下させ得る、時間のかかる困難なプロセスであるからである。工程の次の段階では、メチルエステルメチルケトシド(3)のＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を、ケタール(4)の形成により保護する。メチルエステルメチルケトシドを、有効量のアセトン及び酸触媒を用いて処理して、ケタールを形成する。適切な酸触媒としては、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩（ピリジニウム塩(PPTS)及び他の塩）、ＺｎＣｌ₂及びＦｅＣｌ₃等がある。好ましい酸触媒は、ｐ−トルエンスルホン酸の非吸湿性ピリジニウム塩である。保護されたメチルエステルメチルケトシド(4)を、その後、Ｃ−４についてアルキル化して、４位にアルコキシ基を含む中間体(5)を形成する。Ｃ−４のヒドロキシル基のアルキル化は、メチル化、エチル化、プロピル化、ブチル化、ペンチル化又はヘキシル化であってもよく、それにより、Ｃ−４のヒドロキシル基がＲＯ−基（Ｒは１〜６個の炭素原子を含むアルキルラジカルである）に転化される。好ましくは、Ｃ−４でのアルキル化は、メチル化、エチル化、プロピル化又はブチル化である。より好ましくは、Ｃ−４でのアルキル化は、メチル化又はエチル化であり、それにより４−メトキシ又は４−エトキシ誘導体が得られる。更に好ましくは、Ｃ−４でのアルキル化は、メチル化であり、４−メトキシ誘導体が得られる。Ｃ−４位の高級アルキル基の導入は、一般に、メチル化より遅く、かつその収率はいくらか低い。更に、高級アルキル基を有する色素性基質は、４ −メトキシ−Neu5Acより酵素的切断を受けにくく、それにより、アッセイの感受性がより低くなる。それにもかかわらず、いくつかの特定の用途及びアッセイについては、そのようなＣ−４の高級アルキル基が有用なものであり得、かつ好ましくさえあるかもしれない。Ｃ−７のより立体的なヒンダード遊離ヒドロキシル基についてのアルキル化は本質的に防止することができ、かつＣ−５のＮ−アセチル基についてのアルキル化はこの直後に記載のように反応条件を調節することにより最小にすることができる。そのプロセスによれば、中間体(4)を、水酸化ナトリウムの８０％分散液中において、約1.2〜約1.4モル当量のアルキル化剤を用いて処理する。アルキル化剤は、ジメチルスルフェート、ジエチルスルフェート、ジプロピルスルフェート、ジブチルスルフェート、ジペンチルスルフェート及びジヘキシルスルフェートからなる群から選択される。反応は、一般に、約０℃〜約３０℃の温度で、約１０分〜約４８時間行う。好ましくは、反応温度は、約０℃〜約２２℃の範囲内とする。４位に高級アルコキシ基を形成する場合には、一般に、長い反応時間が好ましい。本発明の好ましい実施態様では、Ｃ−４にメトキシ基を形成するためのメチル化反応は、約０℃〜約３０℃の温度、より好ましくは約０℃〜約２２℃ の温度で、約１０分〜約３０分間行う。本発明の他の好ましい実施態様では、Ｃ −４にエトキシ基を形成するためのエチル化反応は、約０℃〜約３０℃、より好ましくは約０℃〜約２２℃の温度で約１時間〜約２４時間行う。それぞれ約６０％及び４０％より高い４−メトキシ及び４−エトキシ誘導体(5)の収率は、精製後にカラムクロマトグラフィーにより得ることができる。 (5)からのケタール基の除去は、約８０％酢酸を用いる処理により達成する。酢酸加水分解により、また、Ｃ−９ヒドロキシル基での部分アセチル化が起こり得る。従って、加水分解生成物をナトリウムメトキシドで処理して、Ｃ−９における酢酸根を除去することができる。(6)の最終的な脱保護を、アルカリ処理及びその後の酸水解により行って、最終生成物４−アルコキシ−Neu5Ac(7)を得る。４−アルコキシ−Neu5Acは、例えば、色素性又は蛍光性マーカーグループを含む任意の適切なマーカーグループへの結合により、更なる利用が可能である。好ましいマーカーグループは、例えば、４−クロロ−１−ナフトール、６−ブロモ −１−ナフトール及び５−ブロモ−４−クロロインドール等を含む色素性グループである。色素性改質４−アルコキシ−Neu5Acは、臨床サンプル又は試験体におけるウイルスノイラミニダーゼ活性を検出するのに有用なノイラミニダーゼアッセイに導入することができる。そのような４位改質色素性Ｎ−アセチルノイラミン酸基質の合成方法及びウイルスアッセイにおける使用方法は、ＰＣＴの国際公開公報WO 91/09972；YolkenらのJ ．Infectious Diseases，142（1980）516-523 ；及びPachuckiらのJ ．Clinical Microbiology，26（1988）2664-2666 に記載されている（それぞれの文献の記載は本明細書に含まれるものとする）。