JPH10507929A - 高い安定性と生物活性をもつ酸性繊維芽細胞増殖因子の類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によると、ＦＧＦファミリーのタンパク質の類似体が提供される。これらの類似体は対応する天然タンパク質よりも安定である。タンパク質のアミノ酸配列中の特定ループ形成領域でより低いループ形成力価をもつアミノ酸残基をより高いループ形成力価をもつ少なくとも１個のアミノ酸で置換することにより、高い安定性を達成することができる。本発明の類似体は治療用途に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】高い安定性と生物活性をもつ酸性繊維芽細胞増殖因子の類似体 発明の背景 創傷や火傷等の組織損傷後の複雑な治癒過程は、軟組織成長因子とも呼ばれる 多数のタンパク質因子により媒介される。これらの因子は、新しい細胞を増殖及 び分化させ、破壊した組織に置き換えるために必要である。この軟組織成長因子 の群に含まれるものとして、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミ リーが挙げられる。ＦＧＦは上皮、間葉及び神経起源の種々の細胞のマイトジェ ン及び化学走化性因子である。更に、ＦＧＦは血管新生促進因子であり、血管の 形成を刺激することができる。ＦＧＦファミリーのメンバーには酸性ＦＧＦ、塩 基性ＦＧＦ、ＫＧＦ、Ｉｎｔ−２、ＨＳＴ、ＦＧＦ−５及びＦＧＦ−６が含まれ る。 酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）と塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）はＦＧＦファミリーの２ つの「原」メンバーであるとみなされる。ａＦＧＦとｂＦＧＦはいずれも同一祖 先遺伝子に由来すると考えられ、両者の分子は同一イントロン／エキソン構造以 外に約５５％の配列一致をもつ。酸性ＦＧＦとｂＦＧＦは同一レセプ ターに結合することも知られているが、特異的なａＦＧＦ及びｂＦＧＦレセプタ ーの存在も否定されていない。種々の組織に数種の分子量形態のａＦＧＦとｂＦ ＧＦが存在する。しかし、サザンブロッティング実験によると、ａＦＧＦとｂＦ ＧＦの各々に１個の遺伝子しか存在しないことが示唆されており、これらの分子 間の差異は恐らく翻訳後プロセシングに起因すると思われる。酸性及び塩基性Ｆ ＧＦはいずれも中胚葉及び神経外胚葉起源の多種多様の細胞型のマイトジェンで あり、インビトロ及びインビボの両者で血管形成を誘導することができる（例え ばＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら（１９７９），Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．， ２８ ：５０１−５１４参照）。これらの２類の生物活性範囲はほぼ同一であるが 、ｂＦＧＦは殆どのバイオアッセイ系でａＦＧＦよりも約１０倍強力である。 ＫＧＦは種々の細胞に対して強力なマイトジェン活性を示し、ａＦＧＦとｂＦ ＧＦも結合し得るＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイト上の細胞表面レセプターと結合 する（Ｂｏｔｔａｒｏら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１ ２７６７−１２７７０）。他方、ＫＧＦは繊維芽細胞又は内皮細胞のマイトジェ ンでない点が公知ＦＧＦ（例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ） と異なる（Ｒｕｂｉｎら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，８６：８０２−８０６）。ＫＧＦは更に、ＫＧＦと相互作用すること ができないａＦＧＦ及びｂＦＧＦのレセプターとは異なるレセプターをＮＩＨ／ ３Ｔ３繊維芽上にもつ（Ｂｏｔｔａｒｏら）。 ａＦＧＦとｂＦＧＦに共通する特徴の１つは、これらの因子がヘパリンに強く 結合する傾向があることである。ヘパリンに対するａＦＧＦの親和性はｂＦＧＦ よりも弱いと考えられ、ａＦＧＦはアニオン性等電点をもつ（Ｔｈｏｍａｓら（ １９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６４０９− ６４１３）。ａＦＧＦとｂＦＧＦのヘパリン結合特性は、これらの因子の精製に 大いに役立っている。 ＦＧＦが固定化ヘパリンに対する強い親和性をもつことが発見され、ＦＧＦの インビボ生物学におけるヘパリン様分子の調節役割に関する研究に一層拍車がか かった。ヘパリンの完全な機能はまだ解明されていないが、ヘパリンはいくつか の方法でＦＧＦ機能を調節できることが知られている（Ｌｏｂｂ（１９８８）， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１８：３２１−３２６）。例えば、ヘ パリン様分子はａＦＧＦの活性化又 は強化といったＦＧＦの機能に直接的な役割を果たし得る（Ｕｈｌｌｒｉｃｈら （１９８６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３７ ：１２０５−１２１３）。 しかし、固定化ヘパリンに対するＦＧＦの親和性と可溶性ヘパリンによるその 強化能の間に直接的相関は存在しない。この点で、ヘパリンの強化能はａＦＧＦ に選択的であると思われる。他えば、前出のＵｈｌｌｒｉｃｈら（１９８６）は 、純ａＦＧＦの強化度が純ｂＦＧＦの約１０倍であり、ａＦＧＦの力価をｂＦＧ Ｆとほぼ同一レベルまで引き上げられることを知見した。しかし、ウシ胎児血清 の存在下では、ヘパリンの強化作用は有意に低下することが判明した（Ｕｈｌｌ ｒｉｃｈら（１９８６），前出）。 ＦＧＦタンパク質を使用すると、外傷を受けた組織の治癒を促進するのに有効 であると考えられる。ＦＧＦは血管形成特性をもつため、深い創傷の治癒に特に 有用である。ｂＦＧＦ天然タンパク質は心筋梗塞の治療に有用であると報告され ている（米国特許第４，２９６，１００号及び４，３７８，３４７号）。更に、 ヒトｂＦＧＦはラット胎児海馬ニューロンでニューロン保存と神経突起伸長を増 進することが判明し、この因子 がアルツハイマー病やパーキンソン病等の変性神経系障害の治療にも有用であり 得ることを示唆している（Ｗａｌｌｉｃｋｅら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３０１２−３０１６）。 治療用としてのａＦＧＦの有効利用を阻む大きな障害の１つは、その生物活性 がｂＦＧＦに比較して有意に低いことに関係すると思われる。ヘパリンの研究に よると、ａＦＧＦとｂＦＧＦの間に認められる力価の差は、ヘパリンを使用して ａＦＧＦの活性をｂＦＧＦと同等のレベルまで高めることにより実質的に縮める ことができると予想されるが、薬剤でヘパリンを使用するのは必ずしも望ましい とは言えない。この点で留意しなければならないこととして、ヘパリンは不均一 構造の高硫酸化グリコサミノグリカンであり、抗トロンビンIII がホメオスタシ スのプロテアーゼを不活性化する速度を加速することによって機能する抗凝血剤 として知られている（Ｊａｃｑｕｅｓ（１９８０），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅ ｖ，３１：９９−１６６）。深い創傷を治療するのに用いる薬剤では適正な治癒 を達成するためにある程度の凝血が望ましいと思われるが、このような薬剤でヘ パリンを使用するのが有害であるか否かはわかっていな い。 更に、ヘパリンを創傷治療用薬剤に組み込む場合には実地上の問題も生じると 予想できる。薬剤送達では、患者の体内に投与後に（ａＦＧＦとヘパリンを併有 する）薬剤の組成を制御することが問題になる。更に、（Ｕｈｌｌｒｉｃｈらの 知見によると）ウシ胎児血清はヘパリンのａＦＧＦ強化作用に負の効果があり、 ａＦＧＦの活性化又は強化因子として薬剤にヘパリンを配合することによって得 られる利点は、患者自身の血清に接触すると全く無効になるか又は失われると考 えられる。 本発明の１つの目的は、天然形態のタンパク質に比較して高い安定性をもつＦ ＧＦファミリーからのタンパク質類似体を提供することである。本発明の別の目 的は、ヘパリンの不在下で高い安定性と生物活性を示すａＦＧＦの類似体を提供 することである。本発明の更に別の目的は、治療用ａＦＧＦ類似体を提供するこ とである。 発明の要約 本発明はＦＧＦファミリーのタンパク質の新規類似体を提供する。このような 類似体の１例は、天然ａＦＧＦよりも安定性が高く、ヘパリンの不在下で高い生 物活性を示すａＦＧＦ類似 体である。このような類似体の別の例は、天然ＫＧＦよりも高い熱安定性をもつ ＫＧＦ類似体である。高い安定性は、天然タンパク質のループ形成配列Ａｓｎ− Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ中又はその付近に存在する低ループ形 成力価のアミノ酸残基を、より高い低ループ形成力価をもつ少なくとも１個のア ミノ酸で置換することによって達成される。