JPH10508591A - 同種タンパク質および異種タンパク質に対する抗体、診断および治療におけるそれらの用途ならびにそれらを測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分子量約１４Kdaを有し、異種個体種に投与された場合に抗腫瘍活性を有する、哺乳動物の器官から抽出可能なタンパク質を認識する天然の抗体を検出するための診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】同種タンパク質および異種タンパク質に対する抗体、診断および治療におけるそ れらの用途ならびにそれらを測定する方法 本発明は、分子量約１４Kdaを有し、異種個体種に投与された場合に抗腫瘍活 性を有し、哺乳動物の器官から抽出可能なタンパク質を認識する天然の抗体を検 出するための診断方法に関する。 本発明はまた、精製された形態の上記の天然の抗体、ならびに診断および治療 におけるそれらの用途に関する。 ＷＯ９２／１０１９７号は、哺乳動物の器官、特に肝臓を過塩素酸および高張 生理食塩水を用いて抽出することによって入手し得るタンパク質物質を開示して いる。 分子量約１４Kdaを有する上記物質の一つが単離され、部分的に配列決定され( イタリア国特許出願第ＭＩ９４００１４６９号)、観察された生物学的特性、す なわち、抗腫瘍活性およびそれが抽出された種とは異なる種の動物に投与された 場合に腫瘍抗原を認識し得る抗体を生じさせる能力を担う主要タンパク質が明ら かになった。 上記イタリア国特許出願はまた、European Collection of Animal Cell Cultu res(ECACC)，Porton Down，Salisbury，UKに第９３０８０６１０３号および第９ ３０８０６１０４号という番号で寄託されたハイブリドーマによって分泌された ２つのモノクローナル抗体を開示している。この２つのモノクローナル抗体は、 腫瘍抗原、および上記ハイブリドーマ調製物において抗原として用いられるヤギ 肝臓由来の上記１４Kdaタンパク質（以下ＵＫ１１４という）に共通のエピトー プを認識する。 上述の特性を有し、ヒト固形腫瘍の約９３％に存在する、器官（特に肝臓）か ら抽出可能な同種タンパク質および異種タンパク質の両方を認識す る天然の抗体が哺乳動物の血清内を循環していることが今や発見された。上記抗 体は、通常、健康な動物もしくはヒトの血清中に低力価(＜1/100)で存在し、対 応する抗原の注射によって刺激されて、力価およびガン細胞に対して細胞毒性効 果を生みだす血清中での能力の顕著な増加を引き起こすことができる。 観察された結果の可能な解釈および天然の抗ＵＫ１１４抗体の存在意義の可能 な解釈、すなわち本発明の有効性とは無関係な解釈とは別に、上記抗体およびそ れらの検出は、診断、予防および治療目的に有用である。 第一の実施態様においては、本発明は、したがって、天然の抗ＵＫ１１４抗体 免疫学的検出方法に関する。本発明はまた精製された抗ＵＫ１１４抗体およびそ れらの診断、治療、および免疫細胞化学における用途に関する。天然の抗体の検 出方法は従来のタイプのものであり、直接、競合、もしくは「サンドイッチ」タ イプの反応に依存してもよい。プロトコールは固体支持体もしくは免疫沈降技術 のいずれかを用いてよい。免疫アッセイにおいて用いられる抗体および／または ＵＫ１１４タイプ抗原は、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ技術で）を用いて、または 放射性もしくは蛍光性の化合物、染料もしくは色素などを用いて適切に標識され る。免疫複合体のシグナルは、場合によりビオチン−アビジン系の手段により増 強されてもよい。 方法および関連材料の構成の選択は、平均的な技術を持つ当業者の裁量の範囲 内である。 ＷＯ９２／１０１９７に開示されたタンパク質によって、もしくは精製された ＵＫ１１４によって処置される患者の血清中に存在する抗ＵＫ１１４抗体は、ヒ ト腫瘍細胞に対してin vitroおよびin vivoの細胞毒活性および細胞溶解活性を 有することもまた発見された。