JPH10508182A

JPH10508182A - 活性化ウイルス

Info

Publication number: JPH10508182A
Application number: JP7523695A
Authority: JP
Inventors: アール．ウェクター，ステフェン; イー．リンドナー，ルター
Original assignee: パシフィックバイオテクインターナショナル，インコーポレーテッド
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 1998-08-18
Also published as: WO1995024470A1; US6177081B1; CA2185097A1; AU1991095A

Abstract

(57)【要約】活性化ウイルス（ＡＶ）と呼ばれる新規なウイルスが感染したキヌザルから単離される。この活性化ウイルス（ＡＶ）は、レトロウイルス感染が原因であると考えられるいくつかのがんを含めて、広範囲のがん性細胞中に見られる。

Description

【発明の詳細な説明】活性化ウイルス発明の背景１．発明の分野本発明は、一般には、ウイルス感染の検出および治療に関する。より詳細には、本発明は、活性化ウイルス（activating virus：ＡＶ）と呼ばれるリンパ球性ウイルスの新たに発見されたファミリーによる感染の診断に有用であり、かかる感染に対するワクチン接種にも有用な組成物および方法に関する。２．関連技術の説明ウイルスは、宿主細胞の増殖の遺伝子刺激から免疫抑制の誘導（抑制ウイルスと直接には関係がない腫瘍を発生させる）に至るまでのさまざまな作用機構によってヒト腫瘍の発生に関与しうる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者はカポジ肉腫やＢ細胞リンパ腫を発生する危険が実質的に増し、これは明らかにＨＩＶ感染に起因する免疫抑制によるものである。一方、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は腫瘍特に肛門性器や口腔のがんの一因であると疑われている（A．Nahmiasら，Am．J．Epidemol.，91:547，1970; W.E．Rawlsら，Canc er Res.，33:1542，1973; R．Duff ら，J．Virol.，8:469，1971; H．zur Hause n，Int．Rev．Exp．Pathol，25:307，1983）。エプスタイン- バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、いくつかのタイプの乳頭腫ウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉと恐らくはII（ヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルス）は常に特定の悪性腫瘍と結びつけられるが、これらのウイルスはどれも、がんを誘導するのに単独では十分でないことが知られている。最近の研究からは、エプスタイン- バーウイルスとヒト乳頭腫ウイルスは感染細胞を不死化させて、それらの細胞を絶えず分裂させる遺伝子を担っていることが示唆された。その証拠として、がん関連乳頭腫ウイルスのトランスフォーミング遺伝子と思われる、Ｅ６およびＥ７と名づけられた２つの遺伝子が提示された。両遺伝子は子宮頸癌細胞のＤＮＡ中に常に見いだされ、そこで活動している。また、エプスタイン- バーウイルスもトランスフォーミング遺伝子ＥＢＮＡ−２をもっていると思われ、この遺伝子は他のウイルスや細胞の遺伝子（潜在的な膜タンパク質遺伝子を含む）の発現を刺激することができる。Ｂ型肝炎ウイルスは、これまで知られている限り、トランスフォーミング遺伝子を保持していないが、肝臓がんを発生させる。その理由はたぶん感染細胞のゲノムへ挿入されたウイルスＤＮＡそれ自体が細胞のオンコジーンを活性化するためであるらしい。ＤＮＡ腫瘍ウイルスは、それらの重要性にもかかわらず、単独でがんを引き起こすことはできない。感染細胞には、現在確認されていない他の変化や原因となる因子（恐らく数種）も必要とされる。本発明は「活性化ウイルス」またはＡＶと呼ばれる、新たに探索されたウイルスについて記述する。このウイルスは多種多様ながんの病因として関係づけられる。これは広範囲のがん性細胞から単離されたものであり、この種のがんの多くはこれまで誘発要因としてウイルス感染が関与しているとされてきたが、ウイルス病因物質は全く見つかっていなかった。発明の概要活性化ウイルス（ＡＶ）と呼ばれる新規なウイルスを検出するための、また、該ウイルスに対してワクチン接種するための組成物および方法が提供される。本組成物は完全ウイルス(whole virus)またはその部分（特に主要なエンベロープおよびコアタンパク質に存在するような、このウイルスに特有の抗原決定基に特異的な抗体と交差反応するポリペプチドを含む）を含むものである。本組成物はさらに、該ウイルスと反応しうるすることのできる抗体またはＡＶゲノムと二本鎖を形成しうるポリヌクレオチドを包含する。本発明の組成物を用いると、各種の技法により、とりわけイムノアッセイやヌクレオチドプローブを用いる技法により、上記のウイルスおよびウイルス感染を検出することができる。イムノアッセイは生理学的検体特に血液やリンパ組織に含まれる該ウイルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出を可能にする。核酸プローブは生理学的検体中のＡＶゲノムの存在を検出するために用いられる。ワクチンは部分的不活化または完全不活化のいずれかにより完全ウイルスから調製することができる。また、サブユニットワクチンは、Ｂリンパ球やＴリンパ球の応答をモジュレートし得るウイルスタンパク質の抗原部分から調製することができる。図面の簡単な説明図１は、５〜７日後にＭＡＶを接種したＯＭＫ細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図２は、５〜７日後にＭＡＶを接種したＯＭＫ細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図３は、感染していないＯＭＫ細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図４は、感染していないＯＭＫ細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図５は、衰弱しているキヌザル(marmoset)由来のリンパ球培養物から得られた活性化ウイルスの浮遊液からのネガティブ染色グリッドの電子顕微鏡写真である。図６は、衰弱しているキヌザル由来のリンパ球培養物から得られた活性化ウイルスの浮遊液からのネガティブ染色グリッドの電子顕微鏡写真である。図７は、ウイルス粒子のエンベロープメント（包膜化）を示す感染ＯＭＫ細胞の核領域の切片の電子顕微鏡写真である。図８は、ヒト活性化ウイルス（株＃６５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析のイムノグラフである。図９は、ヒト活性化ウイルス（株＃６５）の垂直電気泳動後の銀染色ゲルの写真である。特定の実施態様の説明活性化ウイルス（ＡＶ）と名づけられた新規なウイルスが発見され、ヒト（ＨＡＶ）やキヌザル（ＭＡＶ）などの霊長類から実質的に純粋な形態で単離された。このウイルスは霊長類内で感染性であって、脱毛症、貧血、慢性鼻炎、下痢、やせ衰え、腸炎、歯肉炎、神経異常、歯周炎、脂漏性皮膚炎を含め、多様な症状と関連している。ＡＶの病因論、病原論、形態学はヒトおよび霊長類においてそれぞれ後天性免疫不全症候群を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサルＴリンパ球性ウイルスIII（ＳＩＶ）のものとは似ていない。ＡＶはＨＩＶともＳＡＩＤＳとも、また、他のどのような既知ウイルスとも抗原的に関係がないらしい。予備的調査により、ＡＶ感染は広く行き渡っていて、恐らくさまざまな病変の原因になっていることが示唆された。ＡＶは球形の不完全な二十面体対称の、明確には定められていないキャプシドを有し、滑らかなエンベロープ、１００ナノメートルよりやや小さい平均寸法の形態をした二本鎖ＤＮＡウイルスとして特徴付けられる。また、このウイルスは水平伝播をおこなう点に特徴があり、さらに少なくともいくつかの場合には垂直伝播もおこなう点に特徴がある。ＡＶは多形性であると予想され、本明細書中でＡＶについて言及するときは、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の実質的相同を共有して免疫学的に関連した各種の株を含めて、全ＡＶファミリーを包含するものである。ここに示した情報は、ほんの数例のＡＶ株から得られたものであるが、ウイルス分類学者が本請求の範囲に含まれる他の株を同定するには十分である。アミノ酸配列の実質的相同とは、約７５％以上の相同、通常は約８０％以上の相同、多くの場合は９０％以上の相同がウイルスの遺伝子およびタンパク質の少なくとも一部に見られることを意味する。例えば、ウイルスゲノムが全体として相同でないのに、ウイルスタンパク質は必要な相同を示すかもしれない。このような場合は、ウイルスが免疫学的に関連している限り、そのウイルスは本発明の範囲内のＡＶであると見なされる。アミノ酸配列の相同を調べる技法は当技術分野で知られている。例えば、アミノ酸配列を直接解析して、ここに示した配列と比較することができる。また、例えば、推定上のＡＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を決定し（通常はｃＤＮＡ中間体を経る）、そこにコードされるアミノ酸配列を解析して、対応領域を比較することもできる。本明細書中で用いるとき、指定された配列（例えば、ＡＶＤＮＡまたはＡＶゲノム）「から誘導される」ポリヌクレオチドとは、その指定された配列のある領域に一致するか、相同であるか、または相補的である少なくとも８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０〜１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５〜２０ヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチド配列を指す。