ａＦＧＦの場合には、このループ形 成配列はほぼアミノ酸９２〜９６の領域に存在する。ＫＧＦの場合には、このル ープ形成領域はほぼアミノ酸１１５〜１１９の領域に存在する。本発明の好適類 似体は、ループ形成配列中のヒスチジン残基を、より高いループ形成力価をもつ アミノ酸で置換したものである。 図面の簡単な説明 図１は組換えウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦの核酸及びアミノ酸配列を 示す。 図２は組換えヒト［Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦのアミノ酸配列を示す。 図３は疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用したウシ［Ａｌａ⁴⁷］及び［ Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の溶離曲線を示す。 図４Ａ及び４Ｂはウシ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似 体の円二色性スペクトルを示す。 図５はアミドＩ’（重水素化タンパク質のＣ＝Ｏ範囲）領域におけるウシ［Ａ ｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の二次導関数ＦＴＩＲスペ クトルを示す。 図６は最大刺激百分率に対するウシ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ ａＦＧＦ類似体とヒト［Ｓｅｒ⁷⁰，Ｓｅｒ⁸⁸］ｂＦＧＦの濃度の対数のプロット を示すグラフである。 図７はヒト［Ｓｅｒ⁷⁰，Ｓｅｒ⁸⁸］ｂＦＧＦに比較したヘパリンの不在下のウ シ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の経時的活性損失を 示すグラフである。 図８はＸ線結晶分析により決定した本発明のウシ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷ ，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の構造を示す。 図９は天然ＫＧＦの核酸及びアミノ酸配列を示す。 図１０は組換え［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦの核酸及びアミノ酸配列を示す。 発明の詳細な説明 本発明によるとＦＧＦファミリーの新規類似体が提供される。これらの類似体 は対応する天然タンパク質に比較して改善され た安定性を示す。本発明のａＦＧＦ類似体の場合には、類似体はヘパリンの不在 下で高い安定性と生物活性を示す。本発明のＫＧＦ類似体の場合には、類似体は 高い熱安定性を示す。本発明の類似体は、天然形態に存在するループ形成配列Ａ ｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ中又はその付近に、対応する天 然タンパク質とは異なる少なくとも１個のアミノ酸残基をもつ。ａＦＧＦの場合 にはループ形成配列は（図１に示すようにウシａＦＧＦの公知アミノ酸配列のナ ンバリングに基づいて）ほぼアミノ酸残基９２〜９６の領域に存在する。ＫＧＦ の場合には、ループ形成配列は図９及び１０に示すように、ほぼアミノ酸残基１ １５〜１１９の領域に存在する。天然タンパク質と異なるアミノ酸は、類似体の この領域を安定化できるように、より高いループ形成力価をもつように選択され る。比較的高いループ形成力価をもつアミノ酸としては、グリシン、プロリン、 チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン及びセリンが挙げられる［Ｌｅｓｚｃ ｙｎｓｋｉら（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：８４９−８５５（１９８ ６）（ループ形成力価の相対値は天然分子のループ構造における出現頻度に基づ いて決定される）］。ループ形成配列中のヒスチジン残 基を、より高いループ形成力価をもつ別のアミノ酸で置換するのが好ましい。よ り好ましくは、ループ形成配列中のヒスチジンをグリシン残基で置換する。 本発明の類似体は他の付加、置換及び／又は欠失も含み得る。例えば、類似体 は場合により非保存システイン残基（例えばウシａＦＧＦ分子の４７位のシステ イン残基及びヒトａＦＧＦ分子の１６位のシステイン残基）のアミノ酸置換も含 み得る。更に、大腸菌宿主細胞から発現される本発明の類似体は、（例えば図１ に示すように−１位に）開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。ある いは、対応する天然タンパク質の高い生物活性を実質的に維持しながら、当業者 に公知のようにＤＮＡ配列から末端アミノ酸残基の１個以上を欠失させてもよい 。 本発明の類似体の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列も提供される。このよ うな配列としては好ましくは、選択された大腸菌宿主株による「発現」に好適な コドン（「大腸菌発現コドン」）を組込んだものや、制限エンドヌクレアーゼに よる切断部位を提供するもの、及び／又は容易に発現されるベクターの構築を助 長する付加的な開始、末端又は中間ＤＮＡ配列を提供するものなどが挙げられる 。これらの新規ＤＮＡ配列としては、 真核及び原核両者の宿主細胞（例えば大腸菌）で本発明の類似体の発現を確保す るのに有用な配列が挙げられる。 より特定的には本発明のＤＮＡ配列は、ほぼアミノ酸９２〜９６の領域のアミ ノ酸残基をコードする少なくとも１個のコドンが、より高いループ形成力価をも つ別のアミノ酸残基をコードするコドンで置換された図１に示すＤＮＡ配列（以 下、「ａＦＧＦ類似体配列」又は「類似体配列」と呼ぶ）と、類似体配列の１種 又はそのフラグメントにハイブリダイズするＤＮＡ配列と、遺伝暗号の縮重を別 にして類似体配列の１種にハイブリダイズするＤＮＡ配列を含み得る。 同様に本発明のＤＮＡ配列は、ほぼアミノ酸１１５〜１１９の領域のアミノ酸 残基をコードする少なくとも１個のコドンが、より高いループ形成力価をもつ別 のアミノ酸残基をコードするコドンで置換された図１０に示すＤＮＡ配列（以下 、「ＫＧＦ類似体配列」又は「類似体配列」と呼ぶ）と、類似体配列の１種又は そのフラグメントにハイブリダイズするＤＮＡ配列と、遺伝暗号の縮重を別にし て類似体配列の１種にハイブリダイズするＤＮＡ配列を含み得る。 本発明の類似体は、当業者に公知の多数の組換え技術の任意 のものによりコード化、発現及び精製することができる。好適製造方法は、材料 のコスト及び入手し易さや他の経済的要因を含めた多数の因子により種々多様で ある。当業者は最小限の実験で所与の状況に最適な製造方法を決定できよう。本 発明の類似体は大腸菌宿主細胞を使用して特に高いレベルで発現させることがで き、その後、当業者に公知の方法を使用して発現産物をほぼ均質まで精製するこ とができる。典型的な精製方法の１例では、まず類似体を含む抱合体を可溶化し た後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、次いでタンパク質を再生させ、最 後に疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。 本発明の類似体は驚くほど高度の安定性を示す。天然ａＦＧＦとは異なり、本 発明のａＦＧＦ類似体はヘパリンの不在下で高い安定性と生物活性を示す。（例 えば公開ＰＣＴ特許出願第８８／０４１８９号に開示されているように）所定の システイン残基をセリン又は他の中性アミノ酸で置換することにより安定性の高 いｂＦＧＦ類似体が得られることは知られているが、天然ウシａＦＧＦの４７位 の非保存システイン残基を置換するだけでは、ａＦＧＦ類似体の生物活性及び／ 又は安定性を有意に増加できるとは考えられない。これは、後記実施例に記載す るように、（システイン置換した）ウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体が（ａＦＧ Ｆ分子の残基９２〜９６領域に所望のアミノ酸置換をもつ）ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇ ｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体に比較して低い活性を示すことから明らかである。具体 的に言うと、ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］類似体はｂＦＧＦに比較するとまだ低 力価であるが、ウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体の約１０倍の力価をもつことが 判明した。４５μｇ／ｍｌのヘパリンを加えると、全３種の形態のＦＧＦの生物 活性は増加し、ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］類似体、ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³ ］類似体及びヒト［Ｓｅｒ⁷⁰，Ｓｅｒ⁸⁸］ｂＦＧＦ類似体は実質的に等しい力価 をもつ。 