JPH10506536A - 安定化外部ガイド配列 - Google Patents

安定化外部ガイド配列

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Abstract

(57)【要約】 特定の標的RNAの切断を媒介する修飾された外部ガイド配列（EGS）分子が構築された。この修飾された分子は、標的RNA分子に特異的に結合し、RNAse Pに媒介されるこの分子の切断を促進し、そして増強されたヌクレアーゼ耐性を有するように設計された、RNAse Pに対する外部ガイド配列分子である。特定の領域は、RNAse P活性を維持すると同時に、増強された安定性を達成するように修飾される。Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置における使用に適切な修飾された外部ガイド配列分子が構築された。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化外部ガイド配列 発明の背景 本出願は、RNAse PによるRNAの切断を標的化するように設計された方法および 外部ガイド配列組成物に関する。 Ｉ．リボザイムおよび外部ガイド配列分子 リボ核酸（RNA）分子は、遺伝情報のキャリア（例えば、レトロウイルスゲノ ムRNAおよびメッセンジャーRNA（mRNA）分子）、およびタンパク質合成に不可欠 な構造物（例えば、トランスファーRNA（tRNA）およびリボゾームRNA（rRNA）分 子）として作用し得るだけでなく、核酸分子を特異的に切断する酵素としても作 用し得る。このような触媒性RNA分子はリボザイムと呼ばれる。 Altman博士およびCech博士（彼らは、1989年にノーベル賞を授与された）によ る触媒性RNAの発見は、商業的適用（特に、治療物）において多くの関心を生み 出した（Altman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10898-10900(1993); Symons ，Annu．Rev．Biochem．61:641-671(1992); Rossiら、Antisense Res．Dev.，1: 285-288(1991); Cech，Annu．Rev．Biochem．59:543-568，(1990)）。数種のク ラスの触媒性RNA（リボザイム）が記載され、その中には、イントロン由来リボ ザイム（WO 88/04300; また、Cech，T.，Annu．Rev．Biochem.，59:543-568，(1 990)も参照のこと）、ハンマーヘッド型リボザイム（GeneShearsによるWO 89/05 852およびEP 321021）、アクスヘッド（axehead）型リボザイム（Innovirによる WO 91/04319およびWO 91/04324）が含まれる。 RNAse P 別のクラスのリボザイムには、酵素RNAse PのRNA部分が含まれる。RNAse Pは 、トランスファーRNA（tRNA）のプロセシングに関与し、タンパク質合成機構の 共通の細胞性成分である。細菌性RNAse Pは、２つの成分、タンパク質（C5）お よびRNA（M1）を含む。Sidney Altmanおよび彼の共同研究者らは、M1 RNAがまさ に完全な酵素のように機能し得ることを実証し、Escherichia coliにおいてこの RN Aが本質的に触媒成分であることを示した（Guerrier-Takadaら、Cell 35:849-85 7(1983)）。その後の研究において、Altman博士および同僚は、外部ガイド配列 （EGS）を用いることによって、事実上いかなるRNA配列をも細菌性RNAse Pに対 する基質に変換するための方法を開発した。外部ガイド配列は、切断されるべき RNA中の切断部位に対するヌクレオチド3'に相補的な少なくとも７ヌクレオチド をその5'末端に有し、そしてその5'末端にヌクレオチドNCCA（Nは任意のヌクレ オチドである）を有する（WO 92/03566ならびにForsterおよびAltman，Science 238:407-409（1990）。同様の原理を用いて、EGS/RNAse Pが指示するRNAの切断 が、真核生物系での使用のために開発されている（Yuanら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA 89:8006-8010(1992)）。本明細書中で使用される場合、「外部ガイド 配列」および「EGS」は、標的RNAにおいてRNAse Pに対する活性な切断部位を形 成する任意のオリゴヌクレオチドをいう。 II．Ｂ型肝炎ウイルス（HBV） 肝臓の持続性の非細胞変性性感染を引き起こす小さなDNAを含有するウイルス 群のメンバーであるHBVは、世界中に見出され、そして慢性キャリアの多数の保 有宿主のヒトの間で永続されるヒトの感染性病原体である。地球上の人口の約６ 〜７％が感染している（３億人のキャリア）と見積もられている。感染の普及率 は、世界中で均一ではない。HBVの分布における地理的な勾配が存在する。これ は、北アメリカおよび西ヨーロッパで最も低く（ここでこのウイルスは、人口の 0.1〜0.5％に検出され得る）、そして、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカ で最も高い（ここで感染頻度は、人口の５〜20％に変化し得る）。この歪んだ分 布は、肝細胞癌腫の分布と平行し、そして慢性のHBV感染とこのタイプの悪性腫 瘍との間の関連についての強力な疫学的証拠を提供する。 Ｂ型肝炎は、おそらく、ヒトにおける肝細胞癌腫を含む慢性肝疾患の最も一般 的な原因であるため、医学的に非常に重要である。感染した肝細胞はウイルス粒 子を継続的に分泌し、このウイルス粒子は血液中に高レベルで蓄積する。これら の粒子には、２つのタイプがある：(i)過剰なウイルスコートタンパク質（HBsAg ）からなり、かつ核酸を含有しない非感染性粒子（血液１mlあたり1013粒子まで の濃度）、および(ii)主要ウイルスコートタンパク質、炭水化物、および脂質 を含むエンベロープがその周りに集合した27nmのヌクレオキャプシドコア（HBcA g）からなり、低い濃度で存在する（血液１mlあたり109粒子）感染性のDNA含有 粒子（デーン粒子）。ヒトＢ型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルス科のメンバー であり、ウッドチャック肝炎ウイルス（WHV）、カモ肝炎ウイルス（DHV）、およ びハタリス肝炎ウイルス（GHV）を含む近縁種を有する（Robinson(1990)）。レ トロウイルスのように、ヘパドナウイルスはその3.2kbのDNAゲノムの逆転写を利 用する（Pugh(1990)）。Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムは、環状かつ部分的に１本鎖 であり、不完全なプラス鎖を含有する。不完全なプラス鎖は、ビリオン中でDNA ポリメラーゼと複合体化する。DNAポリメラーゼは完全なマイナス鎖をテンプレ ートとして用いてプラス鎖を伸張することが示されている。これらの形態学的お よび構造的特性は、Ｂ型肝炎ウイルスと全ての既知のクラスのDNA含有ウイルス とを区別する。 Ｂ型肝炎ウイルスの複製サイクルはまた、他のDNA含有ウイルスとは著しく異 なり、そしてRNA含有レトロウイルスとの近い関係を示唆する。主な珍しい特性 は、DNAゲノムの複製において中間体としてゲノムのRNAコピーを用いることであ る。感染しているDNAゲノムは、２本鎖形態に変換され、これは、RNAの転写のテ ンプレートとして働く。多数のRNA転写物が、各々の感染ゲノムから合成され、 メッセンジャー機能またはDNA複製機能のいずれかを有する。後者は、「プレゲ ノム」と呼ばれ、子孫のDNAゲノムの前駆体である。なぜならば、それらはヌク レオキャプシドコア中に集められ、そしてコーティングおよび細胞からの輸送の 前にDNAに逆転写されるからである。従って、各々の成熟ビリオンは、RNAプレゲ ノムのDNAコピーおよびDNAポリメラーゼを含む。 合成されるべき最初のDNAは、マイナス鎖の極性のDNAであり、そしてウイルス 遺伝地図上の独特の部位で始まる。非常に小さな発生期のDNAマイナス鎖（30ヌ クレオチド未満）は、タンパク質に共有結合し、そしてマイナス鎖DNA合成のた めのプライマーとして作用するようである。マイナス鎖DNAの成長は、産物が、R NA:DNAハイブリッドよりもむしろ完全長１本鎖DNAであるように、プレゲノムの 同等の分解を伴う。プラス鎖DNA合成は、マイナス鎖の完了後にのみ観察されて おり、そしてマイナス鎖の5'末端の近くの独特の部位で始まる。プラス鎖の完全 な伸張は、ヌクレオキャプシドコアのコーティングおよび輸送のための必要条件 ではない。従ってほとんどの細胞外ビリオンは、そのゲノム中に不完全なプラス 鎖および大きな１本鎖ギャップを含む。肝炎ウイルスゲノムは自律性であり、そ してその複製のためにDNAからDNAへの経路を利用しないので、そのゲノムの継続 的な細胞内複製はウイルスの維持に不可欠である。 ウイルスエンベロープを形成するＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）は、ウ イルスのプレS1、プレS2、およびＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドであ る。主要なタンパク質は、2.1kbサブゲノムメッセージ由来の226アミノ酸のＳ遺 伝子産物である。 III．急性前骨髄球性白血病（APL） 成人の急性骨髄芽球性白血病（AML）の約10％が急性前骨髄球性白血病（APL， French American British Classification（FAB）M3、Warrellら、New England J．Med.，329:177-189(1993)を概説として参照のこと）である。この疾患は、代 表的には化学療法によりしばしば悪化する出血体質とともに現れ、主に頭蓋内の 出血による高い早期死亡率を導く。出血体質は、凝血促進物質を放出する悪性の 前骨髄球の存在に起因する。これらは次に、凝固カスケードを活性化し、フィブ リノーゲン、凝固因子、および血小板を涸渇する。 従来の化学療法は、ほとんどの患者で完全な緩解を達成し得るが、５年生存の 平均は、35〜45パーセントに過ぎない。これらの数字には高度の早期死亡率は含 まれていない（Warrellら(1993)）。 APL患者のための治療の第２手段は、レチノイド（特に、全てのトランスレチ ノイン酸（ATRA;tretinoinTMとして市販される、Hoffman La Roche，Nutley，NJ ））の使用を含む。いくつかの公表された研究において、tretinoinTMは、処置 した患者の約48％において緩解を誘導し得ている（Warrellら(1993); Huangら、 Blood，72:567-572(1988); Castaigneら、Blood，76:1704-1709(1990); Warrell ら、New Engl．J．Med.，324:1385-1393(1991); Cheson，New England J．Med. ，327:422-424(1992)）。しかし、緩解の持続期間は短く（平均で3.5カ月）、こ の後、患者はレチノイドに対して獲得抵抗性を示す。この抵抗性は、おそらく、 シトクロームP-450酵素の誘導および細胞のレチノイン酸結合タンパク質の増加 した発現による、血流からの薬物の増加したクリアランスによって説明される。 レチノイド処置と従来の化学療法との組み合わせは、現在活発に追跡され、最初 の結果は60〜70％の回復を示している（Cheson，New England J．Med.，327:422 -424(1992)）。 APLは、第15染色体の長腕と第17染色体の長腕との間の釣り合いのとれた、か つ交換的な転座によって特徴付けられるランダムでない染色体異常（t(15:17)） と一貫して関連しており、これは、患者由来のAPL細胞の90％より多くで見出さ (1991); Pandolfiら、Oncogene，6:1285-1292(1991); Changら、Mol．Cell．Bio l.，12:800-810，(1992)）。この転座は、レチノイン酸レセプター遺伝子（RAR α）と推定の転写因子PMLの遺伝子との間の融合をもたらす。この融合産物であ る、PML-RARαは、野生型のRARα遺伝子産物（これは、レチノイン酸(RA)に応答 して転写エンハンサーとして作用する）と比較して変化したトランス活性化特性 (1991); Pandolfiら、Oncogene，6:1285-1292(1991)）。ATRAがインビボ（Warre llら、New England J．Med.，329:177-189，(1991)）および培養細胞内（Lanott eら、Blood，77:1080-1086，(1991)）の両方で白血病細胞の成熟を誘導すること が示されており、レチノイドの臨床効果を説明している。このレチノイン酸（RA ）反応性は、PML-RARα遺伝子産物の存在と密に関連している（Lanotteら、Bloo d，77:1080-1086，(1991); Millerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:2694-2 698(1992)）。これらおよび他の知見（Grignaniら、Cell，74:423-431(1993)） から、PML-RARαが優性のネガティブ変異として機能し、その産物が、骨髄分化 をブロックすると仮定される。APLの病因におけるPML-RARαタンパク質の関与に ついての証拠は、U937細胞におけるその発現により提供される。これは、分化に おけるブロック、RAへの感受性の増大、および培養培地中の制限血清の存在下で の増加した細胞生存をもたらす（Grignaniら、Cell，74:423-431(1993)）。 実質的に全てのAPL患者が、上記のt(15;17)転座を有する未成熟な前骨髄球を 示す。分子レベルでのこの転座の正確な位置は重要である。なぜならば、異なる 配列が融合接合点で生成されるからである。一連のAPL患者の研究により、種々 のPML-RARα転写物の中で高度な不均一性が存在することが示されている（Mille rら、Proc．