本発明はまた、さらなる実施態様において、過塩 素酸によりヤギ肝臓から抽出可能であり、ＥＣＡＣＣに 第９３０８０６１０３号および第９３０８０６１０４号という受託番号で寄託さ れたハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体によって認識される タンパク質によって動物もしくはヒトを免疫することによって生じるモノクロー ナルもしくはポリクローナル抗体または高度免疫血清を含む細胞溶解性かつ細胞 毒性の組成物を提供する。 In vivoでは、この細胞毒活性は抗原投与（ＵＫ１１４またはＵＫ１０１）の ２、３日後にピークに達し、その後の複数週で緩やかに減少する。対照的に、Ｉ ｇＧタイプの抗ＵＫ１１４抗体の力価は、ＥＬＩＳＡ法による評価では時間と共 に増加する。したがって、細胞毒性の最初のピークはＩｇＭタイプの抗体に起因 するか、および／または未だに同定されていない他の血清成分に起因すると仮定 することができる。 ともかくも明らかなのは、抗体および／または細胞毒性の検出を可能にする方 法の重要性であり、それ故、治療を適切にモニターすることができるということ である。 本発明による天然のもしくはモノクローナル抗体のいずれかの投与は、細胞毒 性効果を達成するのに十分な用量で非経口的に行うことができる。適切な投与方 法は、ワクチン、抗体もしくは高度免疫血清の投与について既知の方法と実質的 に同じである。本発明および以下の実施例２〜４は、上記抗体の治療適用および 診断適用に関するさらなる指針を提供する。 以下の実施例はさらに本発明を例示する。実施例１ ２．５％のＳＤＳおよび５％メルカプトエタノールを１００μｌのヤギ肝臓過 塩素抽出物（ＷＯ９２／１０１９７；ＵＫ１０１）に添加した。この試料を１０ ０℃まで５分間熱し、４μｌを、PHAST SYSTEM装置(Pharmacia)を、ポリアクリ ルアミド８／２５勾配ゲル(Pharmacia)で用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ で分析した。あるいは、高密度の均質のゲルを用いてもよい。分離したタンパク 質をPhast-Transfer装置(Pharmacia)を用いて電気泳動的に転写した。ニトロセ ルロールメンブラン（０．２２μ）は予めＴｒｉｓ（２５ｍＭ）グリシン（１９ ２ｍＭ）緩衝液で平衡化させ、この緩衝液に２０％メタノールを添加した。泳動 は５Ｖ×２０分間（Ｉ Ａ／ｃｍ²）で行った。次いで、このメンブランを、飽和 通過(saturation passage)させた後、非特異的結合を防ぐため試験中の血清とイ ンキュベーションした。 場合によっては存在する抗体の結合は、比色測定方法、放射性免疫測定法、ま たは化学発光法用に適切に標識した抗ヒトＡ_zｂ二次抗体を用いて検出される。実施例２ ＵＫ１１４に対する抗体の検出のための酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ） 以下の緩衝液を用いた： （Ａ）５０ｍＭ 重炭酸ナトリウム ｐＨ８．５、 （Ｂ）５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、 （Ｃ）５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４、０．１％（w/v）ＮａＮ₃、 （Ｄ）４０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ０．０２％（w/v）ＮａＮ₃、０．０５（v/v）Ｔｗｅｅｎ２０、 （Ｅ）５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４、０．１％（w/v）ＮａＮ₃、 ０．１％（w/v）ＢＳＡ、 （Ｆ）５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ０．１％（w/v）ＮａＮ₃、０．