JPH0198497A - ウシ胎盤ラクトゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウシ胎盤ラクトゲン、生合成法によるその製造
法、及びウシの生物学的応答を誘導するためのその使用
に関する。

胎盤ラクトゲンは成長ホルモン遺伝子群のベプヂドであ
る。ソマトトロピン（成長ホルモン）は、動物に投与し
た場合にはその投与ａに応じて、動物の成長を促進し、
食物の摂取効果を高め、ミルクの産生を促進し、動物の
脂肪肉に対する赤身肉の割合いを高め、そして動物の他
の生物学的応答を誘導することができる。胎盤ラクトゲ
ンはソマトトロピンと同様の各種の生物学的応答を誘導
することができ更には他の生物学応答も誘導することが
できる。胎盤ラクトゲンのこのような活性を支持する証
拠は動物の種によって異なり、ウシの場合においてもそ
のような活性が示唆されているが、羊の場合に最も確か
な証拠が認められている。

ウシ胎盤ラクトゲンはその投与量とその投与時期に応じ
て望ましい各種の生物学的応答を誘導することができる
ため、ウシ胎盤ラクｌヘゲンは、ウシに適用するための
魅力的な薬物候補の１つになっている。

ウシ胎盤から天然のウシ胎盤ラクトゲンを精製しその特
性を明らかにすることに関して多くの文献で議論がなさ
れている。即ら、例えば、Ｂ１１１ａｔｔｅｔ　ａｌ　
　：　（１９８６）　；Ａｒｉｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　
　（１９８３）　：Ｈｕｒｔｈｙ　ｅｔ　ａｔ、、　（
１９８２）　：　Ｅａｋｌｅ　ｅｔａｌ、、　（１９８
２）などの文献がある。

ウシ胎盤から単離したウシ胎盤ラクトゲンの予備的な分
析により、ウシ胎盤ラクトゲンには少なくとも２つの対
立遺伝子型が存在することが示唆されているが、それら
の分子を完全に分離することができないためウシ胎盤ラ
フトゲン種についての完全な特性の解明が行なわれてい
ない。ウシ胎盤ラクトゲンの推定上の対立遺伝子型が、
蛋白質の混合物として単離されているにすぎず、それら
の対立遺伝子型がどのようにして分離できるかについて
は何んら知られていない。実際に、胎盤からウシ胎盤ラ
クトゲンを単離する方法は、商業的な用途に十分な量で
また実質的に純粋な量でウシ胎盤ラクトゲンを製造する
ための実用的方法とは言えないものである。

商業的用途に十分な量のウシ胎盤ラクトゲンの製造法は
、ウシの体外でウシ胎盤ラクトゲンを合成できるように
なった時に初めて実用的なものとなると考えられる。一
般的な合成スキームとしては、例えば、化学合成；遺伝
子的に形質転換された真核生物にて発現させる方法、即
ちウシ胎盤ラクトゲンの発現を可能にする適当なＤＮＡ
コントロールセグメントとともにウシ胎盤ラクトゲンを
コードするＤＮＡ配列を含む遺伝子的に形質転換された
Ｉｌｉ乳動物細胞を培養するか又はそのようなＤＮＡ配
列を含む遺伝子的に形質転換された酵母を発酵すること
等により発現する方法；あるいは、ウシ胎盤ラクトゲン
の発現を可能にするＤＮＡの適当なコントロールセグメ
ントとともにウシ胎盤ラクトゲンをコードするＤＮＡ配
列を含む遺伝子的に形質転換された原核生物にて発現さ
せる方法などがある。これらのいずれの合成スキームを
使用する場合においても、ウシ胎盤ラクトゲンのアミノ
酸配列を知る必要がある。化学合成の場合には、合成の
際に完全なアミノ酸配列に関する知見を直接使用する。

遺伝子的に形質転換された細胞において製造する場合に
は、宿主細胞に挿入できるように、ウシ胎盤ラクトゲン
をコードするＤＮＡ配列を単離し又は製造するためにア
ミノ酸配列に関する知見を間接的に使用する。いずれの
ウシ胎盤ラクトゲン分子についてもその完全なアミノ酸
配列はこれまでに報告されていない。

本発明はこのような技術的ギャップを解決するものであ
る。即ち、ウシ胎盤ラクトゲンの合成的製造を可能にし
そして合成されたウシ胎盤ラクトゲンを上記した如き生
物学的応答を誘導するために使用することを可能にする
。２つの対立遺伝子型のウシ胎盤ラクトゲンの完全なア
ミノ酸配列を提供することによって本発明は上記した技
術的ギャップを解決するものである。実際に、本明細帛
においてより詳細に記述するように、本発明により２つ
の対立遺伝子型のウシ胎盤ラクトゲンの完全なアミノ酸
配列が提供される。本発明のこのような知見により、実
質的に純粋な形態でそれぞれの対立遺伝子型のウシ胎盤
ラクトゲンを商業的使用に十分な争で製造するための手
段が提供され、またウシ胎盤ラクトゲンの生物学的機能
の特性を十分に解明するための手段が提供されるため、
本発明のかかる知見は極めて意義深い。

発明の要旨 本発明によれば、アミノ末端からカルボキシ末端まぐ実
質的に以下の配列： （式中、ＸはＡｌａ又はＶａｌを示す）を有するペプチ
ドであってウシ由来の他の蛋白質又はペプチドを含有し
ない成熟型ウシ胎盤ラクトゲンを含む組成物が提供され
る。

また本発明によれば、ウシ胎盤ラクトゲンのアミノ酸配
列のＮ末端にシグナルペプチドを有するブレウシ胎盤ラ
クトゲンであってそのアミノ末端からカルボキシ末端ま
で実質的に以下にアミノ酸配列： （式中、ＸはＡｌａ又はＶａｌを示す）を有し且つウシ
由来の他の蛋白質又はペプチドを含有しないブレウシ胎
盤ラクトゲンを含む組成物が提供される。

本発明の他の局面によれば、上記したペプチドをコード
する構造遺伝子、及びこれらの構造遺伝子を含む組換え
真核もしくは原核生物発現ベクターが提供される。原核
生物発現ベクターは、構造遺伝子の上流に原核生物のプ
ロモーター及びリボゾーム結合部位を有し、構造遺伝子
の５′末端に翻訳開始コドンを有し、構造遺伝子の下流
に転写終止コドン及び転写終止シグナルを有している。

真核生物発現ベクターは、構造遺伝子の上流に真核生物
プロモーター及び翻訳コントロールエレメントを有し、
構造遺伝子の５′末端に翻訳開始コドンを有し、構造遺
伝子の下流に翻訳終止コドン及び３′非翻訳ポリアデニ
ル化転写終止シグナルを有している。

また本発明によれば、上記した真核生物発現ベクターを
含む遺伝子的に形質転換された真核生物、及び上記した
原核生物発現ベクターを含む遺伝子的に形質転換された
Ｗｔ核生物が提供される。

また、本発明によれば、化学合成によるウシ胎盤ラクト
−ゲンの製造法；遺伝子的に形質転換した真核生物にて
発現せしめることによるウシ胎盤ラクトゲンの製造法、
即ち上記した如き真核生物発現ベクターを含む遺伝子的
に形質転換された哺乳動物細胞を培養することによりあ
るいは該真核生物発現ベクターを含む遺伝子的に形質転
換されたＭｆｆｉを発酵することにより真核生物にて発
現せしめてウシ胎盤ラクトゲンを製造する方法：及び、
上記した原核生物発現ベクターを含む遺伝子的に形質転
換された原核生物にてウシ胎盤ラクトゲンを発現せしめ
て製造する方法が提供される。

また本発明の他の局面によれば、ウシ胎盤ラクトゲンの
有効口を動物に投与して目的とする生物学的応答を誘導
せしめることによる上記したウシ胎盤ラクトゲンの使用
が提供される。好ましい投与方法としては、皮下又は筋
注などの非経口投与、あるいは乳房注入などの体表面膜
からの投与などが挙げられる。

図面の説明 本明細書に添付した図面においては、他にことわりのな
い限り、核酸配列は５′から３′の方向に向って示され
ている。アデニン、グアニン、シトシン及びチミジンヌ
クレオチドは、それぞれＡ、Ｇ％Ｃ，Ｔで示されている
。２０個のアミノ酸は以下の略号で示されている。

Ａ　ｌ　ａ＝アラニン △ｒｑ＝アルギニン △ｓｎ−アスパラギン ＡＳｐ＝アスパラギン酸 ＣｙＳ−システィン Ｇｌｎ−グルタミン Ｑ　Ｉ　ＬＪ　＝グルタミン酸 Ｇｌｙ−グリシン ＨｉＳ−ヒスチジン １ｉｅ−イソロイシン １ｅｕ＝ロイシン Ｌ’ｌ／Ｓ＝リシン Ｍｅｔ＝メチオニン Ｐｈｅ−フェニルアラニン Ｐｒｏ＝プロリン ５ｅｐ＝セリン Ｔｈ　ｒ＝スレオニン Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｔｙｒ＝チロシン Ｖａｌ＝バリン 第１図は、２つの対立遺伝子型のウシ胎盤ラクトゲン（
ｂＰＬ）をコードする配列を含む２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ
配列を示す。番号はヌクレオチドを表わしており、この
番号は図面上の目的のためにのみ付されている。下側に
記した文字はｄＳＤＮＡによってコードされるｂＰＬの
アミノ酸配列を示しており、下線を引いたアミノ酸配列
はジグ±ルベブチド（゛ブレ″）を示している。

線形を付けた部分はＮ−結合グリコシル化部位を示して
いる。丸くかこったアミノ酸及びヌクレオチドは、それ
ぞれアミノ酸置換、ヌクレオチド置換を示しており、ｂ
ＰＬの２つの対立遺伝子型をそれぞれ区別しておりまた
定義するものである。

＊印は、置換アミノＭＶａｌ及び置換ヌクレオチドＴ、
Ｔ並びに八を含むｂＰＬの対立遺伝子型をコードするｂ
ＰＬメツセンジャーＲＮＡの開始点を示す。

第２図は、ｂＰＬをコードする２つのＣＤＮＡクローン
Ａ及びＢの制限酵素地図を示す。関連のある制限酵素部
位のみが示されており、各断片の凡その長さ（塩基対ｂ
ｐ＞が示されている。矢印は、ＤＮＡ配列分析を行なっ
たｃＤＮＡ配列の領域を示している。“Ａ　Ｔ　Ｇ　”
はブレーｂＰＬ蛋白質の開始点を示している。＋１″は
成熟型ｂＰＬ蛋白質の開始点を示している。“Ｔ　Ａ　
Ａ　”は終止コドンを示しており、“Ａ”はポリＡテイ
ルの開始点を示している。