有利には、ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列はＡＶゲノムにユニークな配列に相同であるか相補的な配列である。ある配列がＡＶゲノムにユニークであるか否かは当業者に知られた方法で判定できる。例えば、その配列をデータバンク（例えば、Genebank）にある配列と比較することにより、それが非感染宿主や他の生物中に存在するか否かを調べる。また、その配列を他のウイルス（ヒトの病気を誘発することが知られているものを含む）の既知配列と比べてみてもよい。誘導された配列と他の配列との一致または不一致は適当なストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによっても調べられる。核酸配列の相補性を調べるハイブリダイゼーション法は当技術分野で知られており、例えば、Maniatisら（19 82）に記載されている。さらに、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖ポリヌクレオチドのミスマッチも、例えば二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に消化するＳ１のごときヌクレアーゼを用いた消化を含めて、公知の方法により見つけ出すことができる。代表的なＤＮＡ配列が「誘導」され得る領域には、限定するものではないが、例えば特定のエピトープをコードする領域、非転写および／または非翻訳領域が含まれる。誘導ポリヌクレオチドは必ずしもＡＶヌクレオチド配列から誘導される必要はなく、例えば、そのポリヌクレオチドが誘導された領域の塩基配列から得られた情報に基づく化学合成、ＤＮＡ複製または転写などの任意の方法で作製してもよい。さらに、指定された配列の領域に一致する複数の領域の組合せを、意図した用途に合致するように当技術分野で知られた方法により修飾してもよい。同様に、指定の核酸配列から誘導されたポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその部分（ここで該部分は少なくとも３〜５アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１１〜１５アミノ酸からなる）、またはその配列によりコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であると見なしうるポリペプチドを指す。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしも指定の核酸配列またはＡＶゲノムから翻訳される必要はない。それは例えば化学合成、組換え発現系の発現、突然変異ＡＶからの単離を含めて任意の方法で調製することができる。本明細書中で用いる「組換えポリヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ由来の、半合成または合成由来のポリヌクレオチドを指し、その由来または操作によって、(1)自然界でまたはライブラリーの形で結合されているポリヌクレオチドの全部または一部と結合されていないポリペプチド、および／または(2)自然界で連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）の任意の長さの重合形態を指す。この用語はその分子の一次構造を指すにすぎない。従って、この用語は二本鎖および一本鎖のＤＮＡと二本鎖および一本鎖のＲＮＡを含み、また、例えばメチル化および／またはキャッピングによるそのポリヌクレオチドの修飾形態と、非修飾形態を含むものである。本明細書中で用いる「ｃＤＮＡに対応する配列を含むＡＶ」とは、ＨＣＶが指定のＤＮＡ中の配列に相同であるか相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ｃＤＮＡに対する相同性または相補性の度合は約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上であるだろう。対応する配列は少なくとも約７０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド、より好ましくは約９０ヌクレオチドの長さであるだろう。ＡＶ配列とｃＤＮＡとの対応関係を調べるには、例えば、配列決定された物質と記載されたｃＤＮＡとの直接比較、またはハイブリダイゼーションおよび一本鎖ヌクレアーゼによる消化と、その後の消化フラグメントの大きさの測定を含めて、当技術分野で知られた技法により行う。ウイルス粒子からのウイルスポリヌクレオチドの精製方法は当技術分野で知られており、例えば、カオトロピック剤によるウイルス粒子の破壊、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび密度に従う沈降によるポリヌクレオチドとポリペプチドの分離を含む。「免疫学的に関連した」とは、種々の株が新たに発見されて寄託された株と実質的な血清学的交差反応性を示すことを意味する。血清学的交差反応性は、寄託されたＡＶ株に対して特異的な抗血清または抗体が寄託株のみならず他のＡＶ株とも反応する能力として定義される。通常、免疫学的に関連した株は１以上のエピトープ部位、一般には５以上のエピトープ部位、多くの場合は１０以上のエピトープ部位に特異的な抗体と交差反応するだろう。有利には、ＡＶ株はウエスタンブロット分析により同定することができ、その場合、精製したウイルスを適当な界面活性剤（例：ドデシル硫酸ナトリウム）で破壊し、スラブゲル上で電気泳動により分離する。分離したポリペプチドバンドをゲルからニトロセルロースフィルターに移行させ、標識した抗体で視覚化する。次いで、分割された種々のバンドの分子量を既知の分子量スタンダードとの比較により決定する。同じ手法を使って調製した場合の、未同定ウイルスと既知ＡＶウイルスのウエスタンブロット分析の実質的類似性は、その未知ウイルスがＡＶウイルスである可能性を示すものである。ウエスタンブロット分析により得られたＡＶバンドは１．１２〜１．２０ｇ／ｃｍ³（３０〜４５％スクロース）の密度範囲をカバーする。ＡＶ感染細胞のライセート（溶解産物）のウエスタンブロッティングは、それぞれ３２ｋＤ、４４ｋＤ、４８ｋＤおよび５８．８ｋＤに主要なバンドを生じさせる。一つのはっきりしたバンドが１０６．５ｋＤに見られ、そして２６ｋＤ、３０．５ｋＤ、７４．５ｋＤ、８０ｋＤ、９５ｋＤ、１２６．８ｋＤ、１６８ｋＤおよび１９８ｋＤのそれぞれにかすかなバンドが見られた。ＡＶは慣用技術により感染動物の血清から単離できる。例えば、感染動物の血液から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離して適当な培地に置く。下記の実施例１に記載したような細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ウイルス血症のヒトまたはキヌザル血清をヨザル(owl monkey)腎細胞(ATCC#CRL 1556)に接種するときにも見られる。培養物をインキュベートし、その間当初の細胞がウイルスによって死滅するので、その生存度を維持するために正常ＰＢＬを培養物に周期的に加える。感染細胞を定期的に新鮮な培地に置き、そして細胞培養物の上清からスクロース勾配分離や他の公知分離技術によりウイルスを回収する。また、他の検体から、とりわけ感染動物のリンパ組織からＡＶを得ることもできる。リンパ組織を破砕して培地中に浮遊させ、その後上記の手順を行う。単離したウイルスから、当技術分野で知られた方法を用いて、ウイルスおよびその部分をコードするＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを誘導することができる。本発明による組成物は完全ウイルスおよび該ウイルスの部分を含む。完全ウイルスは上記したとおりin vitro培養物中に維持されるか、−８５℃で、または約 −７８℃以下（固体ＣＯ₂−ドライアイス）で、通常は結晶化よりもむしろ非晶質のガラス様固体化を促進する薬剤の存在下に、生存可能な状態で凍結される。適当な薬剤としてはグリセロール、ジメチルスルホキシドなどがある。特に興味のもてるＡＶの部分には、ＡＶゲノムによりコードされる構造および調節タンパク質、例えばキャプシドおよびコアタンパク質とこれらのフラグメントが含まれる。本発明のポリペプチドはハプテン性または抗原性であり、天然ＡＶタンパク質の内部に連続して存在する少なくとも６アミノ酸、一般的には少なくとも９アミノ酸、より一般的には１２またはそれ以上のアミノ酸を含むものである。通常、ポリペプチドはＡＶに特有の少なくとも１つのエピトープ部位、好ましくはＢ細胞および／またはＴ細胞と関連したエピトープに相当するだろう。これに関連して「特有の」とは、そのエピトープ部位が生理学的サンプル中のウイルスの免疫学的検出をかなりの精度で可能にすることを意味する。通常、エピトープ部位はＡＶ以外のウイルスとは免疫学的にはっきり区別される（すなわち、ＡＶ以外のウイルスを認識する抗体とは交差反応しない）ことが望ましい。しかし、ある場合には、エピトープ部位が他のウイルスと免疫学的に類似していることが望ましいかもしれない。ＡＶポリペプチドは天然源から単離された全ＡＶタンパク質またはそのフラグメントを含む天然物であっても、合成物であってもよい。天然ポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーのごとき慣用技術により、上記のように得られる完全ウイルスから単離される。有利には、本発明により得られたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使って、公知技術により適当なアフィニティカラムを作製する。こうした技術は、例えば、Hudson and Hay，Chapter 8，Practic al Immunology，Blackwell Scientific Publications，Oxford，United Kingdom ，1980に教示されている。天然ＡＶタンパク質と免疫学的に交差反応する合成ポリペプチドは、２つの一般的なアプローチのいずれかにより製造することができる。