当然、現在の４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を使用して、他の色素体及び蛍光体含有誘導体を形成することができ、かつそれは他のウイルスアッセイに使用することができる。以下の実施例は、本発明を行う方法を説明しており、かつクレームに記載の本発明の範囲を制限することのない説明的なものである理解されるべきである。実施例Ｉ：４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸４−メトキシ−Ｎ−Neu5Acの合成を、以下の反応式に表す。化合物２を、刊行物(BaumbergerらのHelv ．Chim．Acta 69（1986）1927)に記載の手順に従って、Ｎ−アセチルノイラミン酸(１、MediHerb，Englewood,Co.)のエステル化により得た。２（１０ｇ）のメタノール（２００ｍｌ）の冷（氷浴）溶液に、塩化アセチル（１０ｍｌ）を添加し、かつ混合物を３時間７０℃で攪拌した。混合物を蒸発させて乾燥状態にし、残留物を減圧下で乾燥して、生原料メチルエステルメチルケトシド(3)を得た。生原料３を、公知の手順(HagedornらのHelv ．Chim．Acta 69 （1986）2127)によりアセタールに転化した。３のアセトン（３００ｍｌ）溶液に、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（５０ｍｇ）を添加した。混合物を、室温で１時間攪拌した。混合物を、その後、Dowex 1(OH)で中和し、かつ残留物を濾過し、アセトンで洗浄した。濾液を蒸発させて乾燥状態にし、残留物をシリカゲルカラムにおいて精製した。塩化メチレン：メタノール（１５：１）による溶離により、ほとんどの副生成物が除去された。塩化メチレン：メタノール（９：１）による連続溶離により、純粋なメチル５−アセタミド−３，５−ジデオキシ −８，９−Ｏ−イソプロピリデン−４−メトキシーβ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシドニックアシッド（nonulopyranosidonic acid）メチルエステル（４、５．１９ｇ、４５％）を得た。４（１．７ｇ）のアセトニトリル（１５ｍｌ）冷（氷浴）溶液に、水酸化ナトリウム（８０％分散液、２４５ｍｇ）を（窒素下で）添加した。ジメチルスルフェート（０．８ｍｌ）を添加する前に、混合物を、１５分間氷浴において（窒素下で）攪拌した。氷浴での攪拌を、更に２０分間続けた。混合物を、セライトにより濾過し、かつ濾液を蒸発させて乾燥状態にした。残留物をシリカゲルカラム（８０ｇ）において精製し、かつ純生成物(5)を塩化メチレン：メタノール（２５：１）により溶離した。５の収率は、１．２２ｇ（６９％）であった。化合物５（１．２２ｇ）を、８０％酢酸水溶液（１５ｍｌ）を用いて８５℃で１時間処理した。酢酸を、蒸発及び水との共蒸発(co-evaporation)により除去した。残留物を、メタノール（１０ｍｌ）のＭナトリウムメトキシド溶液（２．２ｍｌ）を用いて室温で１時間処理した。混合物のｐＨを、Dowex 50(H⁺)樹脂を用いてｐＨ約７に調節し、樹脂を濾過により除去し、かつ濾液を蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムにおいて精製し、かつ生成物を、塩化メチレン−メタノール（５：１の容量）により溶離した。６の収率は、０．８７ｇ（８０％）であった。化合物６（０．８７ｇ）を、水（３．５ｍｌ）及びエチルアルコール（３．５ｍｌ）のＭ水酸化ナトリウム溶液（３．０ｍｌ）を用いて室温で１時間処理した。混合物を、Dowex 50(H⁺)樹脂を用いて中和し、濾過により樹脂を除去し、かつ濾液を蒸発させた。残留物を、Dowex 50(H⁺)（１．５ｇ）及び０．０２５Ｍ塩酸を用いて１０５℃で３時間処理した。樹脂を濾過により除去し、かつ濾液を蒸発させて乾燥状態にした。残留物を乾燥させて、生成物７（０．７１ｇ、８８％）を得た。７の構造を、プロトン及びカーボン−１３ＮＭＲ分光学により確認した。実施例II：４−エトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸４−エトキシ−Neu5Acの合成を、以下の反応式に表す。化合物１〜４を実施例Ｉに記載の手順に従って合成した。メチル５−アセタミド−８，９−Ｏ−イソプロビリデン−３，５−ジデオキシ −β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシドニックアシッドメチルエステル（４、１．６９ｇ）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液（窒素下０℃で維持した）に、８０％水酸化ナトリウム（２２０ｍｇ）を添加し、かつ混合物を１０分間攪拌した。ジメチルスルフェート（２．５ｍｌ）を添加して、混合物を１５分間氷浴中で、更に１７時間室温で（窒素下で）攪拌した。混合物をセライトにより濾過し、かつ濾液を蒸発させた。粗残留物をシリカゲル（６０ｇ）において精製し、かつ生成物を塩化メチレンーメタノール（２５：１の容量）により溶離した。５の収率は、０．７６ｇ（４２％）であった。生成物の構造を、ＮＭＲ分光学により確認した。化合物５（６８６ｍｇ）を、８０％酢酸水溶液（１０ｍｌ）を用いて９０℃で１時間処理した。混合物を蒸発させ、かつ残留物を、メタノール（５ｍｌ）のＭナトリウムメトキシド溶液（１．６ｍｌ）により処理した。混合物を、１時間室温で攪拌し、Dowex 50(H⁺)を用いて中和し、濾過し、かつその後、蒸発させた。残留物を、シリカゲル（３０ｇ）において精製した。塩化メチレン−メタノール（５：１の容量）での溶離により、急速移動(fast-moving)副生成物を除去した。同一溶剤システムでの連続溶離により、化合物６（４５０ｍｇ、７３％）を得た。化合物６（４５０ｍｇ）を、エチルアルコール（５ｍｌ）と水（５ｍｌ）との混合物のＭ水酸化ナトリウム溶液（１ｍｌ）を用いて室温で１時間処理した。混合物を、Dowex 50(H⁺)を用いて中和し、かつ蒸発させた。残留物を、０．０２５Ｍ塩酸中においてDowex 50(H⁺)を用いて９０℃で４時間処理し、かつ蒸発させた。残留物を乾燥させて、化合物７（３３３ｍｇ、８０％）を得た。生成物の構造をＮＭＲ分光学により確認した。本発明の実施における種々の改良及び変更は、本発明の前述の詳細な記載を読んだ当業者には予期し得ることである。従って、そのような改良及び変更は、以下のクレームの範囲内に包含されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブリストンシェリーアメリカ合衆国オハイオ州 44060 コンコードモーリーロード 7465 (72)発明者ターナーグレゴリーエイアメリカ合衆国ミズーリー州 64055 インディペンダンスクラッカーネックロード 16301

Claims

【特許請求の範囲】１．４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、以下の工程を含む該方法： (a) Ｃ−１にアルキルエステル及びＣ−２にアルキルケトシドを有するＮ−アセチルノイラミン酸誘導体のＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (b) 工程(a)により保護された誘導体のＣ−４をアルキル化して、Ｃ−４にアルコキシ基を形成する工程；及び (c) 工程(b)によりアルキル化された、保護された誘導体を、Ｃ−８及びＣ− ９のケタール除去及びＣ−１及びＣ−２のアルキル基除去により脱保護して、４ −アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を形成する工程。２．ケタールを形成するために使用される酸触媒が、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＺｎＣｌ₂及びＦｅＣｌ₃からなる群から選択される請求項１に記載の方法。３．酸触媒が、ｐ−トルエンスルホン酸のピリジニウム塩である請求項２に記載の方法。４．Ｃ−４のアルキル化により、Ｃ−４に式ＲＯ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である）のアルコキシ基が形成される請求項１に記載の方法。５．アルキル化が、ジメチルスルフェート、ジエチルスルフェート、ジプロピルスルフェート、ジブチルスルフェート、ジペンチルスルフェート及びジヘキシルスルフェートからなる群から選択されたアルキル化剤を用いて行われる請求項４に記載の方法。６．アルキル化が、約０℃〜約３０℃の温度で約１０分〜約４８時間行われる請求項４に記載の方法。７．アルキル化が、約０℃〜約２２℃の温度で約１０分〜約３０分間行われるメチル化である請求項６に記載の方法。８．Ｃ−８及びＣ−９のケタール基が、酢酸を用いた処理により除去される請求項１に記載の方法。９．Ｃ−１及びＣ−２のアルキル基が、アルカリ処理及びその後の酸水解により除去される請求項１に記載の方法。 10．