５％（w/v）ＢＳＡ プロテアーゼなし、 ０．０５％（v/v）Ｔｗｅｅｎ２０、０．％％（v/v）正常ヤギ 緩衝液Ａ中の３．５ｍｌのＵＫ１１４（３．５ｍｇ）を、ジメチルスルホキシ ド中２ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ−ＬＣビオチン(S.p.A.,Milan)９μｌと混合する。 この混合物を２２℃で３時間インキュベーションし、４℃で２４時間、緩衝液Ｂ を数回交換しながらSpectrapor ６透析チューブ（カットオフ３５００Ｄ）中で 透析した。 マイクロタイターウェルを、１００μｌのＢＳＡ−ビオチン（緩衝液Ｃ中５μ ｇ／ｍｌ）で、２４時間４℃でコートした。次いで、洗浄し１００μｌのストレ プトアビジン（緩衝液Ｅ中５μｇ／ｍｌ）で処理した。第２回目に４℃で一晩の インキュベーションをした後、これらのウェルを洗浄し、異なる濃度の１００μ ｌのＵＫ１１４−ビオチン（緩衝液Ｅ中２、１および０．５μｇ／ｍｌ）で、２ ４時間４℃で処理した。洗浄後これらのウェルをブロックした。 コートされない抗原ウェルを、３回目のインキュベーション工程でＵＫ１１４ −ビオチン溶液の代わりに緩衝液Ｅを用いる以外は同じ手法にしたがって作成し た。 洗浄工程は、３００μｌ／ウェルの緩衝液Ｄを３回添加することにより行った 。ブロッキングは１０％のスクロースおよび異なるブロッキング剤（１％および ５％のウシ血清アルブミン、１％のグリシン、３％のポリビニルピロリドンを添 加した１％のＢＳＡ、５％の正常ヤギ血清）を含む緩衝液Ｃを３００μｌ添加す ることにより行った。室温で３０分間後、ブロッキング溶液を廃棄し、ウェルを バキュームチャンバー内で乾燥させ、次いでポリエチレンホイルおよびアルミホ イルで包んで使用するまで４℃で保存した。ＥＬＩＳＡ手法 血清試料およびネガティブコントロールを、アッセイする前に、緩衝液Ｆで１ ：２１に希釈した。１００μｌの試料および標準緩衝液（緩衝液Ｆ中に１、２、 ４および８Ｕ／ｍＬ）をコートしたウェルに添加し、室温で １時間、水平振盪機上（４００−５００ｒｐｍ）でインキュベーションした。次 に、このウェルを、３００μｌの緩衝液Ｄで４回洗浄し、それに続いてStabilge n Bufferに溶解したヤギ−抗ヒトＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体の １：３０００溶液１００μｌを添加した。室温で１時間、水平振盪機上（４００ −５００ｒｐｍ）でインキュベーションした後、このプレートを洗浄し、１００ μｌのBlue Star Solution（Ｈ₂Ｏ₂／ＴＭＢ）を用いて発色させた。室温（１８ −２４℃）で１５分間インキュベーションした後、１００μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄ を添加することにより反応を停止させ、吸光度(ＯＤ)を、二波長光度計を用い参 照波長として４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで測定した。 ＯＤが８Ｕ／ｍＬ標準より高い試料はアッセイする前にさらに希釈した。 試料の濃度は、検量線より計算した。免疫療法を受けている患者における力価の測定 ＵＫ１０１治療を受けている患者において実施される抗ＵＫ１１４抗体力価の 評価は、ＵＫ１０１投与（皮下注射４回）１５日後に２８％の乳ガン患者および ４６％の結腸ガン患者においてのバックグラウンド値より高い抗体応答を示す。 ＵＫ１０１治療の開始から４０日後には、抗ＵＫ１１４抗体力価の増加はそれぞ れ結腸ガン患者の６３％、乳ガン患者の９７％で検出することができる（図１お よび２）。実施例３ 抗ＵＫ１１４抗体が腫瘍細胞系におよぼす細胞毒性効果 ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃ガン）およびＮＩＣＨ（小細胞肺ガン）腫瘍細胞系は、 それぞれ、ＥＣＡＣＣに第９３０８０６１０３号として寄託されているハイブリ ドーマＰ３Ｄ１ＤＩＩから分泌されるモノクローナル抗体およびウサギポリクロ ーナル抗体抗ＵＫ１１４（ｒＡｂ）を用いる間接免疫蛍光による表面染 色に関して陽性および陰性であり、これらを細胞毒性研究に用いた。