第一の方法では、約８０個より少ない、一般には約５０個より少ないアミノ酸を有するポリペプチドが公知のMerrifield固相合成法（伸長しつつある鎖にアミノ酸が逐次付加される）により、合成する(Merrifield，J．Am．Chem．Soc.，85:2149-2156，1963)。本発明のポリペプチドを合成するための好適な第二の方法は、ＡＶゲノムの所望の部分をコードする組換えＤＮＡ分子を培養細胞内で発現させることを含む。ＡＶゲノムの所望部分はそれ自体が天然物でも合成物でもよく、天然遺伝子は慣用技術により単離ウイルスから得られる。ポリヌクレオチドは公知技術により合成することもできる。例えば、ホスホルアミダイト法(Beaucage and Carruthers ，Tet．Letters，22:1859-1862，1981)により短い一本鎖ＤＮＡフラグメントを製造しうる。その後、相補鎖を合成して鎖同士を適当な条件下でアニールするか、または適当なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成することにより二本鎖フラグメントが得られる。所望のＡＶタンパク質またはフラグメントをコードする天然または合成ＤＮＡフラグメントは、in vitro細胞培養下での導入および発現が可能なＤＮＡ構築物に組み込まれる。通常、ＤＮＡ構築物は酵母やバクテリアのような単細胞宿主内での複製に適している。また、それらは哺乳動物または他の真核生物の培養細胞のゲノムへの導入および組込みに適している。バクテリアや酵母への導入のために作製されたＤＮＡ構築物は、宿主により認識される複製系、目的のポリペプチド産物をコードするＡＶＤＮＡフラグメント、そのＡＶＤＮＡフラグメントの５’末端に結合された転写および翻訳開始調節配列、そのフラグメントの３’ 末端に結合された転写および翻訳終止調節配列を含むだろう。転写調節配列は宿主により認識される異種プロモーターを含むだろう。都合がよいことに、多くの宿主に適する種々の発現ベクターは市販されている。本発明の検出方法において有用であるためには、ポリペプチドは実質的に純粋な形態、すなわち、一般的には約５０％（ｗ／ｗ）またはそれ以上の純度で得られるものであり、本質的に干渉性のタンパク質および汚染物質を含まない。好ましくは、ＡＶポリペプチドは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）の純度で単離または合成される。慣用のタンパク質精製技術を使うと、少なくとも約９９％（ｗ／ｗ）の純度の均質なポリペプチド組成物が得られる。例えば、タンパク質は、そして完全ＡＶでさえも、後述される抗体を用いる免疫吸着アフィニティカラムにより精製することができる。十分量のＡＶポリペプチドが得られさえすれば、in vitroまたはin vivo 技法によりＡＶに特異的なポリクローナル抗体を生産することができる。in vitro技法は抗原性ポリペプチドへのリンパ球のin vitro暴露を必要とし、一方、in viv o 技法は種々の脊椎動物への該ポリペプチドの注入を必要とする。適当な脊椎動物はヒト以外の動物であって、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ロバなどである。本発明の抗体の生産にはロバとその他のウマ科の動物種が適している。約３０個以上のアミノ酸、通常は約５０個以上のアミノ酸を有するポリペプチドが免疫原として直接的に作用しうる。ポリペプチドが約１０ｋＤより小さい、特に約６ｋＤより小さい場合には、所望の免疫反応を誘起させるためにポリペプチドをより大型の分子に結合させる必要があるかもしれない。次いで、免疫原を予め決められたスケジュールに従って動物に注射し、その後抗体価と特異性の向上を示す逐次採血により動物から定期的に血液を採取する。通常、筋肉内、皮下などに注射を行い、そして不完全フロインドアジュバントのようなアジュバントを用いる。完全ウイルスを免疫原として用いることもできるが、特定の抗原決定基に対して特異的な抗体を選択することがより困難になるだろう。所望により、モノクローナル抗体が希望の特異性の抗体を産生する能力のある不死化細胞系を作製することにより得られる。こうした不死化細胞系はいろいろなやり方で作ることができる。有利には、マウスのような小型の脊椎動物を上記の方法により所望の抗原で高度免疫する。次に動物を、通常は最後の免疫感作の数日後に、犠牲にして脾臓を摘出し、その脾細胞を不死化させる。不死化のやり方は特に限定的なものではない。現在最も汎用されている技術は、Kohler and M ilstein，Eur．J．Immunol.，6:511-519，1976に最初に記載された、ミエローマ細胞融合相手との融合である。その他の技術には、ＥＢＶ形質転換、オンコジーンによる形質転換、レトロウイルスによる形質転換、および細胞系の安定した維持とモノクローナル抗体の生産をもたらすあらゆる方法が含まれる。融合相手との融合を採用する場合、融合方法は特に限定的なものでなく、種々の技術を用いることができる。有利には、脾細胞とミエローマ細胞とを非イオン界面活性剤（普通はポリエチレングリコール）とダルベッコ改良イーグル培地のような他の添加剤の存在下で２，３分間混合する。融合終了時に細胞を洗って非イオン界面活性剤を迅速に取り除く。すぐに融合細胞はハイブリッド細胞の生育を支持するがミエローマ細胞には致命的な選択培地を入れた小さな培養ウェル（通常は約１〜５×１０⁵細胞／ウェルの比較的低い細胞密度でマイクロタイタープレート）に分配する。通常、ミエローマ細胞は感受性となるように突然変異されており、選択培地は未融合のミエローマ細胞の増殖を阻止するのに十分な濃度のＨＡＴを含んでいる。十分な時間の経過後、通常はおよそ１〜２週間後、ハイブリッドのコロニーが観察されるようになるので、超陽性ウェルを含むプレートを同定する。ウェルあたりただ１つのコロニーを有するプレートおよびウェルを選択し、これらのウェルから得られた上清を試験して、ＡＶまたは特定のＡＶタンパク質に対する結合活性を測定する。ひとたび陽性のハイブリドーマが同定されたら、その細胞系を生存可能な培養物として維持することができ、そして／または、ある量のウイルスを増殖させて分離し、凍結乾燥により貯蔵することができる。希望する抗体の用途に応じて、ハイブリドーマの更なる精製が望ましいかもしれない。免疫診断アッセイにおいて使用する場合は、本発明のＡＶまたはＡＶポリペプチドの抗原部位に対する特異性と親和性が非常に高い抗体が望ましい抗体である。所望のハイブリドーマが選択されさえすれば、モノクローナル抗体は増殖中のコロニーの上清から単離しうる。しかしながら、得られる抗体の収量は通常低いものである。この収量は、例えば脊椎動物宿主の腹膜腔の中にハイブリドーマ細胞系を注入するといった種々の技術により、高めることができる。その後、腹水や血液からモノクローナル抗体が回収される。通常、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、抽出などの慣用技術によって使用前にモノクローナル抗体からタンパク質性の汚染物質や他の汚染物質が除かれる。また、抗体鎖をコードするｃＤＮＡを既知の方法により得て、そのｃＤＮＡを含むベクターで原核または真核宿主細胞を形質転換し、組換えにより抗ＡＶ抗体を生産することも可能である。好ましい宿主細胞はヨザル腎細胞（ＯＭＫ）、例えば ATCC #CRL 1556 により提供されるものである。本発明のポリペプチドと抗体は、ＡＶ感染の検出やそれに対するワクチン接種のために修飾を加えてまたは加えないで使用することができる。多くの場合は、検出可能なシグナルを生じる物質を共有結合または非共有結合により結合させてポリペプチドや抗体を標識する。さまざまな標識および結合技術が知られており、科学文献と特許文献の双方に詳しく報じられている。標識としては、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光体、化学発光体、磁性粒子なとが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,81 7,837 号、第3,850,752 号、第3,939,350 号、第3,996,345 号、第4,277,437 号、第4,275,149 号、第4,366,241 号などがある。上記のごとく調製された抗体とポリペプチドは、生理学的検体特に体液サンプル（例えば、血液、血漿、血清、尿など）および細胞サンプル（例えば、リンパ球）中に含まれるＡＶおよび抗ＡＶ抗体を検出するための各種の免疫学的方法において用いられる。サンプルの性質に応じて、イムノアッセイと免疫組織化学的染色の両方を使用してもよい。体液、特に血液や尿、の中に含まれるＡＶを検出するには液相イムノアッセイとウエスタンブロット分析が用いられるだろう。タンパク質結合アッセイにおける抗体の使用は確立された技術である。多数の競合的および非競合的タンパク質結合アッセイが科学文献と特許文献に記載されており、こうしたアッセイの大多数は商業的に入手可能である。血清サンプル中のウイルスの有無を検出する方法の詳細は「実験」の項に記載してある。さらに、血液中のＡＶに対する抗体の有無を検出する酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）も「実験」の項に記載してある。本発明の組成物はＡＶ感染を防御するためのワクチンの製造にも有用である。例えば、完全ウイルスが完全にまたは部分的に不活化され得る。部分的不活化は高温での継代を重ねるか、紫外線やメタンスルホン酸エチルなどの突然変異原と接触させることにより行う。完全不活化は他の作用物質、例えばホルマリン、フェノール、α−ラクトプロピオネート、紫外線、加熱、プソラレン類、白金コンプレックス、オゾン、その他の殺ウイルス剤との接触により行う。また、生きているが弱毒化された活性化ウイルスによるワクチン接種も意図されており、好ましくは水酸化アルミニウムまたはフロインドアジュバントと組み合わせて無毒性予防量で用いる。弱毒生ウイルスワクチンを用いる利点は、強い免疫反応を起こさせるのに必要な物質の量が少なくてすむことである。ウイルスは当技術分野で公知の方法を使って弱毒化され得る。