ヘパリンの不在下でウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体のマイトジェ ン活性及び安定性がウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦよりも増加する理由は、明確には わかっていない。３３位のヒスチジン残基をグリシンで置換すると、ａＦＧＦ分 子は多少疎水性になるように思われたが、円二色性及びＦＴＩＲ分光分析による と、その三次構造を激変させるようには思われなかった。他方、ウシ［Ａｌａ⁴⁷ ，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体と（４７位のみを置換した）ウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦ ＧＦ類似体の インビトロバイオアッセイでは活性に相対的差異が認められ、ウシ［Ａｌａ⁴⁷， Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体のグリシンで置換したアミノ酸９３位は、レセプター 結合に関与する領域の内側又はその付近に位置するのではないかと予想された。 ａＦＧＦにおけるレセプター結合領域は決定されていないが、ａＦＧＦの９３位 はレセプター結合領域の内側又は付近に存在すると報告されているｂＦＧＦ内の 領域に対応する（Ｂａｉｒｄら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，８５：２３２４−２３２８）。 更に、ウシ［Ａｌａ⁴⁷］類似体は短時間で活性を失ったが、本発明のウシ［Ａ ｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体はウシ［Ａｌａ⁴⁷］類似体と異なり、２５０ 時間にわたってヘパリンの不在下で元のマイトジェン活性を維持しながら高い安 定性を示した。 ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体を結晶化し、得られた結晶をＸ線 結晶分析により試験した。これらの結晶の試験から得られたＸ線結晶分析データ は、残基９３が溶媒に暴露され、即ち９３位のヒスチジンをグリシンで置換する ことにより分子が低親水性になるという疎水性相互作用クロマトグラフ ィーデータからの示唆に裏付けを与える。９３位付近のウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³ ］ａＦＧＦ類似体を詳細に試験した結果、ほぼ９０位のグルタミン酸残基から ほぼ９７位のチロシン残基までの領域で高いループ形成力価をもつ約８個のアミ ノ酸が集合していることが判明した。アミノ酸の相対ループ形成力価は報告され ており、グリシンは全アミノ酸のうちで最高のループ形成力価をもつアミノ酸残 基であることが確認されている（Ｌｅｓｚｃｙｎｓｋｉら，前出）。このように グリシン残基はヒスチジンに比較して著しく高いループ形成力価をもつため、ヒ スチジンをグリシンで置換すると推定ループを安定化できると考えられる。 本発明のＫＧＦ類似体も、ＫＧＦの対応領域がレセプター結合に関与し得る溶 媒暴露ループであることが立証された。具体的に言うと、本発明の［Ｇｌｙ¹¹⁶ ］ＫＧＦ類似体は後記実施例に記載するように、天然ＫＧＦとは異なる低いマイ トジェン活性を示すことが判明した。［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体は天然ＫＧＦ よりも５〜７℃高い熱安定性をもつことも判明した。 本発明は、本明細書に具体的に説明する好適な［Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ及び［Ｇ ｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体以外の他の類似体も 包含する。当業者は本明細書の教示に従ってこれらの他の類似体を容易に作成で きよう。例えば、１５種以上のアミノ酸がヒスチジンよりも高いループ形成力価 をもつと報告されている（Ｌｅｓｚｃｙｎｓｋｉら（１９８６），前出）。これ らのアミノ酸は（ループ形成力価の高い順に）グリシン、プロリン又はチロシン 、アスパラギン酸又はアスパラギン、セリン、システイン、グルタミン酸、トレ オニン、リシン、シスチン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン及びト リプトファンである。天然タンパク質のループ形成配列中のヒスチジン残基をこ れらの残基の任意のもので置換すると、高い安定性をもつ本発明の類似体が得ら れると予想できる。当然のことながら、例えば付加的システイン又はシスチン残 基の挿入により望ましくないジスルフィド結合を形成するなどの潜在的な負の効 果を生じることなしに、できるだけ高いループ結合力価をもつアミノ酸でループ 形成配列中のヒスチジン残基を置換することが好ましい。従って、ループ結合配 列中のヒスチジン残基を置換するのに好適な（グリシン以外の）アミノ酸として は、プロリン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン 酸、トレオニン、リシン、グルタミン、アルギニン、フェニ ルアラニン及びトリプトファンが考えられる。 本発明は更に、天然ａＦＧＦのアミノ酸９２〜９６領域（即ちアミノ酸９２と ９４〜９６）及び天然ａＦＧＦのアミノ酸１１５〜１１９領域（即ちアミノ酸９ ２と１１５〜１１７〜１１９）に含まれる他のアミノ酸残基を、高いループ形成 力価をもつアミノ酸で置換することも包含する。本発明のａＦＧＦ類似体は、例 えば天然ａＦＧＦの９６位のトレオニン残基を好ましい順にグリシン、プロリン もしくはチロシン、アスパラギン酸もしくはアスパラギン、セリン、又はグルタ ミン酸で置換したａＦＧＦ類似体も含むが、トレオニンをグルタミン酸で置換し てもこれらの２種のアミノ酸のループ形成力価は同等であるため、安定性及び／ 又は生物活性は最小限しか増加しないと予想される。 天然ａＦＧＦの９２、９４、９５及び９７位のアミノ酸残基（それぞれアスパ ラギン、チロシン、アスパラギン及びチロシン）は十分高いループ形成力価をも つので、これらの特定残基を置換しても最小限の利益しか期待できない。 本発明の類似体は、下記ループ形成アミノ酸配列： をもつヒト及び動物（例えばウシ）起源の類似体並びに全形態のタンパク質を包 含するものとみなされる。 例えば、ヒト及びウシ両形態のａＦＧＦは知られており、９２及び９６位に同 一の（上記）アミノ酸配列をもつことが確認されている。更に、ヒト及びウシａ ＦＧＦの間には約９２％の配列一致があり、９７％の「相同度」がある（即ちこ れらの２形態のａＦＧＦ形態の合計８％の差異のうちの５％は「保存性」である ）。ヒト及びウシ両形態の天然ａＦＧＦは実質的に同一のインビトロマイトジェ ン活性を示す。 本発明の新規生物活性ａＦＧＦ類似体は、ヘパリンの不在下で高い安定性と生 物活性をもつので、医師及び／又は獣医が哺乳動物種の多種の創傷の治療用薬剤 で使用するのに特に適している。本発明のＫＧＦ類似体は熱安定性が高いため、 同様に薬剤で使用するのに適している。このような治療に使用する生物活性類似 体の量は当然のことながら、治療しようとする創傷の重度、選択する投与経路、 及び類似体の特定活性又は純度に依 存し、主治医又は獣医により決定される。「治療薬として有効な類似体の」量な る用語は、哺乳動物で治療応答を生じるように決定された類似体の量を意味する 。このような治療薬として有効な量は当業者に容易に決定される。 本発明の類似体は治療する創傷又は症状に任意の経路で投与することができる 。本発明の類似体を治療薬として投与して治療すると有益であると考えられる症 状の非限定的な例としては、表面創傷の治癒、骨治癒、血管形成、神経再生及び 臓器発生及び／又は再生が挙げられる。 獣医学及びヒト用の両者の本発明の組成物は、治療薬として有効な量の類似体 と共に１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤーと場合により他の治療成分を含 有する。キャリヤーは組成物の他の成分と適合性であり且つレシピエントに無害 であるという意味で「許容可能」でなければならない。組成物は簡便に単位剤形 にでき、当該技術分野で周知の方法の任意のものにより製造することができる。 全方法は１種以上の補助成分を構成するキャリヤーと活性成分を混合する段階を 含む。一般に、組成物は類似体を液体キャリヤー又は微粉砕固体キャリヤー又は その両者と均質に混和することによって製造される。 以下の実施例は本発明の理解し易くする目的であり、本発明の真の範囲は請求 の範囲に記載する通りである。発明の趣旨から離れずに手順を種々に変形できる とみなされる。 