Natl．Acad．Sci USA，89:2694-2698(1992); Pandolfiら、EMBO J. ，11:1397-1407(1992)）。変異性の３つの原因が存在する：(1)mRNAのPML側にお けるオルタナティブなスプライシング、(2)PML-RARα側（転写物の3'末端）にお けるオルタナティブなポリアデニル化部位、および(3)様々な融合点。多数のAPL の症例の研究により、第17染色体の切断点は常にRARα配列のイントロン２の内 部に位置することが示されている（Millerら、Proc．Natl．Acad．Sci USA，89: 2694-2698(1992); Pandolfiら、EMBO J.，11:1397-1407(1992)）。これは、PML- RARα転写物の全ての変異体に同じRARα配列の存在をもたらす。PML遺伝子にお ける第15染色体の切断点は、その代わりに、bcr1、bcr2、およびbcr3と定義され る３つの異なる領域に集中する（Pandolfiら、EMBO J.，11:1397-1407(1992)） 。bcr1領域は、PML遺伝子のイントロン６の全長にわたり、そしてこの切断点を 含む転座は、成熟mRNAの生成をもたらす。このmRNA中で、PMLのエクソン６およ びRARαのエクソン３は一緒にスプライシングされる。bcr2領域は、PMLのイント ロン４、エクソン５、イントロン５、およびエクソン６の小さな部分を含む領域 にわたる。この切断点に関与する転座は、本質的に互いに異なり、そしてそれら の多くはPMLエクソンの内部で起こり、融合配列に広範な変異を生じ、そして時 折異常型のリーディングフレーム（これは異常でかつ端の切断されたタンパク質 をコードする）を生成する。bcr3領域はPMLのイントロン３内に位置し、そして 常にPMLのエクソン３とRARαのエクソン３とが一緒にスプライシングされるmRNA をもたらす。融合接合点中の配列は、全てのbcr3の症例で同一である。ひとまと めにして考えると、bcr1およびbcr3型の接合点は試験されたAPLの症例の少なく とも80パーセントの原因であり（Pandolfiら、EMBO J.，11:1397-1407(1992)） 、１つの研究はbcr1型接合点がbcr3型接合点の２倍の割合であることを見出して いる（Millerら、Proc．Natl．Acad．Sci USA，89:694-2698(1992)）。 他の転座性ガン 多くの他のガンが、染色体の転座により生じるか、またはそれに関連している ことが文献中に報告されている。例として、Ｔ細胞急性白血病および赤血球生成 におけるRBTN2およびt[11;14][p13;q11]、リンパ球様新生物におけるトランスリ ン（translin）、急性リンパ芽球性白血病におけるT[5;14][q34;q11]、濾胞性リ ンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病におけるT14;18染色体転座；ヒト滑膜 肉腫におけるT18転座；バーキットリンパ腫；ユーイング肉腫におけるt[11;22][ q24;q12]転座；ヒト小細胞肺癌腫におけるt[3p;6p]およびt[12q;17p]転座；およ び播種性縦隔癌腫におけるt[15;19]転座が挙げられる。転座を有する細胞を選択 的に殺傷するかまたは不活性化する治療剤が設計され得る場合、これらの症例の 多くで、融合物の転写産物または融合物それ自体は、治療の標的を意味する。 従って、本発明の目的は、ウイルス性疾患および異常な転写産物が関与する疾 患の処置を目標とする治療薬、およびその使用方法を提供することである。 本発明の別の目的は、ヌクレアーゼ分解に対して増強した耐性を有するRNAse Pに対する修飾した外部ガイド配列を提供することである。 本発明の別の目的は、RNAse Pに対する修飾した外部ガイド配列によって媒介 される標的RNA分子の切断方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、肝炎に対して特異的に標的化されたRNAse Pに対す る外部ガイド配列、このような外部ガイド配列をコードするベクター、およびそ れらの使用方法を提供することである。 発明の要旨 真核生物RNAse Pに対する外部ガイド配列（EGS）分子を、標的RNAの効果的か つ特異的な切断を標的化するために操作する。RNAse Pに対する外部ガイド配列 の、肝炎ウイルスRNAへの選択的な結合、およびそのRNAse P媒介性切断の促進を 可能にする特定のヌクレオチド配列を含む操作されたRNA分子が設計され、そし て合成される。修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド結合を有するこれら の操作されたRNA分子の修飾型を、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を増強するた めに設計する。特定の領域を修飾して、RNAse P標的化活性を維持しながら増強 された安定性を達成する。実施例は、肝炎ウイルスRNAに結合し、そしてそのRNA se P切断を促進するRNAse Pに対するEGS分子を構築したことを証明する。構築物 スクリーニングの目的のためのEGSの活性の決定方法、ならびにこのようなRNA分 子を使用し、そして産生するための方法もまた開示される。 図面の簡単な説明 図１は、配列番号４のヌクレオチド配列および特異的領域の化学的修飾を有す るEGSの構造の図である。 図２は、配列番号２のヌクレオチド配列、および配列番号１のヌクレオチド配 列を有する短いモデル標的RNAを有するEGSの構造の図である。この２つのオリゴ ヌクレオチドを、RNAse−Ｐ様構造を形成する塩基対を示すために並べる。RNAse P切断部位を矢印で示す。 図３は、配列番号２のヌクレオチド配列(INNO-102、INNO-108、INNO-109、INN O-110、およびINNO-111)、または配列番号３のヌクレオチド配列（INNO-139）を 有するEGSの構造の図を示す。2'-O-メチル化修飾を含有するヌクレオチドを下線 で示す。 図４は、図３で示すEGS分子の切断効率のグラフである。 図５は、配列番号２のヌクレオチド配列を有する種々のEGS分子の相対RNAse P 切断効率（％）のグラフである。INNO-102（wt）を除くアッセイした全てのEGS 分子は、両方の認識アーム（可変ループおよびＴステム）において完全に2-O-メ チル化修飾された。各EGSに対するさらなる修飾は、対応する棒グラフの下に示 す。2'-O-メチル化修飾を下線で示す。5'ホスホロチオエート基を有するヌクレ オチドを略図（outline text）と共に示す。 図６は、配列番号３のヌクレオチド配列を有する種々のEGS分子の相対RNAse P 切断効率（％）のグラフである。各EGSに対する修飾を対応する棒グラフの下に 図で示す。未修飾領域を図中に最も太い線で示す。2'-O-メチル化修飾のみを有 する領域を図中に次に細い線で示す。5'-ホスホロチオネート基のみを有する領 域を図中の次に太い線で示す。2'-O-メチル化修飾および5'ホスホロチオエート 基の両方を有する領域を図中で最も太い線で示す。 図７は、ウシ胎児血清アッセイにおける修飾されたEGS分子の安定性を示す表 である。各EGSについて、相対切断活性（％）およびアッセイにおける半減期を 示す。各EGSに対する修飾は、対応する表の見出しの下に図で示す。未修飾領域 を図中で最も細い線で示す。2'-O-メチル化修飾のみを有する領域を図中に次に 太い線で示す。5'-ホスホロチオネート基のみを有する領域を図中の次に太い線 で示す。2'-O-メチル化修飾および5'ホスホロチオエート基の両方を有する領域 を図中で最も太い線で示す。 図８は、全RNAおよび化学的に修飾されたEGS分子による2.1kb HBV転写産物のR NAse P−媒介性切断アッセイを示す図である。各EGSに対する修飾を対応するゲ ルレーンの下に示す。 図９は、配列番号５のヌクレオチド配列、および特定の領域における化学的修 飾を有するEGSの構造の図である。 図10は、配列番号６のヌクレオチド配列、および特定の領域における化学的修 飾を有するEGSの構造の図である。 図11は、配列番号４のヌクレオチド配列、および特定の領域における化学的修 飾を有するEGSの構造の図である。 図12は、配列番号７のヌクレオチド配列、および特定の領域における化学的修 飾を有するEGSの構造の図である。 図13a、13b、13c、および13dは、PML RAR融合接合点に対して標的化される外 部ガイド配列の構造および配列である。図13aは、EGS APL A20（標的APL RNAは 、配列番号10の７〜24ヌクレオチドである；EGS APL A20は、配列番号11である ）；図13bは、不活性コントロールA20D（配列番号11からヌクレオチド22と23を 引く）である；図13cは、EGS APL 1009（標的APL RNAは、配列番号10のヌクレオ チド６〜22である；EGS APL 1009は配列番号12である）；図13dは、不活性なコ ントロールAPL 1017（配列番号11からヌクレオチド14、17、18、29を引く）であ る。 図14aおよび14bは、APL標的EGS A20（図14a）および不活性コントロールEGS（ 図14b）について、濃度10μM（黒四角）、９μM（白四角）、８μM（黒菱形）、 ７μM（白菱形）、６μM（黒三角）、５μM（白三角）、４μM（黒丸）、３μM （白丸）、２μM（×）、および１μM（＊）で、経時的（日数）に光学密度（す なわち、細胞数）をプロットした細胞増殖の阻害についてのMTTアッセイのグラ フである。 図15aおよび15bは、APL標的EGS 1009（図15a）および不活性コントロールEGS （図15b）について、濃度10μM（黒四角）、９μM（白四角）、８μM（黒菱形） 、７μM（白菱形）、６μM（黒三角）、５μM（白三角）、４μM（黒丸）、３μ M（白丸）、２μM（×）、および１μM（＊）で、経時的（日数）に光学密度（ すなわち、細胞数）をプロットした細胞増殖の阻害についてのMTTアッセイのグ ラフである。 図16は、切断アッセイにおけるEGS分子の反転を示すグラフである。グラフは 、インキュベーション時間に対するHBV基質切断のパーセントをプロットする。 図17は、HBVに対して指向するEGS分子の名前およびヌクレオチド配列を示す表 であり、化学的修飾を含む。配列中の［Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、および「Ｕ」（ 標準型）は、2'-O-メチルリボヌクレオチドを示す。［Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、 および「Ｕ」（イタリック型）は、リボヌクレオチドを示す。ヌクレオチド間の 小文字の「ｓ」は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示す。ヌクレオ チド間の他の全ての結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかのEGS配列 の末端の名称「T(3'-3')-5'」は、3'-3'結合を介して接着されたチミジンヌクレ オチドを示し、従って、これらのEGS上の第２の5'末端を切断する。EGS配列は、 上から下に向かって、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列 番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列 番号24、および配列番号25である。 図18は、HBVを標的化する化学的に修飾されたEGSの抗ウイルス活性を示す表で ある。左欄は各EGSの名称を示し、中央欄は各EGSについて決定したμM中のEC50 を示し、そして右欄は各EGSにより標的化されるHBVゲノムにおける切断部位を示 す。最後の列は、潜在的な抗HBVヌクレオシドアナログ2'-3'-ddCのEC50を示す。 図19は、HBV RNA中のそれらの標的配列にハイブリダイズされるEGS分子（EGS2 およびEGS 2A）のヌクレオチド配列および構造を示す図である。切断部位でのヌ クレオチドを番号を付けた矢印で示す。ステム構造の隣の番号は、ステム内に含 まれる塩基対の番号を示す。 図20は、HBV RNA中のそれぞれの標的配列にハイブリダイズされるEGS分子（EG S 62およびEGS 62A）のヌクレオチド配列および構造を示す図である。切断部位 のヌクレオチドを番号を付けた矢印で示す。ステム構造の隣の番号は、ステム内 に含まれる塩基対の番号を示す。 図21は、インビボでEGS分子を発現するためのpol IIIプロモーターベースのベ クターの構造を示す図である。このベクターは、エプスタインバールウイルス（ EBV）ベースベクター中に挿入されたヒトU6 RNAのpol IIIプロモーター（hU6P） に作動可能に連結されたEGS分子をコードする領域を有する。 図22は、HBV RNA中のその標的配列にハイブリダイズされるEGS分子（EGS 62B ）のヌクレオチド配列および構造を示す概略図である。切断部位のヌクレオチド を番号を付けた矢印で示す。ステム構造の隣の番号は、ステム内に含まれる塩基 対の番号を示す。 図23は、pol IIIプロモーター由来のEGS発現ベクターで一過的に感染させたHe pG2.2.15細胞により産生されるHBVの相対量を示すグラフである。各棒の先端の パーセントは、EGSを発現しないベクターを用いて感染させた細胞により産生さ れる量に対する産生されるHBVの割合である。 発明の詳細な説明 標的RNA分子の切断を促進するために適切なRNA分子を構築した。RNA分子は、R NAse Pの外部ガイド配列（EGS）分子であり、これは、標的RNA分子に特異的に結 合し、そしてRNAse P媒介性切断を促進するように、およびヌクレアーゼ耐性を 増強するように設計された。Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置において使用するため に適切なRNA分子を構築した。 Ｉ．EGS分子の設計および合成 EGS分子は、真核生物のRNAse Pの前駆体tRNAの天然の切断部位に類似した二次 構造および三次構造を形成する標的基質に結合する合成オリゴヌクレオチドであ る。