JPH10509139A - 受容体ポテンシエーターの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＮＥＲ受容体を活性化する化合物は、神経成長因子の作用を増強し、アルツハイマー疾患の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 受容体ポテンシエーターの使用 発明の要旨 本発明は、一般に、以降ＮＥＲと称される新規組換え体ヒトステロイドホルモ ン受容体を使用するスクリーニング手段を使用する受容体のポテンシエーター（ 増強因子）を検出する方法に関する。化合物ＴＯＦＡ（５−（テトラデシルオキ シ）−２−フランカルボン酸）は、ＮＥＲを使用する上記スクリーニング手段を 通して、受容体に非依存的に作用せずに、他の受容体、とくにＧ−タンパク結合 受容体のリガンドのポテンシエーターであることが分かった。 ＴＯＦＡのようなＮＥＲ受容体を活性化する化合物は、神経成長因子（ＮＧＦ ）の作用を増強し、そしてアルツハイマー疾患の処置に有用である。これらの化 合物は、高眼圧症を処置する際のムスカリン様作用薬の作用を増強するのにも有 用である。さらに、ＮＥＲ受容体を活性化する化合物は、精神病、特に精神分裂 病を処置する際、およびジストニア、遅発性ジスキネジアおよびジル・ド・ラ・ テューレット症候群のような運動不全を処置する際のドーパミンＤ１アンタゴニ スト（拮抗物質）の 作用を増強するのにも有用である。さらにＮＥＲ活性化因子は、眼の流体力学的 不全において、また頭蓋内圧が増した患者において、ドーパミン作用薬により誘 発される眼内圧の進行を防ぐ能力を有している。 新規組換え体ステロイドホルモン受容体ＮＥＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）技術により製造された。ヒトＮＥＲ相補的ＤＮＡの完全な配列、ＣＯＳ安 定発現系を含む発現系、およびＣＯＳ発現系を用いたアッセイも記載されている 。さらに、本発明は、ＮＥＲ受容体の機能性リガンドを同定する方法にも関する 。発明の背景 レチノイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンおよび他の可能な分子は、ステ ロイド受容体スーパーファミリーのタンパク質に結合することにより、それらの 生物学的作用を生み出す。これらの受容体は、特定のＤＮＡ配列と相互作用し、 遺伝子発現を調節する(総説として、ＪＭ Ｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ ５７：１０６ ５−１０６８（１９８９）、ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８９ ９−８９５（１９８８）、Ｍ Ｂｅａｔｏ，Ｃｅｌｌ ５６：３３５−３４４（ １９８９）参照)。 これらの受容体の配列の解析および機能の研究は、高度のアミノ酸残基の保存を 示す２つの重要な領域を明らかにした。受容体の中で最も高いレベルの類似性は 、亜鉛原子を結合して、ＤＮＡの同族のステロイド応答因子と相互作用する２つ の「亜鉛フィンガー」を形成する９つのシスチン残基を含む領域に見られる（Ｊ Ｍｉｌｌｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ ４：１６０９−１６１４（１９８５）、ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｃｅｌｌ ５２：１−３（１９８８））。ほとんど保存されない 第２領域は、ホルモンとの相互作用に関わるリガンド結合ドメインである（Ｊ． Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ ７９：４２６０−４２６４（１９８２）。Ｊ．Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕ ｋｅら，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４４３７−４４ ４０（１９８７）。）。最近の研究では、さらなる機能は転写調節に関係するタ ンパク質−タンパク質相互作用のようなこれらの受容体の他のドメインによるも のとされている（Ｒ Ｓｃｕｌｅら，Ｃｅｌｌ ６２：１２１７−１２２６（１ ９９０）。ＨＦＹａｎｇ，Ｃｅｌｌ ６２：１２０５−１２１５（１９９０）、 ＪＭ Ｈｏｌｌｏｗａｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８１６０−８１６４（１９９０）。）。ＤＮＡ結合ドメ インでのアミノ酸保存が、ステロイド受容体スーパーファミリーの新規構成員の 同定に導いてきた。 例えば、ｈＥＲ１およびｈＥＲ２は、エストロゲン受容体のＤＮＡ結合ドメイ ンをコードするＤＮＡプローブで、ｃＤＮＡライブラリーを低ストリンジェンシ ー・ハイブリダイゼーションすることによりクローン化された（Ｇｉｇｕｅｒｅ ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：９１−９４（１９８８））。同様のアプローチによ って、レチノイン酸受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰ ＡＲ）が発見された（ＩＩｓｓｅｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４７：６４５− ６５０（１９９０）。ＤＪ Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３４５ ：２２４−２２９（１９９０））。最近、アフリカツノガエルの核ホルモン受容 体スーパーファミリーの３つの新規構成員が開示された（Ｃ Ｄｒｅｙｅｒ，Ｃ ｅｌｌ ６８：８７９−８８７（１９９２）。）。さらに、Ｅｖａｎｓらの米国 特許第４９８１７８４号には、レチノイン酸受容体の同定および新規リガンドの 同定用のハイブリッド受容体を作るためのキメラ構築物の使用が開示されている 。しかし、上記文献は本 発明をなんら開示も示唆もしていない。 ＴＯＦＡ（５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸）が、ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成での律速段階であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを、 ｉｎ ｖｉｖｏで、高い用量、すなわち食物の０．１５％で阻害することにより 、脂肪酸合成を阻害することが報告されている。 ［例えばアルビーニの「脂肪酸合成を阻害すると、ハムスターでの腎臓の低密度 リポタンパク質分泌が減少する。」Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３：８４３−８ ５１（１９９２）。Ｒｉｂｅｎｅａｕ−ＧｙｏｎおよびＧｉｌｌｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ６２：３０９−３１２（１９７６）。ＨａｌｖｏｒｓｏｎおよびＭ ｃＣｕｎｅ，「単離脂肪細胞における５−（テトラデシルオキシ）−２−フロリ ックアシドによる脂肪酸合成の阻害」、Ｌｉｐｉｄｓ １９（１１）：８５１− ８５６（１９８４）、Ｏｔｔｏら，「脂肪酸酸化に対する５−（テトラデシル オキシ）−２−フオリックアシドの逆効果」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．