実施例１ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の製造 合成 部位特異的突然変異誘発を使用して［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体と ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体を作成した。但し、本発明のこれらの類似体及び他 の類似体は化学的合成などの他の方法でも作成できることが理解されよう。［Ａ ｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の場合にはウシ配列を使用した。具体的に説 明すると、［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体は次のように作成した。 本発明によるウシａＦＧＦ類似体を作成し、以下の実施例で試験した。このウ シ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体は図１に示すように、ａＦＧＦ分子の 残基９２〜９６ループ形成配列中に所望のアミノ酸置換（９３位のヒスチジンを グリシンで置換）を含むと共に、４７位の非保存システイン残基をアラニンで付 加的にアミノ酸置換するように構築した。所望のウシ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の対照として使用するために、システイ ンをアラニンでアミノ酸置換しただけのウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体も作成 した。これらの実施例は本発明のウシａＦＧＦ類似体に関するものであるが、相 同度の高いヒトａＦＧＦ類似体でも同一の結果が得られる。例えば、本発明の対 応するヒト［Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体のアミノ酸配列は図２に示す通りである 。 合計２８個の成分オリゴヌクレオチドからのウシａＦＧＦの［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌ ｙ⁹³］類似体をコードする合成遺伝子を２セクションで構築した。Ｇｉｍｅｎｅ ｚ−Ｇａｌｌｅｇｏら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３８５−１３ ８８のアミノ酸配列をこの遺伝子の基礎として使用し、大腸菌で類似体の発現を 最適にできるようにコドンを選択した（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏら（１ ９８５），前出）。セクションＩは１６個のオリゴヌクレオチドから構築し、Ｘ ｂａＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位でプラスミドベクターに挿入可 能な２８７ヌクレオチドフラグメントを得た。セクションIIは１２個のオリゴヌ クレオチドから構築し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ適合性末端により結合した１７ ０ヌクレオチドフラ グメントを得た。３成分連結でＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで予め消化しておいた発 現プラスミドｐＣＦＭ１１５６に２つのセクションを挿入し、λｐＬプロモータ ーの制御下の完全ａＦＧＦ遺伝子を得た。 プラスミドｐＣＦＭ１１５６は公知プラスミドｐＣＦＭ８３６から作成される 。プラスミドｐＣＦＭ８３６の作成は米国特許第４，７１０，４７３号に記載さ れており、同明細書の該当部分、特に実施例１〜７は参考資料として本明細書の 一部とする。ｐＣＦＭ８３６からｐＣＦＭ１１５６を作成するためには、２つの 内因性ＮｄｅＩ制限部位を切断し、露出した末端をＴ４ポリメラーゼで充填し、 充填した末端を平滑末端連結する。 次に、得られたプラスミドをＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、切り出したＤＮ Ａフラグメントを下記配列： のＤＮＡオリゴヌクレオチドで置換する。 このプラスミドで形質転換した大腸菌細胞を（Ｆｏｘら（１９８８），Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１８４５２− １８４５８に記載されているように）容量１６リットルの発酵容器で増殖させた 。 オリゴ部位特異的突然変異誘発を使用してウシ［Ｇｌｙ⁹³，Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧ Ｆをコードする遺伝子を［Ａｌａ⁴⁷］形態に変換した。まずａＦＧＦ遺伝子をフ ァージベクターＭ１３ｍｐ１８に移入し、突然変異誘発反応の鋳型として用いる １本鎖ＤＮＡを調製した。このＤＮＡ約０．５μｇを突然変異誘発プライマー（ ５’−ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣ−３’）及びＤＮＡ配列決定 に使用するＭ１３汎用プライマー各５ピコモルと混合し、６５℃まで３分間加熱 し、ゆっくりと放冷させた。アニールした鋳型−プライマーをＡＴＰ、ｄＮＴＰ 混合物、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラグメント及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ と混合した後、１５℃で４時間インキュベートした。この反応混合物のアリコー トをコンピテント大腸菌ＪＭ１０１細胞に加え、０．７％Ｌ−寒天にプレーティ ングした。得られたプラークをニトロセルロースフィルターに移し、フィルター を³²Ｐ標識突然変異誘発プライマーとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズし たファージから調製したＤＮＡを配列決定した処、所望の突然変異誘発事象が有 効に完了しているこ とが確認された。得られた遺伝子を次にｐＣＦＭ１１５６ベクターに戻して組換 えタンパク質を発現させた。ａＦＧＦ類似体の精製 組換えタンパク質を発現する大腸菌細胞を機械的に溶解して遠心分離すること により得た不溶性フラクションからウシ［Ｇｌｙ⁹³，Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷ ］ａＦＧＦ類似体の両者を精製した。ペレットフラクションを８Ｍ尿素、０．１ Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で可溶化し、遠心分離して不溶分を除去した。６Ｍ尿 素、１０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で平衡化しておいたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）カラム に上清を添加し、６Ｍ尿素、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で洗浄 した。カラムに結合したタンパク質を２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５ ）中０→０．５Ｍ塩化ナトリウム直線勾配で溶離した。ａＦＧＦを含むフラクシ ョンをプールし、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸アンモニウムで２ ０倍に希釈し、遠心分離して沈殿を除去した。上清を２０ｍＭクエン酸ナトリウ ム、２Ｍ硫酸アンモニウム１容量と混合し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ 硫酸アンモニウム（ｐＨ６．５）で平衡化 しておいたフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムに添加した。結合 したタンパク質を硫酸ナトリウムの直線下降勾配（１Ｍ→０Ｍ）でカラムから溶 離した。ａＦＧＦを含むフラクションをプールし、２０ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐＨ６．５）で透析した。この生成物は、図４に示すようにＳＤＳゲル中にク ーマシーブルー以外のバンドが現れないことから実質的に均質であると判断され た。 実施例２ ａＦＧＦ類似体のゲル濾過クロマドラフィー Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌ ａ，スウェーデン）でＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）−１２カラムを使用して室 温でゲル濾過を実施した。カラムは２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化 ナトリウム（ｐＨ６．５）中０．５ｍｌ／分で操作した。 ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、精製ウシ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷， Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体はリボヌクレアーゼＡ（Ｍｒ＝１３，７００）と同一 の溶出位置で単一ピークとして溶出することが判明した。