EGS分子がRNAse P活性を標的化する能力は、以下により詳細に記載するよう に、肝炎RNA配列のRNAse Pによる切断についてのインビトロ活性アッセイを用い て、容易に決定される。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を有するEGS 分子の場合、安定アッセイにより種々のタイプの修飾のヌクレアーゼ耐性の決定 が可能になる。活性アッセイは、異なる修飾を有するEGSにより媒介されるRNAse P切断の効率の比較を可能にする。ならびに、アッセイは修飾されたEGS分子の安 定性および切断効率を至適化および平衡化するために使用される。 ウイルス疾患およびガンの処置において使用するために適切である例示のEGS 分子を構築した。特異的標的はＢ型肝炎ウイルスであり、より詳細には、RNAを コードするＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）であった。HBsAgがウイルス表面構造およ び感染において不可欠な役割を果たすので、EGSベースの治療は、HBsAg mRNA切 断を介して肝炎をダウンレギュレートするために使用され得る。Ｂ型肝炎RNA内 の好ましい標的部位または他の標的RNAは、標的RNAの全ての形態において現れる 保存配列の領域である。このような好ましい２つの部位は、Ｂ型肝炎RNAのHBsAg コード領域内で同定され、そして配列番号５および配列番号６において示すヌク レオチド塩基配列を有するEGS分子により標的化される。 EGS分子および公知の配列を有するEGS分子をコードするDNA配列を生成または 合成する方法は、自動化核酸合成を用いて（例えば、Applied Biosystems，Inc. （Foster City，CA）より提供されるDNA392型合成機またはPharmacia Oligo Pil ot（Pharmacia，Piscataway，NJ）でのシアノエチルホスホルアミダイト法（cya noethyl phosphoramidite method）を用いる）現在は日常的である。核酸分子を 合成する他の方法がまた利用され得る（例えば、Ikutaら、Ann．Rev．Biochem． 53: 323-356(1984)(ホスホトリエステル法およびホスフェイト（Phoshite）−ト リエステル法)；Narangら、Methods Enzymol．65:610-620(1980)(リン酸トリエ ステル法)を参照のこと）。あるいは、EGS分子は、例えば、T7 RNAポリメラーゼ を用いてDNAテンプレートの転写により合成され得る（Milliganら、Nucl Acids Res．15:8783(1987)）。EGS分子はまた、EGSをコードし、そして細胞内でEGSを 発現するベクターを細胞内に置くことにより合成され得る。 Ａ.EGS分子の活性 無制限の量のRNAse P存在下で、種々の量の操作されたEGSとともにインキュベ ーションした後に残存する基質RNAのパーセントを測定するインビトロ切断アッ セイは、EGS/RNAse P複合体の潜在的な活性の指標として使用される。最も高い インビトロ活性を示すEGS/RNAse P複合体を、さらなる試験のために選択する。 残存するRNAのパーセントは、EGS濃度の関数としてプロットされ得る。EGS/RNAs e Pの触媒効率は、kcat/Km（ここでkcatは切断の速度定数であり、そしてKmはミ カエリス定数である）、遊離のEGSおよび基質RNA分子の反応に対する二次速度定 数として表され得る。HeidenreichおよびEcksteinの方法（J．Biol．Chem.，267 :1904-1990(1992)）によれば、kcat/Kmが式 −lnF/t＝（kcat/Km）[C] を用いて決定され、ここでＦは、残存基質の画分であり、ｔは反応時間であり、 そして[C]はEGS濃度である。 好ましいEGS構築物は、肝炎基質RNAに結合し、そして優先的にRNAse P切断を 促進する構築物である。好ましい構築物は、実施例１に記載のリボザイム切断ア ッセイを用い、そして、上記のkcat/Km値により決定されるように、どの構築物 が肝炎基質RNA配列の特異的RNAse P切断を媒介するのに最も効果的であるかを決 定して選択され得る。 Ｂ．EGS分子の構築 EGS分子は、pre-tRNA分子（pre-tRNATyr）の塩基構造の適用、および例えば、 本明細書中で参考として援用されるWO92/03566に記載の基質認識配列の付加によ り設計され得る。例えば、標的配列に相補的な配列は、アミノアシルアクセプタ ーステムおよびＤステムの配列を置換し得る。このような置換配列は、認識アー ムと呼ばれる。アミノアシルアクセプターステムに対応する認識アームは、Ａ認 識アームと呼ばれ、そしてＤステムに対応する認識アームはＤ認識アームと呼ば れる。tRNA配列および構造エレメントに対応する残りの配列は、切断標的配列と 呼ばれる。認識アームの配列は選択され、所望の切断部位の標的RNAの極めて近 い3'の配列に特異的に相補的な領域を有する。認識アームの配列は、標的配列の 相補的な領域が、互いに隣接するが、対にならない小さな領域により分けられる ように選択される。関連の例を図２に示す。認識アームは、機能的なEGS分子を 生じる任意の長さであり得る。一般に、3'-末端認識アームは、少なくとも７ヌ クレオチド長であるべきであり、そして少なくとも７ヌクレオチド長の標的RNA 分子に相補的な領域を有するべきである。 認識アームに加えて、機能的EGS分子は、前駆体tRNAのＴステムおよびループ に対応する構造のみを必要とすることが見出されている。従って、機能的EGS分 子は、切断標的配列としてＴステムおよびループのみが必要である。EGS分子の Ｔステムおよびループは、機能的EGS分子（すなわち、標的RNA分子のRNAse P切 断を媒介するEGS分子）を生じる任意の長さまたは任意の配列であり得る。６、 ７、および８ヌクレオチドのループ長を有するEGS分子が機能的である。Ｔルー プにおいて制限された配列変化を有するEGS分子は、tRNA Ｔループ配列中に見出 される変異を越えて変化し、EGS機能はまた保持される。４、５、および６塩基 対のステム長を有するEGS分子は、機能的であると期待される。好ましいＴステ ムおよびループ配列（配列番号４のヌクレオチド７〜23）を図１に示す。また、 tRNA分子中のＤステムとＴステムとの間に現れる過剰のループ、または可変ルー プは、EGSの機能に必要ではないことが開示された。 従って、本明細書中に記載されるEGS分子は、標的配列に相補的な、Ｔステム およびループの5'および3'末端に付着する２つの認識アームのみを必要とする。 EGS分子はまた、Ｄループまたは3'-末端NCCA配列のようなtRNA前駆体分子におい て見出される配列および構造に対応するさらなる配列および構造を含み得る。こ のような付加的な配列および構造は、切断標的配列の一部であると考えられる。 EGS分子はまた、標的配列に相補的ではない遠位の末端およびtRNA構造に関連し ない遠位の末端の、いずれかまたは両方を含み得る。このような配列は、認識配 列または切断標的配列のいずれかの一部であるとは考えられない。 EGS分子は、Yuanら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:8006-8010(1992)に記 載されるアッセイまたは上記のアッセイを用いて、RNAse Pにより標的化RNA切断 を促進する能力について容易にスクリーニングされ得る。 EGSおよびRNAse Pの触媒RNAサブユニットは結合され、EGSの標的化機能および RNase P触媒RNAの切断機能の両方を保有する単一のオリゴヌクレオチド分子を形 成し得る。単一のオリゴヌクレオチド分子におけるこのような組み合わせは、RN Ase P内部ガイド配列（RIGS）と呼ばれる。RIGSは、EGSと同じ様式で標的RNA分 子を分解するために用いられ得る。 RIGSは、任意の適切な手段によりガイド配列をRNAse P触媒配列へ連結するこ とにより形成され得る。例えば、EGSおよびRNase P触媒RNAは、分離分子として 調製され得、次いでインビトロにおいて共有結合される。あるいは、完全なRIGS は、化学合成によるか、あるいは連結されたEGSおよびRNAse P触媒配列をコード するDNA分子のインビトロまたはインビボ転写によるかのいずれかで、単一の分 子として合成され得る。EGSとRIGSのRNase Pドメインとの間の連結は、ドメイン が標的RNAを切断することを可能にする任意の形態を有し得る。例えば、２つの ドメインは、オリゴヌクレオチドリンカーにより接合され得る。好ましくは、リ ンカーは、ホスホジエステル結合により接合された通常のヌクレオチドからなる 。EGSおよびRNAse P触媒配列成分は、EGS成分の3'末端または5'末端のいずれか に連結されたRNase P触媒配列と、いずれかの順で連結され得る。RIGSの構築方 法および使用方法は、Yale UniversityによるPCT出願番号WO95/24489に記載され る。 EGS分子はまた、調節可能であり得る。調節可能なEGS分子は、上記のようにリ ガンド結合配列に連結され、このリガンドの制御下にEGS分子の活性をおき、お よび活性または不活性のためのリガンドの存在を必要とする、EGS配列である。R NA分子は、ある部分がリガンドに結合し得、そして他の部分がEGS配列であるよ うに構築される。リガンドに結合する分子を選択した後、リガンド結合分子を、 リガンドまたは「co-drug」の存在下または非存在下においてその触媒機能につ いてアッセイする第２の選択プロセスを行う。この手段では調節可能なEGS分子 は、リガンドの存在下における標的RNAの切断、またはリガンドの非存在下にお ける標的RNAの切断において使用するために選択される。 この方法および調節可能なEGS分子は、制御様式での標的RNA分子の切断におい て有用である。これは、これらのRNA分子の完全な不活性化により宿主細胞を殺 傷することが望ましくない細胞内に標的RNA分子が存在する場合、特に有用であ る。調節可能なEGS分子の形態、選択、および使用は、本明細書中で参照として 援用されるPCT出願番号WO94/13791および同WO94/13833に十分に記載される。 II．ヌクレアーゼ耐性EGS分子 Ａ．修飾のタイプ 非修飾オリゴリボヌクレオチドは、無ヌクレアーゼ環境において有効なEGSと して機能し得るが、血清および細胞内における短い半減期は、治療物としてのそ の有効性を低下させる。RNA標的のRNaseP媒介性切断を誘導するその生物学的機 能を弱めることなく、EGSのヌクレアーゼ耐性を大いに増大させる化学修飾がな され得る。例えば、EGS構築物の１つ以上の塩基は、利用可能な核酸合成法を用 いて（例えば、Offenspergerら、EMBO J.,12:1257-1262(1993);Rosenbergらによ るWO93/01286（スルフルチオエートオリゴヌクレオチドの合成）;Agrawalら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA,85:7079-7083(1988);Sarinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85:7448-7794(1989);Shawら、Nucleic Acids Res,19:747-750(1991)(３'末端ホ スホロアミデート修飾を含む３'エキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの 合成)を参照のこと;参考として本明細書中に援用される）、２'メトキシリボヌ クレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド、またはホスホロチ オエートリボヌクレオチドに置き換えられ得る。 オリゴヌクレオチドアナログの分解が主に３'エキソヌクレアーゼに帰因する ことは、最新の文献で十分に証明されている。いくつかの研究はまた、種々の３ '修飾がこれらのアナログのヌクレアーゼ感受性を大いに減少させ得ることを証 明している。従って、３'エキソヌクレアーゼに対する感受性を低下させる別の 方法は、EGS分子の３'末端水酸基への遊離アミンの導入である（例えば、Orson ら、Nucl.Acids Res.,19:3435-3441(1991)を参照のこと）。別の有用な３'末端 修飾は、３'と３'との結合を用いて、EGSの３'末端にチミンヌクレオチドを結合 することである。このような構造は、本明細書において３'-３'-チミンヌクレオ チドまたはＴ(３'-３')という。細胞内ヌクレアーゼに対する核酸分子の感受性 を低下させるためにのさらなる有用な修飾は、配列中に存在し得るシトシン塩基 のメチル化、およびインターカレート剤（例えば、アクリジン誘導体）の５'末 端リン酸への共有結合（例えば、ペンタメチレン架橋を用いる）を含む(例えばM aherら、Science,245:725-730(1989);Grigorievら、J.Biol.Chem.,267:3389-339 5(1992)を参照のこと)。 有用であることが期待される化学修飾の別のクラスは、ヌクレオチドのリボー ス部分の２'OH基の修飾である。この２'OH基は、種々の細胞内および細胞外ヌク レアーゼの活性に重要であることが示されている。代表的な２'修飾は、２'-O- メチルオリゴヌクレオチド(Paolellaら、EMBO J.,11:1913-1919,1992)および２' -フルオロおよび２'-アミノ-オリゴヌクレオチド（Piekenら、Science,253:314- 317(1991);HeidenreichおよびEckstain,J.Biol.Chem,267:1904-1909(1992)の合 成である。ヌクレアーゼ耐性EGS構築物の例は、図３および図６に示される。EGS 分子の部分はまた、デオキシリボヌクレオチドを含み得る。このような置換は、 重要な２'OH基を除去することによりヌクレアーゼ耐性を改善する。 Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.