２４２（１）、２３−３１（１９８５）。Ｐａｒｋｅｒら，「５−（ テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸および関連の低脂血脂肪酸様アル キルオキシアリールカルボン酸」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：７８１−７９ １、１９７７参照］。本発明は、１つの実施態様で、Ｇ−結合受容体のリガンド の活性を増強し、内在的に産生されたホルモンまたは神経伝達物質の活性を増強 する低用量のＴＯＦＡの使用を包含する。 Ｐｏｗｅｌｌら，（「ステロイド受容体ファミリーのオルファンのドーパミン 活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５４６−４８（１９９１）、および「ス テロイドホルモン受容体のドーパミン作動性およびリガンド非依存的活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６３６−３９（１９９１））は、ドーパミンがリガ ンド非依存性の機構により、ステロイドホルモン受容体によって仲介された転写 を活性化することを報告した。しかし、ドーパミンとは違い、ＴＯＦＡおよびＮ ＥＲの活性化因子は、それら自身は使用される用量レベルではドーパミン作動性 活性を示さない。 ドーパミン受容体は、７つの膜貫通ドメインを有し、ヘテロ三量体のＧタンパ ク質を介して膜貫通シグナル伝達を仲介する膜タンパク質である。受容体は、中 枢神経系に主として局在するが、腎臓のような末梢の臓器、食道下部、および噴 門ならびに腸間膜動脈も特異的結合部位を介してドーパミンに応答する。（Ｓｔ ｒａｎｇｅ，「ドーパミン受容体：構造および機能」、Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ９９：１６７−７９、１９９３、ストランジの「中枢神経系でのドーパ ミン受容体の新知見」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２２（３）：２２３−２ ３６、１９９３。）分子クローニングは、この受容体ファミリーが５つの遺伝子 Ｄ１−Ｄ５よりなり、アデニル酸シタラーゼの活性を調節することを明らかにし た。Ｄ１およびＤ５ドーパミン受容体は、アデニル酸シクラーゼ活性を刺激する 一方で、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体は、この酵素を阻害する。（Ｓｅｅｍａｎ およびＶａｎ−Ｔｏｌ，「ドーパミン受容体の薬理学」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ６（４）：６０２−６０８、１９９３。Ｋ ｅｂａｂｉａｎ，「多様性ドーパミン受容体および医薬への使用」、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ５（４）：５１４ −５１８、１９９２。Ｋｅｂａｂｉａｎ，「脳内ドーパミン受容体、２０年の歩 み」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ.Ｒｅｓ.１８(１)：１０１−１０４、１９９３。Ｓｉ ｂｌｅｙら，「ドーパミン作動性受容体の分子神経生物学」、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３５：３９１−４１５、１９９３。） ドーパミン性作動剤およびそれらのアンタゴニストは、運動不全、その他の神 経精神科学的障害、悪心、およびある種のホルモン障害を処置する役割を果たす 。 ドーパミンＤ１受容体は、アデニル酸シクラーゼに結合される。公知のドーパ ミンＤ１アンタゴニストとしては、ＳＣＨ２３３９０（８−クロロ−２，３，４ ，５−テトラヒドロ−３−メチル−５−フェニル−１Ｈ−３−ベンズアゼピン− ７−オール ヘミマレート）： が挙げられる。ドーパミンＤ１アンタゴニストについては、ア ルツハイマー疾患の処置でその役割が示された。記憶増強剤を試験するためのア ッセイである放射状迷路試験（radial-armmazetest）で、内側コリン作動性経路 病巣が、記憶喪失の証拠を生み、およびＳＣＨ２３３９０による長期処置が病巣 誘導障害動作を回復させることを示した。（ＭｃＧｕｒｋら，「ドーパミン作動 性薬が、コリン作動性内側経路を含む病巣により引き起こされた放射状迷路の動 作障害を回復させる」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．５０（１）：１２９−１３ ５、１９９２）。 ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストはジル・ド・ラ・テューレット症候群、 ジストニアおよび遅発性ジスキネジアのような運動不全の治療にも有用である。 ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストは、精神病、さらに特定的には精神分裂病 を治療するのにも有用である。 ジル・ド・ラ・テューレット症候群、または遺伝性多発性チック症は、子供時 代に軽いチック(tic)をともなって始まるが、呼吸および声帯のチックを含む多 発性で複雑な動作に進展する。患者の５０％に、醜語症（汚言）、不随意の糞便 発言が起こる。チックおよび醜語症は、肉体的にそして社会的に無能力であると されるのに十分重篤でありうる。ジル・ド・ラ・テューレッ ト症候群は、一般に０．５〜４０ｍｇ／日のハロペリドールで処置される。ハロ ペリドールの用量は、発声障害、パーキンソン症候群およびアカシジア（静坐不 能）のような副作用のために制限される。クロニジン０．１〜０．６ｍｇ／日も ある患者には有効であるかもしれないが、高血圧の副作用により制限される。本 発明は、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストを増強することにより、ドーパミ ンＤ１受容体アンタゴニストの投与を減らしながらジル・ド・ラ・テューレット 症候群を処置することを可能にする。 失調症は、筋肉緊張での変調から生じる継続運動の持続した異常体位および破 壊により特徴づけられる。一般に、失調症は、トリヘキシフェニジル６〜３０ｍ ｇ／日、ベンズトロピン３〜１４ｍｇ／日およびドーパミン消耗薬レゼルピン０ ．１〜０．６ｍｇ／日のような高い用量の抗コリン性作動薬で処置される。 遅発性ジスキネジアは、頬−舌−顔面の筋肉、まれに四肢の舞踏病状運動によ り特徴づけられる。稀に、病巣または一般化さえされた失調症が見うけられる。 遅発性ジスキネジアは、若年精神分裂病患者に共通の方法で長時間与えられた高 い用量のフェノチアジンにより起こる可能性がある。患者が年配であれ ば、特に女性で脳に障害がある者であればそれだけ、遅発性ジスキネジアの発生 率が高い。薬が中断されたときに問題は消えず、運動不全の標準的治療に対抗す る。抗コリン性作動薬は遅発性ジスキネジアを完全に一掃できる。フェノチアジ ンの一般的で長期化した投与で発生率が増加した。増強により、ＴＯＦＡのよう なＮＥＲ受容体活性化因子である投与されたドーパミンＤ１受容体アンタゴニス トの作用は、遅発性ジスキネジアの予防に有用である。 公知ドーパミンＤ１受容体作用薬としては、ＳＫＦ３８３９０ （１−フェニ ル−７，８−ジヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズ アゼピン）： が挙げられる。 ドーパミンＤ１受容体作用薬はパーキンソン病を処置するのに有用である。 