■１日とＦＪ　ＩＩＩ　＜口１邪 本明細書において用いるアミノ酸を示す記号（例えばア
ラニンのＡｌａ）は、他にことわりのない限り、慣用的
に使用されているものである［Ｌｅｈｎｉｎａｅｒ　　
（１９７６）　］　、本明細書において使用する°゛ウ
シ由来他の蛋白質又はペプチドを含有しない″とは、天
然起源（例えばウシ）の蛋白質を含まない、という意味
である。゛実質的に純粋″とは、ウシ胎盤ラクトゲンの
生物学的活性に重要なあるいは悪い影響を与える他の蛋
白質又はペプチドをその組成物が含まない、という意味
である。°゛合成という言葉は、例えば、これらには限
定されないが、化学合成、酵素的合成、慣用的組換えＤ
ＮＡ技術（例えばＨａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９８２）などの人為的操作を必要とする手段によって
行なわれる合成を意味する。真核及び原核生物発現ベク
ターにおいて用いられている゛構造遺伝子の５′末端″
とは、構造遺伝子の５′末端部分、あるいは構造遺伝子
の５′末端部分のコドンに直接隣接した部分を意味する
。

本発明によれば、成熟型ウシ胎盤ラクトゲン（ｂＰＬ）
のアミノ酸配列及びブレウシ胎盤ラクトゲン（ブレーｂ
ＰＬ）のアミノ酸配列が提供される。プレーｔ）ＰＬと
は細胞内型のウシ胎盤ラクトゲンを意味し、ｂＰＬとは
成熟型の分泌された（細胞外）ウシ胎盤ラクトゲンを意
味する。具体的には、゛ブレーｂ　Ｐ　Ｌ　”は、Ｎ末
端シグナルペプチドを伴った成熟型ｂＰＬを含むもので
ある。

また本発明によれば、成熟型ｂＰＬをコードするＤＮＡ
配列及びブレ〜ｂＰＬをコードするＤＮＡ配列が提供さ
れ、また、本発明の蛋白質を動物に投与して例えばこれ
に限定されないがウシ乳房柔組織の成長促進などの成長
促進効果を生み出すための方法及びｖＡ製物が提供され
る。

ｂＰＬ、ブレーｂＰＬ及びこれらの対立遺伝子型の完全
なアミノ酸配列の知見により、ｔ）ＰＬ活性を有するペ
プチドを商業的用途に十分な歩で製造するための基礎が
提供される。即ち、かかる知見に基づけば、活用できる
いずれの工程を用いてもそのような製造を実施すること
ができる。例えば、通常のペプチド合成装置あるいは化
学合成を用いて製造することができる。

あるいはまた、本明細書に記載されたｔ）ＰＬ及びブレ
〜ｂＰＬのアミノ酸配列により、ｂＰＬ及び／又はブレ
ーｂＰＬをコードするＤＮＡ配列を単離しまた製造する
こと（例えば化学的及び／又は酵素的合成により）が可
能となる。またこのようにして得られたＤＮＡ配列は、
組換えＤＮＡ技術によってｂＰＬ及び／又はブレーｂＰ
Ｌを産生することのできる真核及び原核生物発現ベクタ
ーを製造する際に有用である。更に本発明によって提供
されるアミノ酸配列により、ｂＰＬ産生組織（例えばウ
シ胎盤）又はブレーｂＰＬもしくはｂＰＬ産生遺伝子工
学的細胞からブレーｂＰＬもしくはｂＰＬを単離する際
に、該単ｍ操作が容易となりまた単離されたか否かをｉ
ｆｆ認することも可能となる。即ち、例えば、生体組織
あるいはｂＰＬを産生ずるように遺伝子的に形質転換さ
れたＳＵａからブレーｂＰＬもしくはｂＰＬを生成する
際に有用なりＰＬ特異的抗体を製造する時に、ブレーｂ
ＰＬもしくはｂＰＬの各種アミノ酸断片を得てこれを利
用することができる。

本発明の１つの態様においては、以下の実施例１でより
詳細に記述するように、ウシ胎盤からｂＰＬが単離され
そして精製される。ここで注目すべき重要な点は、ウシ
胎盤ラクトゲンの精製はいくつかのファクターによって
かなり困難となっているという点である。その第１のフ
ァクターは、ウシ胎盤中のｂＰＬの温度が極めて低いと
いうことである。第２は、ｂＰＬは羊及びヤギの胎盤ラ
クトゲンに比べてその大きさ及び物理化学的特性が相違
しているため、羊及びヤギの胎盤ラクトゲンを単離する
のに使用した単離法とは有意に異なる単離技術がｂＰＬ
の単離には必要であるということである。更に他のファ
クターは、ｂＰＬはグリコシル化された蛋白質であるこ
とから、ｂＰＬの多くのイソフオームみ存在するという
ことである。

ｂＰＬが精製されると、かくして単離されたｂＰＬは、
次いで成熟型ｂＰＬのアミノ末端についての部分的アミ
ノ酸配列分析に付される。またｂＰＬ蛋白質の大きさか
ら、該蛋白質の内部領域についての限定されたアミノ酸
配列分析も行なわれる。次いで、かくして１りられたア
ミノ酸配列は、ｂＰＬをコードするＤＮＡを単離するた
めに用いるｂＰＬ特異的ＤＮＡプローブを作成するのに
用いられる。ｂＰＬをコードするＤＮＡより、ｂＰＬ及
びブレーｂＰＬの完全なアミノ酸配列を知ることができ
る。驚くべきことに、これらのアプローチを試みること
によって、成熟型ｂＰＬの２つの異なる対立遺伝子型及
びこれまで報告されていないその前駆体蛋白質が発見さ
れた。ｂＰＬ、ブレーｂＰＬ及びこれらの対立遺伝子型
のアミノ酸配列が第１図に記載されている。

ウシ胎盤ラクトゲンの生物学的活性に必須でないアミノ
酸配列部分においては置換も修正も可能であり、また生
物学的活性に悪影響を与えることなしにアミノ酸配列の
置換又は修正を行なうことができることは、当業者にお
いて認識された事実である。例えば、成熟型ウシ胎盤ラ
クトゲンは任意にＮ末端メチオニンを含んでいてもよく
、かかる成熟型ウシ胎盤ラクトゲンはある組換え系で発
現させることによって得られる。更には、蛋白質のある
もしくは全ての部位のグリコシル化を変化させ及び／又
は除去するためにアミノ酸を修正することもできる。こ
のように置換されもしくは修正されたアミノ酸配列を有
するペプチドも、ｂＰＬ活性を本質的に保持しているか
ぎり、水明ａｍに記載したペプチドと等価である。

ｂＰＬ活性を測定する方法としては、例えば、これらに
限定されるものではないが、ペプチドの催乳性（例えば
プロラクチン様）活性を測定するアッセイ法、及び／又
はペプチドの成長ホルモン様（例えばソマトトロピン）
活性を測定するアッセイ法がある。催乳性活性アッセイ
法には、例えば、ＢｕｔｔｌＱ及びＦｏｒｓｙｔｈ　　
（１９７６）　、Ｂｙａｔｔ及びＢｌｅｎｅｌ　（１９
８６）　、５ｈｉｕ　ｅｔ　ａｔ　（１９７３）に記載
されたアッセイ法があり、これらの文献の記載は本明細
１に引用する。ソマトトロピン様活性アッセイ法には、
例えば、本明細書において以れば、ｂＰＬもしくはそれ
と等価のペプチドの存在下で乳房組織を培養し、次いで
乳房組織において生じる分化の程度を測定しく組織学的
に測定する、又はアルファーラクトアルブミン、ラクト
ース及び／又はカゼインなどのミルク特異的マーカーの
量を測定する）、公知の濃度のプロラクチンとともにイ
ンキュベーションして生じる分化の程度と比較すること
によって催乳性活性アッセイを行なうことができる。成
長ホルモン様活性アッセイ法の具体例は、本明細書の実
施例において十分に詳細に記載されている。

上記したように、ｂＰＬのアミノ酸配列が得られ、また
組換え技術によって商業的用途に十分な量のｂＰＬを製
造する際に有用なりＰＬ及び／又はプレーｂＰＬをコー
ドするＤＮＡ配列を、水明ＭＯＷにおいて詳細に記載さ
れるように単離しまた合成することができる。

本発明の１つの態様においては、以後の実施例２に詳細
に記載するように、ｂＰＬ、プレーｂＰＬ及びそれらの
対立遺伝子型をコードするＣＤＮＡ配列を、ウシ胎盤組
織から得たメツセンジャーＲＮＡから作成されるＣＤＮ
Δライブラリーより単離することができる。具体的には
、第２図に示されているように、クローンＡ１クローン
Ｂと命名される２つのｃＤＮＡクローンが単離された。

これらのクローンＡ及びＢについてのＤＮＡ配列分析に
より、ブレ及び成熟１ｂＰＬの２つの対立遺伝子型の完
全なＤＮＡコード配列、ｂＰＬの遺伝子の５′−非翻訳
領域の１部及び３′−非翻訳領域の全てが明らかにされ
た。かくして得られたＤＮＡ配列を第１図に示した。

本明細１においてはｂＰＬ及びプレーｂＰＬのアミノ酸
配列が示されているが、遺伝子コドンに基づき多くのＤ
ＮＡコード配列を構成することが可能である。ｂＰＬも
しくはブレｂＰＬ　　ＤＮＡコード配列を作成する際に
用いる具体的アミノ酸コドンの選択は、一般に、転写、
翻訳そして結局は特定の宿主細胞において産生されるｂ
ＰＬ蛋白質の岱にとって最適な配列を決定するファクタ
ーに基づいて行なわれる。成熟型ｂＰＬ蛋白質のみを含
むｂＰＬをコードするＤＮＡ配列又はシグナルペプチド
（“ブレ″）配列を含むｂＰＬをコードするＤＮＡ配列
を作成することができる。合成及び／又は単離したｂＰ
ＬｃＤＮＡクローンは、遺伝子工学的細胞で大量のｂＰ
Ｌを産生ずるために用いるＤＮＡ配列の１例である。

現在においては、Ｅ、　ｃｏｌｉなどの原核生物宿主；
酵母（例えばＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　、咄乳
肋物細胞（例えばマウスＣ−１２７、ウシＭＤＢＫ。

ＣＨＯ細胞）などの真核生物宿主において、ｂＰＬなど
の哺乳動物蛋白質を発現する方法が知られている。天然
のｂＰＬはグリコシル化蛋白質であるので、真核細胞は
好ましい宿主である。

ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母も、咄乳紡物細
胞と同様に、グリコシル化蛋白質を産生することができ
る。しかしながら、糖鎖の組成は、蛋白質産生に用いる
宿主細胞によって変動する。原核細胞の場合には、典型
的には非グリコシル化蛋白質が得られ、生物学的活性型
を得るには合成された蛋白質の再構成が必要である。

原核及び真核細胞においてｂＰＬを産生するためには、
慣用されている発現ベクター中にｂＰＬＤＮＡコード配
列を挿入することが必ばである。

Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ、　Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓなどの宿主において作用することのできる原
核生物発現ベクターの例は当業界において周知である。