このことから、２種の タンパク質はモノマーであり、同一の流体力学的半径をもつと考えられ るが、両形態のタンパク質がカラムマトリックスと相互作用してカラムからの溶 出が遅れたとも考えられる。 実施例３ ａＦＧＦ類似体の疎水性相互作用クロマトグラフィー Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムでフェニル−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録 商標）カラムを使用して室温で疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。 ２Ｍ硫酸アンモニウムで予め平衡化しておいたカラムに２Ｍ硫酸アンモニウム、 ２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の試料を添加した。２Ｍ硫酸アン モニウムで洗浄後、残留タンパク質を２Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム下降勾配で 溶離した後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で最終洗浄した。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）におけるタンパク質の溶出位置 は折り畳まれた状態の疎水性領域の暴露に強く依存するので、この方法は類似す るタンパク質のコンホメーション均質性の高感度プローブを提供する。図３はウ シ［Ａｌａ⁴⁷］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の溶離曲線を示す。 ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦは０．２５Ｍ硫酸アンモニウムで溶出する主要ピークを示 したが、［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａ ＦＧＦ類似体は０．１３Ｍ硫酸アンモニウムで単一ピークを示し、２種のタンパ ク質が主に単一の別個のコンホメーションで存在すると予想された。［Ａｌａ⁴⁷ ，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦのほうが低い塩濃度で溶出したことから、［Ａｌａ⁴⁷］形 態よりも多少疎水性であると予想される。この知見は、９３位のヒスチジン残基 が溶媒に暴露されるようなタンパク質のコンホメーションの場合にこの残基がグ リシンで置換されているという仮説に一致する。あるいは、この残基の置換によ って分子のコンホメーションに全体的な変化が生じ、高疎水性構造を生じたとも 考えられる。 実施例４ ａＦＧＦ類似体の分光分析 円二色性 Ｊａｓｃｏ Ｍｏｄｅｌ Ｊ−５００Ｃ分光旋光計（ジャスコ、東京）にＯｋ ｉ Ｉｆ ８００ Ｍｏｄｅｌ ３０コンピューター（沖電気、東京）を接続し て室温で円二色性スペクトルを測定した。測定は、それぞれ近及び遠紫外範囲で １及び０．０２ｃｍのキュベットを用いて１ｎｍの帯域幅で実施した。データは 、どちらの形態のａＦＧＦにも１１３の平均残基重量 を使用して計算した平均残基楕円率［θ］として表した。 ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］及び［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体の円二色性（Ｃ Ｄ）スペクトルはそれぞれ図４Ａ及び４Ｂに示すように遠及び近紫外領域の両者 でほぼ同一であった。これらの類似体のＣＤはヒトｂＦＧＦ（Ａｒａｋａｗａら （１９８９），ＢＢＲＣ，１６１：３３５−３４１）に報告されているスペクト ルにも非常によく似ていた。近紫外領域におけるスペクトルの類似はＦＧＦの三 次構造の類似に一致する。熱遷移 熱プログラミング及び熱キュベットホルダーを装備したＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｉ Ｉ分光光度計（Ｇｉｌｆｏｒｄ，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ ｓ）でタンパク質の熱遷移を測定した。試料を０．１℃／分又は０．５℃／分の 増分で加熱し、２８７ｎｍの吸光度をモニターした。ｂＦＧＦでは０．９８、２ 種のウシａＦＧＦ類似体では１．０４の消光係数を使用して０．１％タンパク質 について２８０ｎｍでタンパク質濃度を分光光度により測定した。 ２０ｍＭクエン酸ナトリウムのｐＨを６．５及び７．０としてヘパリンの存在 下及び不在下でａＦＧＦ類似体の熱変性を試 験した。いずれの場合も温度が上昇するにつれてタンパク質は沈殿した。吸光度 の急増が生じた温度を変性温度とみなした。ヘパリンの不在下では、この温度は ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］類似体のほうがウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体よ りも約１０℃高かった。１．４倍又は８倍（ｗ／ｗ）量のヘパリンを加えると、 使用した温度上昇率に依存して両形態とも変性温度は１４〜２０℃上昇した。２ 形態の変性温度の差は約１０℃のままであった。１．４倍又は８倍（ｗ／ｗ）量 のヘパリンは２４０〜３４０ｎｍ範囲で各タンパク質のＣＤスペクトルに明白な 効果を生じなかったが、８倍量のヘパリンの場合には、２４０〜２６０ｎｍ領域 のａＦＧＦスペクトルはヘパリン自体の吸光度が重なった。フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析 両者ａＦＧＦのコンホメーションの類似を更に試験するためにフーリエ変換赤 外（ＦＴＩＲ）スペクトルを測定した。ＦＴＩＲ分光分析のために、タンパク質 を水で十分に透析した。各タンパク質はＤ₂Ｏ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，９９．９％同位体純度）中で調製した２０ｍＭイミダゾール緩衝液の ２％溶液として調製した。ＣａＦ₂窓と１００μｍス ペーサーを備えるＩＲセルに溶液を入れた。各スペクトルで１５００インターフ ェログラムを収集し、ゲルマニウム被覆ＫＢｒビームスプリッターとＤＴＧＳデ テクターを取り付けたＮｉｃｏｌｅｔ ８００ ＦＴＩＲシステムでコード化し た。光学ベンチを連続的に乾燥窒素ガスでパージした。（Ｓｕｓｉら（１９８８ ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１１５：３９１− ３９７に記載されているように）二次導関数スペクトルを計算した。水蒸気を差 し引いたスペクトルに９点平滑化関数を適用した。 図５はアミドＩ’（重水素化タンパク質のＣ＝Ｏ範囲）領域における［Ａｌａ⁴⁷ ］及び［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ウシａＦＧＦ類似体の二次導関数スペクトルを 示す。ポリペプチド及びタンパク質については、この領域における成分バンドの 周波数は二次構造含量に関連付けられる。Ｓｕｒｅｗｉｃｚら（１９８８），Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９５２：１１５−１３０。スペクト ルは１６３０及び１６８５ｃｍ^-1に強いバンドを示し、２種のタンパク質に有意 量のβ構造が存在することを示す。１６４７ｃｍ^-1付近の強いバンドは不整又は 無秩序構造の存在を示す。１６６６及び１６７３ｃｍ^-1付近の 弱いピークターンは回転構造に起因する。どちらのタンパク質のスペクトルにも １６５１ｃｍ^-1付近に小さいピークが存在する。この周波数付近のアミドＩ’成 分は一般にαヘリックスに起因するとされている。しかし、このバンドはループ 構造に起因するらしいことが最近になって報告された（Ｗｉｌｄｅｒら（１９９ ０），Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．）。 図５に示すように、ＣＤと異なり高解像ＦＴＩＲスペクトルはβ構造と回転の存 在をはっきりと示しており、ウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体及びウシ［Ａｌａ⁴⁷ ，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体のスペクトルはほぼ重ね合わすことができ、これ らの２種のタンパク質はやはり類似のコンホメーションをもつと予想された。 二次導関数スペクトルは２種のａＦＧＦ類似体間のコンホメーションの相違を 明示しなかった。しかし、凍結乾燥したタンパク質をＤ₂Ｏ溶液で平衡化する間 に、ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体よりもウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧ Ｆ類似体のほうが迅速に交換可能なプロトンの重水素化が生じることは明白であ った。