ハロペリドールは、ドーパミンＤ２受容体の好ましい遮断剤である。他のドー パミンＤ２受容体調節因子としては、ジヒドロエルゴクリプチンおよびブロモク リプチンが挙げられる。 ムスカリン様受容体は、天然にアセチルコリンを結合する。 植物アルカロイドムスカリンもムスカリン様コリン作動性受容体を活性化する。 ムスカリン様受容体は、胃胞および尿管の蠕動、腺分泌の促進、瞳孔狭窄、末 梢血管拡張および心拍の整復に関与した節後神経節副交感神経終末で生じる。ム スカリン様受容体は、Ｇタンパク結合受容体でもあり、それを刺激すると、ｃＧ ＭＰの増加の原因となる。ピロカルピンは公知ムスカリン様作動薬である。 他には、カルバコール、メタコリン、ベタンコール、アレコリンおよびオキソト レモリンが挙げられる。 ムスカリン様作動薬は、高眼圧の処置に、特に緑内障で有用であり、胃脳管およ び膀胱を刺激して、術後緊張減退を軽くする。 神経成長因子ＮＧＦは、交感神経および感覚ニューロンの成長のため、また成 人の脳細胞でのニューロンの生存力のために必要とされる。ＮＧＦ治療は、即時 初期応答遺伝子 -- オルフアンステロイドホルモン受容体Ｎｕｒ７７の発現を誘 導する。（Ｄａｖｉｓら，「Ｎｕｒ７７による転写活性化、ステロイドホルモン 受容体スーパーファミリーの１員を誘導しうる成長因子」Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌ． ５（６）：８５４−８５９、１９９１。Ｈａｚｅｌら，「膜脱分極時 および成長因子処置時にＮｕｒ７７はＰＣ１２細胞において示差的に改変される 」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１（６）：３２９３−３２４６、１９９１。 Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，「神経成長因子はグルココルチコイド受容体遺伝子に相同 な遺伝子を誘導する」Ｎｅｕｒｏｎ １（３）：１８３−１８８、１９９３。） 。ニューロンの維持でのその役割のため、また神経の成長を刺激する能力のため 、ＮＧＦは、アルツハイマー疾患の処置に重要である可能性がある。（Ｏｌｓｏ ｎ，「栄養因子および細胞移植技術に基づいた脳治療戦略での修復法」Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏ ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ ５８：３−７、１９９３）。アルツハイマー疾患でのＮ ＧＦの潜在的利益も、アルツハイマー患者でのＮＧＦの頭蓋内浸出液を伴う記憶 改善の最近の例示により示唆される。つまり、ＮＧＦはアルツハイマー疾患のコ リン作動劣勢に対抗することができるように思われる。（Ｓｅｉｇｅｒら，「ア ルツハイマー患者に対する精製された神経成長因子の頭蓋浸出液」Ｂｅｈａｖｉ ｏｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：２５５−２６１、１９９３） 。発明の詳細な説明 本発明の１つの実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関し、上 記受容体は他のヒト受容体タンパク質を含有しない。 １つのクラスでは、この実施態様はヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関 し、上記受容体は他のヒトタンパク質を含有しない。 このクラスの範囲内で、この実施態様は、骨肉腫のようなヒト細胞由来のヒト ステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関し、上記受容体は他のヒトタンパク質を含 有しない。 第２のクラスでは、この実施態様は、アミノ末端からカルボ キシ末端へ描かれた以下の４６１のアミノ酸配列（配列番号：２）： またはその変性変異体を包含するタンパク質に関し、ここでこのタンパク質は、 他のヒト受容体タンパク質を含有しない。 第２の実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ相補的ＤＮＡをコー ドするＤＮＡ配列に関し、ここでＤＮＡ配列は、他のヒトＤＮＡ配列を含有しな い。 当業界で習熟した者が認めるとおり、特定のアミノ酸を翻訳するコドンの組に 実質的な量の縮重がある。したがって、本発明は、１つのコドン（または複数の コドン）が別のコドンに置き換えられ、それでＤＮＡ配列により翻訳されたアミ ノ酸配列が変化しない代替塩基配列をも含む。この明細書において、１つまたは それ以上のこのような置換コドンをもつ配列は縮重変異として定義される。ロイ シンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、そしてグルタミンの代わ りにアスパラギンのような、当業界で習熟した者が機能性になんら影響を示さな いと予測する突然変異（個々のアミノ酸の交換）も含まれる。 本発明の第２の実施態様の１つのタラスは、５’から３’末端に描かれる相補 的ＤＮＡの以下のヌクレオチド配列（配列番号：１）に関する。 本発明の第３の実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲの全部また は一部を発現する系に関する。 本発明のこの第３の実施態様の１クラスは、 ａ）ＰＪ３ＮＥＲＩのような発現ベクター、および ｂ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲタンパク質をコードする塩基配列、 を含むプラスミドのような発現構築物、よりなる。 第３の実施態様のこのクラスの範囲内で、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲは 、上で示されるとおり相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）よりな る。 本発明のこの第３の実施態様の第２のクラスは、サルの腎臓セルライン（ＣＯ Ｓ）のような適切な宿主細胞でヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲの過渡的発 現の系に関し、その系は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ ｃＤＮＡを発 現するベクターよりなる。 一般的に使用される広範なセルラインが本発明の使用に適することは、当業界 で習熟した者に十分に明らかである。種々の種から得られた適切なセルラインは 、ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類、あるいは酵母や細菌株のセルライ ンを含むが、 これらに限定されない。 本発明の第４の実施態様は、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲについて試験サ ンプルの結合アフィニティーを測定するための全ての上述の真核生物または原核 生物の発現系を使用する方法に関する。 ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列の単 離に続いて、ＮＥＲ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列中のＤＮＡ結合ドメイン 領域を、別のステロイドホルモン受容体タンパク質、例えばグルココルチコイド （ＧＲ）受容体タンパク質、甲状腺受容体タンパク質、ミネラルコルチコイド受 容体タンパク質またはレチノイン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列か ら取り出されたＤＮＡ結合ドメイン領域で置換することによりキメラ遺伝子を作 ることができる。