例えば、アフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞内で生存ウイルスの継代を重ねることが L.N．Binn，J.Cl in．Microbiol．20:28-33，1984に記載されている。また、米国特許第5,021,348 号（その全体を参考としてここに組み入れる）に記載されるように、弱毒化ウイルスをin vitro細胞培養物中で繁殖させることもできる。簡単に述べると、細胞培養物はアカゲザル（ＦＲｈＫ６）、マカクザルまたはオナガザルからの胎児または新生児腎細胞、あるいはヒトまたはヒト以外の霊長類の肺組織からの二倍体繊維芽細胞、ＷＩ−３８（ATCC #CCL 75）またはＭＲＣ−５(ATCC #CCL 171) に由来するものである。最初に、ウイルスを腎細胞または肝細胞培養物中で少なくとも１回、好ましくは２〜２０回ほど継代し、さらにヒト肺組織由来の二倍体繊維芽細胞中で少なくとも４回、好ましくは５〜２０回ほど継代を重ねる。接種した細胞培養物は、抗原の存在について陽性の結果が得られるまで長期間にわたり、少なくとも約２０日間、好ましくは約２５〜１００日間インキュベートする。インキュベーションは細胞を維持する栄養培地の存在下に、細胞培養物中でのウイルスの増殖を可能にする温度、一般的には約３０〜３９℃、好ましくは３５℃で行う。栄養培地は例えばイーグルＭＥＭ、ウイリアムズ培地、培地１９９、ダルベッコ改良イーグル培地、ＲＰＭＩ培地または０．５％のウシ胎児血清を補った基本培地イーグルでありうる。その後培養物を収穫し、ウイルスの連続継代を実施する。大方のワクチンの防御効果は誘導されたレベルの循環抗体によるものである。生きているが弱毒化されたウイルスはまた、当技術分野で公知の方法を用いて、ワクチンとして使用するための免疫刺激複合体（immunostimulating complex ：ＩＳＣＯＭ）中に組み入れることができる。ウイルスキャプシドタンパク質を含有する活性化ウイルス免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）ワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃＣＵＭおよびＡ／Ｊ近親交配マウス株において２回のブースター投与後に高い中和抗体価をもたらした。ＩＳＣＯＭ粒子中のウイルスコートタンパク質抗原の提示は主に３つの利点を有する。すなわち、複製するウイルス核酸が宿主中に導入されないこと、高レベルの中和抗体が生産されること、そしてＭＨＣクラスIIの制限下で誘導された細胞障害性Ｔ細胞を含めて細胞性免疫が引き出されることの３点である。ＩＳＣＯＭワクチンを製造する方法は当技術分野で公知である（B. Morein ら，Nature，308:457-60，1984）。抗原性エピトープの遺伝子をベクターに挿入するには分子生物学の既知技術を用いることができる。一つのこのようなベクターとしてワクシニアウイルスが使用されてきた。Current Protocols in Molecular Biology，F.M．Ausubel編，Cu rrent Protocols，Vol．2, §16.17，1993 を参照のこと。現在、いくつかのコクサッキーＢウイルスのキャプシドタンパク質の遺伝子が入手可能であり、当技術分野で公知の技術を用いて適当なベクターに挿入することができる。さらに、単一の脂質二重層からなる単ラメラ小胞を含めたリポソームを、ウイルスコートタンパク質のようなウイルスタンパク質を送達するためのベクターとして用いることができる。こうした方法は Almeidaらの米国特許第4,148,876 号および Manninoらの米国特許第4,663,161 号に教示されている（これらの全体を参考としてここに組み入れる）。上記のように調製されたウイルスタンパク質およびその部分は、既知技術によりサブユニットワクチンの製造にも用いられる。防御免疫応答を引き出すことができる抗原領域を提示するポリペプチドを選択して、適当なキャリアー中に配合する。また、ウイルスタンパク質の抗原部分を、融合タンパク質の発現により大きなタンパク質の中に組み入れてもよい。他のウイルスのサブユニットワクチンの製造は、Lernerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:3403，1981 およびBhat anagar ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:4400，1982 を含めた種々の文献に記載されている。米国特許第4,565,697 号（天然由来のウイルスタンパク質がワクチン組成物中に配合される）、第4,528,217 号および第4,575,495 号（ウイルスタンパク質の一部を形成する合成ペプチドがワクチン組成物中に配合される）も参照のこと。ウイルスタンパク質の一部のみを用いてワクチンを製造する他の方法は米国特許第4,552,757 号、第4,552,758 号および第4,593,002 号に記載されている。これら特許の関連部分を参考としてここに組み入れる。この種のワクチンはキヌザル、ロバとその他のウマ科動物種のようなウイルスに感受性の哺乳動物やヒトにおいてＡＶに対する免疫応答（例えば、防御抗体価）を高めるのに有用である。この活性化ウイルスは、ウイルスやレトロウイルスの感染が原因であるらしい多くのがんの発生に寄与するヘルパー作用因子として機能すると考えられるので、ＡＶに対する防御抗体価の上昇はカポジ肉腫やＢ細胞リンパ腫のようながん、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）と関連した肛門性器や口腔のがん、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）と関連したバーキットリンパ腫や鼻咽頭がん、ＨＴＬＶ−Ｉと関連した成人Ｔ細胞白血病、そしてＢ型肝炎ウイルス、いくつかのタイプの乳頭腫ウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉと恐らくはII（ヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルス）と関連した特定の悪性腫瘍の発生に対する予防手段として役に立つかもしれない。上記のように調製されたワクチンは通常のやり方で、例えば鼻腔に、皮下に、または筋肉内に投与しうる。ただし、部分的不活化ウイルスワクチンの場合には鼻腔投与は通常採用できない。完全不活化ワクチンの皮下および筋肉内注射には免疫応答を増強するためにアジュバントも用いられるだろう。さらに、生物学的サンプル中のＡＶの存在を検出する診断試験もポリヌクレオチドプローブを用いて行うことができる。この種のポリヌクレオチドプローブはウイルスゲノムの配列に基づいて作製しうる。プローブの長さは特に決まっていないが、一般には少なくとも約１２塩基、より一般には少なくとも約１６塩基からなり、これらはウイルスゲノムの一部に実質的に相補的である。プローブ自体はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＡＶゲノムとの完全な相補性を示す必要はない。長さが２０塩基までのプローブでは１または２個のミスマッチ対が許容され、２０〜３５塩基のプローブでは３〜５個のミスマッチ対が許容されるだろう。プローブは合成的に調製することもでき（適当な合成技術については上述した）、検出可能な標識を含むだろう。通常、合成配列は大量に得るために慣用のクローニングベクターと適当な宿主内で増幅される。増幅したベクターそれ自体をプローブとして使うために標識してもよく、また、相補鎖を含む短鎖フラグメントを切り出して標識してもよい。診断試験用のヌクレオチドプローブの作製および使用方法は Falkow らの米国特許第4,358,535 号（その開示内容を参考として組み入れる）に記載されている。イムノアッセイでの使用のために上述した標識（特に放射性核種）を含めて、各種の標識が用いられている。適当な標識は多くの技術によりプローブに結合させることができる。一般的に採用されている技術は、α−³²Ｐ−ｄＮＴＰを用いるニックトランスレーション、アルカリホスファターゼによる末端ホスフェート加水分解と、これに続くγ−³²Ｐ−ＮＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いる放射性³²Ｐによる５’末端標識またはα−³²Ｐ−ＮＴＰとターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いる３’末端標識である。また、存在する１以上の原子を放射性アイソトープで、例えば水素をトリチウムで、置換したヌクレオチドを合成することもできる。さらに、種々のリンキング基を用いてもよい。末端ヒドロキシルを無機酸（例：³²Ｐリン酸）または¹⁴Ｃ有機酸でエステル化したり、二官能性試薬でエステル化して他の反応性基（これに標識を結合させる）を導入したりしてもよい。以下の実施例は例示のために提供されるものであって、制限するためのものではない。実施例１キヌザル活性化ウイルス(MAV)の単離および精製初期の研究は、消耗しているキヌザルの血液から得られたリンパ球をIL-2(4単位／ml)で刺激した時にかなりの期間にわたって維持できることを実証した。リンパ球の小比率（％）は消耗キヌザルから回収された抗体によるイムノペルオキシダーゼ染色により陽性であった。この反応性は４ケ月にわたって持続することが示された。抗体は硫酸アンモニウム排除続いて過剰の硫酸アンモニウムを除去するための透析により消耗キヌザルの回収した血清および／または腹水から得た。プロテインＡプロセシング続いてビオチン化を使用して「精製キヌザル調整物」を得、これをエイズ（ＡＩＤＳ）オートプシーから採取したリンパ系組織の組織切片、エイズ解剖病理学的切片、表４にリストされたモノクローナル抗体に特異性な病気のリンパ系組織と一致する正常リンパ組織に対し反応させた。細胞培養または同時培養のためのリンパ球フラクションは、密度1.077 のフィコール−メトリダゾール(Sigma)10mlを含む円錐形の15mlの遠心分離管中に５ml までの血液を入れ、そしてスイングバケットローター中で40分間にわたって700r cf で遠心分離することにより、新鮮なヘパリン処理した血液から得た。