２種のタンパク質は類似のコンホメーションを もつので、Ｈ−Ｄ交換速度に認められる相違を両者の間の交換可能なプロトンの 照射度の差から説明することはできない。［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体のほうが 柔軟な構造をもつために、アミドプロトンを溶剤に接触させ易いと考えるほうが 妥当である。 実施例５ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体のヘパリンクロマトグラフィー ヘパリン−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１×８ ｃｍカラムに充填し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で平衡化した 。カラムに試料を添加し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄し 、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを使用して０．５ｍｌ／分の流速で同 一緩衝液中０→２．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶離した。 酸性及び塩基性ＦＧＦはヘパリン及びヘパリン様分子に強く結合する特徴があ る。ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］及び［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体はいずれも１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中１．５４Ｍ塩化ナトリウムで溶出す る単一ピ ークを示した。 実施例６ ａＦＧＦ類似体の生物活性 インビトロバイオアッセイ 上記実施例からのａＦＧＦ類似体がＮＩＨ ３Ｔ３細胞に及ぼすマイトジェン 活性を下記のように測定した。更に、公開ＰＣＴ特許出願第８８／０４１８９号 に記載されているように調製したヒト［Ｓｅｒ⁷⁰，Ｓｅｒ⁸⁸］ｂＦＧＦ類似体も ａＦＧＦ類似体と平行して生物活性アッセイで試験した。 ＮＩＨ ３Ｔ３細胞はＡＴＣＣから入手した。１０％ウシ血清、１０単位／ｍ ｌペニシリン、２ｍＭグルタミン及び１０単位／ｍｌストレプトマイシンを補充 したＤＭＥで細胞を増殖させた。細胞を毎週２回１：４０の比で継代した。アッ セイの１日目に、亜集密培養物をトリプシンで分散し、上記培地に各ウェル１ｍ ｌずつ２０，０００細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートにプレーティングした。 ５日目に、血清を含有せず且つ上記濃度でペニシリン、ストレプトマイシン及び グルタミンを含有するＤＭＥＭ １ｍｌ／ウェルに培地を交換した。６日目に実 験試料を１００μｌ以下の容量で培地に加えた。１８時間後に、 ３７℃で三重水素化チミジン２〜１０μＣｉを含む上記培地１ｍｌを細胞に１時 間パルスした。パルス後、細胞を培地で１回洗浄し、次いで２５０ｍＭスクロー ス、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加え、プレート を３７℃で１０分間インキュベートして細胞を遊離させた。細胞をＳｋａｔｒｏ ｎハーベスター（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎ ｉａ）で回収した。フィルターを乾燥してシンチレーション液に入れ、Ｂｅｃｋ ｍａｎシンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で計数した。 ＮＩＨ ３Ｔ３に対するウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］及び［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧ Ｆ類似体のマイトジェン活性を図６に示すように試験した。ヘパリンの不在下で ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体は１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で３Ｈ−チミジン取 り込みの薬量依存性刺激を生じ、半最大刺激薬量は２５ｎｇ／ｍｌであった。同 一アッセイ条件下で［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体は著しく低いタンパ ク質濃度で同一マイトジェン効果を生じることができ、半最大薬量は約１ｎｇ／ ｍｌであった。 組換えｂＦＧＦは［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦの４〜５倍強力であり、半最 大薬量は２２０ｐｇ／ｍｌであった。４．５μｇ／ｍｌのヘパリンを両者類似体 に加えると、そのインビトロ活性は増加したが、［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧ Ｆ類似体のほうが強力であることは変わらなかった。４５μｇ／ｍｌのヘパリン の存在下では活性は増大し、全３種の分子の薬量応答はほぼ同一であり、半最大 薬量は９０ｐｇ／ｍｌであった。 １ｍｇ／ｍｌのヘパリンの存在下及び不在下で３７℃で２０ｍＭクエン酸ナト リウム（ｐＨ７）中各ＦＧＦ類似体０．１ｍｇ／ｍｌの溶液をインキュベートし てそれぞれのマイトジェン活性の維持を調べることにより、ａＦＧＦ類似体の安 定性を試験した。ヘパリンの不在下では、ウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体は迅 速に活性を失い、図７に示すように半減期は約１３時間であった。他方、ヘパリ ンの存在下ではウシ［Ａｌａ⁴⁷］ａＦＧＦ類似体は２５０時間の実験にわたって 生物活性を失わなかった。これに対して、ウシ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ 類似体とヒト［Ｓｅｒ⁷⁰，Ｓｅｒ⁸⁸］ｂＦＧＦ類似体はヘパリンの有無に拘わら ず、２５０時間にわたって活性の損失を全く示さなかった。 実施例７ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の結晶分析 ０．２Ｍ ＮＨ₄ ＳＯ₄、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０９９Ｍクエン酸ナトリウム 及び０．０２Ｍリン酸ナトリウムカリウム（ｐＨ５．６）で蒸気拡散によりウシ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦ類似体の結晶を成長させた。タンパク質液滴は 等容量のレザバー溶液と１０ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液を含んでいた。結晶は三 方晶系（空間群Ｐ３₁２₁、ａ＝７８．６Å、ｃ＝１１５．９Å）であり、２．５ Å分解まで回折した。１８ｋｗ回転アノード発電機に取り付けたＳｉｅｍｅｎｓ （Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｏｎｓｉｎ）マルチワイヤーエリアデテクターで強度 データを収集した。Ｓｉｅｍｅｎｓのプロセシングプログラムセットを使用して データ編集した。性能係数０．６８で２つの導関数から多重同形置換（ｍｉｒ） 位相を３Å分解まで計算した。溶媒平坦化後、不斉単位中の２個の独立したａＦ ＧＦ分子に対応する領域が確認された。これらの分子間の一般非結晶学的対称関 係を回転関数、実空間並進関数及び密度相関試験から決定した。修正したＢ．Ｃ ．Ｗａｎｇアルゴリズムを用いて平均ａＦＧＦ分子の周りの分子エンベロープを 決定した。分子 平均化及び溶媒平坦化により位相を反復修正した。 初期マップは図８に示すように、小さい分子エンベロープにより、ループ面取 りされたβシート構造の広がった領域を示した。（Ｒｏｕｌｄら，（１９８９） ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１１３５−１１４２に記載されているように平均化 位相に対して再修正した重原子のパラメーターからの）ｍｉｒ位相でモデル構築 用最終マップを計算し、初期モデルの原子位置の周囲に６Å球を配置することに より形成した分子エンベロープで反復平均化した。３Å分解で平均化すると、実 測構造因子と平均化及び溶剤平坦化マップから計算される構造因子の間の１７． ８％の最終Ｒ因子に収束した。Ｃ．ＣａｍｂｉｌｌａｕによりＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ４Ｄ８０用に作成されたグラフィックプログラムＴＯＭ／Ｆ ＲＯＤＯを使用してａＦＧＦ配列の残基１０〜１３６から平均化電子密度マップ を構築した。 