によるWO95/23225は、リボザイムの安定性を 増大するための化学修飾（例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド糖の５'炭 素でのアルキル基の導入）を記載する。このような修飾はまた、EGS分子に使用 され得る。アルキル基は、飽和脂肪族炭化水素（直鎖、分枝鎖、および環状アル キル基を含む）をいう。このようなアルキル基は１〜12個の炭素を有することが 好ましい。WO95/23225はまた、オリゴヌクレオチドの安定性を増大するために存 在し得る２'-デオキシ-２'アルキルヌクレオチドを記載する。例えば、そのヌク レオチドが機能には必須ではない所に存在する糖分子の２'位にアルキル部分を 有するオリゴヌクレオチドは、さらに安定である。WO95/23225はまた、３'およ び/または５'ジハロホスホネート置換ヌクレオチド（例えば、３'および/または ５'-CF2ホスホネート置換ヌクレオチド）の使用を記載する。このようなヌクレ オチドは、そのヌクレアーゼ耐性を増大するようにEGS分子において使用され得 る。 このような修飾が、修飾EGS分子が標的RNAのリボザイム媒介切断を促進する効 率に影響する程度は、上記の切断アッセイを用いて容易に決定され得る。 Ｂ．キメラEGS分子 上記の修飾が、EGS分子の限定した領域においておよび/または組み合わせて使 用され、修飾EGS分子のキメラを生じ得る。EGS分子の特定の領域は、活性な三次 元構造を形成する適切なヌクレオチド相互作用の必要性のため、他の領域より修 飾を受け入れやすい。例えば、２'-O-メチル修飾ヌクレオチドおよびホスホロチ オエート結合の組み込みは、著しいRNAseP標的化活性の損失なく、EGSの特定の 領域に導入され得ることが見出された。２'-O-メチルリボヌクレオチドは、標的 配列に相補的な配列、およびＴステムにおける任意のヌクレオチドを置換し得る こともまた見出された。Ｔループにおける一部のヌクレオチドのみが、リボザイ ム切断に著しく影響することなく２'-O-メチルヌクレオチドを置換し得る。最大 のリボザイム切断活性のために、EGS分子のＴループ部分における全てのヌクレ オチドは、非修飾リボヌクレオチドまたはホスホロチオエート結合を有するリボ ヌクレオチドのいずれかを含むことが好ましい。実施例２、３、および５は、可 能な修飾の組合せおよび好ましい修飾ヌクレオチドの配置を例示する。 修飾が、修飾EGS分子が標的RNAのRNAseP媒介切断を促進する効率に影響する程 度は、上記の切断アッセイを用いて容易に決定され得る。化学的に修飾されたEG S分子は、非修飾EGS（すなわち、修飾EGSと同一のヌクレオチド配列を有するが 、非修飾リボヌクレオチド、非修飾ホスホジエステル結合、および非修飾３'お よび５'末端からなるEGS分子）によって媒介されるリボザイム切断活性と比較さ れる場合、修飾EGSによって媒介されるリボザイム切断活性のレベルに従って分 類され得る。この比較は、修飾EGS分子により媒介される相対的なリボザイム切 断活性を提供する。この活性は、好ましくは非修飾EGS分子により媒介されるリ ボザイム切断活性のパーセントとして表される。修飾EGS分子は、これらの活性 レベルに基づいてクラスに分けられ得る。ここで、修飾EGS分子は、例えば４つ のクラスに分けられ得る：(1)非修飾EGSにより媒介されるリボザイム切断活性の 70％より高い活性を媒介する修飾EGS分子、(2)非修飾EGSにより媒介されるリボ ザイム切断活性の50％〜70％を媒介する修飾EGS分子、(3)非修飾EGSにより媒介 されるリボザイム切断活性の25％〜50％を媒介する修飾EGS分子、(4)非修飾EGS により媒介されるリボザイム切断活性の25％未満を媒介する修飾EGS分子。好ま しい修飾EGS分子は、非修飾EGSにより媒介されるリボザイム切断活性の少なくと も25％を媒介する。より好ましいEGS分子は、非修飾EGSにより媒介されるリボザ イム切断活性の少なくとも50％を媒介する。最も好ましいEGS分子は、非修飾EGS により媒介されるリボザイム切断活性の少なくとも70％を媒介する。 III．クローン化および発現ベクター 哺乳動物細胞にEGS分子を導入するための好ましいベクターは、レトロウイル スのようなウイルスベクターを含む。このウイルスベクターは核に直接EGS分子 をコードするDNAを導入し、次いで核においてこのDNAは転写され、コードされる EGS分子を産生する。 遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許 第4,868,116号および同第4,980,286号；PCT出願WO 90/02806および同WO 89/0713 6;ならびにMulligan,Science 260:926-932(1993)に記載される；これらの教示は 本明細書中に参考として援用される。 宿主染色体にDNAの形態でそれ自体のRNA配列を組み込む、欠陥レトロウイルス ベクターは、宿主の細胞にEGSを組み込むように操作され得る。ここでEGSのコピ ーが作製され、そして細胞質に放出されるか、または核中に保持され肝炎RNAの 標的ヌクレオチド配列と相互作用する。 骨髄幹細胞および造血細胞は、ヒトから比較的容易に取り出され、そして置換 され、そして移入された遺伝子の増殖のために自己再生する細胞集団を提供する 。このような細胞は、EGS分子をコードするレトロウイルスに基づくベクターを 用いて、インビトロまたはインビボでトランスフェクトされ得る。幹細胞のイン ビトロトランスフェクションが実施される場合、一旦トランスフェクトされた細 胞が特定のEGS分子を産生し始めると、この細胞は、EGSを発現する完全なクロー ン性細胞集団を樹立するために患者に戻され得、従ってウイルス感染、形質転換 、および他の疾患に耐性である。 一例として、構築物をコードするDNA配列をクローン化し、そして発現するた めに使用されるベクターは、以下のものを含み得る： １．発現されるべきEGS分子をコードするDNA配列を挿入するためのクローン化 部位。 ２．エピソーム（非組み込み）複製を可能にする哺乳動物複製起点（任意）（ 例えば、エプスタインバールウイルス由来の複製起点）。 ３．EGS構築物をコードするDNAの必要とされる量を産生するための細菌細胞に おいて機能する複製起点（例えば、pBR322プラスミドに由来する複製起点）。 ４．哺乳動物細胞において発現されるべきEGS構築物をコードする挿入されたD NA配列の転写を指向するプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、サ イトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター、または哺乳動物U6遺伝子の プロモーター（RNAポリメラーゼIIIプロモーター））。 ５．哺乳動物選択マーカー（任意）（例えば、ネオマイシンまたはハイグロマ イシン耐性）、これは構築物でトランスフェクトされる哺乳動物細胞の選択を可 能にする。 ６．細菌抗生物質耐性マーカー（例えば、ネオマイシンまたはアンピシリン耐 性）、これはプラスミドベクターで形質転換される細菌細胞の選択を可能にする 。 インビボでEGS分子を送達し、そして発現させるための好ましいベクターは、 発現のためにRNAポリメラーゼIII(pol III)プロモーターを使用する。図21は、 このようなベクターの一例の構造を示す。このようなプロモーターは、細胞型特 異的発現なしに、構成的に転写物を産生し得る。pol IIIプロモーターはまた、 多くの標的RNA分子の位置である、細胞の核に残存するように操作され得る転写 物を産生する。完全なpol III転写単位(pol IIIプロモーター、キャッピングシ グナル、および終結配列を含む)が使用されることが好ましい。pol IIIプロモー ター、および他のpol III転写シグナルは、tRNA遺伝子、5S RNA遺伝子、核内低 分子RNA遺伝子、および細胞質低分子RNA遺伝子に存在する。EGS発現ベクターに おける使用のための好ましいpol IIIプロモーターは、ヒト核内低分子U6遺伝子 プロモーターおよびtRNA遺伝子プロモーターである。インビボで短いRNA分子を 産生するためのU6遺伝子転写シグナルの使用は、Noonbergら、Nucleic Acids.Re s.22:2830-2836(1995)に記載され、そしてtRNA転写シグナルの使用は、Thompson ら、Nucleic Acids Res.,23:2259-2268(1995)に記載されており、両方とも参考 として本明細書に援用される。 多くのpol IIIプロモーターは、内在性である（すなわち転写単位内に存在す る）。従って、これらのpol III転写物はプロモーター配列を含む。EGS分子の発 現に有用であるために、これらのプロモーター配列は、EGSの構造または機能を 妨げるべきではない。EGS分子はtRNA分子に由来するので、tRNA遺伝子プロモー ター配列は、容易にEGS分子に組み込まれ得る。内在性のtRNA遺伝子プロモータ ーは、２つの部分すなわちＡボックスおよびＢボックスに存在する。tRNA分子に おいて、Ａボックス配列は、一般にtRNA分子のＤループおよびＤステムの半分に 存在し、そしてＢボックス配列は、一般にＴループおよびＴステム中の近位のヌ クレオチドに存在する。最小のEGS分子はＴステムおよびループ構造を維持し、 そしてＢボックス配列は、それらがtRNA分子のＴステムおよびループに組み込ま れるのと同様に、EGSのこの部分に組み込まれ得る。最小のEGSはＤループもＤス テムも必要としないので、Ａボックス配列は、EGS分子のいかなる機能的な構造 中にも存在する必要がない。例えば、Ａボックス配列は、ＡボックスとＢボック スとの間の適切な間隔が維持されるように、Ｄ認識アームの後で、EGSの５'末端 に追加され得る。 U6遺伝子プロモーターは、内在性ではない(KunkelおよびPederson,Nucleic Ac ids Res.18:7371-7379(1989);Kunkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8575-8579 (1987);Reddyら、J.Biol.Chem.262:75-81(1987))。EGS分子の発現に有用な適切 なpol IIIプロモーター系は、Hallら、Cell 29:3-5(1982)、Nielsenら、Nucleic Acids Res．21:3631-3636(1993)、FowlkesおよびShenk,Cell 22:405-413(1980) 、GuptaおよびReddy,Nucleic Acids Res.19:2073-2075(1990)、Kickoeferら、J. Biol.Chem.268:7868-7873(1993)、ならびにRomeroおよびBalckburn,Cell 67:343 -353(1991)により記載される。リボザイムの発現のためのpol IIIプロモーター の使用はまた、Ribozyme Pharmaceuticals,IncによるWO 95/23225に記載される 。 IV．治療 Ａ．薬学的組成物 EGS分子は、患者を処置するのに適切な薬学的組成物を形成するために、薬学 的に受容可能なキャリアと直接組み合わせて使用され得る。あるいは、EGSは、 特定のRNAに特異的なEGS分子をコードし、そして発現する配列を含むベクターを 介して送達され得る。 直接送達は、通常、脂質複合体（リポソーム）の援助を伴って、細胞膜と他の 分子（例えば、抗体または他の小さなリガンド）との交差を容易にして、標識化 を最大にするために、標的細胞内に予め合成したEGS分子を挿入することを包含 する。RNAは分解に対して感受性であるため、多くの場合、直接送達したEGS分子 を、上記のように化学的に修飾して、ヌクレアーゼ耐性にし得る。この送達方法 論は、治療用量のより正確なモニタリングを可能にする。 ベクター介在送達は、ベクター上に保有した配列中にコードされた大量のEGS を産生する、自己複製系または非複製系（例えば、修飾されたウイルスベクター またはプラスミド）を有する標的細胞の感染を包含する。細胞の標的化および侵 入のメカニズムは、ウイルスによって提供され得るか、または、プラスミドが使 用される場合、EGS分子の直接送達について記載された方法に類似の方法を使用 し得る。ベクター介在送達は、EGS分子の維持量を産生する。それは、実質的に 安価で、そして直接送達（例えば、EGS分子の静脈内注射）ほど頻繁な投与を必 要としない。 直接送達法は、感染の急性かつ重篤なステージの期間に使用され得る。好まし くは、静脈内注射または皮下注射が使用され、EGS分子を直接送達する。オリゴ ヌクレオチドの有効量が、意図する標的部位に到達する前のオリゴヌクレオチド の分解を最小限にする形態で送達されることが必須である。 最も好ましくは、薬学的キャリアは、EGSを、冒された細胞へ特異的に送達す る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞に作用し、従って、好適な薬学的キャリ アは、抗肝炎EGS分子を肝細胞に送達する。 Ｂ．EGS分子の送達 ２つの送達方法が使用され得、（１）合成EGS分子の送達、または（２）一過 性の様式におけるEGS分子を発現するベクターの送達である。選択の方法は、標 準的な方法論を用いて前臨床試験において決定され、そしてそれらは、組み合わ せて使用し得ることが可能である。それらの両方は、例えば、陽イオンリポソー ム調製を用いることにより、有効に送達され得る。 種々の非ベクター法は、EGS分子を細胞に送達するのに利用することができる 。例えば、一般に、EGS分子、またはEGS分子をコードするDNA配列は、マイクロ パーティクル内またはマイクロパーティクル上に組み込まれ得る。本明細書中で 使用されるように、マイクロパーティクルは、リポソーム、ビロソーム、マイク ロスフェア、およびマイクロカプセルを含み、合成および／または天然のポリマ ーから形成される。マイクロカプセルおよびマイクロスフェアを作製する方法は 、当業者において公知であり、そして溶媒蒸発、溶媒キャスティング、スプレー 乾燥、および溶媒拡張(solvent extention)が挙げられる。種々のマイクロパー ティクル内に組み込まれ得る有効なポリマーの例としては、ポリサッカライド、 ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリヒドロキシド、ならびにタンパク質およ び ペプチドが挙げられる。 