４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、以下の工程を含む該方法： (a) Ｎ−アセチルノイラミン酸のＣ−１のカルボン酸基及びＣ−２のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のアルキルエステルアルキルケトシドを形成する工程； (b) アルキルエステルアルキルケトシドのＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ZnCl₂及びF eCl₃からなる群から選択された酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (c) 工程(b)の保護されたアルキルエステルケトシドのＣ−４のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｃ−４にアルコキシ基を形成する工程；及び (d) 工程(c)の生成物のＣ−８及びＣ−９に形成されたケタール基を除去し、かつＣ−１及びＣ−２のアルキル基を除去して、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得る工程。 11．Ｃ−１のカルボン酸基が、触媒の存在下でアルキル化される請求項１０に記載の方法。 12．触媒が、トリフルオロ酢酸及びカチオン交換樹脂からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。 13．Ｃ−２のヒドロキシル基が、有効量の塩化アセチルの存在下でアルキル化される請求項１０に記載の方法。 14．酸触媒が、ｐ−トルエンスルホン酸のピリジニウム塩である請求項１０に記載の方法。 15．Ｃ−４のヒドロキシル基をアルキル化して、式ＲＯ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である）のアルコキシ基を形成する請求項１０に記載の方法。 16．Ｃ−４のアルキル化が、ジメチルスルフェート、ジエチルスルフェート、ジプロピルスルフェート、ジブチルスルフェート、ジペンチルスルフェート及びジヘキシルスルフェートからなる群から選択されたアルキル化剤を用いて行われる請求項１５に記載の方法。 17．Ｃ−４のアルキル化が、約０℃〜約３０℃の温度で約１０分〜約４８時間行われる請求項１６に記載の方法。 18．Ｃ−４のアルコキシ基がメトキシ基であり、かつＣ−４のアルキル化が約０ ℃〜約２２℃の温度で約１０分〜約３０分間行われる請求項１７に記載の方法。 19．Ｃ−８及びＣ−９のケタール基が、酢酸を用いた処理により除去される請求項１０に記載の方法。 20．Ｃ−１及びＣ−２のアルキル基が、アルカリ処理及びその後の酸水解により除去される請求項１０に記載の方法。 21．４−アルコキシ基が４−メトキシ基又は４−エトキシ基である４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成方法であって、以下の工程を含む該方法： (a) Ｎ−アセチルノイラミン酸のＣ−１のカルボン酸基を、トリフルオロ酢酸及びカチオン交換樹脂からなる群から選択された触媒の存在下でメチル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルを形成する工程； (b) Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルのＣ−２のヒドロキシル基を、有効量の塩化アセチルの存在下でメチル化して、Ｎ−アセチルノイラミン酸のメチルエステルメチルケトシドを形成する工程； (c) メチルエステルメチルケトシドのＣ−８及びＣ−９のビシナルヒドロキシル基を、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＺｎＣｌ₂及びＦｅＣｌ₃からなる群から選択された酸触媒の存在下でケタールを形成することにより保護する工程； (d) 保護されたアルキルエステルケトシドのＣ−４のヒドロキシル基をアルキル化して、Ｃ−４にメトキシ基又はエトキシ基を形成する工程、ここで該アルキル化は約０℃〜約３０℃の温度で約１０分〜約２４時間行われる；及び (e) Ｃ−８及びＣ−９に形成されたケタール基を、酢酸を用いた処理により除去し、かつＣ−１及びＣ−２のメチル基をアルカリ処理及びその後の酸水解により除去して、４−アルコキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（該４−アルコキシ基は４−メトキシ基又は４−エトキシ基である）を得る工程。 22．４−アルコキシ基がメトキシ基であり、かつ工程(d)のアルキル化が約０℃ 〜約２２℃の温度で約１０分〜約３０分間行われる請求項２１に記載の方法。 23．４−アルコキシ基がエトキシ基であり、かつ工程(d)のアルキル化が約０℃ 〜約２２℃の温度で約１時間〜約２４時間行われる請求項２１に記載の方法。