結晶分析結果は、９０〜９７領域がループ構造に関係するという仮説を裏付け た。この領域が（Ｂａｉｒｄら（１９８８），前出により示唆されているように ）実際にレセプター結合に関与するならば、ループを安定化する全アミノ酸置換 は分子の生物活性を安定化及び／又は強化できるであろう。これが、ウシ ［Ａｌａ⁴⁷，Ｇｌｙ⁹³］ａＦＧＦで認められた活性強化達成の機序であると推定 される。 実施例８ ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体の製造 合成 ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体を作成するために、まず天然ＫＧＦをコードする 配列を獲得した後、類似体をコードする配列を得るようにアミノ酸１１６のコド ンを改変した。 天然ＫＧＦをコードする配列は、ヒト繊維芽細胞（細胞系ＡＧ１５２３）から 分離したＲＮＡを出発材料として使用して獲得し、当該技術分野で公知の標準技 術を使用してＫＧＦのｃＤＮＡを作成した。次にＫＧＦ ｃＤＮＡをポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で鋳型として使用してＫＧＦ遺伝子を増幅した。ＫＧＦ遺 伝子には内部ＮｄｅＩ部位が存在するため、ＰＣＲＤＮＡをまず２つのフラグメ ントとして作成し、固有のＢｓｍＩ部位で連結した。（下記に示す）オリゴヌク レオチド２３８〜２１及び２３８〜２４を使用してＤＮＡ産物を作成した後、Ｂ ｓｍＩ及びＢａｍＨＩで切断して分離すると、ＫＧＦの１８８塩基対フラグメン トが得られた。オリゴヌクレオチド２３８ 〜２２及び２３８〜２４を使用してＤＮＡ産物を作成してからＮｄｅＩ及びＢｓ ｍＩで切断すると、ＫＧＦの３１１塩基対フラグメントが得られた。２つのＤＮ Ａフラグメントを相互に連結すると、図９に示す天然ＫＧＦの遺伝子が得られる 。 所望の［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体をコードする配列を得るためには、ＫＧＦ 遺伝子中のＨｉｓ¹¹⁶コドンをグリシンコドンで置換することが必要であった。 これは、［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体をコードするように適当に塩基対を改変し たＨｉｓ¹¹⁶領域に対応するＫＧＦ ＤＮＡ配列をコードするオリゴヌクレオチ ド３１５〜１７及び３１５〜１８を用いてＰＣＲ重複オリゴヌクレオチド突然変 異誘発により実施した。ＰＣＲのＫＧＦ ＤＮＡ鋳型は、図１０に示すようにＫ ｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位間のＤＮＡ配列を化学的に合成したＤＮＡで置換した 以外は図９に示すものと同一であった。オリゴヌクレオチド２３８〜２２及び２ ３８−２４等のように、部位特異的突然変異のＫＧＦ ＤＮＡ領域５’−及び３ ’−に対応するものであれば任意の適当なオリゴヌクレオチドを使用して重複突 然変異誘発ＰＣＲの外部プライマーとすることができる。［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ 類似体をコードする配列を含むＥｃｏ ＲＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントを次に、既にＫＧＦ遺伝子を含んでいる 上述の発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６に連結し、ＫＧＦ遺伝子の対応領域を、 ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体をコードするために必要な変異を含むコーディング 配列で置換した（図１０）。次に連結ＤＮＡをＦＭ５（ＡＴＣＣ＃５３９１１） 宿主に形質転換し、ｐＣＦＭ１１５６［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体プラスミドを 含むコロニーを分離した。次に、標準発酵技術を使用してＦＭ５／ｐＣＦＭ１１ ５６ ＫＧＦ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体株を発酵させ、細胞ペーストを回収し た。 ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体の精製 約４リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．２Ｍ ＮａＣ ｌに大腸菌細胞ペースト６６５ｇを懸濁した後、懸濁液を９，０００ｐｓｉのＧ ａｕｌｉｎホモジナイザー に３回通すことにより、上記発酵からの［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体を含む細胞 を先ず破壊した。次に、懸濁液をＢｅｃｋｍａｎ ＪＡ−１０ローター（Ｂｅｃ ｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ ａ）で１０，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離した。 ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化して おいたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）カラム（５×２３ｃｍ、４５０ｍｌ総 容量）に遠心分離した懸濁液からの上清を２５ｍｌ／分の流速で添加することに より、イオン交換クロマトグラフィーを実施した。次にカラムを２Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．４Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、［Ｇｌｙ¹¹⁶ ］ＫＧＦ類似体を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中０．４Ｍ→０．６ Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。総勾配容量は７Ｌ（カラム容量の約１６倍 ）であった。ＫＧＦを含むフラクションをプールし、撹拌機付き容量４００ｍｌ のセルでＹＭ（登録商標）−１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）で約２２倍に濃縮した。 ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．５Ｍ Ｎａ ＮａＣｌで平衡化しておいたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−７５（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）カラム（４．４×８５ｃｍ）総容量１３００ｍｌ）にイオン交換ク ロマトグラフィーから得た濃縮ＫＧＦ（総容量８０ｍｌ）の半量を添加した後、 カラムをこの緩衝液で展開することにより、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ ＥＣ）を実施した。濃縮ＫＧＦ調製物の残りの半量で同一プロセスを繰り返した 。 次に、まず［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体のモノマー形態に対応するＳＥＣフラ クションをプールした後、プールしたフラクションを５容量の２ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ６．８）、０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈し、２０ｍＭリン酸ナトリウ ム（ｐＨ６．８）、０．４Ｍ ＮａＣｌで平衡化しておいたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（５×２３ ｃｍ、総容量４５０ｍｌ）に希釈フラクションを添加することにより、第２回目 のイオン交換クロマトグラフィーを実施した。次に、このカラムを約１．５Ｌの ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．４Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。精 製した［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８） 中０．４Ｍ→ ０．６Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。総勾配容量は１０Ｌ（カラム容量の 約２２倍）であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体を含 むことが確認された試料をプールし、ＫＧＦ含量をＵＶ吸収により測定した。 