次に、（１）発現プラスミドで行われるのが好ましいキメラ受 容体遺伝子、および（２）これもプラスミドで行われるのが好ましいＣＡＴ遺伝 子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子、で適切な受容 体欠損宿主細胞をトランスフェクションさせる。全ての場合に、レポーター遺伝 子は、ホルモン応答エレメントが、使用されたＤＮＡ結合ドメインによ り活性化されてキメラ受容体遺伝子になる能力のある作動性ホルモン応答エレメ ント（ＨＲＥ）（野生型であるかまたは工学的に作られたもの）に機能的に結合 される。（例えば、キメラレポーター遺伝子がグルココルチコイド受容体コーデ ィングＤＮＡ由来のＤＮＡ結合ドメイン領域を含む場合、ＨＲＥはその後野生型 、工学的に作られたもの、または合成ＧＲＥ、すなわちＧＲ受容体タンパク質の ＤＮＡ結合領域の作動性部分により活性化されることができるものであるべきで ある。）次に、キメラ遺伝子によってコードされたキメラタンパク質のリガンド 結合ドメイン領域と結合する能力のある１つまたはそれ以上のリガンド（類）を 含有する試験サンプルで、トランスフェクトされた宿主細胞をチャレンジする。 リガンドがキメラ受容体タンパク質と機能的に複合できる程度を決定するために 、レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質のタンパク質レベルの変化を モニターすることによりレポーター遺伝子の誘導を観察する。（例えば、ルシフ ェラーゼがレポーター遺伝子である場合、ルシフェラーゼの産生は受容体調節遺 伝子転写を示す。）最後に、あるリガンド（類）がレポーター遺伝子の転写を誘 導できることが分かった場合、このリガンド（類）は当初 のサンプルＤＮＡ配列によりコードされた受容体タンパク質に結合できることが 結論づけられる。レポーター遺伝子の発現を誘導するリガンドと比較して、当初 のＤＮＡ配列によりコードされた受容体タンパク質の結合特性を試験することに より、この結論をさらに確認できる。 さらに第４の実施態様は、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲを活性化するため の試験サンプルのアフィニティーを測定する方法に関し、この方法は、 （ａ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列 のＤＮＡ結合ドメイン領域の部分を、公知リガンド応答性受容体タンパク質由来 のＤＮＡ結合ドメイン領域の作動性部分で置換することによりキメラ遺伝子を構 築すること、 （ｂ）（ｉ）段階（ａ）から得られたキメラ遺伝子、および（ｉｉ）ホルモン 応答エレメントが、段階（ａ）のキメラ遺伝子によりコードされた受容体タンパ ク質のＤＮＡ結合ドメイン領域により活性化される能力がある作動性ホルモン応 答エレメントに機能的に結合したレポーター遺伝子、 を適切な受容体欠損宿主細胞に導入すること、 （ｃ）段階（ａ）のキメラ遺伝子によりコードされたキメラ受容体タンパク質 を用いて、リガンド結合活性について、評価されるべき試験サンプルを用いて段 階（ｂ）由来の感染宿主細胞をチャレンジすること、 （ｄ）レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質のタンパク質レベルの 変化をモニターすることにより、レポーター遺伝子の導入を検定すること、 よりなる。 この実施態様の１つのクラスは、適切な受容体欠損宿主細胞としてサルの腎臓 セルライン（ＣＯＳ）を使用する方法に関する。さらに、ＣＯＳ宿主セルライン を、プラスミドでトランスフェクトできる。そのプラスミドは、 （ａ）ＰＪ３ＮＥＲＩのような発現ベクター、および （ｂ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲタンパク質をコードする塩基配列 、 を含む。 前述の第４の実施態様は、ＴＯＦＡのような化合物を同定するのにさらに有用 であり、これらの化合物は、ドーパミンＤ１受容体およびムスカリン様受容体の ような他の受容体について のリガンドの作用を増強する。この実施態様は、機能を身体的に制御する新規ホ ルモン系のリガンドを同定するのにも有用である。前述の具体例の別の用途は、 ＮＥＲ受容体を活性化する化合物を、最も特定的にはそれらを必要とする被験動 物に投与することよりなる、Ｇタンパク結合受容体の調節因子活性を増強するこ とである。 さらに、本発明のこの実施態様の別のクラスは、その化合物（またはその化合 物類の内のいずれか１つ）がＮＥＲ受容体を調節するかどうかを決定するために 化合物または化合物の混合物を評価するためのリガンド依存性スクリーニングア ッセイよりなる。リガンド依存性スクリーニングアッセイは、転写がＮＥＲ受容 体の制御下にあるＮＥＲ受容体とレポーター遺伝子を同時発現することにより行 われる。このようなレポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターがＮＥＲ受容体 の制御下にあるように改変されているＭＭＴＶルシフェラーゼレポーター遺伝子 であってよい。ＮＥＲステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡおよび適切なレポータ ー遺伝子を含有するプラスミドは、ＣＯＳまたは他の適切な細胞に移入すること ができる。トランスフェクション後、そして１８〜４８時間後にリガンドまたは 抽出物を 添加し、細胞を洗浄し、細胞抽出物を製造し、そしてレシフェラーゼ活性につい て分析する。ある種の実施例で、大量の組織培養皿でのバッチモードにより、ト ランスフェクションが行われる。１８時間後、細胞を洗浄し、多穴プレートに接 種する。細胞を固定した後、リガンドを加え、そしてレシフェラーゼ活性を１日 または２日後試験する。全化合物または抽出物を乾燥させ、そして１００−１０ ００倍の濃度の貯蔵溶液としてエタノールまたはＤＭＳＯのようなそれらに適切 な溶媒に溶かす。 概して、本発明は、そのタンパク質配列または遺伝子配列の先行知見なしに、 ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離する方法 を記載する。ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡを単離するのにポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用した。 ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡの完全な配列を決定し、そして そのコードタンパク質配列を推定した。他のものの中で、このような配列情報は 新規ステロイドホルモン作動薬およびアンタゴニストを開発する過程で有用であ る。 クローン化ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡを発現するのに発現 系を使用した。ヒトステロイドホルモン受容 体ＮＥＲのリガンド結合特性を測定するのにＣＯＳ（サル腎臓セルライン）発現 系を使用することができる。 アッセイのプロトコールは、アンタゴニストによりステロイドホルモン受容体 ＮＥＲの活性化を決定するために、不均一に発現したヒトステロイドホルモン受 容体ＮＥＲを使用する。 一般的に、本発明はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの新規構成 員に関する。ＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列（塩基２４５〜１０２７） は、このファミリーの受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの両方の特徴 的特性を示す。配列分析は、核受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインを特 徴づける保存アミノ酸残基を含む４６１アミノ酸のタンパク質を推定した。 本発明は、ヒト骨細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離されたステロイド受容体 様遺伝子ファミリーの新規構成員であるＮＥＲに関する。ＮＥＲは、典型的ステ ロイド受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの保存配列を含む４６１アミ ノ酸のポリペプチドをコードする。最良の相同性は、異なるレチノイン酸受容体 ：α、βおよびγで、ＤＮＡα、γ結合ドメインで５５％であり、リガンド結合 ドメインで３８〜４０％で共有さ れる。試験した全細胞および組織で２．３ｋｂの一本鎖転写体を検出した。レポ ーター遺伝子のリガンド依存性転写活性化を仲介するこれらの構築物の能力を試 験した。 新規構成員が一定に同定されるとき、サイズにおいて核受容体遺伝子ファミリ ーを拡張する。ここで、ヒト骨肉腫細胞由来の新規配列のクローニングを報告す る。ＮＥＲと名付けられたこの遺伝子は、４６１のアミノ酸のポリペプチドをコ ードし、ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの両方の典型的な保存配列を含む。 推定されたタンパク質のアミノ末端は、高度に安定化され且つ複合化された２次 構造を導入するかもしれない高含量のプロリンおよびセリン残基を含む。高含量 のプロリン残基も、ＣＴｆ／Ｎ１、ｆｏｓ、ｊｕｎ．ｐ５３、ＯＣＴ−２および ＳＲＦのような転写活性を伴う他の核受容体およびその他の分子に見られた（Ｍ ｉｔｃｈｅｌおよびＴｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５、３７１−３７８１頁 （１９８９）。Ｍｅｒｍｏｄら，１９８９）。 推定上のタンパク質の大きさおよび異なるドメインの空間分布は、甲状腺、ビ タミンＤおよびレチノイン酸受容体サブグループで見られる配列に似ている（Ｌ ａｚａｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６、７７７１−７７７４頁、１９８９）。推定 されたリガンド結合ドメインでの配列相同性は、このサブグループの構成員と３ ３〜４０％同一性の範囲にある一方で、リガンド結合ドメインがエストロゲン、 グルココルチコイド、アンドロケンおよびプロケステロンを含むステロイド受容 体サブグループの関連のドメインと比較した場合に、２５％より低い相同性が測 定された。上述のとおり、リガンド結合ドメインの最高の相同性は、レチノイン 酸受容体であった。この相同性であるレチノイン酸ＲＡＲ２で４０％であり、７ ９％の相同性よりかなり低く、それ以外ではＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγの間 で見られる。しかし、配列類似の程度は、わずか２７％同一で他のレチノイン酸 受容体と共有されるレチノイン酸受容体ＲＸＲの最近発見された新規形態から明 らかなとおり、リガンドの特性を常に表示できるわけではない（ＯｒＯら，Ｎａ ｔｕｒｅ 、３４７、２９８−３０１頁、１９９０）。したがって、配列相同性の 知見に基づいて、任意の公知リガンドを帰属させるかまたは排除することは不可 能である。ほとんどの他の核受容体とのＤＮＡ結合ドメインでの相同性は、およ そ５０％である。最高の相同性は、エストロゲンおよびレチノ イン酸受容体に対し、それぞれ５６％、および５３−５５％であると決定された 。しかし、これらのレベルは、他の受容体との相同性よりわずかに高いのみだっ た。このドメインで、異なるレチノイン酸受容体（α、βおよびγ型）の間で共 有される相同性は、９５％より高いということに注目する価値がある。そしてこ の領域での他のレチノイン酸受容体に対するＲＸＲの相同性でさえ、６０％を超 える。 骨肉腫セルラインからクローン化された場合、ＮＥＲのｍＲＮＡは、異なる組 織および全試験セルラインに広範に分布される。 確認しにくいリガンドの探索を容易にするために、ＮＥＲ遺伝子のリガンド結 合ドメインに結合したエステロゲン受容体のＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリ ッド受容体遺伝子を構築した。このような戦略が、ＰＰＡＲ受容体についてのリ ガンドを同定するうえで好結果であったことが立証された。Ｉｓｓｅｎｍａｎｎ およびＧｒｅｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ、３４７、６４５−６４９頁（１９９０）。 ＮＥＲ受容体についての推定上のリガンドを探索するために、キメラ受容体Ｇ Ｒ／ＮＥＲを作製した。このキメラ受容体は、 不均一な応答性ＤＮＡ配列の転写のリガンド依存性活性化を示す能力がある。Ｄ ＮＡ結合ドメインを含むマウスのグルココルチコイド受容体（ｍＧＲ）のアミノ 末端部分を、核受容体ＮＥＲの推定上のリガンド結合ドメインに融合させて、予 測上のキメラ受容体ＧＲ／ＮＥＲを形成した。ｈＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａ ｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をコードするｃＤＮＡ配列（シナーらのＮＥＲ、ステロ イドホルモン核受容体ＧＥＮＥをコードする遺伝子ファミリーの新規構成員（印 刷中））をＸｈｏ Ｉ制限部位に変換し、その部位は、その後ＤＮＡ結合ドメイ ンをコードするＧＲｃＤＮＡ配列とのライケーションに使用した。したがって、 ＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をアミノ酸残基Ｓｅｒ^{15 5} およびＨｉｓ¹⁵⁶に変換した。 ＭＭＴＶプロモーターの制御下でそのルシフェラーゼｃＤＮＡが転写されるレ ポーター遺伝子ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼを用いるリガンド依存性トランスアク チベーションアッセイにキメラを使用した。 メルク・ケミカル・コレクションからの脂肪酸にトポロジー的に類似する化合 物の特異的スクリーニングを介して、ＮＥＲ 受容体のリガンドとしてＴＯＦＡを同定した。レデレラポラトリーズで開発され た類似性デスタリプターに基づく（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｅ．Ｃｈａｒｈａｒｔ、Ｄ ｅｎｎｉｓ Ｈ．Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｇｈａｖａｎ，Ｊ．Ｃｈ ｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ 、１９８５、２５：６４−７３）が、 部分的荷電のような追加のデスクリプターを含むサイモンカールスレイによる未 公表の研究の成果であるメルタの形状的類似性（ＴＯＰＯＳＩＭ）プログラムを 使用することにより、メルク・ケミカル・ストラクチャー・データベースから化 合物を選択した。