リポソームは、標準的な方法（例えば、Kimら、Biochim.Biophys.Acta、728:3 39-348(1983);Liuら、Biochim,Biophys.Acta.、1104:95-101(1992)；およびLee ら、Biochim.Biophys.Acta.、1103-185-197(1992)；Wangら、Biochem.、28:9508 -9514(1989)）によって産生され得、これらは、本明細書中で参考として援用さ れる。EGS分子またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクル の調製の間にこの分子が存在する場合、リポソーム内でカプセル化され得る。簡 単に述べれば、有機溶媒に溶解した選択の脂質は、混合されそしてガラス管の底 で減圧下で乾燥される。この脂質フィルムをカプセル化されるべきEGS分子、EGS 分子をコードするDNAの水溶性緩衝化溶液を用いて再水和し、次いで、物質をカ プセル化する得られた水和脂質小胞またはリポソームは、遠心分離によって洗浄 され得、そして濾過され、そして４℃で保存され得る。この方法は、核酸分子を MOLT-3白血病細胞株の細胞の核および細胞質に送達するために使用されている（ ThierryおよびDritschilo、Nucl.Acids Res.、20:5691-5698(1992)）。あるいは 、EGS分子、またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクル内 に組み込まれ得るか、またはマイクロパーティクルの外側にイオン的または共有 的のいずれかで結合され得る。 陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、負電荷の化合物（例えば、こ れらのリポソームの正に荷電した外側の表面にイオン的に結合し得る核酸に基づ く化合物）を送達するのに特に有効なマイクロパーティクルである。種々の陽イ オンリポソームは、インビトロおよびインビボの両方において核酸または核酸− タンパク質複合体を細胞に送達する場合、非常に有効であることが示されており 、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7412-7417(1987);Felgner、Advance d Drug Delivery Reviews、5:163-187(1990)Clarencら,Anti-Cancer Drug Desig n、８:81-94(1993)（これらは、本明細書中で参考として援用される）によって 報告されている。陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、混合物から形 成されたリポソームまたはマイクロカプセルが、負電荷の化合物にイオン結合す る実効正電荷(net positive charge)を所有するように、十分な量の陽イオン側 鎖基を有する１つ以上の脂質を含む混合物を用いて調製され得る。陽イオンリポ ソームを産生するために使用され得る正電荷の脂質の例としては、アミノリピッ ドジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(PE)（これは正に荷電した一級 アミノ頭部(head group)を所有する）；ホスファチジルコリン(PC)(これは一級 アミンではない正に電荷した頭部を所有する)；そしてN[1-(2,3-ジオレイルオキ シ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（「DOTMA」、Felgnerら、Proc.Na tl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987);Felgnerら、Nature、337:387-388(1989) ;Felgne、Advanced Drug Delivery Reviews、5:163-187(1990)を参照のこと）が 挙げられる。 EGS分子の送達のために好適なマイクロパーティクルの形態は、ヘム運搬マイ クロパーティクルである。これらのマイクロパーティクルにおいて、ヘムは、マ イクロパーティクルの外側表面にインターカレートするかまたは共有結合する。 ヘム運搬マイクロパーティクルは、それらが、ヘム受容体を発現する細胞（例え ば、肝細胞）により優先的に結合し、そして取り込まれるため、有効用量に必要 な薬物または他の化合物の量を、著しく減らせるという点で利点を提供する。こ のような標的送達はまた、非標的送達法において比較的高い薬物濃度を用いるこ とから生じ得る全身性の副作用を減少する。ヘム運搬マイクロパーティクルを形 成するための好ましい脂質は、1,2,-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモ ニウム）プロパン(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン( DOPE)である。ヘム運搬マイクロパーティクルの産生および使用は、Innovirによ るPCT出願WO 95/27480に記載されている。 核酸はまた、哺乳動物内に静脈注射し得る陽イオンリポソームによってカプセ ル化され得るか、またはリポソーム上を被覆し得る。この系は、造血細胞が存在 する内皮および骨髄を含む成体マウスの多くの組織の細胞内へDNAを導入するた めに使用されている（例えば、Zhuら、Science、261:209-211(1993)を参照のこ と）。 EGS分子またはこれらの分子をコードするDNAのいずれかを含むリポソームは、 抗肝炎EGS分子の標的細胞への送達に有効な量で、例えば、静脈内投与または腹 膜内投与によって全身に投与され得る。適切なマイクロパーティクルと共同で使 用される場合、他の可能な経路は、経皮または経口を含む。一般に、個体に投与 されるリポソーム結合核酸の総量は、同一の所望の効果または意図する効果のた めに投与されなければならない結合しない核酸の総量より少ない。 種々のポリマー（例えば、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリ エチレン、およびポリオルソエステルならびに抗肝炎EGS分子、またはこのよう な分子をコードするDNA）を含む組成物は、カテーテルまたはシリンジを用いる ことによって、適切な細胞に局所的に送達され得る。このような組成物を細胞に 局所的に送達する他の手段は、注入ポンプ（例えば、Alza Corporation、Palo A lto、Carifornia）を用いることか、またはポリマーインプラント内へ組成物を 組み込むこと（例えば、JohnsonおよびLloyd-Jones編、Drug Delivery Systems( Chichester、England:Ellis Horwood Ltd.、1987を参照のこと）を包含し、これ は、治療用抗肝炎EGS組成物のインプラントの隣接領域への徐放を引き起こし得 る。 以下の実施例は、例示的目的およびさらなるガイダンスのために示す。 実施例 実施例１：EGS分子の構築および分析のためのオリゴヌクレオチド合成、プラス ミドおよび転写反応 オリゴヌクレオチド：5'-ジメトキシトリチル-2'-メチルシリル-リボヌクレオ シド 3'-CE-ホスホルアミデート(Biosearch,MA、またはChemGenes Corp.、MA)を 用いて、オリゴリボヌクレオチド(RNA)を、Ogilvieら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S .A.、85:5764-5768(1988)の方法に従って調製した。2'-O-メチルオリゴリボヌク レオチド（2'-O-メチルRNA）を、BioseachまたはGlen ReseachのいずれかのRNA 合成プロトコルを用いて合成し、そしてBioseachまたはGlen Reseachのいずれか からアミデートを購入した。Millipore 8909 Experdite DNA/RNAシンセサイザー で合成を行った。制御されたポアガラス(controlled pore glass)(CPG)を固体支 持マトリックスとして使用した。カップリング時間は約13分間であった。チオリ ン酸結合を有するアナログの合成のため、酸化の代わりに硫化を行い、これは、 Beaucage試薬を用いて10〜15分間実行した。平均カップリング収率は、トリチル 測定によってアッセイして、96％〜98％であった。 支持体からの切断、塩基およびリン酸脱保護(deprotection)、および2'-O-TBD NS基の除去を、Scaringeら、Nucleic Acid Reseach、18:5433-5441(1990)による 記載のように実行した。TBAF溶液中の粗オリゴヌクレオチドを、15〜20％のポリ アクリルアミド／７M尿素ゲルを用いる標準的な電気泳動精製の前に、Sephadex G-25カラムで脱塩した。産物のバンドをUV-シャドーイングによって視覚化し、 切り出し、そしてゲルマトリックスから溶出させた。溶出したオリゴマーを、C1 8 Sep-Pakカートリッジで最終的に脱塩し、そしてOD260測定により定量した。精 製したアナログの均質性を、5'末端標識または分析HPLCによって確認した。それ らは、SeelaおよびKaiser、Nucleic Acids Reseach.、15:3113-3129(1987)によ って記載された塩基組成分析によりさらに特徴付けし、チオエート結合の含量を31 P-NMRによって定量した。3'末端の末端修飾をアミノ基を含む修飾したCPG支持 体から合成を開始することにより作製した。 プラスミド：ベクターpCR 1000(Invitrogen Corp.、San Diego、CA)内へPML-R ARα融合領域全体を含む788ヌクレオチドフラグメント（配列番号13のヌクレオ クレオチド1076〜1739のPML配列およびPML-RARαクローンB467のヌクレオチド17 66〜1890のRARα配列に相当する）をクローン化することにより、プラスミドpAP L 7-5を構築した。このフラグメントを、休止点(break point)および配列がNB4 ら、Blood、77:1080-1086(1991)）。融合領域の配列を以前に報告された配列 I制限フラグメントをベクターpGEMTM-3Z（Promega、Madison、Wisconsin）へク ローン化し、プラスミドpAPL-3Z3を生成した。 転写：直線化したプラスミド(2.5μg)のランオフ転写を、40mM Tris-HCl(pH 7 .5)、18mM MgCl2、1mMスペルミジン、５mM DTT、2000 U/mlの胎盤RNaseインヒビ ター(Promega)、それぞれ３mMのATP、UTP、CTP、およびGTP、50μCiのα-[32P]- rNTP(通常CTP、New England Nuclear)、および3000 U/mlのT7 RNAポリメラーゼ （New England Biolabs）を含む100μlの反応物中で行った。HindIII直線化 pAP L-3Z3の転写は、PML-RARαの788ヌクレオチドおよび3'末端でのベクター配列の 約60ヌクレオチドを含む転写物を生成した。全コード鎖およびプロモーター領域 全体を含む部分的に相補的な鎖を用いて、本質的にMilliganら（Nucl.Acids Res .、15:8783-8798(1987)）より記載の標準的な方法を用いて、オリゴヌクレオチ ドからの転写を実行した。全ての転写を37℃で２〜16時間実行し、そして120μl の終結反応混液(termination cocktail)（ホルムアミド、EDTA、および極微量の 染料）の添加によって終結した。次いで、反応混合物を90℃で３分間加熱し、氷 中で急速に冷却し、そして尿素/ポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動に供 した。 転写産物を紫外線シャドーイングによって視覚化し、そして適切なバンドを切 り出して、ポリアクリルアミドゲルから溶出させた。精製したRNAを水に再懸濁 し、そして-20℃で保存した。 RＮAse P切断アッセイ：切断反応は、一般に、Yuanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA、89:8006-8010(1992)（これらは、本明細書中で参考として援用される）によ り記載の手順に従って実施した。簡単に説明すると、200nMのEGS濃度および20nM 未満の標的分子濃度を伴う、50mM Tris-HCl pH7.4、10mM MgCl2、25mM KCl、0.1 mM EDTAをを含む全量31μl中で短い基質反応を行った。反応物を37℃で１時間イ ンキュベートした。インキュベーション後、反応溶液をローディング緩衝液（98 ％ホルムアミド、10mM EDTA、0.025％ブロモフェノールブルー）と混合した。切 断した基質を、７Mの尿素を含む15%アクリルアミドゲル上で電気泳動によって非 断物から分離した。バンドを、Molecular Dynamics Phosphorimagerで定量した 。 前駆体のRNA基質および得られた２つの切断産物に相当するバンドを、Betasco peゲルアナライザー（Betagen）を用いて乾燥ゲルから計測した。 本質的にBartkiewiczら、Genes Dev．3:488-499(1989)（これは、本明細書中 で参考として援用される）に記載のDEAE Sepharoseクロマトグラフィーおよびグ リセロール密度勾配遠心分離によってRNAse Pを精製した。 より長い標的RNA分子で切断を試験するために、異なる反応条件を用いた。反 応物は、全量10μl中に、40mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、１mMスペルミジ ン、10mMジチオスレイトール、0.05μg/μlのヌクレアーゼを含まないウシ血清 アルブミン、0.01％(v/v)トリトン-X100、0.8Units/μl RNASIN、0.2mM ATP、0. 