実施例９ ＫＧＦ類似体の分光分析 フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析 ２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）中のタンパク 質溶液をＤ₂Ｏ（Ｓｉｇｍａ，９９．９％＋同位体純度）中で調製した２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＤ６．８）緩衝液で透析濾過する ことにより、赤外分光分析用試料を調製した。ｐＤ値は、Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎら （１９６８），Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４０：７００−７０６に従ってガラス電 極ｐＨメーターからのｐＨ読み取り値に０．４５を加えることにより決定した。 最終タンパク質濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。ＣａＦ₂窓と１００μＭ Ｔｅ ｆｌｏｎスペーサーを備えるＩＲセルにタンパク質溶液を入れた。 構造特性決定のために、両面に２５６インターフェログラム を同時に加え、Ｎｉｃｏｌｅｔ ８００ＦＴＩＲシステムを使用してＨａｐｐ− ｇｅｎｚｅｌアポディゼーション関数の適用後にフーリエ変換した。分解能は２ ｃｍ^-1に設定した。Ｎｉｃｏｌｅｔソフトウェアを使用してＳｕｓｉとＢｙｌｅ ｒ（１９８３），Ｂｉｏｃｈｍｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１１ ５ ：３９１−３９７に従って導関数スペクトル及びフーリエ自己解析を実施した 。プログラムＰｅａｋｆｉｔ（登録商標）（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ Ｃｏ．）を使用して曲線調整を行った。ＫＧＦの赤外スペクトルはｂＦＦＦ 及びａＦＧＦと強い類似性を示し、これらの３種のタンパク質が構造的に似てい ることを示した。 自動温度制御器（Ｓｐｅｃａｃ Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅ ｃｔｉｃｕｔ）により制御される電気加熱ジャケットにＩＲセルを入れることに より、天然ＫＧＦと［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体の熱安定性試験を実施した。温 度を０．５℃／分の速度で上昇させた。８ｃｍ^-1分解能でＩＲスペクトルを収集 した。 ５０℃未満の温度では、スペクトルは周囲温度のスペクトルから殆ど変化しな いようであった。温度が５０℃を越えると、 スペクトルは天然ＫＧＦがこの時点でサーモトロピック遷移することを示した。 スペクトルには１６１６及び１６８５ｃｍ^-1付近のピークが明白であり、６５℃ までではこれらのピークがスペクトルで優勢であり、１６４３ｃｍ^-1に対応する 強度損失があった。このスペクトル遷移は、天然ＫＧＦの協同的変性を表す。観 察された熱遷移は可逆的でなかったので、変性したタンパク質が凝集したためで あると思われる。天然ＫＧＦの融点Ｔ_mは６０℃であると推定され、［Ｇｌｙ¹¹⁶ ］ＫＧＦ類似体のＴ_mは天然ＫＧＦよりも５℃高く６５℃であると推定され、［ Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体は天然ＫＧＦよりも高い相対熱安定性をもつと思われ る。紫外線分光分析 Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ ＵＶ分光光度計（Ｇｉｌｆｏｒｄ，Ｍｅｄｆｉｅｌ ｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）にＰｅｌｔｉｅｒ温度制御器及び熱プログラ マーを取り付けて［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体と天然ＫＧＦの両者の熱変性を試 験した。２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中のＫＧＦ溶液を最終タンパ ク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ及び最終グアニジンＨＣｌ濃度０〜２Ｍとなるよう に８ＭグアニジンＨＣｌ又 は２０ｍＭリン酸ナトリウムと混合した。熱走査速度は０．５℃／分に設定し、 モニター波長は２８６ｎｍとした。少量のグアニジンＨＣｌを加えて熱変性中の タンパク質の沈殿を除去したが、変性は可逆的にならなかった。従って、比較し ようとする試料を同時に試験した。 ＵＶ分光分析を用いた熱変性実験は、０及び１ＭのグアニジンＨＣｌの存在下 では加熱すると濁りが生じるため、成功しなかった。しかし、［Ｇｌｙ¹¹⁶］Ｋ ＧＦ類似体よりも天然ＫＧＦのほうが低温で濁りが生じたので、天然ＫＧＦのほ うが低温で変性し、従って凝集すると考えられる。１．５ＭグアニジンＨＣｌ中 では、２８７ｎｍの吸光度はタンパク質が変性するにつれて減少し、その後、凝 集により増加した。吸光度の増減が生じた温度は［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体で はそれぞれ２５及び４４℃であった。２ＭグアニジンＨＣｌを加えると、２５℃ では天然ＫＧＦと［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体の両者で部分的変性が生じた。温 度を上げるとタンパク質は完全に変性し、天然ＫＧＦは３７℃、［Ｇｌｙ¹¹⁶］ ＫＧＦ類似体は４６℃で変性を終了した。これらの結果は、［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧ Ｆ類似体のほうが融点の点で数度熱安定性であることを示し、 ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体のＴ_mが天然ＫＧＦよりも約５℃高いという赤外分析 に一致する。 実施例１０ ［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体のマイトジェン活性 Ｒｕｂｉｎら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８６：８０２−８０６のマイトジェン分析アッセイを使用して［Ｇｌｙ¹¹⁶］ ＫＧＦ類似体のマイトジェン活性を分析した。［Ｇｌｙ¹¹⁶］ＫＧＦ類似体は天 然ＫＧＦで観察されるよりも少量の³Ｈ−チミジン取り込みを示し、［Ｇｌｙ¹¹⁶ ］ＫＧＦ類似体のほうが特異活性が低いことを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フオツクス，ギヤリイ・マイケル アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320 −1789、ニユーベリー・パーク、ウエス ト・ケリイ・ロード・35

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＦＧＦファミリーの天然タンパク質の類似体であって、前記天然タンパク質 の−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−のループ形成配列中の少なくと も１個のアミノ酸がより高いループ形成力価をもつ別のアミノ酸の残基で置換さ れている前記類似体。 ２．前記天然タンパク質がＫＧＦである請求項１に記載の類似体。 ３．置換される前記アミノ酸がアミノ酸１１６である請求項２に記載の類似体。 ４．より高いループ形成力価をもつ前記アミノ酸がグリシン、プロリン、チロシ ン、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、トレオニン、リシ ン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン及びトリプトファンから構成さ れる群から選択される請求項３に記載の類似体。 ５．より高いループ形成力価をもつ前記アミノ酸がグリシンである請求項４に記 載の類似体。 ６．図１０に示すアミノ酸配列をもつ請求項５に記載の類似体。 ７．前記類似体が前記高い生物活性を実質的に維持しながら少なくとも１個の末 端アミノ酸残基が欠失している請求項６に記載の類似体。 ８．前記天然ＫＧＦの少なくとも１個のシステイン残基が中性アミノ酸の残基で 置換されている請求項７に記載の類似体。 ９．請求項１に記載の類似体の原核又は真核発現をコードするＤＮＡ配列。 １０．前記類似体が請求項６に記載の類似体である請求項１０に記載のＤＮＡ配 列。 １１．治療薬として有効な量の請求項１に記載の類似体と１種以上の医薬的に許 容可能なアジュバントを含む医薬組成物。 １２．前記類似体が請求項６に記載の類似体である請求項１１に記載の医薬組成 物。 １３．治療薬として有効な量の請求項１に記載の類似体を創傷に投与することを 特徴とする創傷の治療方法。 １４．前記類似体が請求項６に記載の類似体である請求項１３に記載の方法。 １５．図１に示すアミノ酸配列をもつ請求項５に記載の類似体。 １６．図２に示すアミノ酸配列をもつ請求項５に記載の類似体。