真核生物発現ベクターとしては、例えばこれらに限定さ
れないが酵母でのガラクトース（（Ｊａｌ　）プロモー
ターベクター（Ｇｏｆｆ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８４　
）　、哺乳動物細胞でのウシパピローマウィルス（ＢＰ
Ｖ）ベクター（ｌｌｏｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８
３）　、ｄＨＦＲベクター（Ｓｕｂｒａｌａｎｉ、　ｅ
ｔ、　ａｌ、、　　１９８１　）などが挙げられる。

真核及び原核細胞において目的とする蛋白質を産生ずる
発現系は今日においては知られているが、そのような手
段を用いて活性ｂＰＬを産生ずることの可能性について
はこれまで証明されていない。

ある蛋白質を産生ずる際に用いる宿主細胞は、それ自身
の独自のグリコシル化を起こすことがある。

このようなグリコシル化パターンが、得られる変化した
グリコシル化部位を有する分子の組成あるいはその活性
に対してどのような特徴を付与するかについては未だ解
明され、ていない。今日の考え方では、グリコシル化は
、適当な蛋白質の組み立て、内部蛋白質のクリアランス
、ｂＰＬなどのホルモンの作用を仲介する生物学的レセ
プターとの相豆関係などの特性に対して重要な影響を与
えることが知られている。ｂＰＬのグリコシル化パター
ンがその生物学的活性に対してどのような役割りを演す
るかについてはこれまで知られていない。

本発明によれば、組換えＤＮＡあるいは化学的方法によ
ってグリコシル化あるいは非グリコシル化型の活性ｂＰ
Ｌを製造するための方法及びｖＡ製物が提供される。本
発明による、グリコシル化及びグリコシル化型の両者の
合成りＰＬが活性を示すという知見は、活性を有するｂ
ＰＬを工業的に製造するための技術に道を開くものであ
って極めて意義深い。実際に、哺乳動物細胞で産生きれ
たｂＰＬを等電点分析し、ウシ胎盤から単離されたｂＰ
Ｌと比較した所、組換えｂＰＬは天然型のｂＰＬとは異
なるグリコシル化パターンを有するが、しかしながら組
換えｂＰＬの活性は保持されているということが確認さ
れた。同様に、ウシ胎盤から単離された脱グリコシル化
ｂＰＬ、及びＥ、　ｃｏｌｉなどの原核生物において産
生された非グリコシル化型のｂＰＬはいずれも活性を有
していた。

本発明の１つの態様によれば、Ｈｏｗｌｅｙ　ｅｔ　ａ
ｔ。

（１９８３）に記載されたと本質的に同じ方法により、
ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）ベクター系を用いて
マウスＣ−１２７ｍ胞にてｂＰＬが産生された。具体的
には、慣用的組換えＤＮＡ技術によりブレｂＰＬをコー
ドするＤＮＡ配列をＢＰＶ発現ベクターに挿入し、かく
して得られるベクターで形質転換された細胞にてｂＰＬ
の産生が可能となる。成熟型ｂＰＬの産生に用いたＢＰ
Ｖ発現ベクターには、ｂＰＬを産生ずるために選択した
宿主細胞において作用することのできるプロモーター、
５′−非翻訳領域、ブレーｂＰＬコード配列及び哺乳動
物細胞の転写終止ポリアデニル化シグナルが含まれてい
る。本発明の１つの態様においては、ＳＶ４０後期ポリ
アデニル化配列とともにマウスメタノチオネインプロモ
ーターが用いられる。

本発明の１つの態様においては、ｃＤＮＡクローンＡ及
びＢが最初にＤＬＪＣ１９などのバクテリアベクターに
それぞれサブクローン化されて次に述べるようにＣＤＮ
Ａクローンの多数のコピーが産生された。即ち具体的に
は、先ずクローンＡ及びＢがそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉによる部分消化に付されて、ｂＰＬをコードする全長
ＣＤＮＡを有するそれぞれ１３５０ｂ１１．１１００ｂ
ｐの断片が得られる。次いでこれら１３５０ｂｌ）及び
１１００ｂｐの断片は、それぞれゲル精製に付され、慣
用的方法によりゲルから溶出される。次いで、クローン
Ａの１３５０ｂｐ所片及びクローンＢの１１００ｂｐ断
片は、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８２
）に記載された組換えＤＮＡ法により、あらかじめＥｃ
ｏＲＩで消化されたｐＵＣｌ　９の多数のクローニング
部位にそれぞれ挿入される。クローンＡ断片あるいはク
ローンＢ断片を含む得られるキメラプラスミドを、それ
ぞれｐＭＯＮ３０２５．１）ＭＯＮ３０２３と命名した
。次いでキメラプラスミドを用いて［、ｃｏｌｉ　ＪＭ
　１０１を形質転換し、次いでＨａｎｉａｔｉｓ　ａｔ
　ａｌ、　　（１９８２）に記載された一般的方法によ
りプラスミドを精製した。目的とする方向でクローンＡ
又はりＯ−ンＢの断片を含むプラスミドを、酵素あるい
は対称部位を開裂する酵素を用いた制限開裂によって確
認した。次いでｂＰＬコード配列をＢＰＶ発現ベクター
に挿入した。

慣用的組換えＤＮＡ技術を用いてｂＰｌ−もしくはブレ
ーｂＰＬ　　ＤＮＡコード配列をＢＰＶ発現ベクターに
挿入した。本発明の１つの態様においては、精製ｐＭＯ
Ｎ３０２５プラスミドをＨｉｎｄＩＩ［で消化し、慣用
的方法により約１．２キロベース（ｋｂ）の断片が単離
された。ギメラｐＭＯＮ３０２３プラスミドも、ｐＭＯ
Ｎ　３０２５と本質的には同様の方法で取り扱うことが
できる。次いで旧ｎｄＩ［［末端をＨａｎｉａｔｉｓ　
ａｔ　ａｌ、　　＜　１９８２）に記載されたと同様の
方法で平滑末端とし、［３ａｍｔ−１１リンカ−を付加
し、次いでメタロチオネイン−Ｉ（ＭＴ−１）プロモー
ター（ＰａｖｌａｋｉｓとＨａｍｅｒ　、　１９８３）
などの強力な宿主特異的プロモーターを含むＢＰＶベク
ターにｂＰＬコード配列を挿入する。ブレーｂＰＬをコ
ードするＤＮＡの挿入は、酵素的リゲーション又は化学
的リゲーションにより行なうことができる。挿入部位は
、ＭＴ−ＩプロモーターがｂＰＬをコードするＤＮＡ　
（例えば構造遺伝子）の転写を誘導するように選択され
る。ＭＴ−■を含むＢＰＶベクター中に正しい方向で構
造遺伝子が挿入されているか否かは、内部対称制限酵素
部位を開裂する制限酵素を用いた消化゛により確認する
ことができる。

次いで、Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９７９）に記
載されたと同じ方法で、キメラＢＰＶベクターによりマ
ウスＣ−１２７細胞をトランスフエフ１〜し、５ｏｕｔ
ｈｅｒｎとＢｅｒ（１（１９８２）に記載されたと同様
の方法により、Ｇ４１８（ゲンチシン）抵抗性に基づき
形質転換体が選択される。次いで、５ｏｕｔｈｅｒｎと
ＢｅｒＯ（１９８２）に記載されたと同様の方法でトラ
ンスフェクトされた細胞を生育し、本明細書の実施例に
おいて記載されるように、ラジオイムノアッセイ法によ
りｂＰＬＤ産生をモニターする。哺乳動物細胞発現ベク
ター系を用いることによって、正しく組み立てられグリ
コシル化され且つ生物学的に活性なりＰＬの産生が可能
となる。驚くべきことに、ｂＰＬの対立遺伝子型は少な
くとも１つのｉｎ　ＶｉｔｒＯ生物学的アッセイにおい
て異なる活性プロファイルを有していることが見出され
た。

また、酵母においてもｂＰＬの産生が可能である。本発
明の１つの態様においては、Ｇｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃ１９８４）に記載された酵母ガラクトース（Ｖａｌ　
）プロモーターを含むベクターに、ＤＮＡをコードする
ｂＰＬが挿入される。ｂＰＬシグナル（゛プレ″）配列
が用いられるか、あるいはｂＰＬシグナル配列の代わり
にアルファファクター（にｕｒｊａｎとＩｌｅｒｓｋｏ
ｗｉｔｚｌｌ　９８２　）などの酵母シグナルペプチド
配列が用いられる。具体的には、ｂ’ＰＬクローンＡ又
はクローンＢ　　ＤＮＡがそれぞれ上記したと同様にし
てＭ１３ベクターにクローシ化される。次イテ、７ｏ１
１ｅｒとＳ＋ａｉｔｈ　　（１９８２）　、Ｚｏｌｌｅ
ｒとＳｍ１ｔｈ　　（１９８３）及びＮｏｒｒｉｓｅｔ
ａｌ、（１９８３）に記載されたと本質的に同様の方法
で、キメラＭ１３ベクターをオリゴヌクレオチド部位特
異的突然変異に付して、ｂＰＬ］−ド配列の最初のアラ
ニンコドン又はバリンコドンの前にＮＣｏＩ部位を導入
する。尚、上記文献の相当部分は本明細書に引用する。

かくして、アラニンコドン又はバリンコドンに隣接した
直前のＤＮＡ配列を、５　’　−ＣＣＡＴＧＧ−３’に
変換する。次いで、キメラＭ１３ベクターをそれぞれＮ
ｃｏ　Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌによる消化に付し、ゲル精
製して約８００　ｂｐのｂＰＬコード配列を得、これを
、あらかじめＮＣＯＩ及びＨｉ　ｎｄＩＩ［で消化した
アルファファクターシグナル配列を含む酵母ｇａｌプロ
モーターベクターに挿入する。次いで、Ｉｔｏｅｔａｌ
、、（１９８３）に記載されたと同様の方法により、キ
メラ１ｆｆｌａａｌベクターを用いてｓ、　ｃａｒｅｖ
ｉｓｉａｅなどの酵母を形質転換する。ロイシン欠損培
地での生育に基づいて形質転換体を選択し、下記するよ
うにしてラジオイムノアッセイ法によりｂＰＬの産生を
モニターする。