2mM GTP、0.2mM UTP、0.2mM CTP、0.1μCi/μl[a32P]CTP、２mM m7G(5')pppG、0 .06μg/μl 酵母RNA、25mM KCl，３Units T7 RNAポリメラーゼ、250nM EGS、１ μlのヒトRNAse P、および３ng/μl 直線化プラスミドを含有した。直線化プラ スミドを添加することにより反応を開始し、そして37℃で30分間インキュベート した。10μlの80％ホルムアミド、10mM EDTA、0.1％ブロモフェノールブルーの 添加により反応を終結した。90℃で２分間加熱後、サンプルを、５％変性ポリア クリルアミドゲル上、48ワットで２時間電気泳動した。60℃で１時間の減圧乾燥 後、ゲルをホスホイメージング(phosphoimaging)によって分析した。 いずれかのアッセイで残存する前駆体RNA基質の割合を、EGS濃度の関数として プロットし、そして触媒効率をkcat/Km（ここで、kcatは、切断の速度定数であ り、そしてKmは、ミハエリス定数である）として表した。これは遊離のEGSと基 質との反応に対する二次反応定数である。以下のHeidenreichおよびEcksteinの 方法（J.Biol.Chem.、267:1904-1909(1992)、切断反応の効率(kcat/Km)）を、以 下の式を用いて決定した -ln F/t=(kcat/Km)[C] ここでFは、残存したRNA基質の割合、tは反応時間、そして[C]はEGS濃度である 。 仔ウシ胎児血清安定性アッセイ：修飾したEGS分子のヌクレアーゼ耐性を、仔 ウシ胎児血清(FCS)アッセイにおいて試験した。熱で不活化した場合、10％FCSは 、むしろヒト血清を模倣することがShawら、Nucleic Acids Res．19:747-750(19 91)によって報告された。アッセイの条件は、Hokeら、Nucleic Acids Res．19:5 743-5748(1991)によって先に記載のアッセイ条件に極めて類似した。簡単に述べ れば、試験すべきEGSアナログは、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-35S]A TPを用いて標識した5'末端である（この手順は、脱リン酸化に対して耐性である 放射性標識したオリゴヌクレオチドを生成し得る）。次いで、標識EGSをフェノ ール/クロロホルム抽出によって精製し、その後Sephadex G-25スピンカラム濾過 した。精製したEGSを冷EGSおよび10％熱不活化仔ウシ胎児血清(FCS)と混合し、 最終EGS濃度を約５μMとした。EGSアナログを24時間処理した。アリコートを異 なる時点で反応混合物より取り出し、２×ローディング染料と混合し、90℃で３ 分間熱不活化し、次いで、-20℃で保存した。その結果得られたものを12％ポリ アクリルアミド/７M尿素ゲル上で分析した。 実施例２：HBsAg RNAのRNAse P切断を媒介するEGS分子の構築 ヒト外部ガイド配列(EGS)分子を、HBsAgをコードするRNAにおいてRNAse Pによ る切断を生じるように設計した。標的の存在下で、EGS分子はRNAse Pによる切断 を誘発するtRNA様構造を形成した。 HBsAgに標的化されたEGS構築物：EGS配列HBV102（配列番号２）、HBV#1（配列 番号５）およびHBV#2（配列番号６）を、Ｂ型肝炎表面抗原(HBsAg)をコードする RNAの保存領域を標的化するように設計した。図２に示すように、HBV102の認識 アームの１つ（Ａ認識アーム；配列番号２のヌクレオチド25〜31）は、HBsAg（ 配列番号１のヌクレオチド13〜19）をコードする配列の７つのヌクレオチドに相 補的である。HBV102の他の認識アームの配列（Ｄ認識アーム；配列番号２のヌク レオチド１〜４）は、HBsAg（配列番号１のヌクレオチド22〜25）をコードする 配列の４つのヌクレオチドに相補的である。従って、標的配列はEGSの２つの認 識アームに相補的である２つの領域を含有し、これらは、２つの対合しないヌク レオチドに分離される。 可変ループを有さないEGS：EGS構築物HBV140(配列番号３)を、HBV102と同じＢ 型肝炎表面抗原をコードするRNAの保存領域を標的化するように設計した。HBV14 0の認識アームは、HBV102の認識アームと同じ配列を有する。詳細には、HBV140 のＡ認識アーム（配列番号３のヌクレオチド22〜28）の配列は、HBsAG(配列番号 １のヌクレオチド13〜19)をコードする配列の７つのヌクレオチドに相補的であ る。HBV140のＤ認識アーム（配列番号３のヌクレオチド１〜４）の配列は、HBsA g（配列番号１のヌクレオチド22〜25）をコードする配列の４つのヌクレオチド に相補的である。EGS HBV140は28ヌクレオチド長のみである。 2'-O-メチル含有EGS分子：HBV102およびHBV140に基づくいくつかのEGS分子を 、いくつかの2'-O-メチル-ヌクレオチドを含有するように調製した。これらのオ リゴヌクレオチドは、ヌクレオチド試薬が2'-O-メチル基を含有したことを除い て先に記載されるように自動オリゴヌクレオチド合成機において調製した。トリ チ ル測定によりアッセイされたように、平均カップリング収率は、96〜98％の範囲 内であった。脱保護の完了後、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、変性 ゲル電気泳動により精製し、そしてその純度を、５’末端標識、分析HPLC、塩基 組成分析、および31P-NMRにより評価した。図３は、構築されたいくつかの修飾E GS分子を示す。このシリーズにより、EGS分子が、2'-O-メチル化され得、そして 依然としてEGS機能を保有し得る程度、およびこれらの修飾により授けられたヌ クレアーゼ耐性の程度を試験するのが可能になった。 2'-O-メチル／ホスホロチオエートキメラEGS分子：HBV102およびHBV140に基づ くいくつかのEGS分子を、ホスホロチオエートヌクレオチド結合ならびにいくつ かの2'-O-メチルヌクレオチドを含むように調製した。EGS分子の異なる領域は、 修飾されていないか、2'-O-メチル化されているか、チオール化されているか、 またはその両方であった。生じる分子は修飾キメラである。これらのオリゴヌク レオチドを、上述のようにヌクレオチド試薬が2'-O-メチル基を含有したことを 除いて、先に記載されるように自動オリゴヌクレオチド合成機において調製した 。硫化を、Beaucage試薬を用いて10〜15分間行った。図３は構築されたいくつか の修飾EGS分子を示す。このシリーズにより、EGS分子が、2'-O-メチル化され得 、そして依然としてEGS機能を保有し得る程度、およびこれらの修飾により授け られたヌクレアーゼ耐性の程度を試験するのが可能になった。 実施例３：EGS切断活性の測定 実施例２に記載のEGS構築物を、実施例１に記載のRNAse P切断アッセイを用い てアッセイし、切断反応の効率を決定した。図１は、RNase P媒介標的切断を誘 導することにおける修飾EGS分子の能力を評価するために用いられた短い基質を 用いるモデル系を示す。短い基質の配列（配列番号１）は、全長前ゲノムHBV RN Aに由来であった。データを図４、５および６に示す。 2'-O-メチル置換：2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチドは修飾のための論理上 の選択としていくつかの好都合な特徴を有する。これらのアナログの合成は、DN A合成と非常に類似する；それらはDNAより標的RNAにより良好な結合親和性を有 し、そして生じる２本鎖はRNA-RNA二重鎖（Ａ型）とDNA-DNA二重鎖（Ｂ型）との 間の構造を有する。さらに、それらは、RNAまたはDNA特異的ヌクレアーゼのいず れかによる分解に対して相当な耐性を示す。図３は、2'-O-メチル残基での全RNA EGS（INNO-102）の異なるセグメントの連続的な配列置換を示す。置換されたヌ クレオチドは下線を付すことにより示される。図４に示されるように、認識配列 (INNO-108)の置換は、野生型EGSと比較してRNase P-媒介標的切断の効率に影響 しなかった。他方で、可変ループ(INNO-109)およびＴステム(INNO-110)のさらな る置換は、活性において進行性かつ付加的な減少を導いた。しかし、失われた活 性のほとんどは、可変ループ(INNO-139)を欠失させることにより回復され得る。 結果として、2'-O-メチルRNA残基による認識配列および全RNA EGSのＴステムの 置換は、RNase Pにより良好に許容される。対照的に、Ｔループ(INNO-111)にお ける７ヌクレオチドの置換は、事実上活性を有さない修飾EGSを生じた。この結 果は、ＴループにおけるいくつかのまたはすべてのRNA残基が、EGSの３次構造を 修正および／またはRNase Pとの特異的な相互作用を維持するために重大である 。 Ｔループ修飾：このシリーズの修飾の目的はEGS活性の喪失を担う残基を同定 すること、および続いてヌクレアーゼ耐性EGSアナログの生成のための代替的な ストラテジーを開発することである。この目的のために、７つのアナログを設計 し、そして試験した。これらのアナログのそれぞれは、完全に2'-O-メチル置換 された認識配列、可変ループ、およびＴステムを有していた。さらに、Ｔループ における７つの残基の１つはまた、2'-O-メチル基で置換されており、一方、残 りの６つの位置はインタクトRNAとして保存されていることを示した（図５）。 切断アッセイの結果は、第１の5'-U(INNO-124)および第３の5'-C(INNO-126)が切 断効率において最も顕著な減少を引き起こすことを示した。これらの２つの重大 な残基を除いて、全ての残基が2'-O-メチルRNAで置換されたアナログ134を続い て試験した。不運なことに、アナログ134は依然としてほんのわずかな活性を有 していた。このことは、Ｔループがむしろ同等の構造をとらねばならず、そして この領域における2'-O-メチル残基の蓄積がこのような構造を顕著に妨害するよ うであることを意味し得る。無視できない活性の喪失はまた、Ｔループにおける ７つの残基のうち３つが2'-O-メチル残基により置換されたアナログ141で説明さ れる。これらのデータに基づいて、別のタイプの修飾が使用され、ホスホジエス テル骨格がホスホロチオエート骨格で置換される。これらの２つの型の修飾の組 み合わせは、完全に修飾されたアナログ143を生成し、ここではＴループ領域は ホスホロチオエートRNAで置換され、残りの分子は2'-O-メチル残基で置換されて いた。切断アッセイによりアッセイされたように、キメラEGSアナログは、依然 として野生型活性の約70％を保持していた。 骨格修飾：2'-O-メチル置換が非修飾EGSに対して有意なヌクレアーゼ耐性を供 与し得る一方で、修飾された骨格の導入による安定性のさらなる増強を調査した 。例えば、2'-O-メチルホスホロチオエート置換のシリーズを調べた。完全修飾E GS 143から開始し、ホスホロチオエート結合をこの分子の異なる領域に選択的に 添加した(図６；INNO-151〜INNO-154)。しかし、これらのアナログのインビトロ 切断分析は、これらの２重修飾残基での置換がむしろ活性の有意かつ付加的な喪 失を引き起していることを示した。いくつかの研究により、１つのオリゴヌクレ オチドの末端における単純な修飾が、さらなるヌクレアーゼ耐性を提供し得るこ とが示されたので、４つの末端ホスホジエステル結合（２つは３'末端から、そ して２つは５'末端から）をホスホロチオエート骨格で置換したアナログ155を合 成し、そして試験した。図６に示すように、末端キャップ化EGSアナログ155は、 ヒトRNase Pの精製された調製物でアッセイした場合、効果的な標的切断を依然 として誘導し得た。 末端修飾：２つのタイプの末端修飾をアッセイした。１つのケースでは、３’ および５’末端の両方を２つの2'-O-メチルホスホロチオエート結合(INNO-155) でキャップした；もう１つのケースでは、３’末端を、修飾CPG支持体(INNO-149 )から合成を開始することによってアミノ基で保護した。図８に図示するように 、両方のアナログが、2.1kb HBV RNAのRNase p媒介切断を誘導し得たが、アナロ グ149はアナログ155よりさらに効果的であるように思われる。 大きな標的RNAの切断：HBVのAYW株の2.1kb RNAをコードする配列を含むプラス ミドpAYW2.1を、NotIで消化することにより線状化し、次いで[α32P]CTPの存在 下でT7 RNAポリメラーゼにより転写させた。標識された転写物を、種々のEGS分 子の存在下でRNase Pとともに37℃で30分間インキュベートした。反応産物を変 性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そしてホスホイメージングにより分 析した。2.1kb転写産物の標的部位でのEGS媒介切断は、約1.7kbおよび0.4kbの長 さの切断産物を産生する。結果を図８に示す。 レーン１（CTRL）に関して、転写物を、YuanおよびAltman,Science,263:1269- 1273(1994)に記載のように、CAT-9 EGSとともにインキュベートした。CAT-9 EGS はHBV転写物に対して活性を有さない。予想されるように、切断は検出されなか った。レーン２（EGS H62）に関して、転写物をEGS H62とともにインキュベート した。EGS H62は、DNAオリゴヌクレオチドのT7 RNAポリメラーゼ転写から調製さ れた配列番号３の配列を有する全RNA-EGSであった。2.1kb RNAの完全な切断を観 察した。レーン３（EGS 149）に関して、転写物をINNO-149とともにインキュベ ートした。INNO-149は、配列番号３の配列を有する化学的に合成されたRNAであ り、（１）Ａ認識アーム、Ｔステム、およびＤ認識アームのそれぞれの位置にお ける2'-O-メチル、（２）Ｔループのそれぞれの位置におけるホスホロチオエー ト、および（３）３’アミノ基により修飾されていた。2.1kb RNAは、このEGSに よりほとんど切断されたことが観察された。レーン４(EGS 155)に関して、転写 物をINNO-155とともにインキュベートした。