界面にある細胞の層を取り出し、RPMI-1640 で希釈し、10分間にわたって300rcfで遠心分離した。細胞洗浄を２回繰り返した。細胞培養を標準の方法により行った。細胞系を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville，MD)(ATCC は用いた細胞系の殆どの供給源である)により推奨されるように、細胞系に適した培地を含む使い捨て組織培養フラスコ中で増殖させた。SW-13 細胞系およびSW-47 細胞系をW.McCombs 博士（Scot t and White Clinic and Hospital，Temple，TX）から入手した。典型的には、H EPES およびグルタミンを含むRPMI-1640 をリンパ系に使用し、そしてグルタミンを含むイーグルMEM（Sigma #MO643）を上皮系および繊維芽細胞系に使用した。特にATCCにより推奨されない限り、培地に10％のウシ胎児血清および１％の抗生物質抗真菌溶液を補給した。全ての培地成分をSigma Chemical社（St．Louis, MO）から通常入手した。付着細胞系を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス溶液で洗浄し、トリプシン−EDTAとともにインキュベートし、そして細胞をピペットでハンクス溶液に懸濁させることにより細分化した。また、懸濁した細胞を使用して免疫染色のための空気乾燥スミアを調製し、または遠心分離によりペレットにし、そして３％グルタルアルデヒド−0.05M リン酸−スクロース(pH7.2)または１／２の濃度のカルノフスキー固定剤(Karnovsky，J.Cell Bi ol.，17:208，1963)を用いて幾つかの電子顕微鏡研究のために固定した。初期の研究のために、MAV の抗体をキヌザル消耗症候群を患っているキヌザルから最近回収されたキヌザルのヘパリン処理された血液または凝固血液から得た。血清または血漿を30〜45分間にわたって50％飽和硫酸アンモニウムで２回沈殿させ、沈殿物を700rcfで15分の遠心分離により回収した。沈殿物をPBS に溶解し、一夜透析し、プロテインＡ−アガロースに吸着させ、0.5 ％の酢酸−0.15M の食塩水で溶離した。タンパク質ピークを集め、PBS に対し透析し、そして直接免疫染色のために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンでビオチン化した(War nkeら，J.Histochem.Cytochem.，28:771-776，1980)。アリコートを-75 ℃〜-85 ℃で凍結した。ウサギ抗キヌザル第二抗体を産生するために、免疫グロブリンをキヌザルから得、上記のようにして精製した。ウサギを完全フロインドアジュバント中の精製免疫グロブリンの混合物の週に一回の皮下注射で３週間免疫した。アジュバントを含まないブースター投与後に、ウサギ血清を回収し、上記のようにして精製した。ガラス組織グラインダー中でホモナイズし、そして0.2 μm の膜で濾過した脾臓組織、肝臓組織、および腎臓組織を含む、凍結したキヌザルオートプシー組織のホモジネートを細胞培養物に接種することにより、種々の細胞培養物中でウイルスを増殖させる能力について研究を行った。接種後に、細胞系を細胞変性作用そしてイムノペルオキシダーゼ染色による抗原産生について観察した。 MAV 増殖または抗原産生が細胞変性作用の欠如および対照と接種細胞の間のイムノペルオキシダーゼ染色の差異の欠如に基いて観察されなかった細胞系は、HE LA、VERO、CCRF-CEM、MRC-5、WI-38、SW-13、SW-47、K562、RPMI-2650、Ramos およびNIH-3T3 を含んでいた。Rajiはイムノペルオキシダーゼにより低レベルの抗原産生を示した。組織のイムノペルオキシダーゼ染色のために、ルーチンのホルマリン固定され、パラフィン包埋された切片をキシレン中で脱パラフィンし、そしてグレードのついた(graded)アルコールを通して水和した。スミアの染色のために、空気乾燥したスミアを30分間にわたって60℃でホルマリン蒸気で固定し、再度乾燥させた。内在性ペルオキシダーゼ活性を30分間にわたって80％メタノール−0.6 ％過酸化水素でブロックした。スライドをPBS 中で希釈されたビオチン化キヌザル抗体の適当な希釈液(1:10〜1:50)と一緒に１時間にわたってインキュベートした。スライドを15分間にわたってPBS 中で洗浄した。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Vectastain，Vector Laboratories 社、Burlingame，CA）を30〜 45分間にわたって添加した(Hsuら，J.Histochem.Cytochem.,29:577-580，1981; Hsu ら，Amer.J.Clin.Pathol.，80:415-420，1983)。スライドを10分間にわたってPBS 中で洗浄し、そして６〜10分間にわたってPBS または0.1Mトリス-HCl中の 0.075 ％3,3'- ジアミノベンジジン−0.06％過酸化水素中でインキュベートした。Vectastain EliteによるVectastainの置換は1:500 まで、またはそれ以上の高い抗体希釈を可能にした。１時間にわたる非ビオチン化キヌザル抗体、続いてウサギ抗キヌザルIG抗体、続いてビオチン化抗ウサギIG抗体を利用する間接的免疫染色技術（技術的詳細についてはElite Vectastainキット）は1:5000希釈率のキヌザル抗体による染色を可能にした。この方法で接種されたOMK(ATCC#CRL1556)培養物は、丸くなった細胞の領域からなる微妙な細胞変性作用(CPE)を５〜７日で生じ、そして特にそれらの縁で増大された屈折力を示した。これらの変化はこの細胞系で生じる正常な分化変化とは区別される必要があり、これらは異なる細胞サイズ、細胞配置、細胞粒度、等の領域を含む。これらの微妙な変化は位相差顕微鏡により観察されたが、明視野顕微鏡により検出することが困難であった。シンシチウムまたは認められる細胞内封入体は見られなかった。低レベルの細胞壊死が細胞変性作用を示す領域で起こったが、溶解プラークは生じなかった(株表示、Ethel および#65)。対照的に、同条件下で増殖されたヘルペス・アテレス(Herpes ateles)は局在化シンシチウム、細胞内封入体を生じ、そして最後には細胞溶解を生じ、これは多くのフラスコ中に存在する細胞の全てを最終的に溶解した。接種されたOMK 培養物からのスミアは強いイムノペルオキシダーゼ染色を示した。その細胞変性作用および抗原性は、新しいOMK 培養物に培養上清を接種することにより転移可能であった。培養物は数ケ月にわたって生産性のままであった。最終的に、細胞集団は枯渇されるようになった。細胞変性作用を図１および２に示す。対照的に、図３および４は未感染OMK 細胞の外観を示す。図５は、溶解フォーカスがしばしばそれらの周縁に高度に屈折性の細胞の小クラスターを伴って最終的に出現する、長期培養中に発生する変化を示す。また、細胞内顆粒が感染培養物中で共通しているが、比較的特異性に乏しいようである。次にOMK 細胞について上記したように血清から直接得られたリンパ球を同時培養することにより、ウイルスを別のキヌザル（株George）から培養した。このキヌザルはその後消耗症候群を発症した。ウイルスを同じファミリーグループ（株 Palmer）からの無症候性キヌザルの血清および９種のその他のキヌザルの血清から単離した。凍結した、または新鮮な細胞培養上清から、解凍して円錐の50mlの遠心分離管中で10分間にわたって700rcfで遠心分離することによりMAV を精製した。上清を高速の40mlの管に移し、そして８％のポリエチレングリコール(m.w.6000-8000) を上清中に溶解した。ウイルスをJA-20 ローターを使って20,000rpm(31,400rcf) で120 分間遠心分離することによりペレット化した。ペレットを0.05M NaCl- 0. 05M トリス- HCl、pH7.4 中で懸濁させ、そして４℃で一夜インキュベートした。その懸濁液を20％スクロースおよび40％スクロースの段階的勾配の下に入れ（その後の研究は30％および45％スクロースの勾配からの調製物を使用した）、そして120 分間にわたってJS 13.1 ローター中で13,000rpm（17,700rcf）で遠心分離した。スクロース層の界面にある不鮮明なゾーンを取り出し、そしてウイルス調製物を調製した。電子顕微鏡観察により、ウイルスがこのゾーン中に存在することを確かめた。別の精製法を二三の実験のために使用した。上記の初期のPEG 遠心分離後に、再懸濁ペレットをMatrex Cellufine Sulfateカラム（Amicon）に吸着させ、0.05 M NaCl-0.05Mトリス-HClで洗浄し、そして0.02M トリス-HCl、pH7.4 中の次第に増加する濃度のNaClで溶離した。ドットブロットは、抗原が約2.0MのNaCl濃度で溶出することを示した。下記の実施例３に記載したような電子顕微鏡観察は溶出液中の無傷のウイルス粒子の存在を証明した。しかしながら、回収された物質の大半は、溶出液中に抗原活性のかなりの増加があったので、無傷ではなかったかもしれない。実施例２ヒト検体からのヒト活性化ウイルス(HAV)の単離 MAV について上記した技術と同様の技術を使用して、ヒト血清サンプルをMAV に似たヒト活性化ウイルス(HAV)の存在について試験した。初期の研究において、OMK 細胞の培養物に適当な患者からの血清を接種し、そして２例においてリンパ球と共に同時培養したが、これらは一人の典型的なHIV-I エイズ患者(株#65) 、AZT 治療を受けている二人のエイズ患者（株MDH およびSRG 同時培養も行った）、一人の無症候性HIV-I 陽性患者（株SM）、HIV-IIに対し陽性の一人のアフリカ人のエイズ患者(株#75)、HIV に対し陰性であるが、キヌザルに接触した長い履歴を有し、かつイムノペルオキシダーゼ染色により反応性末梢血リンパ球を有することが示された無症候性患者（株FS）、HTLV-Iの無症候性患者（株 #120）、慢性リンパ球性白血病の患者（株PC）および乳癌の患者（株DB）を含んでいた。HAV が全てのこれらの供給源から成功裏に単離された。