細胞毒性は 、異なる濃度のｍＡｂ Ｐ３Ｄ１ＤＩＩ、Ｒｂ抗ＵＫ１１４Ａｂと共に、または コントロールとして無関係なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体と共に 、種々の時間の間、異種（モルモット）補体源もしくは同種補体源の存在下で、 あるいは精製ヒト単球存在下でインキュベーションした細胞系からの⁵¹Ｃｒ放出 のパーセントとして評価した。ｍＡｂ Ｐ３Ｄ１ＤＩＩおよび抗ＵＫ１１４ｒＡ ｂは、ＫＡＴＯ−ＩＩＩに補体依存性細胞毒性を誘導したがコントロールは誘導 せず、この細胞毒性は、熱で不活化した血清もしくはＣ９不全血清を補体源とし て用いた場合には存在しなかった。細胞毒性はＣ９不全血清が精製Ｃ９によって 再構築された場合に回復した。さらに、ＫＡＴＯ−ＩＩＩを標的として用いた場 合、無関係なＲｂＡｂではなくＲｂ抗ＵＫ１１４Ａｂが抗体依存性細胞性細胞毒 （ＡＤＣＣ）を誘導した。抗ＵＫ１１４Ａｂの精製抗原との予備吸着は抗体誘導 細胞毒性を破壊した。対照的に、ＮＩＣＨについては補体細胞毒性もＡＤＣＣも 観察されなかった。これらの結果は、抗ＵＫ１１４抗体はＵＫ１１４抗原を表面 に発現している腫瘍細胞系に対する潜在的補体および抗体−細胞依存性細胞毒性 を有するということを示唆する。実施例４ ヒト腫瘍細胞系を異種移植されたヌードマウス上の抗ＵＫ１１４抗体のin vivo 細胞毒性 ヌードマウスに皮下(s.c.)で１×１０⁶ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞を抗原投与 した。８時間後、それらのマウスは腫瘍部位に、ウサギをＵＫ１１４で免疫する ことによって生じた抗ＵＫ１１４ウサギ高度免疫（１／１２力価）血清０．２ｍ ｌの注射を受けた。処置は抗原投与後第７、１１、１４、１８、２１、２５日に 繰り返した。別のグループのマウスを、ＵＫ１１４投与に臨 床的に応答して抗ＵＫ１１４Ａｂを産生した腫瘍患者由来の血清で同様に処置し た。 コントロールグループには賦形剤のみ与えた。処置したグループは統計的に有 意な寿命の増大と腫瘍量の減少を示した。処置グループではコントロールグルー プと比べて腫瘍潜伏期間も著しく伸びた。実施例の方法により、ウサギ抗血清お よびヒト血清を用いて得た結果を、以下の表に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＥＣＡＣＣに受託番号第９３０８０６１０３号もしくは第９３０８０６１０ ４号で寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体によっ て認識され、約９３％のヒト固形腫瘍に存在する、哺乳動物の器官から抽出可能 なタンパク質を認識する天然の抗体の免疫学的検出方法であって、該天然の抗体 と場合によっては標識されている該タンパク質との間の免疫複合体の検出を包含 する方法。 ２．前記免疫複合体が標識された抗−種二次抗体によって検出される、請求項１ に記載の方法。 ３．ＥＣＡＣＣに受託番号第９３０８０６１０３号もしくは第９３０８０６１０ ４号で寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体によっ て認識され、約９３％のヒト固形腫瘍に存在する、哺乳動物の器官から抽出可能 なタンパク質を認識する天然の抗体。 ４．動物もしくはヒトを、ヤギ肝臓から過塩素酸によって抽出可能であり、ＥＣ ＡＣＣに受託番号第９３０８０６１０３号もしくは第９３０８０６１０４号で寄 託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体によって認識さ れるタンパク質を用いて免疫することによって生じる抗体もしくは高度免疫血清 を含む細胞毒性組成物。