INNO-155は、化学的に合成された配 列番号３の配列を有するRNAであり、（１）Ａ認識アームの最後の４つの位置、 Ｄ認識アームの最初の４つの位置、およびＴステムの各位置における2'-O-メチ ル、（２）Ｔループの各位置におけるホスホロチオエート、および（３）Ａ認識 アームの最初の３つの位置およびＤ認識アームの最後の３つの位置における2'-O -メチルホスホロチオエートにより修飾されていた。2.1kbは、このEGSにより部 分的に切断されたことが観察された。 EGS媒介切断のターンオーバーを、各20nMの濃度のINNO-140およびINNO-139(図 ３に示す)とともに実施例１に記載の短い基質アッセイを用いて測定した。標的 分子は400nMの濃度であり、これは20倍過剰である。種々の時間点で、２μlのア リコートを取り出し、そして10μlのローディング緩衝液で反応を止めた。結果 を図16に示す。明確に、認識アームおよびＴループへの2'-O-メチル修飾は、タ ーンオーバーに有意には影響しない。 実施例４：EGS安定性の測定 修飾EGS分子のヌクレアーゼ耐性の増大させることにおける異なる修飾の影響 を評価するために、実施例２に記載のEGS構築物を、実施例１に記載の胎児仔ウ シ血清アッセイを用いてアッセイした。結果を図７に要約する。予想されるよう に、全RNA EGS（INNO-140）は、10％FCS中で非常に短い半減期を有した（10分間 未満）。2'-O-メチル置換されたINNO-139の半減期は、非常に増大したが、おそ らく非修飾全RNA Ｔループの存在により依然として比較的短いままであった。ホ スホロチオエートRNA（INNO-143）でのＴループの置換は、半減期を２時間から 約10時間に増大し、そして２つの2'-O-メチルホスホロチオエートキャップ(INNO -155)の添加は、半減期を18時間よりも長くさらに増大した。 実施例５：APL EGSの効率の証明 EGSの合成：PML-RARαの融合接合点に標的化された２つのEGSである、APL A20 （配列番号11）およびAPL 1009（配列番号12）を、Applied Biosystems 394 DNA /RNA合成機で化学的に合成した。これらのEGSの配列およびそれらの化学組成を 図13aおよび13cに示す。EGSのＴループに対応する配列において２つのヌクレオ チド欠失するが、他の点ではA20に類似するEGS A20Dを図13bに示す。図13dに示 すEGS APL 1017は、Ｔループにおいて３つのヌクレオチドが欠失しているが、他 の点ではAPL 1009に類似していた。コントロールのEGS（A20DおよびAPL 10I7） は、RNase Pの存在下でAPL mRNAの切断を誘導し得ないが、融合接合点にハイブ リダイズし得た。このEGSを、逆相HPLCにより精製し、濃縮し、そして2MのNaCl に懸濁してEGSを塩形態に変換し、そして水に対して大容量で透析し、次いで凍 結乾燥した。EGSを、試験管切断アッセイのために水中に、または細胞培養試験 のために150mM NaCl中に懸濁した。 試験管切断アッセイ：HindIII制限酵素で線状化したpAPL-3Z3プラスミドの３n gを、0.25μM（最終濃度）のEGS、30分間の32P-ATPの存在下で実施例１に記載の ように転写させ、そしてHeLa細胞(Bartkiewiczら、Genes and Development,3:48 8-499(1989))由来の２μlのRNase Pの精製調製物を転写の間転写反応に添加した 。反応産物を変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてMolecular Dynami cs Phosphorimagerを用いて視覚化した。 A20およびAPL 1009の両方が融合接合点においてAPL RNAの切断を誘導し、一方 、A20DおよびAPL 1017はAPL RNAの切断を誘導し得なかった。 細胞培養試験：急性前骨髄球白血球患者から単離されたt(15;17)転座マーカー を有する成熟誘導化細胞株、NB4細胞(Lanotteら、(1991))を、PML-RARαに標的 化されるEGSの抗増殖活性を試験するために用いた。これらの細胞は、全-trans レチノイン酸の成熟誘導効果に応答する。レチノイン酸に均一に応答するNB4細 胞のサブクローンの１つであるNB4/D5（Ahnら、(1995)）を細胞培養試験に使用 した。NB4細胞を、10％ウシ胎児血清(Intergen，Purchase，NY)、100U/mmlのペ ニシリン、200μg/mlのストレプトマイシン、および20mMグルタミンを含むRPMI 培地中で、５％のpCO2ともに37℃で増殖させた。 全ての処置を３つ組で行い、そして実験を１回より多く繰り返した。対数増殖 期で維持したNB4/D5細胞を、24ウェル組織培養プレート中の１mlのRPMI培地に１ ×105細胞の密度で播種した。増大する濃度のEGSを細胞に添加した。培地の90％ より多くを24時間毎に除去し、同濃度のEGSを含有する新鮮な培地で置換した。 細胞のアリコートを24時間毎に取り出し、そしてMTT増殖アッセイ（Mosmannら、 Journal of Immunological Methods,65:55(1983)に記載のような）をこれらの細 胞について行った。 EGS A20（図14a）およびAPL 1009（図15a）の両方は、MTTアッセイにより測定 されるように細胞増殖に対して阻害的であり、一方、対応する不活性なコントロ ールA20D（図14b）およびAPL 1007（図15b）は細胞増殖に影響を有さなかった。 A20およびAPL 1009の両方は、観察された３μM濃度より上でNB4細胞増殖の用量 依存性阻害を示した。 実施例６：HBVを発現する細胞における抗HBV EGSの効果 適切なEGSの存在下でRNAse Pにより容易に切断され得るHBV RNA中の配列を同 定するために、HBV RNAの種々の保存領域に標的化された80個のEGSをインビトロ 転写により合成し、そしてHBV 2.1kb RNA転写物を基質として用いて、インビト ロでの切断誘導活性について実施例３に記載のアッセイにおいて試験した。これ らのアッセイは、EGSの存在下でRNAse Pにより容易に切断されるRNA上のいくつ かの部位を明らかにした。これらのEGSの大多数は、HBV RNAの２つの異なる領域 （HBV 2.1kb RNAのおよそヌクレオチド350〜およそヌクレオチド700およびおよ そヌクレオチド1425〜およそヌクレオチド625）に限定された。これは、HBV RNA 内に大きな非構造ドメインが存在し得ることを示す。この標的選択方法はまた、 HBV以外のRNAを標的化するためにも適用され得る。 インビトロでの切断を誘導することが示される、化学的に修飾され、そしてヌ クレアーゼに耐性を有するEGSを12種類合成した。これらのEGSの配列および化学 的組成を、図17に示す。全てのEGSを、HBV RNAを構成的に発現し、そしてHBV粒 子を完全に組立てるHepG2.2.15細胞(Sellsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84: 100 5-1009(1987))において、ウイルス複製の阻害について試験した。このアッセイ を、一般にKorbaおよびGerin（Antiviral Res．19: 55-70(1992)）により記載さ れたように行った。EGSを、ヘム脂質粒子との複合体、特に、ヘムと結合した1,2 -ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン（DOTAP）およびジ オレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）（DDHという）として細胞 に10日間送達し、そして培地中に分泌されたHBV粒子のDNAゲノムを、ドットブロ ットアッセイを用いてアッセイした。 ヘム脂質粒子を、一般に以下のように調製した。ヘム（Feプロトポルフィリン IXクロリド、ヘミンとして）を、8.3mM NaOHを含有するエタノールに溶解し、そ して不溶性物質を14krpmにて10分間でペレット化した。カルボジイミドを用いて 効果的に結合させるために、ヘム溶液のpHを、ヘムの沈澱を伴わずに小容量のHC lを添加することにより低下させた。典型的な反応において、200mgのヘミンを、 8.3mM NaOHを含有するエタノール10mlに添加した。HClを上清ヘム溶液に添加し てpHを1.7まで下げ、ヘム溶液（約1.6mgヘムを含有する）、760μl(10μmol)DOP E(10mg/ml)、および500μl DCC(10mg/ml)を添加し、そして暗所にて室温で一晩 、結合を進行させた。クロロホルム中の10μmol DOTAPを、滅菌ガラス試験チュ ーブ中のヘム結合DOPEに添加し、そしてボルテックスデシケーター中で50℃にて 20分間、減圧下で、脂質を薄層フィルムへと乾燥させた。１mlの滅菌した150mM NaClを脂質フィルムに添加し、そして乳濁液を、47kHzで20℃にて操作したBrans onic 1210バスソニケーター中で30分間超音波処理し、濁った溶液を得た。脂質 粒 子を、Lipex Extruder(Lipex Biomembranes，Vancouver，Canada)を用いてポリ カーボネート膜を通して押し出した。 EGS/脂質組成物を、EGS分子含有溶液を150mM NaClにもたらすことにより調製 し、そしてDDH脂質粒子（150mM NaCl中）を0.2mg/mlの最終濃度までEGS溶液に添 加した。室温で15分間インキュベートした後、培養培地を添加し、そしてEGS/脂 質混合物を希釈して所望の最終濃度のEGSを有するEGS組成物を得た。等容量の15 0mM NaClをコントロールとして用いた。 HepG2.2.15細胞のコンフルエントな培養物を、96ウェル平底培養プレートで維 持した。２連のプレートを、各EGS処理について用いた。各プレートあたり全部 で３つの培養物を、希釈したEGS組成物のそれぞれで処理した。培養物を、10個 の連続的な日用量のEGS組成物を用いて処理した。培地を、新鮮的なEGS組成物を 用いて毎日変えた。これらの処理の効果を、細胞外HBV DNAのレベルを測定する ことによりモニターした。 これらのEGSの抗ウイルス活性を、図18に示す。図18の中央の欄は、左側の欄 に列挙したEGSに対するEC50を提供する。EC50は、コントロール組成物を用いて 処理した細胞と比較して、産生されたHBVの量が50％減少する、化合物の濃度で ある。比較のために、2'-3'-ddC（公知の強力な抗HBVヌクレオシドアナログ）の 抗ウイルス効果を、同じアッセイにおいて測定した。EGSのEC50は、2'-3'-ddCに 匹敵する。これは、これらのEGSが、顕著な抗HBV活性を有することを示す。 EGSを与えられた細胞の生存力を測定するフェノールレッドアッセイは、EGSの 投与に関係する毒性（未処理細胞において観察される色素取り込みレベルの50％ より大きな低下として定義される）を全く示さなかった。これは、複製の阻害が いかなる潜在的な毒性とも関係しないことを示した。 実施例７：pol IIIプロモーター駆動発現ベクターを用いたHBV RNAに対するEGS の発現 EGS2およびEGS62のクローン化：エプスタインバールウイルスベースベクター （Yatesら，Nature，313: 812-815(1985)）であるpREP9（Invitrogen，San Dieg o，CA）を、XbaIおよびKpnIで切断してベクター中のRSV LTRプロモーター配列 を除去し、そして244ヌクレオチドのヒトU6プロモーター（hU6；ヌクレオチド＋ １〜−244）を、この領域にクローン化した。EGS2およびEGS62に対応するcDNA（ それぞれ、図19および20）を、Applied Biosystems DNA合成機で合成し、精製し 、そしてKpnIとBamHIとの間のhU6プロモーターの下流にクローン化した。EGS配 列およびhU6プロモーター配列を、XbaIおよびBamHIを用いて切り出し、そしてBg lIIおよびNheIで消化してあるpCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)にサブクロー ン化した。 EGS2A、EGS62A、およびEGS62Bのクローン化：pCEP4プラスミドを、BglIIおよ びKpnIを用いて消化してCMVプロモーターを除去し、次いでU6遺伝子の5'キャッ プ領域を含むヒトU6プロモーター（ヌクレオチド＋25〜−244）をこの部位にク ローン化した。EGS2A、EGS62A、およびEGS62Bに対応するcDNA（それぞれ、図19 、20、および22を参照のこと）を、Applied Biosystems DNA合成機で合成し、精 製し、そしてKpnI部位とBamHI部位との間の5'キャップ領域の下流にクローン化 した。 全てのプラスミドを細菌中で増幅し、そしてプラスミドDNAをQiagen（Qiagen Inc.,Chatsworth，CA）カラムを用いて精製した。次いで、精製したプラスミド を用いて、実施例６に記載のようにDOTAP-DOPE-Heme（DDH）リポソームを用いて HepG2.2.15細胞をトランスフェクトした。HepG2.2.15細胞を、６ウェルプレート に３×105細胞／ウェルで播種した。細胞を、４％ウシ胎児血清を含有するRPMI 培地中で培養し、そして細胞が60〜80％コンフルエントになったときにトランス フェクションを行った。EGS挿入物を有さないプラスミドベクターもまた、コン トロールとしてトランスフェクトした。細胞由来の全RNAを、Chomczynski-Sacch i（Anal.Biochem．162: 156-159(1987)）に記載の手順を用いて、トランスフェ クション２日後および６日後に抽出した。RNase保護アッセイを、EGS RNA、HBV RNA、およびGAPDH RNAのレベルを決定するために、Bordonaroら（Biotechniques 3: 428-430(1994)）の方法に従って、対応する放射性標識したアンチセンスRNA プローブを用いて全細胞性RNAについて行った。保護したフラグメントを６％変 性ポリアクリルアミドゲルで分離し、そして保護したバンドに関連する放射能を Molecular Dynamics Phosphorimagerを用いて定量した。