トランスアクチベーションアッセイで試験するために約２５０ の化合物を選択した。ＴＯＦＡは、ＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／Ｐ ＰＡＲハイブリッド受容体により仲介された発現を、用量依存式に刺激した。Ｔ ＯＦＡと比較して、リガンドＷｙ１４６４３およびオレイン酸は、それらの予測 される受容体特異性を維持し、ＧＲ／ＮＥＲ受容体にはよらずＧＲ／ＰＰＡＲお よびＧＲ／ＮＵＣにより仲介された発現を活性化した。しかし、天然ＮＵＣＩお よびグルココルチコイド受容体の同時トランスフェクション後、ＭＭＴＶレシフ ェラーゼ受容体遺伝子の発現を刺激しないので、ＴＯＦＡは 転写の一般的な刺激因子としては作用しなかった。ＴＯＦＡが、ＭＭＴＶレシフ ェラーゼレポーター遺伝子のみで、または発現がＳＶ４０の初期プロモーターの 制御下にあるレポーター遺伝子のみで、トラスフェクトされた細胞内のレシフェ ラーゼの発現を刺激しなかったという事実により、さらにＴＯＦＡの特異的作用 は説明された。 ＮＥＲ受容体についてのこれらのリガンド依存性転写アッセイおよび結合アッ セイは、ＴＯＦＡよりさらに強力であるもの、またはＧタンパク結合受容体の活 性化に対するよりよい選択性を示すものを含めて追加の化合物を同定するのに使 用できる。 ＴＯＦＡは、関連のないＮＵＣおよびＮＥＲ受容体のリガンド結合ドメインに より仲介される転写を活性化することが分かった。したがって、ＴＯＦＡが、ド ーパミンとＣＯＵＰ−ＴＦ受容体とドーパミンとの相互作用に類似のリガンド非 依存性様式でこれらの受容体と間接的に相互作用することは可能である（Ｐｏｗ ｅｒら，「ステロイド受容体スーパーファミリーのオルファンのドーパミン活性 化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５０１２）：１５４６−１５４８、１９９１。 Ｐｏｗｅｒら，「ステロイドホルモン受容体のドーパミン作動性およびリガン ド非依存性活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３８）、１６３６−１６３ ９、１９９１。Ｐｏｗｅｒら，「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー の活性化における新知見」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１３ （８）：３１８−３２３、１９９２。）。ＴＯＦＡとＤ１ドーパミン作動系の間 の相互作用についての情報を得るために、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒ ｏでのドーパミン受容体作動薬ドーパミン、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニス トＳＣＨ２３３９０、およびＴＯＦＡの間のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉ ｖｏの相互作用を試験した。Ｐｏｗｅｒら（上記文献）によりドーパミンでＣＶ １細胞を処理することがステロイドホルモン受容体により仲介された転写を活性 化することについて開示された報告と対照的に、ドーパミンでＣＶ１細胞を処理 すると、ＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を刺激しなかった。さらに、Ｄ１ド ーパミン受容体を発現しないＣＯＳ細胞で、ＴＯＦＡはＧＲ／ＮＥＲキメラ受容 体により仲介された転写を活性化した。さらに、ドーパミンはＣＯＳ細胞ではな くＣＶ１細胞でＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を抑制した。ＳＣＨ２３３９ ０を用いた処理は、転写を増加させ、そしてドーパミンにより誘導 された転写の抑制を軽減した。ＴＯＦＡとドーパミン作動系の間に雑音はあるが 、これらの結果は、ドーパミンによるステロイドホルモン受容体の刺激について 示唆されたものと異なる分子機構を介してＴＯＦＡが受容体を活性化することを 示す。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＯＦＡとＤ１ドーパミン作動系との間の相互作用に ついての情報を得るために、ラットでＤ１アンタゴニストにより誘導されたカタ レプシーを用いてドーパミン受容体アンタゴニスト、ＳＣＨ２３３９０およびＴ ＯＦＡの間のｉｎ ｖｉｖｏの相互作用を試験した。ＴＯＦＡでの前処置は、Ｓ ＣＨ２３３９０カタレプシーを少なくとも２５倍まで顕著に増加させた。ムスカ リン様コリン作動性受容体の作動薬であるピロカルピンにより誘導されたカタレ プシーをＴＯＦＡ前処置により約３倍まで増強した。しかし、Ｄ２ドーパミン受 容体アンタゴニスト ハロペリドールにより誘導されたカタレプシーは、ＴＯＦ Ａ前処置によっては影響されなかった。 本発明は、受容体のポテンシエーター、特にドーパミンＤ１受容体アンタゴニ ストの、そしてムスカリン様受容体のポテンシエーターを見つけ出す方法にも関 する。この方法は、新規組換え体ヒトステロイドホルモン受容体、ＮＥＲを用い たスクリ ーニング手段を使用する。 本発明の方法に使用されるリガンドスクリーニングアッセイを、以下に記述す る： リガンド依存性転写スクリーニングアッセイは、ＮＥＲ受容体と、転写がＮＥ Ｒ受容体の制御下にあるレポーター遺伝子とを同時発現することにより行われる 。このようなレポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターがＮＥＲ受容体の制御 下にあるように改変されているＭＭＴＶ−レシフェラーゼレポーター遺伝子であ るのが好ましい。ＮＥＲステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡおよび適切なレポー ター遺伝子を含むプラスミドをＣＯＳまたは他の適切な細胞にトランスフェクト する。トランスフェクション後、そして１８〜４８時間後にリガンドまたは抽出 物を加え、細胞を洗浄し、細胞抽出物を作製し、そしてレシフェラーゼ活性につ いて分析する。あるいは、多量の組織培養皿でバッチモードでトランスフェクシ ョンを行ってもよい。１８時間後、細胞を洗浄し、そして多穴プレートに接種し た。細胞を固定した後、リガンドを加え、そして１日または２日後レシフェラー ゼ活性を試験する。全化合物または抽出物を乾燥させ、そして１００−１０００ 倍濃度の貯蔵溶液としてエタノ ールまたはＤＭＳＯのようなそれらに適切な溶媒に溶かす。 さらに、この発明は、ドーパミンＤ１受容体を阻害するポテンシエーターとし てのＴＯＦＡ（５−テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸）および薬学 上許容しうるそれらの塩およびエステルの使用、並びにムスカリン様受容体の使 用にも関する。ＴＯＦＡはＮＥＲを使用する上記スクリーニング手段を通して見 出された。ＴＯＦＡは、ＮＥＲを活性化し、かつ他の受容体のリガンドのポテン シエーターである。しかし、ＴＯＦＡは、そのリガンドがＴＯＦＡによって増強 される受容体に非依存的には作用しない。 ＴＯＦＡは、それらの細胞内シグナル伝達経路を介した細胞表面の受容体機構 との相互作用の新規機構を通して作用するようである。神経伝達受容体での直接 的影響を回避することにより、直接的受容体活性薬の作用を弱体化する受容体の アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションについての変更が回避さ れるので、ポテンシエーターＴＯＦＡの使用には、明確な臨床的利点がある。 