血清からの培養はリンパ球と一緒の同時培養よりも優れていると思われた。単離物はキヌザルの単離物と同じ全般的培養特性を有していたが、細胞変性作用の発生までの期間は３〜10 日から１ケ月程度の長い期間に変化した。これらの単離物の幾つかはその他のヒトまたはキヌザル単離物、特にAZT 治療患者からの単離物よりも継代し難いことが判明したが、全てが成功裏に継代された。単離物を表１に要約する。実施例３活性化ウイルス（アクチビロン(Activiron)）の特性決定広範囲の試験を行って、キヌザルおよびヒトから単離されたAVの新規な性質を証明した。Ａ．電子顕微鏡電子顕微鏡を使用してMAV の特性を決定した。これらの分析のために、細胞ペレットを調製し、上記のように固定し、Poly／Bed812またはアラルダイト(Arald ite)、モレンハウアー(Mollenhauer)培地、スパー(Spurr)培地、またはLRホワイト（Poly science Inc.,社、Warrington，PA）に包埋した。また、細胞懸濁液を滅菌スパチュラを使用して除去した後にフラスコ培養物から調製し、そしてミクロ遠心分離機中で沈降させた。次に全てのペレットを固定し、包埋した。この後者の方法は、細胞への損傷が小さく、更に満足できる調製物を得ることができるようである。切片をダイヤモンドナイフで切り出し、レイノルズのクエン酸鉛 (Reynolds，J.Cell Biol.，17:208，1963)および酢酸ウラニルで染色し、そしてフィリップスEM-420電子顕微鏡で調べた。精製ウイルスは陰性染色であるために、フォームバー(formvar)被覆グリッド( E．M.Sciences,Ft.Washington,PA)をPBS で1:10〜1:20に希釈したキヌザルまたはヤギ抗体上に１〜２時間にわたって浮遊させまたは浸漬させた。PBS 中で洗浄した後、グリッドを１〜３時間精製ウイルス調製物の液滴に浮遊させた。グリッドをPBS で洗浄し、そして30分間３％のグルタルアルデヒド−0.05M のリン酸塩 −蔗糖に浮遊させた。それらを蒸留水中で洗浄し、そして１〜５分間0.5 ％の酢酸ウラニルまたは0.5 ％のリンタングステン酸に浮遊させ、乾燥させ、そして上記のようにして調べた。消耗性キヌザルからのリンパ球培養物の初期の電子顕微鏡観察では、明確なウイルス粒子は実証されなかった。細胞質のリソソーム(cytolysosome)および稠密物質を含む顆粒が増加していた。単核細胞の液胞は、小さい空の膜結合顆粒を含んでいた。トリプシン−EDTA中に懸濁された感染OMK 細胞の電子顕微鏡観察では、小胞体および稠密顆粒状物質を含む顆粒が更に突出していた以外は同様の結果を生じた。また、膜の幾つかの同心の層を含む不規則なプロフィールが見られた。ウイルス粒子は極めて稀であった。例えば、一つの細胞内で、小さいコアー、明確なキャプシドおよびエンベロープを有する単一のウイルス様粒子がリソソーム内で見られた。ウイルス懸濁液からつくられた陰性染色されたグリッドは、若干可変の外観を有するウイルス粒子を示した。多くのウイルス様粒子は不完全であるらしく、かつ粒子の内部構造は染色コントラストが弱いために実証することが難かった。凍結融解された懸濁液からつくられた調製品中で、粒子はしばしば明らかな多角形の形状で包まれていることが明らかであったが、キャプシドは一般的に破壊されていた。リンタングステン酸染色は、酢酸ウラニル染色よりも内部構造を良好に可視化することができた。新鮮な未凍結のウイルス調製物からのグリッドは、その構造を更に良好に立証でき、平滑な表面を有するエンベロープまたはコート、エンベロープとその下層のキャプシドとの間が分離しておらず、このキャプシドは可変数の小さいカプソマーからなる半規則的、かつ明らかに不完全な二十面体の対称性を有する判規則的なキャプシドであること、および不十分に範囲を限定されたおそらく細長いコアまたはドーナツ形のコアを示した。図５および６に示された粒子の寸法は、平均のサイズが100nm よりわずかに小さく、57〜364nm の範囲であった。この外観はウイルスの殆どの既知のグループを排除する。或る種の既知のウイルス、特にヘルペスウイルスとかなり一般的な類似性があるが、これらの結果と全ての現在定義された哺乳類ウイルス属の記載との間には、詳細には有意な相違がある。フラスコの表面からかき取られ、遠心分離によりペレットにされた感染OMK 細胞の切片の電子顕微鏡観察は、殆どの調製物中でウイルス粒子が極めて稀であり、発見しにくいことを示した。細胞培養液中で長く継代された後に非常に顕著な細胞変性作用および細胞溶解をおこすキヌザル株からの調製物中に、ウイルス粒子が比較的多く存在した。ウイルス粒子は核および細胞質の双方の中に存在し、核はより多くの粒子を含み、その殆どがコアを含む、またはコアーを含まない未包被のキャプシドであった。包被は核膜に隣接する核中で観察された。切片中で、コアーはしばしば伸長された外観を呈した。図７は代表的な外観を示す。Ｂ．ゲル電気泳動ゲル電気泳動により精製したAVM についてさらに研究を行ない、種々のタンパク質の分布を調べた。ゲル電気泳動のために、ウイルス調製物を真空限外濾過または遠心分離限外濾過により濃縮した。ウェスタンブロット分析、株#65 垂直エレクトロトランスファー装置(the vertical electrotransfer apparatu s)を通常の条件下で２時間にわたって0.8 ミリアンペアで稼働させた。0.45ニトロセルロース膜（Hoefer Scientific Instr.，サンフランシスコ、CA）を使用して移動タンパク質を受け取った。移動後に、1:100 希釈の精製されたビオチニル化ロバ抗65ポリクローナル抗体を使用して、ブロットを先に記載した操作に従って免疫染色した。Vector Labs（Burlingame，CA）から購入した標準的なアビジン−ビオチン複合体試薬を使用して、染色操作を完了させた（Burlingame，CA）。分断された#65 の一次元ゲル電気泳動をウェスタンブロット操作と比較することが可能であった。#65 の銀染色について、PAGEのRf値を既知のMV標準物質に対してプロットすることにより、推定分子量を求めた。結果は以下のとおりである。より大きなポリアクリルアミドゲルをSE600 vertical PAG Eapparatus（Laemm eli SDS-PAGE technique(Hoefer Scientific Instruments カタログ 1988-1989 、131-134 頁、Hoefer Scientific Instruments, サンフランシスコ、CA; Laem meli，Nature，227:680-85，1970）中で流した。主要バンドは、それぞれ58,800、48,000、44,000、および32,000の分子量と示された。明瞭に識別できる結合物が106,500 にかすかに識別できる残りのバンドとともに示された。 SDS-PAGE 分析、株#65 4.0 ％のスタッキングゲルと8.0 ％の分離ゲルとを使用して、ラエムリに従ってゲルのための通常の実験手順(PhastSystem Owner's Manual，Pharmacia LKB B iotechnology，Inc.，Piscataway，NJ，1986)後に、PHAST^TMシステム（Pharmaci a-LKB,Piscataway，NJ）並びに前もって形成したこのPhast Gel および緩衝剤ストリップを使用して、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。垂直電気泳動を３時間150 ミリアンペアで通常の条件下で行った。次にゲルを銀染色し、写真を撮った。シグマから購入した分子量標準物質を標準的な手順に従い、0.1m g/mlの濃度でビオチニル化し、そして分断株#65 に関して同様の濃度で、ビオチニル化した。ゲルの厚みを注入ゲル（AMRESCO，Solon，OH）当たり1.5mm に保った。６種の分子量標準物質を使用した。それらはそれぞれ205,000 ダルトン、11 6,000 ダルトン、97,400ダルトン、60,000ダルトン、45,000ダルトン、そして29 ,000ダルトンの分子量を有するミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、ウシ血漿アルブミン、卵アルブミンそして炭酸デヒドラターゼであった。ゲルをファーマシア-LKB銀染色キット（Phast Gel Silver Kit Instruction M annual，Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ，1987）で染色し、またはニトロセルロースへのブロット移動を調製した。その後これらのブロットを墨汁で染色し、または免疫染色した。免疫染色のために、遊離結合部位を0.05％のTween-20-0.1％の BSA でブロックし、次に抗体希釈およびインキュベーション時間の適当な調節による組織染色に関して上記の試薬を使用してイムノペルオキシダーゼ染色した。濃縮された精製ウイルスに関するSDS-PAGE電気泳動の予備実験の結果は、図９に示された、少なくとも18のバンドを示す。銀染色の合計トラッキング距離は82 mmであり、一方、ウェスタンブロットに関して使用された合計トラッキング距離は77mmであった。それ故、更に高いMW計算では、若干の不一致がおそらく観察されるようである。分子量168/163、127/126.8、107/106.5、96/95 そして33/32 で近い相関関係がある。直接の相関がそれぞれ80そして74.5で生じる。観察された変化は、おそらくここで実証されたようにRf値対既知のMW標準物質の測定誤差によるらしい。およその分子量を表２に示す。Ｃ．逆転写酵素逆転写酵素を培養上清について分析し、そして精製MAV ウイルスを1.5 時間超遠心して上清から直接ペレット化した。最初に精製ウイルス調製物を希釈して蔗糖含量を減らし、続いて超遠心分離によりウイルスをペレット化した。ペレットを最初の容量の1/10の10mMのTris-HCl(pH7.9)-1mMのEDTA- 200 mMのKCl-10mMの βメルカプトエタノール-3μM のロイペプチン-0.5％のTri-ton X-100 中に再度懸濁し、攪拌により分散させ、そして１時間室温に保った。