更には、ブレーｂＰＬ及び／又はｂＰＬの非グリコシル
化型が、バクテリアなどの原核生物系にて組換えＤＮＡ
技術により産生される。本発明の１つの態様においては
、非グリコシル化型のｂＰＬが以下のようにしてＥ、　
ｃｏｌｉにて産生された。上記したプラスミドＩ）ＭＯ
Ｎ３０２３を３ａｍＨＩ及びＨｉ　ｎｄｌ［［ｒ消化し
、成熟型ｂＰＬをコードする完全なＤＮＡ配列を含む約
８７０ｂｐの断片を得る。次いで、単離された８７０ｂ
ｐ断片を、あらかじめ３ａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌＩＩで
消化したＭ１３ｍｐ９にショットガン法でクローン化す
る。次いで、ｂＰＬコード配列を含むキメラＭ１３ｍｐ
９ベクターを、Ａｍｅｒｓｈａｍ　（Ａｒｔ　ｉｎｇｔ
ｏｎｌｉｅｉｇｈｔｓ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）のオリ
ゴヌクレオチド部位ｉｎ　ＶｉｔｒＯ突然変異系を用い
てオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異に付して、Ｎ
ｃｏＩ部位を導入し成熟型ｂＰＬコード領域のアミノ末
端にイニシエーターメチオニンを付加しそして成熟型ｂ
ＰＬコード配列の５′末端におけるＡ−Ｔ吊を増加せし
める。かかる突然変異に用いたプライマーは次のいずれ
かである。

ＣＯＩ ＭＥＴ八Ｌへ、、、成熟型ｂＰＬ、　、　。

５　’　−ＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡ
ＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡ−３“又は ｃｏＩ ＨＥＴＶＡＬ、、、　成熟ｆｉ　ｂＰＬ、、。

５　’　−ＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧ
ＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡ−３゜突然変異に続い
て、修正されたｂＰＬコード配列を、欧州特許出願公開
Ｎｏ、２４１．４４６　（１９８７年１０月４日公開）
号明細書に記載されたｒｅｃＡプロモーター、ＧＩ［）
Ｌｉｆｔ訳エンハンサ−配列及びＴ７転写ターミネータ
−を含むＥ、　ｃｏｌｉ発現ベクターにサブクローン化
する。次いで、修正されたｂＰＬコード配列を含む発現
ベクターでＥ、　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｇ株などの適当
なＥ、　ｃｏｌｉ宿主を形質転換し、次いで上記した欧
州特許出願公開公報に記載されたと本質的に同じ方法で
、ｂＰＬコード配列の発現を誘導する条件下で形質転換
細胞を培養する。次いで、このような形質転換Ｅ、　ｃ
ｏｌｉによって産生されるｂＰＬ蛋白質を、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉなどのバクテリアから蛋白質を単離するのに用いる
慣用的方法により精製する。あるいは、欧州特許出願公
開Ｎｏ、　　１１４．５０６＜１９８４年８月１日公開
）　、Ｌｌ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ。

４．５９９．１９７：４．５１８．５２６；４゜５１１
．５０２；４．５１１．５０３：及び４゜５８２．７９
９に記載されたものと類似の方法により精製する。Ｅ、
　ｃｏｌｉで産生されたｂＰＬ蛋白質の正しいホールデ
ィング（ｒｏｌｄｉｎｏ　）は、尿素などの適当な変性
剤に蛋白質を溶解し、生物学的活性を有する配置が得ら
れるように蛋白質を酸化することによって達成される。

本発明の他の１つの態様においては、非グリコシル化型
のｂＰＬが酵素的に製造される。具体的には、高度に精
製されたグリコシル化ｂＰＬを、Ｎ−グリカナーゼ（ペ
プチド−Ｎ４　［Ｎ−アセチル−ベーターグルコサミニ
ル］−アスパラギンアミダーゼ）及び／又はＯ−グリカ
ナーゼ（エンド−アルファーＮ−アセチル−ガラクトサ
ミニダーゼ）で処理して、Ｎ−結合オリゴサツカライド
及び〇−結合オリゴサツカライドをそれぞれ除去する。

Ｎ−グリカナーゼ及びＯ−グリカナーゼはＧｅｎｚｙｍ
ｅ　Ｃｏｒｐ、　　（Ｂｏｓｔｏｎ、　ｆｖｌ　Ａ、　
）から入手できる。

本発明によれば、ｂＰＬのオリゴサツカライドを酵素的
に除去してもｂＰＬの活性は低下しないことが見出され
た。実際には、Ｎ−結合オリゴサツカライドを除去する
と活性が上昇する。

本発明の方法及び調製物によって産生及び／又は単離さ
れるブレーｂＰＬ及び／又はｂＰＬは、それらの有効量
を動物に投与することによって動物の乳汁分泌を促進し
及び／又は成長を促進するために用いることができる。

本発明の１つの態様においては、ｂＰＬは、ウシに非口
径投与してウシの乳房柔組織の成長を促進するために用
いることができる。例えばｂＰＬの非経口投与の１つの
方法は、ｕ、　ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ出願明ｍＷに記載さ
れた乳房注入の方法及びそのための組成物によって投与
する方法である。該特許出願は、゛乳房柔組織の成長を
促進するための方法及び組成物”と題する発明であり、
Ｒｏｂｅｒｔ　Ｊ。

Ｃｏ１１ｉｅｒと旧ｃｈａｅｌ　Ｆ、　ＨｃＧｒａｊｈ
が発明者であって代理人ドケットＮｏ、３２−２１　（
５７３４）Ａでありモンサント社にｆｌｌａＩＩされて
いるものである。

例えば好ましくは、それぞれの乳首のストリーク管を通
して、乳汁分泌のないウシ、妊娠中の若い雌牛、受胎可
能な時から最初の妊娠時の間の雌牛などにｂＰＬは投与
される。ｂＰＬの注入は、分娩前の約６０日日から数遍
問に亘って毎日あるいは１日おきに行なうのが好ましい
。ｂＰＬの投与量は、リンパ腺１／４当り１回の投与口
が約１００μシー約２００１１１ｇ、好ましくは約１０
ＩＩｔｇ−約２００ＩＩｔｇ、より好ましくは約１０１
１９−約１１００１ｒｒである。１サイクルの処置の間
に投与されるｂＰＬの全投与量は、約１００μび一約５
００ＩＩｔｇ、好ましくは約５０１９−約１００！ＩＩ
ｇである。

あるいはまた本発明のｂＰＬは、注射、注入又はポリマ
ーを用いた移植などの方法によってウシに皮下又は筋注
投与されて、循環系に目的とする投与量のｂＰＬを供給
することができる。溶液剤、エマルジョン剤、ゲル剤な
どの薬学的に許容し得る基剤からなる製剤の形態を採用
することができ、これらの製剤はカプセル化されていて
もよくまたされてなくともよい。これらの製剤には、単
一のｂＰＬ型又はそれらの混合物を含有せしめることが
できる。投与量は、１日もしくはそれ以上の日数当り動
物１匹に対して少なくとも約０．００５η−約２００Ｉ
Ｉ！ｇであり、好ましくは動物１匹当り１日約５■−約
４０■である。目的とする生物学的効果を達成のするた
めの最適な有効投与量は、通常の実験から決めることが
できる。ｂＰＬの実験の好ましい投与量は、動物の大き
さ、健康状態、栄養状態、生殖条件などによって変動す
る。

実施例 材料と方法 全てのオリゴヌクレオチドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉＯ３
ｙ３ｔｅｉｌＳ　　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザーを用いて
製造者＾１）Ｄｌｉｅｄ　Ｂ１０３ＶＳｔｅｎ＋Ｓ、　
ＩｎＣ、　（ｒｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔＶ、ＣＡ　）の方法
に従って合成した。他にことわりのない限り、全ての特
別化学品は５ｉｕａ　　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
から入手した。制限酵素及びＤＮＡ修正酵素はＮｅＷ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　’Ｂｉｏｌａｂｓ　　（Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ、Ｍ　Ａ　）　、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ　　（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）及びＢｅｔｈｅＳ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　［
Ｂ　ＲＬ　］（ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒＯ，Ｍ　Ｏ）か
ら入手し、製造者の指針に従って使用した。ｐＵｃ８及
びｐＬＪｃ９プラスミド４；ｔ　Ｂ　ＲＬ　（ａａ＋ｔ
ｈｅｒｓｂｕｒａ、　Ｍ　Ｏ）から入手した。

Ｑ−セファロース、セファデックスＧ−７５及びセファ
デックスＧ−５０極微粒子はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａＶ、　Ｎ　Ｊ　）から入手した。Ａ＋ｅ
ｉＣＯｎＧＨ２５は八ｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　　（Ｄ
ａｎｖｅｒｓ、Ｍ　Ａ　）から入手した。Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅ　　Ｃ１８カラムはＢｒｏｗｎｌｅｅＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　　（５ａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ、　ＯＡ　
）から入手した。アセトニトリルはＢｕｒｄｉｃｋとＪ
ａｃｋｓｏｎ（Ｈｕｓｋｅｏｅｎ、　Ｍ　［）から入手
した。Ｐｅｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　ＩｍｅｒＬ　Ｃ１−１０
０Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍｌンビューターインテグレ
イクー及びシリーズ４液体クロマトグラフはＰｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ　（Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ　）から入
手した。

ヨードゲンはＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
、　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

ＩＬ）から入手し、下記した方法により使用した。

正常ラビット血清及びヤギ抗ラビット血清はＢｉｏｔｅ
ｋ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　（Ｓｈａｗｎｅｅ　Ｍｉｓｓ
ｉｏｎ、Ｋ　Ｓ　＞から入手した。

ウシ胎盤ラクトゲン（ｂＰＬ）及び／又はそのペプチド
断片のアミノ酸配列決定は、 Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）
に記載された方法に従いＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅＩａｓ　Ｍｏｄｅｌ　　４７０Δ蛋白質シークエン
サー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ１０５１／５ｔｅｌｌＳ、　
ＩｎＣ、。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＯＡ　＞を用イテ実施した
。ツレツレのフェニルチオインダントイン（ＰＴＨ）−
アミノ酸誘導体は、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　（Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　（Ｓａｎｔａ　Ｃ
１ｅｒａ、ＣＡ）　２．１１１直、径ＰＴＨ−ＣＩ　８
カラムを備えたＡｐｐｌｉｅｄＢｉＯ３ｙＳｔｅｌＳ　
　ＩｎＣ、　（Ｆｏｓｔｅｒ　ｃｉｔｙ、　ＣＡ　）　
　Ｎｏｄｅ１１２０Ａ　　ＰＴＨアナライザーを用いて
オンライン法による逆相高速液体クロマトグラフィーに
より同定した。他にことわりのない限り、全ての特別化
学品はＳｉｇｍａ　　（ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｈｉｓ
ｓｏｕｒｉ　）から入手した。制限酵素及びＤＮＡ修正
酵素は、ＮｅｗＥｎｏｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　　（
Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　　（Ｂｏｓ
ｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）又はＢｅｔ
ＭＳｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｔｅ
ｓ　（Ｂ　ＲＬ　）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｏ、　Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）から購入し、製造者の指針に従って使
用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＰｒｏｎ＋ｅｇａ　ｅｔ
ｏｔｅｃ　（Ｈａｄｉｓｏｎ、旧５ｃｏｎｓ　ｉ　ｎ　
）から購入し、製造者の明細書に従って使用した。　Ｐ
ラベル化ヌクレオチド及びＩ　　ラベル化プロティンＡ
　は八ｍｅｒｓｈａｎ＋　　（Ａｒｌｉｎａｔｏｎ　　
ｌｌｅｉｇｈｔｓ、　　ｌ１ｌｉｏｎｉｓ　　）から購
入した。ベクターＭ１３ｍｐ９及びｐＵＣ１９はＢ　Ｒ
Ｌ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍ　Ｄ　）から入
手した。