ＴＯＦＡはドーパミンＤ１アンタゴニストＳＣＨ２３３９０が有用である疾患 の治療に特に有用である。例えば、ＳＣＨ ２３３９０には、コカインの依存特性を回避し、コカイン、アンフェクミンまた は他のＣＮＳ刺激剤の多用から生じる毒性効果を遮断するかまたは回避するうえ で有用でありうる。（ＬｏｍａｘおよびＤａｎｉｅｌ,「ラットでのコカインお よび体温：ドーパミンＤ１アンタゴニストの効果」、Ｐｒｏｃ．ＷｅｓｔＰｈａ ｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ． ３４：５−９、１９９１。また、Ｗｉｔｋｉｎら，「リ スザルのスケジュール制御行為についてのコカインおよびドーパミン受容体サブ タイプ選択的作動薬を用いたハロペリドールおよびＳＣＨ２３３９０の相互作用 」、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｂｅｒｌ．１０４（４）：４５２ −４３１、１９９１。）さらに、ＴＯＦＡは、抗精神病薬で処置する間に進行す るものを含め精神分裂病および行動不全の治療をする上でＳＣＨ２３３９０の作 用を増強するのに有用でもありうる。さらに、ＴＯＦＡは、目の流動力学的不全 症で（Ｖｉｒｎｏら，「ドーパミン、ドーパミン作動薬および高眼圧」、Ｉｎｔ ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １６（４−５）：３４９−３５３、１９９２参照。） 、および頭蓋内圧が増加した患者で（ＢｏｙｓｏｎおよびＡｌｅｘａｎｄｅｒの 「脳脊髄液の正味の産生がＳＣＨ２３３９０により減少される」、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ． ２７（６）：６３１−６３５、１９９０参照。）のドー パミン作動薬により誘導された眼内圧の進行を回避する際にＳＣＨ２３３９０の 作用を増強する上で有用である。 ＴＯＦＡは、アルツハイマー疾患の治療でＳＣＨ２３３９０の作用を増強する のに有用でもある。 さらに、ＴＯＦＡは、ＰＣ１２細胞でのＮＧＦの分化作用を顕著に増強し、そ してコリン作動性受容体刺激剤（ピロカルピン）のｉｎ ｖｉｖｏ作用を増強す るので、ＴＯＦＡは、正常な加齢に関連するもの、またアルツハイマー疾患のよ うな年齢関連疾患でコリン作動性欠陥と関連した記憶不全を治療するのにも有益 に使用されうる。 ＴＯＦＡが脂肪酸合成の潜在的阻害剤であることが知られているが、この作用 は、それを通してＴＯＦＡがこれらの受容体を活性化する共有機構であるとは思 われない。Ｋａｗａｇｕｃｈｉａ Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、東京、（１ ９８２）、９２、７−１２の脂肪酸合成の潜在的阻害剤である別の化合物セルレ ニンは、ＴＯＦＡの増強作用を真似るものでなく、それにより、脂肪酸合成それ 自体の阻害はキメラ受容体の活性化お よびドーパミン受容体シグナル伝達経路での雑音に応答可能でないということを 示すさらなる証拠を加える。 要約すると、新規構成員のステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを同 定した。これらの機能の同定は、新規ホルモンの調節系への研究の見込みを提供 する。 本発明の化合物の薬学上許容しうる塩は、ナトリウム、カリウム、アルミニウ ム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛のような陽イオンから、または アンモニニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルタミン、リジン、アルギニ ン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロ カイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェニエチルアミン、 ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およ び水酸化テトラメチルアンモニウムのような塩基から形成されるものを包含する 。これらの塩は、例えば遊離酸を適切な有機または無機塩基と反応させることに より標準法により製造できる。 ＴＯＦＡのエステルは、ＴＯＦＡを乾燥有機溶媒、好ましくはテトラヒドロフ ラン（ＴＨＦ）に、０−３０℃で溶解し、そして適切に置換したイソウレアで８ −２４時間、−１５℃に冷 却しつつ処理し、そしてウレアを濾過することにより製造できる。濾液を減圧下 で濃縮して所望のエステルを得る。特に本発明の適切なエステルとしては、 （ａ）Ｃ_1-5アルキル、または （ｂ）（ｉ）フェニル、または （ｉｉ）メチル、メトキシ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆまたはヒドロキシで置換さ れたフェニル、で置換されたＣ_1-5アルキル、が挙げられる。 しかし、他の薬学上許容しうるエステルを使用してもよい。 錠剤、カプセル（各々除放性および持続放出処方を含む）、丸剤、粉末、顆粒 、エリキシル、チンキ、懸濁物、シロップおよびエマルジョンのような経口投与 形態でＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子を投与することができる。同様に、 薬学界で通常の技術を有する者に十分よく知られた形態を使用して、静脈（濃縮 塊および輸液の両方）、腹腔内、皮下、または筋肉内形態で投与することもでき る。有効であるが毒性のない量の所望の化合物を抗男性ホルモン剤として使用す ることができる。 ＮＥＲの活性化因子を利用する用量管理は、対象の型、種、年齢、体重、性別 および治療状況、処置されるべき症状の重篤 度、投与の経路、対象の腎臓および肝臓の機能、および使用される特定の化合物 またはそれらの塩を含む種々の因子にしたがって選択される。通常に習熟した医 師または獣医は、必要とされるＮＥＲの活性化因子の有効量を決定し、処方して 、ドーパミンＤ１アンタゴニストまたはムスカリン様作動薬の作用を増強するか または、ＮＧＦの産生およびその作用を刺激することが十分できる。 作用を示すために使用される場合、本発明の経口用量は、ＮＥＲ活性化因子の 約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、特に１日当たり０．１〜５０ｍｇの間の範囲に ある。組成物は、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５ ．０および５０．０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供されることが好 ましい。都合よく、ＴＯＦＡは、単回１日用量で、またはそれより少なく投与さ れてよいか、または総１日用量は１日２回、３回または４回の分割用量で投与さ れてもよい。さらに、ＴＯＦＡは、適切な鼻腔ビヒクルの局所使用を介して、ま たはその業界で通常の技術をもつものによく知られた経皮性皮膚パッチのそれら の形態を使用し経皮経路を介して鼻腔内形態で投与されてもよい。経皮伝搬系の 形態で投与されるために、 もちろん用量投与は、用量管理を通して断続的であるよりむしろ継続的である。 他の好ましい局所的製品としては、有効成分の濃度が０．１％〜１５％（ｗ／ｗ またはｗ／ｖ）の範囲にあるクリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー およびゲルが挙げられる。 