GAPDH RNAの定量化を用 いて、サンプルを標準化した。RNAse保護アッセイは、EGS RNAが各々のEGSプラ スミド構築物を用いてトランスフェクトした細胞において発現されることを実証 した。異なるEGSの発現は、コントロールと比較してHBV RNAの発現の29〜53％の 範囲（図23）の様々な程度の阻害をもたらした。EGS2Aは、HBV RNA発現の最大阻 害を示したが、一方、コントロールプラスミドはHBV RNAレベルに何の効果も有 さなかった。これらの実験は、pol IIIプロモーターを用いたHBV RNAに対するEG Sの発現が、HepG2.2.15細胞におけるHBV RNAレベルの減少をもたらすことを明ら かに実証する。 本発明の方法の変更および改変は、前述の詳細な説明から当業者に明らかであ る。このような変更および改変は、添付の請求の範囲の範囲内であることが意図 される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 (72)発明者 マ， マイケル アメリカ合衆国 ニューヨーク 10044, ルーズベルト アイランド， リバー ロード 30， アパートメント ３エフ (72)発明者 ワーナー， マルチナ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10028, ニューヨーク，イースト 84ティーエイ チ ストリート 444， アパートメント 10ディー (72)発明者 ペイス， アンベルト アメリカ合衆国 ニューヨーク 10463, リバーデイル，グレイストーン アベニ ュー 8320，２エヌディー フロアー (72)発明者 ゴールドバーグ， アラン アール. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ー ストリート 500， アパートメント ５ジェイ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．RNAse P切断標的配列、および 標的RNA分子中の標的配列に相補的な認識配列、 を含有する単離されたオリゴヌクレオチド分子を含有する外部ガイド配列であっ て、 ここで、該外部ガイド配列は、真核生物RNAse Pにより媒介される標的RNA分子 の切断を促進し、 ここで、該認識配列は、Ａ認識アームおよびＤ認識アームを含有し、ここで該 Ａ認識アームは該外部ガイド配列の3'末端に位置し、そして該Ｄ認識アームは該 外部ガイド配列の5'末端に位置し、 ここで、該RNAse P切断標的配列は、前駆体tRNAのＴステムおよびループに対 応する構造を含有し、そして ここで、前駆体tRNAの該Ｔループに対応する該構造における少なくとも１つの ヌクレオチドは、2'位で化学的に修飾されている、外部ガイド配列。 ２．前駆体tRNAの前記Ｔループに対応する前記構造における少なくとも１つのヌ クレオチドが、ホスホロチオエート結合を有する、請求項１に記載の外部ガイド 配列。 ３．配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号14、配列番号 15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号 21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、および配列番号25からなる群より選 択されるヌクレオチド塩基配列を含有する、請求項１に記載の外部ガイド配列。 ４．前記標的RNA分子が、Ｂ型肝炎RNA分子である、請求項１に記載の外部ガイド 配列。 ５．標的RNA分子の切断を促進するための組成物であって、該組成物は、薬学的 に受容可能な送達系中に請求項１に記載の外部ガイド配列を含有する、組成物。 ６．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ビロソーム、ミクロスフェ ア、およびマイクロカプセルからなる群より選択される、請求項５に記載の組成 物。 ７．以下の構造 を有する請求項１に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、Ｒは、3'-OH、3'-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、3'-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2 NH2、または3'-3'-チミンヌクレオチドを表し、 Ｚは、5'リン酸を有する2'-O-メチルリボヌクレオチド、5'ホスホロチオエー トを有する2'-O-メチルリボヌクレオチド、5'リン酸を有するリボヌクレオチド 、または5'ホスホロチオエートを有するリボヌクレオチドを表し、 Ｖは、5'リン酸を有する2'-O-メチルリボヌクレオチド、または5'リン酸を有 するリボヌクレオチドを表し、 Ｍは、5'リン酸を有する2'-O-メチルリボヌクレオチド、または5'ホスホロチ オエートを有するリボヌクレオチドのいずれかを表し、 Ｘは、5'リン酸を有するリボヌクレオチド、または5'ホスホロチオエートを有 するリボヌクレオチドを表し、 ここで、ｎは０より大きく、ｍは０より大きく、そしてｎとｍとの合計は３よ り大きい、外部ガイド配列。 ８．以下の構造 を有する請求項７に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、Ｒは、3'-OH、3'-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、3'-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2 NH2、または3'-3'-チミンヌクレオチドを表し、 Ｙは、5'リン酸または5'ホスホロチオエートのいずれかを有する2'-O-メチル リボヌクレオチドを表し、 Ｊは、5'リン酸を有する2'-O-メチルリボヌクレオチドを表し、 Ｌは、5'リン酸を有する2'-O-メチルリボヌクレオチド、または5'ホスホロチ オエートを有するリボヌクレオチドのいずれかを表し、 Ｓは、5'ホスホロチオエートを有するリボヌクレオチドを表し、そして ここで、ｎは０より大きく、ｍは０より大きく、そしてｎとｍとの合計は３よ り大きい、外部ガイド配列。 ９．以下の構造 を有する請求項８に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、Rは、3'-OH、3'-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、3'-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2 NH2、または3'-3'-チミンヌクレオチドを表し、 Ｙは、5'リン酸または5'ホスホロチオエートのいずれかを有する2'-O-メチル リボヌクレオチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'リン酸を有する示された2'-O-メチルリボヌクレ オチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'ホスホロチオエートを有する示されたリボヌクレ オチドを表し、そして ここで、ｎは０より大きく、ｍは０より大きく、そしてｎとｍとの合計は３よ り大きい、外部ガイド配列。 １０．以下の構造 を有する請求項９に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、Ｒは、3'-OH、3'-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、3'-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2 NH2、または3'-3'-チミンヌクレオチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'リン酸を有する示された2'-O-メチルリボヌクレ オチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'ホスホロチオエートを有する示された2'-O-メチ ルリボヌクレオチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'ホスホロチオエートを有する示されたリボヌクレ オチドを表す、外部ガイド配列。 １１．以下の構造 を有する請求項９に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、Ｒは、3'-OH、3'-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、3'-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2 NH2、または3'-3'-チミンヌクレオチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'リン酸を有する示された2'-O-メチルリボヌクレ オチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'ホスホロチオエートを有する示された2'-O-メチ ルリボヌクレオチドを表し、 Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、5'ホスホロチオエートを有する示されたリボヌクレ オチドを表す、外部ガイド配列。 １２．前記標的RNA分子が、Ｂ型肝炎RNA分子である、請求項７に記載の外部ガイ ド配列。 １３．標的RNA分子を切断するための方法であって、RNAse P切断を促進する条件 下で、真核生物RNAse P、標的RNA分子、および請求項１に記載の外部ガイド配列 に接触をもたらす工程を包含し、 ここで、該外部ガイド配列が、該標的RNA分子のRNAse P媒介切断を促進する、 方法。 １４．前記標的RNA分子がＢ型肝炎RNA分子である、請求項１３に記載の方法であ って、 ここで、前記接触をもたらす工程が、患者または患者由来の細胞に前記外部ガ イド配列を投与することにより達成され、そして ここで、該外部ガイド配列が、薬学的に受容可能な送達系の中にある、方法。 １５．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ビロソーム、ミクロスフ ェア、およびマイクロカプセルからなる群より選択される、請求項１４に記載の 方法。 １６．Ｂ型肝炎ウイルスの阻害方法であって、 RNAse P切断標的配列、および Ｂ型肝炎RNA分子中の標的配列に相補的な認識配列 を含有する外部ガイド配列をコードする操作された発現ベクターを、患者または 患者由来の細胞に投与する工程を包含し、 ここで、該外部ガイド配列が、該Ｂ型肝炎RNA分子のRNAse P媒介切断を促進す る、方法。 １７．前記操作された発現ベクターが、薬学的に受容可能な送達系の中にある、 請求項１６に記載の方法。 １８．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ビロソーム、ミクロスフ ェア、およびマイクロカプセルからなる群より選択される、請求項１７に記載の 方法。 １９．前記薬学的に受容可能な送達系がリポソームである、請求項１８に記載の 方法。 ２０．前記ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター 、およびエプスタインバールウイルスベクターからなる群より選択されるウイル スベクターである、請求項１６に記載の方法。 ２１．さらに、リガンドに結合するRNA配列を含有する、請求項１に記載の外部 ガイド配列であって、 ここで、該外部ガイド配列が、該リガンドに結合した場合にのみRNAse Pによ る標的RNA分子の切断を促進する、外部ガイド配列。 ２２．さらに、リガンドに結合するRNA配列を含有する、請求項１に記載の外部 ガイド配列であって、 ここで、該外部ガイド配列が、該リガンドに結合していない場合にのみRNAse Pによる標的RNA分子の切断を促進する、外部ガイド配列。 ２３．リボヌクレオチドの１つ以上の前記2'ヒドロキシル基が、水素、O-アルキ ル基、アミノ基、およびフッ素からなる群より選択される化学基により置換され る、請求項１に記載の外部ガイド配列であって、 ここで、１つ以上のリン酸結合基が、メチルホスホネートおよびホスホロチオ エートからなる群より選択される結合基により置換され、そして ここで、前記修飾が、該外部ガイド配列のヌクレアーゼへの耐性を増大させる 、外部ガイド配列。 ２４．前記リボヌクレオチドの１つ以上の前記2'ヒドロキシル基が、水素または メトキシ基により置換される、請求項２３に記載の外部ガイド配列であって；そ して ここで、１つ以上のリン酸結合基が、ホスホロチオエートにより置換される、 外部ガイド配列。 ２５．3'末端が、3'-3'-結合チミンヌクレオチドでキャップされる、請求項２３ に記載の外部ガイド配列。 ２６．RNAse P切断標的配列、および Ｂ型肝炎RNA分子中の標的配列に相補的な認識配列、 を含有する単離されたオリゴヌクレオチド分子を含有する外部ガイド配列をコー ドする操作された発現ベクターであって、 ここで、該外部ガイド配列は、Ｂ型肝炎RNA分子のRNAse P媒介切断を促進する 、ベクター。 ２７．Ｂ型肝炎RNA分子の切断を促進するための組成物であって、ここで、該組 成物が、薬学的に受容可能な送達系の中に、請求項２６に記載の操作された発現 ベクターを含有する、組成物。 ２８．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ビロソーム、ミクロスフ ェア、およびマイクロカプセルからなる群より選択される、請求項２７に記載の 組成物。 ２９．RNAse P切断標的配列、および Ｂ型肝炎RNA分子中の標的配列に相補的な認識配列、 を含有する単離されたオリゴヌクレオチド分子を含有する外部ガイド配列であっ て、 ここで、該外部ガイド配列は、Ｂ型肝炎RNA分子のRNAse P媒介切断を促進する 、外部ガイド配列。
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