全てのバクテリア生育培地成分及び抗生物質は、５１ｇ
１Ｉｌａ　　（Ｓｔ、　Ｌｏｖｉｓ、　Ｈｉｓｓｏｕｒ
ｉ　）又はＤｉｒｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｈｉｃ
ｈｉｇａｎ　）から入手した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ用の生育培地、及びアンピシリン抵抗性
（ａｍｐ’　）マーカーを含むプラスミドを保持したバ
クテリアの選択条件は、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ
。

（１９８２）に記載されたものと同じであった。

蛋白質発現用に用いる時には、Ｅ、　Ｃ０１ｉは、１０
０μｇ／１ｔｔｌｌアンピシリンを添加したＬｕｒｉａ
ブロース（ＬＢ）又はＭ９最少培地（Ｈａｎｉａｔｉｓ
　ｅｔ　ａｔ、。

１９８２）で生育させた。組換えベクターによるＥ、　
ｃｏｌｉ宿主細胞の形質転換はＨａｎｉａｔｉｓ　ａｔ
　ａｌ、。

（１９８２）に記載されたと同様の方法により実施した
。

組換えＥ、　ｃｏｌｉ宿主細胞によって産生されるウシ
胎盤ラクトゲンの単離及び精製は以下のようにして実施
した。組換えＥ、　ｃｏｌｉ細胞を旧ｔｒａ−Ｔｕｒｒ
ａｘ　（Ｔｅｋｍａｒ、　Ｃｏ、、　Ｃ１ｎｃｉｎｎａ
ｔｉ、ＯＨ）でホモジナイズした。次いで、細胞を７０
００−９００Ｑｐｓｉで３回あらかじめ冷却したＨａｎ
ｔｏｎ　Ｇａｕｌｉｎ（ＡＰＶ　　Ｇａｕｌｉｎ、　Ｅ
ｖｅｒｅｔｔ、　　ＭＡ）に通してライシスし、次いで
２５．０ＯＯｒｐＩ！１で４℃で２０分間遠心した。単
離したペレットをリンスし、上記と同様にしてホモジナ
イズし、尿素を加えて終濃度４．５Ｍ尿素となるように
した。次いでＮａＯＨを用いてｐｔ＋を１１．３に調整
し、撹拌しながら４℃で約２１ｉ２日間放置してｔ）Ｐ
Ｌ蛋白質で再構成（ｒｅｆｏｌｄ）させた。次いで、得
られる混合物を２５．００Ｏｒｐｍで４℃で３０分間遠
心し、上滑をＣ−８カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏ
Ｃ、。

Ｄｅｅｒｒｉｅｌｄ、　ｌ１ｌｉｏｎｉｓ）を用いた逆
相ＨＰＬＣに付り、　ｔｃ。ｂＰＬｅ、０．１　％　（
Ｖ／Ｖ）Ｔ　ＦＡヲ含む４５−６０％（Ｖ／Ｖ）アセト
ニトリルグラジェントでカラムから溶出した。

以下のようにして、ｂＰＬについてラジオイムノアッセ
イを実施した。ヨードラベル化するために用いた高度に
精製したｔ）ＰＬと同様に、アッセイ用の抗血清ＵＳＤ
Ａ−ｂＰＬ−Ｆ５６を口、Ｊ。

Ｂｏｌｔ、　Ｕ、　Ｓ、　Ｄ、　Ａ、、　Ｂｅ１ｔｓｖ
ｉｌｌｅ、ＭＤから得た。

５ａｌａｕｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、）　　（１９８
１）に記載されたと本質的に同様にしてヨードケン法に
より、ｂＰＬをヨードラベル化した。具体的には、ヨー
ドケン１μグをガラステストチューブの壁土で乾燥せし
め、これに、１０μ９ｂＰＬを含む０．５Ｍ　リン酸ナ
トリウムバッファー、ｐＨ７，６（３ＯμＺ　）及び１
０　ｕ　Ｃｉ　Ｎ　ａ　［Ｉ　ｉを加えた。

室温で１０分間反応を進行させた。セファデックスＧ５
０のカラム０．７５ｘ２５αを用いて、ヨードラベル化
ｂＰＬを分離した。アッセイバッファー［４０ｉＨリン
酸ナトリウム、４ＱｍＨＮａＣ１，１０ｍＨＥＤＴＡ、
０，１％ＮａＮ５（１４／Ｖ）　、０．１２５％ゼラチ
ン（−／Ｖ）　、ｐＨ７、３］で１１５０００に希釈し
た抗血清（１００μｍ）を、希釈サンプル２００μｌ又
はスタンダード（０，１−１００ｎＭチューブ）とヨー
ドラベル化ｂＰＬ２００μｊ！　（約１０ｇ／チューブ
）との混合物に加えた。正常ラビット血清（１００μｌ
）及びヤギ抗ラビット血清（１００μｌ）を加える前に
、チューブを室温で２．５〜３時間インキュベートした
。チューブを少なくとも６時間インキュベートし、遠心
（３，５００ｘｇで２０分間）により沈殿物を沈殿させ
た。上清を吸引し、ガンマカウンターでチューブをカウ
ントした。

組換えＤＮＡ技術により製造したｂＰＬの活性は、以下
のようにしてウシ肝ラジオレセプターアッセイにより測
定した。）ｌａｒｏ　ｅｔ　ａｔ、　　（１９８４）に
記載された方法により、妊娠５−６ケ月目のウシから、
ソマトトロピンレセプターを含む粗膜調製物を得た。次
いで以下のようにしてラジオレセプターアッセイを実施
した。サンプル又は組換えウシソマトトロピン（ｂｓＴ
）スタンダードの１００μｌを、１３Ｘ１００ｍポリス
チレンアッセイチューブ中のアッセイバッファー［２５
ｍＨＴｒｉｓ−１」ｃｊ！、１０１ＨＣａＣｊ！２．０
．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳ△、ｐＨ７，６１２００Ｌｔｉに
加えた。

これに、１００μｊ２［１］ｂｓＴ［約１００゜０００
ｃｐｉ／チューブ；比活性６０−１００μＣｉ／μ９　
：Ｈａｒｏ　ｅｔ　ａｔ、、　（１９８４）に記載され
たラクトベリオキシダーゼ法によりヨードラベル化した
］及び再懸濁肝膜調製物（４−６Ｒｇ／＊）１００μｌ
を加えた。一定速度で振とうしながら、室温で１晩チユ
ーブをインキュベートした。氷で冷ｆＪ］　Ｌ、たアッ
セイバッファー（２ｄ）を加えてアッセイを終始せしめ
、次いで室温で２０００Ｘ９で３０分間遠心した。上清
を吸引し、得られるベレットをガンマカウンターでカウ
ントした。１００、ＯＯＯｘｇ膜の肝結合部位に対する
、２５℃、ｐＨ７，６，２４時間での［Ｉ］ｂＳＴとの
ｂＰＬの競争結合能力によって、活性が示される。

慣用的方法により、レセプター結合親和性を測定した。

また、胎盤から精製したｂＰＬ及び組換えＤＮＡ技術に
より製造した。ｂＰＬのソマトトロピン様活性は、イン
シュリンによって促進される脂質への［１４Ｃ］−グル
コース取り込みの抑制効果を測定することによって３Ｔ
３−１１アジボサイトにて測定した。ｂＰＬの抗インシ
ュリン活性を、ウシソマトトロピンスタンダードの活性
と比較した。本アッセイは、３Ｔ３−１１アジボサイト
におけるグルコースの利用はインシュリン又はソマトト
ロピンによって逆にレギュレートされているという知見
に基づいている。ソマトトロピンは、用量依存的に５０
％まで、インシュリンによって促進される［１４Ｃ］−
グルコースの脂質への取り込みを直接的に抑制する。イ
ンシュリン（Ｒｅｇｕｌａｒ　［１ｅｔｉｎ■、１００
ユニツト／ｃｃ）はＥｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ、　ＩｎＣ、、
　［ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　　Ｉ　Ｎから購入した
。ウシ下垂体ソマトトロピン及び組換えウシソマトトロ
ピンは、Ｏｒ、　Ａ、　Ｆ、　Ｐａｒｌｏｗ、　ｔｌａ
ｒｂｏｒ−Ｌｌ、　　Ｃ，Ｌ、　　Ａ、　　Ｍｅｄｉｃ
ａｌ　　Ｃｅｎｔｅｒ、　　Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、　　Ｃ
Ａ。

から購入した。全ての細胞培養は滅菌条件下で実施し、
ＲｅｅｄとＬａｎｅ　（１９８０）及びＳｃｈｗａｒｔ
ｚ　（１９８４）に記載された方法の変法に基づいて実
施した。

３Ｔ３−１１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー−
’ｍｌレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ　Ｄ　Ａ　
Ｔ　ＣＣＣＣＬ９２．１）の培養物を、培養培地［１０
％（Ｖ／Ｖ）子ウシ血清、１００ユニツト／Ｉｌ！ｉ！
ペニシリン、１００μ９７ｄストレプトマイシン及び２
１１８し一グルタミン（全てＧｉｂＣＯ，Ｇｒａｎｄ　
ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ。

Ｙ、から入手した）を含む４．５９／１グルコース（高
グルコースＤＭＥ）及びＤｕｌｋｅｃｃｏ−Ｖｏａｔ　
修正イーグル培地］を含む１００履組織培養皿で、７．
５％ＣＯ２及び９２．５％空気からなる湿った雰囲気下
で３７℃で、生育せしめた。指数関数的に生育する細胞
の培養ストックを３−４日間毎にサブカルチャーし、集
密化するのを防いだ。細胞をサブカルチャーするために
、吸引により培地を除き、Ｃａ２＋とＭｑ２＋を含まな
いＤｕｌｂｅｃｃｏ（７）　ＩＪシンｍｍ化食塩水で２
回細胞層をリンスした。プラスチック製器から３Ｔ３−
１１細胞を取るために、細胞を０．０５％（１４／Ｖ）
　トリプシン及び０．０２％（１４／Ｖ）　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａの等張緩衝溶液とともに３７℃で５−１０分間イン
キュベートした。分散した細胞を皿からリンスして取り
、遠心チューブに移し、１５０Ｘ９で２２℃で５分間遠
心した。

細胞ベレットを新たな培養培地に再懸濁し、新たな１１
００ＩｌＩ１皿に３．８−７．６ｘ１０２細胞／ｃｍ２
／１０Ｉｄ培地の割合で、あるいは６０ｓ皿（Ｆａｌｃ
ｏｎ）に３．０−５．０ｘ１０３細胞／　ｃａｒ　２／
４ｄ培地／皿の割合いで接種した。３Ｔ３−１１細胞の
アジボサイトへの変換は、分化培地［２μｇ／ＩＩｉイ
ンシュリンを含む高グルコースＤＭＥ。