10μl のサンプルを 60mMのTris-HCl(pH7.9)、0.07％のTriton X-100、７mMのMgCl₂または0.6 mMのMn Cl₂、20μg/mlのpoly(rA)-p(dT)(Marczynska ら，Infect.Immun.，31:1261-1269 ，1981; Roizman B.編、The Herperviruses，Plenum Press,ニューヨーク、NY， 1982; Salahuddinら，Science，234:596- 601，1986; Fox ら，Lancet，2:396， 1988，および６μM のdTTP(41.6Ci³H/ミリモル)を含む50μl の最終容量で分析した。反応混合物を37℃で１時間インキュベートし、ピロリン酸ナトリウムの添加により反応を終了させた。アリコートをガラス繊維フィルター上に沈殿させ、そして５％のトリクロロ酢酸、エタノール、そしてアセトンでバッチ洗浄した。フィルターを乾燥させ、放射能をカウントした。真正なHIV-I 逆転写酵素を陽性対照として、それぞれの実験を実施した。アッセイを同一試料を４つに分けて(q uadruplicate)実施した。 HIV の典型的なMg⁺⁺依存性逆転写酵素および殆どのその他の特定のヒトレトロウイルスは全てのサンプルに存在しなかった。Mn⁺⁺依存性逆転写酵素をウイルス生産培養液および未接種細胞系の両方からの培養上清中で同定したが、精製ウイルスは存在しなかった。これは、細胞系がおそらく軟組織腫瘍を生じるグループ中で定義されていないレトロウイルスを含むかもしれないことを示す。Ｄ．ヌクレアーゼに対する感受性ヌクレアーゼを使用して、幾つかの実験を行い、MAV の核酸含量を測定した。 50μl の総容量中４〜10単位のDNAseI（Sigma ；10mMのMnCl₂、50mMのTris-HCl 、pH7.5、50μg/mlのBSA 中）、RNAse A（Sigma ；10mMのTris-HCl、pH7.5、300 mMのNaCl、５μM のEDTA中）またはS 1 ヌクレアーゼ(Sigma ；50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5、１mMの酢酸亜鉛、0.25M のNaCl、0.5 mg/ml のBSA)を使用して、ウイルスゲノムを消化した。それぞれの反応チューブは４μg のウイルス核酸を含んでいた。反応チューブを１時間にわたって37℃でインキュベートした。その混合物のフェノール抽出を行い、続いて-20 ℃で終夜エタノール沈殿させた。核酸を遠心分離(14,000xG)によりペレット化し、TE緩衝液(10 mMのTris-HCl、pH7.4 および１ mMのEDTA)100μL 中に再度懸濁した。0.7 ％のアガロースゲル電気泳動を使用して、消化反応を分析した。未消化ウイルスゲノム抽出物は20キロベース(kb)の見かけの分子量で移動する一つのバンドおよびおそらく分解された核酸の低分子量のスミアを生じた。DNaseI消化はその断片の完全な分解を生じた。RNase A 消化はバンドプロフィールに対して目視できる効果を有していなかった。S1ヌクレアーゼ消化は約0.5kb だけ20kb断片のサイズを減少させ、そしてそのプロフィールに関する核酸のスミアが完全に分解された。Ｅ．種々のウイルスとの抗MAV(株Ethel)および抗HAV(株#65)の反応性サンプルを0.2 μm のニトロセルロース膜（Pharmacia，Hoefer）にピペットで移し、それらを４℃で終夜吸収させることによりドットブロットを調製した。典型的には、PBS 中10μg/mlのタンパク質濃度を有するサンプルを使用し、そして膜上にピペットで移されたサンプルアリコートは100 μl/ドットであった。次にそれぞれの膜をメタノール：ペルオキシド（３％）の80:20 溶液でブロックし、続いて回転させながら0.1MのTris、pH7.2、0.1 ％のBSA そして0.05％の Twe en-20を含む溶液で３回洗浄した。抗体濃度はアッセイのこの型について常に30 μg/mlであった。検出抗体を吸収された抗原の濃度の少なくとも３倍であるように希釈し、少なくとも２時間室温でインキュベートさせた。膜を洗浄し、そして ABC(ベクター)を45分間室温でのせ、洗浄し、発色が認められるまでDAB/Trisと一緒にインキュベートした。水を使用してその反応を停止し、膜を室温で乾燥させた。活性化ウイルス(AV)の抗体との反応性について試験されたウイルスを表３にリストする。それぞれの場合に、適当な陰性対照および陽性対照を置いた。弱い反応性（+/ -）がATCC vr585、595、そして731 で見られたが、その他のウイルスのいずれでも反応は検出されず、試験された全てのウイルスとAVとが識別されることが示された。Ｆ．MAV(株Ethel)およびHAV(株65)との種々のウイルスに特異的な抗体の反応性精製されたまたは腹水型の種々の既知ウイルスのモノクローナル抗体（Chemic on，Inc.,Temecula，CA; Pan-Data，Boulder，CO）を使用してMAV(株Ethel)およびHAV(株65)の分断ウイルス粒子との反応性を測定した。表４は、試験されたモノクローナル抗体のリストである。表４に示されたウイルスに対しMCA で試験することの他に、AVウイルス株Ethe l、65、およびFSをELISA(Ｂ型肝炎コア抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、HIV-1、HIV-2) による市販キット、およびウェスタンブロット(HIV-1、HIV-2、HTLV-1)による市販キットエで試験した。これらの研究において、既知のウイルスに特異的なMCA のいずれもがHAV またはMAV と反応性しなかった。実施例４ウェタンブロット分析、株#65 通常の条件下で0.8 ミリアンペアで２時間、Pharmacia（Piscataway，N.J.）垂直エレクトロトランスファー装置を使用して、上記のようにして得られた株#6 5 HIV のSDS-PAGEを電気ブロットした。0.45ニトロセルロース膜（Hoefer，Scie ntific Instruments，サンフランシスコ、CA）を使用して移動したタンパク質を受け取った。移動後に、1:100 希釈した精製ビオチニル化ロバ抗65ポリクローナル抗体を使用して、ブロットを前記の手順に従って免疫染色した。Vector Labs( Burlingame，CA)から購入された通常のアビジン−ビオチン複合体試薬を使用して、染色手順を完りょう。使用した基質はホースラディッシュペルオキシダーゼであった。標準分子量ラダー（Sigma,セントルイス、MO）を確立した手順に従ってビオチニル化した。それ故、分断#65 の一次元ゲル電気泳動をウェスタンブロット手順と比較することが可能であった。#65 の銀染色（表２）について、PAGEのRf値を既知の分子量標準物質に対してプロットすることにより、推定分子量を求めた。結果を下記の表５に示す。図８に示されたように、主要バンドをそれぞれ58,800、48,000、44,000および 32,000の分子量で実証した。明瞭なバンドを106,500 で実証し、残りのバンドはかすかに明瞭であった。表２は銀染色結果をウェスタンブロット分析と比較する。実施例５株#65 のSDS-PAGE分析 4.0 ％の濃縮用ゲルとともに8.0 ％の分離ゲルを使用して、精製HAV、株#65をレムリに従ってSDS-PAGEにより分析した。垂直電気泳動を３時間にわたって150 ミリアンペアで通常の条件下で実施した。次にゲルを銀染色し、写真を撮った。分子量標準物質（シグマ(Sigma)、セントルイス、MO）をこの操作(0.1mg/ml)に通常の方法で、破砕した株#65 について同様の濃度で調製した。ゲルの厚さを注入ゲル（AMRESCO, ソロン、OH）当たり1.5mm に保った。結果を下記の表６に示す。６種の分子量標準物質を使用した：それぞれ205,000 ダルトン、116,000 ダルトン、97,400ダルトン、66,000ダルトン、45,000ダルトンそして29,000ダルトンのミオシン、βガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、ウシ血清アルブミン、卵アルブミンおよび炭酸脱水酵素。AAV の推定分子量（図９に示されるとおり）を Rf値対既知MW標準物質により計算した。実施例６ヒト臨床標本を用いる試験Ａ．HAV との患者血清の反応性コーニングE-Z 洗浄ミクロタイター96ウェルプレートおよびコーニング（ニューヨーク、NY）平底ミクロタイター標準組織培養96ウェルプレートを精製された、破砕ウイルス抗原（株65）の固相吸収のために使用した。0.05M のPBS、pH7.2 中の全ウイルス抗原約0.400mg を0.1 ％のドデシル硫酸ナトリウム(w/v)(シグマ、セントルイス、MO)で10μg/mlのタンパク質濃度に希釈することにより破砕した。約１時間の混合後に、破砕ウイルスタンパク質100 μl をウェルA1（これは溶液で満たされておらず、全プレートをブランクするのに使用される）以外のそれぞれのミクロタイターウェルにピペットで入れた。プレートを４℃で３日間保存し、その後それぞれのウェルの内容物を吸引した。0.1MのTris、pH7.2、0.1 ％の BSA および0.05％のTween-20（シグマ）からなるブロッキング溶液(350 μl)をA1以外のそれぞれのウェルにピペットで入れ、４℃で３日間インキュベートした。プレートを吸引し、直ちに使用し、または使用するまで-85 ℃でプラスチックバッグ中で凍結した。また、ミクロタイタープレートを上記のようにして調製したが、破砕ウイルスタンパク質を24時間にわたって４℃で吸収させ、吸引し、Superblock（Pierce，ロックフォード、IL）350 μl を30分間にわたって室温でそれぞれのウェルに適用し、その時間後にプレートを吸引し、直ちに使用した。それぞれのプレートを非特異性タンパク質活性についてブロックした後、1:50 の血清：PBS 臨床サンプル100 μl をそれぞれの実験ウェルにピペットで入れた。少なくとも２種の陽性対照および少なくとも３種の陰性対照を分析されるそれぞれのプレートについて使用した。陽性対照は既知ウイルスキャリヤーからの血清であり、そして陰性対照は既知のウイルス陰性血清サンプルからのものであった。