０．５ｍＨ１−メチル−３−イソブチルキサンチン（Ｓ
ｉｕａ、Ｓｔ、　Ｌｏｖｉｓ、Ｍ　Ｏ）　、２５　ｉＭ
デキサメタシン（Ｓｉｏｍａ　）　、１００ユニット／
−ペニシリン、１００μ！？／ｄス１ヘレブトマイシン
、２ｍＨ１，−グルタミン、及び１０％（Ｖ／Ｖ）胎児
ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）］　２．５ｍを加えることによ
って開始され、４８〜７８時間後に集密培養物となった
。３７℃で４８時間培養後に、吸引により分化培地を除
去し、子ウシ血清に代えて胎児ウシ血清１０％（Ｖ／Ｖ
）を含む培養培地２．５ｄで更に７２時間インキュベー
トした。フェーズコントラスト顕微鏡により調べた所、
細胞の７０％〜９５％がアジボサイトに変換されていた
。実験を行なう２０〜２４時間前に、培養培地を血清を
含まない培地［ウシ血清アルブミン（Ｓｉａｍａ　＃Ａ
−６００３　）　１％（Ｗ／Ｖ）　ヲ含む低グルコース
ＤＭＥ　（１９７Ｉｔグル］−ス）、１００ユニツト／
ｄペニシリン、１００μｇ／緘ストレプトマイシン及び
２ｍＨＬ−グルタミン１２．５ｙＴ：置換した［ＧＩｅ
ｎｎ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８８）　　コ　。

目的とする濃度のホルモン（例えばインシュリン、ソマ
トトロピン、ｂＰＬ）を、２．５−血清フリー培地中の
変換細胞の単層に加えた。ホルモンを加えて６時間後に
、均一にラベル化したＤ−［１４ＣＩグルコース０．２
５μＣＩを、１００μｌ血清フリー培地中のそれぞれの
培養細胞に加え、３７℃で１８時間インキュベートした
。培地を完全に吸収することによって、脂質へのＤ−［
１４Ｇ］グルコースの取り込みをストップし、次いで直
ぐに２．０ｄのＤｏｌｅ試薬［７８％（Ｖ／Ｖ）イソブ
Ｏビルアルコール、２０％（Ｖ／Ｖ）　ＨＰ　Ｌ　Ｃグ
レードｎ−へブタン、及び２％（Ｖ／Ｖ）　１　、０Ｎ
Ｈ２Ｓｏ　　４　　］　　　［Ｄｏｌｅと　Ｈｃｉｎｅ
ｒｔｚ　　（１９８０）　　　］を加えて２２℃で１５
分間インキュベートし、細胞層を溶解した。ガラスパス
シールとベットを用いて皿の表面上に抽出バッファーを
滴下するのを繰り返して溶解した細胞層を分散せしめた
。得られる混合物を１６×１００１ｄポロシリケートガ
、ラスねじぶたチューブに移し、２．０−の００１０試
薬を加えて各プレートをリンスし、最初の抽出液を貯め
た。それぞれの抽出チューブに、１．７５ｍ水及び１．
７５ｄｎ−へブタンを加え、チューブを混合した。有機
溶媒層及び水性溶媒層を分離し、上部の有ｔ３）１２．
０ｄをシンチレーションバイアルに移し、５　、　Ｏｄ
ＲｅａｄＶ　−５ｏｌｖ”　（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ、　ＩｎＣ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、
　ＣＡ　）をそれぞれのバイアルに加え、それぞれの放
射活性をＢｅｃｋｍａｎ液体シンデレージョンカウンタ
ーを用いて測定した。

ｒｅｃΔプロモーターからの転写誘導を以下のようにし
て簡単に行なった。発現ベクターを保持するＥ、　ｃｏ
ｌｉ宿主細胞を１晩培養し、０．２５％（−ハ）グルコ
ース、１％（Ｗ／Ｖ）カブミノ酸及び０．２５μｇ／ｄ
チアミノを添加したＭ９最少培地により２０〜２５に１
ｅｔｔユニツト（グリーンフィルターを用いたＫＩＯｔ
ｔ−８ｔｌｌｌｌｅｒＳＯｎメーター、にＩｅｔｔ　）
ｉｆ（＋、　Ｃｏ、、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ
　Ｗｏｒｋ、により測定）に希釈し、細胞濃度１５０１
８０にＩｅｔｔ　ユニットまで生育せしめた。次いで、
ナリジクス酸を終１度５０μｇ／ｄで生育培地に加えて
細胞を誘導けしめた。３７℃で数時間生育を継続せしめ
、誘導２又は３時間後に異種蛋白質分析用にそのアリコ
ートを取り出した。目的とする遺伝子生成物の産生を最
大とするために、生育期間中は高レベルの通気を行なっ
た。

実施例１ 胎児ウシ胎盤からの　シ　盤ラクトンの棗−及び精製 妊ｔＳ６−８ケ月の食肉用の牛から胎盤を得た。

胎児胎盤腫から顆粒を豊富に含む分画（ＧＥＦ）の溶解
物を、Ｂｙａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　　（１９８６）に
記載されたと同様の方法により調製した。

Ｂｙａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　　（１９８６）に記載さ
れた方法の変法により、ＧＥＦ溶解物からウシ胎盤ラク
トゲン（ｂＰＬ）を精製した。具体的には、ＧＥＦ溶解
物５０ｍをセファデックスＧ−７５極微粒子のカラム（
５ｘ　１００ｃｍ）に付し、２０ｍＭＢ　＋　！３−Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣ１バッファー、Ｉ）８６．５を用いて
流速１２０ｄ／ｈｒで溶出した。３つのＧ−７５カラム
から流出するｂＰＬを含む両分をラジオイムノアッセイ
により決定し、これらの両分を集めてＱ−セファロース
カラム（３，２ｘ１３．５３）に付し、ＮａＧ１　０−
２５０１１８を含む２０ｍＨＢ　ｉ　５−Ｔｒ　ｉ　５
−ＨＣＡバッファー、１）１１６．５テ流速１８０ｓｄ
！／ｈｒで流出した。約１００ｍＨＮａＣｊ！で溶出す
るｂＰＬを含む画分を集め、これにトリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）を２０＋＋＋Ｈまで加えた。ｂＰＬを含むＱ−
セファロース画分を、ｖｙｄａＣ０４カラム（１０−１
５オングストローム孔サイズ；５μｍ粒子サイズ：１０
ｘ２５０　ｙａ　）に流速６１１１／１ｎで付し、次い
で４０％（Ｖ／Ｖ）　７ｔ？トニト１ＪｊＬｚ、２０ｍ
ＨＴＦＡｒ５分間平衡化した。４０−５０％（Ｖ／Ｖ）
アセトニトリルグラジェントで３０分間に亘ってｂＰＬ
を溶出させた。濃度を７０％（Ｖ／Ｖ）に上昇する前に
、カラムから残存している蛋白質を流出させるために５
０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルで５分間溶出させた。

ゲル濾過（＾ｍ１ｃｏｎ　　Ｇ　Ｈ２５，２，８Ｘ２５
ｃ！Ｒカラム）により、逆相工程で得たｂＰ’Ｌを含む
画分中のアセトニトリル／ＴＦＡを２５ｍＭヒスチジン
−ＨＣｌ、ａｌ１６．３に変換した。この材料（約１〜
２Ｉ＃ｇ蛋白質を含む）４０〜５０ｄを、２５１ＤＨヒ
スチジン−ＨＣｌ、１ｌＨ６，３で平衡化したモノーＰ
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
、　Ｎ　Ｊ　）に付した。ポリバッファー７５（１／１
２希釈）　、ｐ＋＋４．０で流速０．５ｄ／ｍｉｎで、
ｂＰＬのイソフオームを流出した。ｂＰＬの３つの主要
なイソフオームをそれぞれ含む両分を集め、水で２０ｍ
１！に希釈しＴＦＡを加えて：）ＱｍＨとした。次いで
、それぞれの両分を流速１　＃Ｉｉ！／１ｎでＢｒ０Ｗ
ｎｌＱｅ　　Ｃ１８カラム（３００Ａ孔サイズ；７μｍ
粒子サイズ；２、ｌＸ３０ｍ＋）に付した。流速１ｍ／
ｎｉｎで２０％（Ｖ／Ｖ）　７セトニトリル、２０ｍＨ
ＴＦＡｒ５分間カラムを平衡化した。次いで、２０〜５
０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルグラジェントで１５分間
かけそのうち５０％アセトニトリルで５５分間かけてｂ
ＰＬを流出した。ｂＰＬビークを集め一２０℃で保存し
た。

精製ｂＰＬを、ブタソマトトロピンなどの蛋白質スタン
ダードを用いて評価した。公知の壜のソマトトロピン（
０，５−５μｇ）をａｒｏｗｎ＋ｅｅＣ１８カラム（２
，１ｘ２０ｓ）に付し、２０−５０％（Ｖ／Ｖ）アセト
ニトリルグラジェントで５分間で流出させた。Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　（Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）ＬＣｌ
−１００ラボラトリーズコンピューターインチグレイタ
ーを用いてピークの下の面積を計算した。次いで、ｂＰ
Ｌのサンプル（ｉｌ１度未知）を流出させピークの下の
面積を計算した。ソマトトロピンスタンダードカーブの
外挿によりｂＰＬの濃度を計算した。

ｂＰＬのＮ末端配列分析を行なう前に、約１０〜１００
μｇ蛋白質を含むｂＰＬアリコートをテフロンチューブ
に移し、５ｐｅｅｔｉ　ＶａＣコンセントレイター（Ｓ
ａｖａｎｔ、　Ｆａｒｉｉｎｇｄａｌｅ、　　ＮＹ）ｔ
’溶媒を除去した。次いで、３０％（Ｖ／Ｖ）アセトニ
トリル約１００μｌにｂＰＬを再溶解した。かくして精
製し単離されたｂＰＬのＮ−末端領域についての、また
内部トリプシン及び■８プロテアーゼで産生される多く
のペプチドについてのアミノ酸配列情報を得た。成熟型
ｂＰＬ蛋白質及びシグナルペプチド領域の完全アミノ酸
配列が、第１図に示したように決定された。イソフオー
ムのｂＰＬの領域においては、アミノ酸配列に相違が見
出されなかつた。またｂＰＬ蛋白質は、Ｎ及び〇−結合
グリコシル化の両者を含んでいた。

実施例２ ウシ胎盤ラクトゲンをコー゛するｃＤ　Ａの０定 ｂＰＬＩＩ及びｂＰＬＩ［［と命名した２つの４５塩基
（４５−マー）のオリゴヌクレオチドを、それぞれｂＰ
Ｌの内部配列及びＮ−末端配列をコードするものとして
デザインした。ｔ）ＰＬＩＩ及びｂＰＬＩ［［４５−マ
ーのヌクレオチド配列は次の通りである。

ｂＰＬＩＩＩ：　３’−ＣＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＧ
ＧＧＧＧ＾ＴＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＧＧＧＣＣＧ
ＴＴＧＡＣＧ−５’ｂＰＬＩＩ：　　３°−ＴＧＧＧＧ
ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧ
ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧ−５゜Ｃｈｉｒｏ＊ｉ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７９）に記載された方法に
より、妊娠７ケ月のウシ胎盤からメツセンジャーＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ）を調製し、またｏｈａｙａｍａとＢｅｒ
（１（１９８２）及びＧｕｂｌｅｒとＢｏｗｍａｎ　　
（１９８３）に記載された方法に基づきｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ（Ｓａｎ　Ｄｉｅａｏ、　（Ａ）から購入した試
薬を用イテλｇｔ１０ｃＤＮ△ライブラリーを調製した
。

Ｕｌｌｒｉｃｈ　ａｔ　ａｌ、　（１９８４）に記載さ
れた方法により、ｂＰＬ］Ｉ及びｂＰＬＩＩＩオリゴヌ
クレオチドプローブを用いてλＱｔ１０ライブラリーを
スクリーニングし、２つのポジイティブクローン、即ち
クローン△及びクローンＢと命名した２つのクローンを
選択し、これらを更に分析した。２つのクローンの部分
制限酵素地図は第２図に示したように決定された。

第２図に示されているように、部分制限酵素地図の下の
矢印は、ＤＮＡ配列についての情報を得るために用いた
クローン△、クローンＢの領域を示している。

Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏｒｐ、　（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。

Ｏ）」）から入手した５ｅｑｕｅｎａＳｅＴＨキツトヲ
ヲ用イてＤＮＡ配列決定を実施した。クローンへ及びク
ローンＢのヌクレオチド配列は、オーバラップしている
配列の全てについては同じであることが判明した。

ｂＰＬ　（成熟型蛋白質及びシグナルペプチド領域）に
ついての完全なＤＮＡコード配列は第１図に示したよう
に決定された。ｃＤＮＡ上のポリーＡテイルの存在によ
り、３′末端が十分に保持されているクローンが得られ
たことが示された。イニシエイションメチオニンから７
２塩基（ｂｐ）上流にインフレームストップコドンが存
在していることが判った。成熟型ｂＰＬ蛋白質は以下に
示す配列で始まっており、これは実施例１に記載した単
離精製ｂＰＬについて求めたＮ末端アミノ酸配列と一致
している。

Ｘ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ、　、　、　。

（式中、ＸはＡｌａ又はＶａｌを示す）更には、配列か
ら以下のことが判った。即ち、ｂＰＬ蛋白質は第１図に
線形を付けて示したように１つのＮ−結合グリコシル化
部位を有しており、また少なくとも１つの〇−結合グリ
コシル化部位、６個のシスティン残基及び２個のトリプ
トファン残塁を有しくプロラクチンと同様）、ウシプロ
ラクチンのアミノ酸配列と約５０％の相同性を有してお
り、ウシソマトトロンのアミノ酸配列とはわずかに約２
５％の相同性しか有していないことが判明した。ｂＰＬ
とウシソマトトロピンとの低いＤＮＡ配列相同性（例え
ば２５％）は、１）ＰＬとウシソマトトロピンとの生物
学的活性における類似性から判断すれば全く予期外のこ
とである。

実施例３ Ｅ、　ｃｏｌｉでのｂＰＬの産生 ｐＵｃｌ　９ベクターの多数のクローニング部位に、ｂ
ＰＬのバリン又はアラニン対立遺伝子型をコードするＣ
ＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＭＯＮ３０２３又はｐ
ＭＯＮ３０２５を、それぞれＭ１３ｍｐ９にサブクロー
ン化した。上記したようにして、ｂＰＬコード配列をオ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異に付して、それぞ
れのｂＰＬ構造遺伝子（例えば成熟型ｂＰＬコード配列
）のＮ末端にＮＣＯＩ部位及びメチオニンコドンを導入
し、ｂＰＬコード配列のＮ末端部分における△−Ｔｆｆ
ｉを上界せしめた。突然変異後に、修正ｂＰＬコード配
列をそれぞれＭ　１３　ｌ′ｌ１ｐ９ベクターからＮｃ
ｏＩ−Ｈｉ　ｎｄｌｌ断片として単離した。

次いで、欧州特許出願公開Ｎｏ、２４１．４４６（１９
８７年１０月１４日公開）に記載されているようにして
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｒｅｃ　Ａでプロモーター、Ｇ１０Ｌ
配列及びＴ７転写終止配列を含むｐＢＲ３２７ブラスミ
ドにそれぞれ挿入した。得られるキメラ発現ベクターを
それぞれｐＭＯＮ３０６８、ｐＭＯＮ３０６９と命名し
た。これらのベクターは、それぞれｂＰＬのアラニン又
はバリン対立遺伝子型をコードする配列を含んでいる。

次いで、ｐＭＯＮ３０６８又はｐＭＯＮ３０６９でＥ、
　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｇ株で形質転換し、ｂＰＬコー
ド配列の発現が誘導されるような条件下で従って形質転
換Ｅ、　ｃｏｌｉによってｂＰＬの産生が起こるような
条件下で上記したようにして培養した。

次いで上記したようにして、Ｅ、　ｃｏｌｉ産生アラニ
ン変異ｂＰＬを単離精製し更に再構成して、上記したウ
シ肝ラジオレセプターアッセイを用いて生物学的分析を
行なった。

驚くべきことに、非グリコシル化蛋白質として産生され
たＥ、　ｃｏｌｉ産生アラニンｂＰＬは、ウシラジオレ
セプターアッセイにおいて活性を示した。

実施例４ Ｃ１２７マ　ス　　におＩ　ｂ　　の　！上記したプラ
スミドｐＭＯＮ３０２３．３０２５をそれぞれＨｉ　ｎ
ｄｌ［ｌで消化し、約９００塩基対（ｂｐ）及び１．２
６ｋｂの断片をそれぞれ精製した。これらの精製断片に
はブレーｂＰＬをコードする全ての領域は含まれている
が、天然型ｂＰＬポリアデニル化シグナル又は３′非翻
訳領域はもはや含まれていなかった。次いで、それぞれ
の断片の末端を７４ＤＮＡポリメラーゼを用いて充填し
て平滑末端とした。次いで、それぞれの末端に３８ｍＨ
Ｉリンカーを連結し、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで消化し、約８
９０ｂｐ及び１．２３ｋｂのＢａｍＨＩ断片をそれぞれ
得た。次いで、バリン又はアラニン対立遺伝子コード配
列を含む３８ｍＨＩ断片を、マウスメタロチオネイン（
ｍＭＴ＞プロモーター及びＳＶ４０後期ポリアデニル化
部位を含むウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）ベクター
に、ｍＭＴプロモーターがｂＰＬコード配列の転写をコ
ントロールするように、挿入した。

次いで、Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９７９）
に記載されたと同様にして、キメラｂＰＬ含有ＢＰＶベ
クター及び３　Ｖ　２　ｎｅｏベクターで、３つのセル
ライン、マウスＣｌ２７、ベビイハムスター腎及びマウ
スＮＩＨ３Ｔ３１［１１１１をトランスフェクトし、形
質転換体をＧ４１８抵抗性に基づき選択した。単離した
コロニーを増殖せしめ、上記した如きラジオイムノアッ
セイによりｂ　ｐ　ｌ−の産生をモニターした。

次いで、組換えＣ１２７細胞で産生されたｂＰＬのアラ
ニン又はバリン対立遺伝子型について、上記したと本質
的に同様の方法により、ラジオレセプターアッセイにて
ｂＰＬ活性の存在を調べた。具体的には、ｂＰＬのアラ
ニン又はバリン変異体でトランスフェクトしたＣ１２７
細胞の培養培地を一連の濃度で希釈し、得られる希釈物
より希釈カーブを作成し、これを、胎盤から精製した天
然型のｂＰＬの希釈物から得た希釈カーブと比較した。

組換え技術により産生されたｂＰＬの２つの対立遺伝子
型は、［Ｉ］ｂｓＴと置換することができ従ってソマト
トロピンレセプターに特異的に結合できることが示され
た。更には、ｂＰＬのバリン変異体の希釈カーブは、天
然型の精［ｂＰＬ及びｂＰＬのアラニン変異体（例えば
対立遺伝子型）の希釈カーブより急勾配であることが判
明した。希釈カーブの傾きの相違から、ソマトトロピン
レセプターのバリン変異体に対する親和性は、天然型ｂ
ＰＬ及びアラニン変異体に対する親和性より大きいこと
が判った。アラニン変異体に比べてバリン変異体が高い
結合親和性を有することから、バリン変異体（バリン対
立遺伝子型）は、ｂＰＬ活性に関係した成長ホルモンに
対して強力な増強作用を有するものと考えられる。

従って、ｂＰＬのそれぞれの対立遺伝子型が動物におい
て強力でかつ特異的な生物学的応答を誘導することがで
きるため、これらのｂＰＬ対立遺伝子型を実質的に純粋
な形態で産生できるということは極めて意義深い知見で
ある。

また、組換えＣ１２７細胞において産生されるｂＰＬの
アラニン及びバリン対立遺伝子型について、上記したよ
うにして、３　Ｔ　２−　Ｌ　１アジボサイトアツセイ
法によりソマトトロピン様活性を調べた。かかるアッセ
イの結果から、ｂＰＬの両者の対立遺伝子型は、ソマト
トロピンと同様の伍で［１４Ｃ］−グルコースの取り込
みを抑制したことが判った。しかしながら、その抑制ｊ
は、ソマトトロピンで観察された抑制量に比べてわずか
に少なかった。

以上に示した実施例は本発明の好ましい態様を説明する
ものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本
発明の好ましい態様に関連して本発明を説明したが、そ
れらの各種の改良は本明細書の記載から当業者には明ら
かであろう。

以下に示す文献の相当する部分の記載を本明細書中に引
用する。

Ａｒ１ｎ＋ａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ　１１３　：２１８６−２１９４゜ Ｂｕｔｔｌｅ、　Ｈ，Ｌ、及びＦＯｒＳｌ／ｌｈ、　１
．＾、　（１９７６）　Ｊ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　６８：　１４１−１４６゜Ｂｙａ
ｔｔ、　Ｊ、　Ｃ，及びＢｒｅ＋ｎｅｔ、　Ｉｔ、　Ｄ
、　（１９８６）　Ｊ。

Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、６９：　　２０６６−２０７１゜
Ｂｙａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１９　　：１３４３−１３５０
゜ Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９７
９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　　：５２９４−
５２９９゜ Ｄｏｌｅ、　Ｖ、　Ｐ　　及びＨｅ１ｎｃｒｔｚ、　Ｉ
ｆ、　（１９８０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　　　２３５：　　２５９５−２５９９゜［
ａｋｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８２）　　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１０　　：１７５８−１７６５
゜ Ｇ１０ｎｎ、に、Ｃ，ａｔ　　ａｌ、　　（１９８８）
Ｊ、　　　Ｃａ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ。

３７：　　３７＋−３８４゜ Ｇｏｆｆ、　　Ｃ，Ｇ、　　ｅｔ　ａｔ、　　（１９８
４）　Ｇｅｎｅ　　２７：　　３５−４６゜Ｇｕｂｌｅ
ｒ、　Ｗ、及びｌｌｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、　（１９８３
）　Ｇｅｎｅ　２　：５２６３−５２６９゜ １１ａｒｏ　ａｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｃ
ｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

３８：　　１０９−１１Ｇ。

ｌｌｏｗｌｅｙ、　　Ｐ、Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、（１９８
３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＦｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　
１０１：　　３８７゜１１ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏ（１９１：　　３９９−４１３゜Ｉｔｏ、
　　Ｉｌ、　　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８３）　　Ｊ、
　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　１５３：１６３−１
６８゜ にｕｒｊａｎ、　　Ｊ、　　ａｎｄ　　Ｈｅｒｓｋｏｗ
ｉｔｚ、　　■、　　（１９８３）　　Ｃｅ１１３０：
　　　９３３−９４３゜ Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　　＾、　　Ｌ、　　（１９７６
）　　Ｂ１０ＣｈＱＩＩｌｉＳｔｒｙ、　　２ｎｄ　　
Ｅｄ。

１４ｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　　Ｉｒ＋Ｃ、
、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃ１ｔｙ、　ＮｅｗＹＯｒｋ
　　ｐｐ、　　　７２−７５，３１５−３２２゜Ｈａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　　ａｌ、　　ｃｄｓ、　　（１９８
２）　　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｔ４ａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ
　　Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　１ｌａｒｂｏｒ、
ＮｅｗＹｏｒｋ。

Ｈｕｒｔｈｙ　ｅｔ　ａｔ、　　（１９８２）　　Ｅｎ
ｄＯＣｒｉｎ０１０ｑＶユＵ。

２１１７−２１２４゜ Ｎｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８３）　ＮｕＣ
、　　＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、−ソー：５１０３−５１１
２゜ Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，及びＢｅｒａ、　Ｐ、（１９８
２）　Ｈｏｔ、　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ　　２　　：
　　１６１−１７０゜Ｐａｖｌａｋｉｓ、　Ｇ、　Ｎ、
及びＩｌａｍｅｒ、　ｏ、　ｉｌ、　（１９８３）Ｒｃ
ｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　ｉｎ　ｌｌｏｒｍｏｎ
ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３９：３５λ。

Ｒｅａｄ、　Ｂ、　Ｃ，及びＬａｎｅ、　Ｈ，Ｄ、　（
１９８０）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　Ｕ、Ｓ
、Ａ、　　７７：２８５−２８９゜５ａｌｉｃｉｎｓｋ
ｉ、Ｐ、Ｒ，Ｐ、ｅｔ　　ａｌ、　　（１９８１）Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１７　
　：　　１３６−ｉ４ｅ。

Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ、（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　　１２５：２３７−２４３゜５ｈｉｕ　ｅ
ｔ　ａｔ、　　（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８虹９
６８．５ｏｕｔｈｅｒｎ、　ｐ、　Ｊ、及びＢｅｒｇ、
　Ｐ、　９１９８３）　Ｊ、　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　
　１　　：　　　３２７゜Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、　　Ｓ
、　　ｅｔ　　ａｌ、　　（１９８１）　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　１：　８５４゜Ｕｌｌｒｉｃｈ、＾、　ｅｔ　ａｌ、
　（１９８４）　Ｅｍｂｏ、　Ｊ、　３：３６１−３６
４゜ Ｗｉｇｌｃｒ、　　Ｈ，ｅｔ、　　ａｌ、　　（１９７
９）　Ｃｅ１ｌ　　１６　　：　　７７７゜２ｏｌｌｅ
ｒ　　及びｓｍｔｔｈ　（１９８２）　ＮｕＣ、　Ａｃ
１ｄｓ、　Ｒｅｓ。

１０：　　６４８７−６５００゜ ７ｏｌｌｃｒ　　及びＳｍ１ｔｈ　（１９８３）　Ｈｃ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ［ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１００：　
　４６８−５００゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、２つの対立遺伝子型のｂＰＬをコードする配
列を含む２本鎖ＤＮＡ配列を示す。 第２図は、ｂＰＬをコードする２つのｃＤＮＡクローン
Ａ及びＢの制限酵素地図を示す。

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ末端からカルボキシ末端まで以下のアミノ
   酸配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ−Ａｌａ又はＭｅ
   ｔ−Ｖａｌを示す） を有するペプチドであつてウシ由来の他の蛋白質又はペ
   プチドを実質的に含有しないペプチドを含む組成物。
2. （２）ペプチドが合成ペプチドである請求項１記載の組
   成物。
3. （３）ペプチドがグリコシル化されていない請求項１記
   載の組成物。
4. （４）ＸがＡｌａである請求項１又は２記載の組成物。
5. （５）ＸがＶａｌである請求項１又は２記載の組成物。
6. （６）ＸがＭｅｔ−Ａｌａである請求項２記載の組成物
   。
7. （７）ＸがＭｅｔ−Ｖａｌである請求項２記載の組成物
   。
8. （８）アミノ末端からカルボキシ末端まで以下のアミノ
   酸配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＡｌａ又はＶａｌを示す） を有するペプチドであつてウシ由来の他の蛋白質又はペ
   プチドを実質的に含有しないペプチドを含む組成物。
9. （９）ペプチドが合成ペプチドである請求項８記載の組
   成物。
10. （１０）ペプチドがグリコシル化されている請求項８記
    載の組成物。
11. （１１）ＸがＡｌａである請求項８又は９記載の組成物
    。
12. （１２）ＸがＶａｌである請求項８または９記載の組成
    物。
13. （１３）請求項１記載のペプチドをコードするＤＮＡ配
    列を含む合成ＤＮＡ分子。
14. （１４）ＤＮＡ配列が、その５′末端から３′末端まで
    以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＴ又はＣ、ＹはＴ又はＣ、ＺはＡ又はＧを
    示す） を含む請求項１３記載の合成ＤＮＡ分子。
15. （１５）ＸがＴ、ＹがＴ、ＺがＧである請求項１４記載
    の合成ＤＮＡ分子。
16. （１６）ＸがＣ、ＹがＣ、ＺがＧである請求項１４記載
    の合成ＤＮＡ分子。
17. （１７）ＤＮＡ配列が、その５′末端から３′末端まで
    以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＴ又はＣ、ＹはＴ又はＣ、ＺはＡ又はＧを
    示す） を含む請求項１３記載の合成ＤＮＡ分子。
18. （１８）ＸがＴ、ＹがＴ、ＺがＡである請求項１７記載
    の合成ＤＮＡ分子。
19. （１９）ＸがＣ、ＹがＣ、ＺがＧである請求項１７記載
    の合成ＤＮＡ分子。
20. （２０）ＤＮＡ配列が、その５′末端から３′末端まで
    以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＴ又はＣ、ＹはＴ又はＣ、ＺはＡ又はＧを
    示す） を含む請求項１３記載の合成ＤＮＡ分子。
21. （２１）ＸがＴ、ＹがＴ、ＺがＡである請求項２０記載
    の合成ＤＮＡ分子。
22. （２２）ＸがＣ、ＹがＣ、ＺがＧである請求項２０記載
    の合成ＤＮＡ分子。
23. （２３）請求項８記載のペプチドをコードするＤＮＡ配
    列を含む合成ＤＮＡ分子。
24. （２４）ＤＮＡ配列が、その５′末端から３′末端まで
    以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＴ又はＣ、ＹはＴ又はＣ、ＺはＡ又はＧを
    示す） を含む請求項２３記載の合成ＤＮＡ分子。
25. （２５）ＸがＴ、ＹがＴ、ＺがＡである請求項２４記載
    の合成ＤＮＡ分子。
26. （２６）ＸがＣ、ＹがＣ、ＺがＧである請求項２４記載
    の合成ＤＮＡ分子。
27. （２７）ＤＮＡ配列が、その５′末端から３′末端まで
    以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＴ又はＣ、ＹはＴ又はＣ、ＺはＡ又はＧを
    示す） を含む請求項２３記載の合成ＤＮＡ分子。
28. （２８）ＸがＴ、ＹがＴ、ＺがＡである請求項２７記載
    の合成ＤＮＡ分子。
29. （２９）ＸがＣ、ＹがＣ、ＺがＧである請求項２７記載
    の合成ＤＮＡ分子。
30. （３０）請求項１３記載の合成ＤＮＡ分子を含む遺伝子
    的に形質転換された細胞。
31. （３１）請求項２３記載の合成ＤＮＡ分子を含む遺伝子
    的に形質転換された細胞。
32. （３２）細胞が、バクテリア、酵母及び哺乳動物細胞か
    らなる群より選ばれる請求項３０又は３１記載の遺伝子
    的に形質転換された細胞。
33. （３３）細胞がＥ．ｃｏｌｉである請求項３０又は３１
    記載の遺伝子的に形質転換された細胞。
34. （３４）細胞がマウスＣ１２７細胞である請求項３０又
    は３１記載の遺伝子的に形質転換された細胞。
35. （３５）ウシ胎盤ラクトゲンをコードする合成ＤＮＡ配
    列を含む遺伝子を形質転換細胞において発現せしめ、次
    いで形質転換細胞において産生されたウシ胎盤ラクトゲ
    ンを得ること、を含むウシ胎盤ラクトゲンを製造する方
    法。
36. （３６）形質転換細胞が、バクテリア、酵母及び哺乳動
    物細胞からなる群より選ばれる請求項３５記載の方法。
37. （３７）バクテリアがグラムネガティブバクテリアであ
    る請求項３６記載の方法。
38. （３８）グラムネガティブバクテリアがＥ．ｃｏｌｉで
    ある請求項３７記載の方法。
39. （３９）哺乳動物細胞がマウスＣ１２７細胞である請求
    項３６記載の方法。
40. （４０）遺伝子が、ｐＭＯＮ３０６８及びｐＭＯＮ３０
    ６９から選ばれるプラスミドに保持されている請求項３
    ８記載の方法。
41. （４１）請求項１記載のペプチドの有効量を投与するこ
    とからなる動物の生物学的応答を誘導する方法。
42. （４２）生物学的応答が催乳性応答である請求項４１記
    載の方法。
43. （４３）動物がウシである請求項４２記載の方法。
44. （４４）Ｎ−結合オリゴサッカライドが除去されている
    請求項１記載の組成物。