全ての対照は実験ウェルと同じ希釈(1:50)で実施した。一次インキュベーションに関する標準時間は典型的には35℃で90分間であった。一次インキュベーションの終了後に、全てのウェルを手動プレートウォッシャー、または自動プレートウォッシャー（Bio-Rad,リッチモンド、VA）で５回洗浄した。次にウェルにモノクローナル二次抗体（これはホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された未希釈のマウス抗ヒトIgG（Ortho Diagnostics,ラリタン、NJ）、または２％の正常なマウス血清（シグマ、セントルイス、MO）、0.1 ％のTween-20、および0.05 M のPBS、pH7.2 中で希釈(1:2000)された、アルカリ性ホスファターゼに結合されたマウス抗ヒトIgG（シグマ、Clone GG-5）のいずれかである）100 μl で満たし、そして35℃で90分間インキュベートした。二次インキュベーションの終了後に、ウェルを吸引し、前記のようにして洗浄し、そして基質100 μl を添加した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)について、蒸留水１ml当たり３ mgのo-フェニレンジアミン(OPD)、0.05％〜３％の過酸化水素を使用した。アルカリ性ホスファターゼ(AP)について、ジエタノールアミン緩衝液１ml当たり１mg のパラ−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)を使用した。プレートを30〜45分間にわたって、または発色が検出に充分になるまで室温でインキュベートした。6N の硫酸を使用してHRPO反応を停止し、4Mの水酸化ナトリウムを使用してAP反応を停止した。次にOrtho reader(492nm/630nm)またはGenetics Systems reader(405 nm/630nm)を使用して光学濃度を測定した。実験ウェル中の対照ウェルの吸光度の２倍より大きい読みを陽性と考えた。下記の表７に示されたようなこれらのスクリーニング試験の結果は、ウイルス病因を有すると疑われた多くの癌の細胞が本発明の活性化ウイルスを宿していることを示す。Ｂ．種々の悪性細胞系との抗HAV の反応性腫瘍細胞系をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、 MD）から購入した。それぞれの細胞系をATCC仕様に従って本発明者らの研究所で細胞培養で増殖させた。組織培養上澄みをそれぞれの細胞飼育後に回収し、Ethe l および株65について上記されたようにして精製まで-85 ℃で保存した。精製物質をドットブロットアッセイにより抗原同定について評価した。ドットブロットアッセイを行うのに際して、0.22μのニトロセルロース膜（Ph armacia,ホエファー）を使用した。#2鉛鉛筆を使用して円を書き、サンプル10μ l(20μg/μl)を膜にピペットで移し、室温で乾燥させた。膜を４℃で保存し、または直ちに使用した。それぞれの膜を30分間にわたってメタノール：３％の過酸化物の80:20 混合物で洗浄して内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、続いて0.1MのTris、pH7.2、0.1 ％のBSA、0.05％のTween-20（シグマ）のブロッキング溶液により洗浄し、これを回転させながら室温でそれぞれ20分間の３回の連続洗浄にかけて非特異性タンパク質活性を防止した。ロバ抗Ethel またはロバ抗65 ビオチニル化ポリクローナル抗体(３μg/100ml のPBS、pH7.2)を回転させながら室温で１時間適用した。膜をブロッキング溶液で３回洗浄し、次にアビジン−ビオチン複合体（ペルオキシダーゼ）（Vector Laboratories, バーリンゲーム、 CA）を回転させながら室温で45分間適用した。膜を３回洗浄し、基質（0.1MのTr is、pH7.5 中0.04％の3,3'ジアミノベンジリデン、0.015％の過酸化水素）を添加し、発色が生じるまで放置した。蒸留水を使用してその反応を停止した。陽性対照は精製AVH(株65)であった。陰性対照は抗体宿主種の正常な血清、正常なヒト血清、および未接種OMK 細胞から精製された物質であった。結果を下記の表８に示す。表８に示されるように、この研究細胞系HS-445であるホジキンリンパ腫は弱い陽性であった。全てのその他の細胞系は抗MAV(Ethel 株)および抗HAV(65株)の両方で陽性であった。加えて、HAV をMo-T、Mo-B、CCRF-CEM、Hut-102、そしてH-9 の培養物から単離し、AVが癌細胞と関連することを示した。本発明の以上の記載は例示および説明の目的のために示される。種々の改良が本発明の精神および範囲から逸脱しないでなし得ることが理解されるべきである。それ故、下記の請求の範囲は全てのこのような改良を含むように解されることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．in vitro細胞培養下で増殖させた細胞から単離された活性化ウイルス（ＡＶ）。２．二本鎖ＤＮＡ、滑らかなエンベロープ、平均約１００ナノメートルの大きさによりさらに特徴づけられる、請求項１に記載のウイルス。３．水平伝播によりさらに特徴づけられる、請求項２に記載のウイルス。４．活性化ウイルス（ＡＶ）株Ｅｔｈｅｌ、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２２５７（株Ｅｔｈｅｌ）の生物学的に純粋な培養物。５．活性化ウイルス（ＡＶ）株６５、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２２５６（株＃６５）の生物学的に純粋な培養物。６．活性化ウイルス（ＡＶ）に特有の決定基部位と交差反応性のペプチド。７．分子量が約１，０００〜２００，０００ｋＤの範囲である、請求項６に記載のペプチド。８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタンブロットにより測定した分子量が約２６〜１９８ｋＤの範囲である、請求項６に記載のペプチド。９．ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色により測定した分子量が約３３〜１６３ｋＤの範囲である、請求項６に記載のペプチド。 10．自然界で生産されたＡＶタンパク質またはそのフラグメントである、請求項６に記載のペプチド。 11．主要コアタンパク質、エンベロープタンパク質またはそのフラグメントである、請求項10に記載のペプチド。 12．合成により生産される、請求項７に記載のペプチド。 13．組換え遺伝子配列の発現により生産される、請求項12に記載のペプチド。 14．固相合成により生産される、請求項13に記載のペプチド。 15．血清から回収されるか、またはin vitro培養物により生産された、活性化ウイルス（ＡＶ）に特有の決定基部位と反応する抗体。 16．ポリクローナル抗体である、請求項15に記載の抗体。 17．前記の抗体がウマ科の動物のものである、請求項16に記載の抗体。 18．モノクローナル抗体である、請求項15に記載の抗体。 19．前記の抗体がウマ科の動物のものである、請求項18に記載の抗体。 20．感受性宿主に有効量で投与したとき、活性化ウイルス（ＡＶ）感染に対する免疫応答を引き出すことができる免疫原を含んでなるワクチン。 21．前記の免疫原が不活化した完全ＡＶである、請求項20に記載のワクチン。 22．前記の免疫原が弱毒化したＡＶである、請求項20に記載のワクチン。 23．前記の免疫原がＡＶのコアまたはエンベロープタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項20に記載のワクチン。 24．有効量の請求項20に記載のワクチンを宿主に投与することを含んでなる、感受性宿主においてウイルス感染に対する抗ＡＶ抗体の生成を誘導する方法。 25．宿主から得られた生理学的検体中の活性化ウイルス（ＡＶ）またはＡＶに対する抗体の存在を検査することを含んでなる、感受性宿主のウイルス感染の検査方法。 26．抗ＡＶ抗体との反応により検体中のＡＶを検出する、請求項25に記載の方法。 27．宿主の生理学的検体を活性化ウイルス（ＡＶ）に特有の抗原にさらすことにより該検体中の抗ＡＶ抗体を抗原に結合させ、そして該抗体の結合を検出する、ことを含んでなる、感受性宿主のウイルス感染の検査方法。 28．検体中の抗体に第二抗体を結合させることにより検体中の抗体の結合を検出する、請求項27に記載の方法。 29．第二抗体が検出可能に標識されている、請求項28に記載の方法。 30．検出可能な標識が酵素、蛍光分子または放射性核種である、請求項29に記載の方法。 31．活性化ウイルス（ＡＶ）に特有のＲＮＡまたはＤＮＡ配列と結合することができる一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドフラグメントと、該ポリヌクレオチドフラグメントに結合された検出可能な標識を含んでなる核酸プローブ。 32．少なくとも約１２個の連続塩基を含む、請求項31に記載の核酸プローブ。 33．請求項31の核酸プローブと検体とを、該プローブと検体中の相補配列との間で二本鎖形成を可能にする条件下で接触させ、そして該プローブと該相補配列との二本鎖形成を検出する、ことを含んでなる生理学的検体中の活性化ウイルス（ＡＶ）の存在の検出方法。 34．請求項16の抗体と検体をそれらの間の結合を可能にする条件下で接触させ、そして該抗体の結合を検出することを含んでなる、生理学的検体中の活性化ウイルス（ＡＶ）の存在の検出方法。 35．活性化ウイルス（ＡＶ）を感染させた細胞系。 36．細胞を活性化ウイルス（ＡＶ）に特異的な抗体と接触させ、そして該抗体の結合を検出することを含んでなる、アフリカバーキット病、バーキット病、広汎性細網肉腫、皮膚Ｔ細胞（ＨＴＬＶ−Ｉゲノム）リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、下垂体腫瘍、結合組織腫瘍、乳がん、肺（小細胞）がん、副腎皮質腺がんおよび白血病より成る群から選ばれるがんのがん細胞の検出方法。