本発明の方法では、ＴＯＦＡは、活性増強成分を形成することができ、そして 、一般的には投与の目的形態に関して適切に選択された適切な薬学上の希釈剤、 賦形剤または担体（正確にはここで「担体」材料と称される）と混合して投与さ れる。それは、経口の錠剤、カプセル、エリキシル、シロップおよびその他であ り、そして常套の薬学上の基準と矛盾しない。 例えば、錠剤またはカプセルの形態での経口投与については、活性剤成分を、 エタノール、グリセロール、水およびその他のような経口で非毒性の薬学上許容 しうる不活性な担体と混合できる。さらに、所望であるか必要であれば、適切な バインダー、滑剤、崩壊剤および着色剤も、この混合物に組み込むことができる 。適切なバインダーとしては、スターチ、ゼラチン、グルコースまたはベーター ラクトースのような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガントまた はアルギン酸ナトリウ ムのような天然および合成のガム、カルボキシルメチルセルロース、ポリエチレ ングリコール、ワックスおよびその他が挙げられる。この用量形態に使用される 滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸 マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびそ の他が挙げられる。崩壊剤としては、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベン トナイト、キサンタンガムおよびその他が挙げられるが、これらに限定されるも のではない。 ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子は、小さな単ラメラ小胞体、大きな単ラ メラ小胞体および多重ラメラ小胞体のようなリポソーム送達系の形態で投与され てもよい。リポソームは、種々のリン脂質から形成でき、コレステロール、ステ アリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む。 ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子は、化合物分子が結合する個々の担体と してモノクローナル抗体の使用により送達されてもよい。ＴＯＦＡは、標的とな りうる薬の担体として水溶性ポリマーと結合していてもよい。このようなポリマ ーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピ ルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチ ルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチ レンオキシドポリリジンを挙げることができる。さらに、ＴＯＦＡは、薬の制御 放出を達成するのに有用な生物分解可能なポリマーの１種、例えばポリ乳酸、ポ リイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、オリ アセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの 架橋または両親媒性保護コポリマーと結合してもよい。 最も好ましくは、ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子を、ピロカルピン、Ｓ ＣＨ２３３９０、ジヒドロエルゴタリプチン、ブロモクリプチン、メタコリン、 カルバコール、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリン、最も好まし くは、ピロカルピンおよびＳＣＨ２３３９０のような、それ自身がＧ結合受容体 の作動性またはアンタゴニズムを示す化合物と組み合わせて投与する。 ここで使用される場合、「投与」の語は、ＮＥＲ活性化因子および増強された 剤の併用および逐次投与の両方に該当する。このような増強剤の例としては、ド ーパミンＤ１受容体アンタゴニストおよびムスカリン様受容体作動薬が挙げられ るが、こ れらに限定されるものではない。このようなドーパミンＤ受容体アンタゴニスト の例示としては、ＳＣＨ２３３９０、ジヒドロエルゴクリプチン、およびブロモ クリプチンがあり、そしてこのようなムスカリン様受容体作動薬の例示としては 、ピロカルピン、メタコリン、カルバコール、ベタンコール、アレコリンおよび オキソトレモリンがある。ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストの用量は、０． ００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。 ムスカリン様受容体作動薬の用量は、１〜２％溶液で上昇した眼内圧を処置する のに局所的に投与されてもよく、または０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ま しくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で経口にまたは非経口に投与されてもよ い。 ここで使用される場合、「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー」は 、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、プロケステロン、エストロゲン 、エストロゲン関連物、ビタミンＤ３、甲状腺、ｖ−ｅｒｂ−Ａ、レチノイン酸 およびＥ７５（ドロソフィリア）受容体からなる関連受容体の種に該当する。こ こで使用される場合、「ステロイドホルモン受容体」は、ステロイドホルモン受 容体スーパーファミリーの範囲内の 構成員に該当する。 ここで使用される場合、「リガンド」は、ホルモンまたは成長物質のような誘 導物質を意味する。細胞の内側で、リガンドは受容体タンパク質に結合し、それ によってリガンド受容体複合体を作り、すぐに適切なホルモン応答エレメントに 結合することができる。単一のリガンドは、複数の受容体を有しうる。 本明細書で使用される場合、「ポテンシエーター」の用語は、第２の剤の作用 または機序のを増強する剤または機序を意味する。「増強量」なる語は、被験動 物において増強作用を生じるために、投与されるべきポテンシエーターの量に該 当する。 「薬学上有効な量」の語は、研究者または臨床医により追求されてきた組織、 系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出す薬または薬学上の剤 の量を意味する。 本明細書で使用される場合、「発現構築物」は、（１）遺伝子エレメントまた は遺伝子発現で調節の役割を示すエレメント、例えばプロモーターまたはエンハ ンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳された構造配列ま たはコード配列、および（３）適切な転写開始および停止配列、の集合よりなる 転写単位を含むプラスミドまたはベクターに該当する。 「組換え体発現系」は、発現構築物と適切な宿主微生物の組合せを意味する。こ こで使用される場合、「受容体」の語は、細胞表面または細胞構造内で特異的な 分子構造を示す結合または認識部位に該当し、これは薬または毒素を含めた神経 伝達物質または他の化合物による刺激への生理学的応答を起こす。 ここで使用される場合、「Ｇ結合受容体」の語は、活性化される際に、その細 胞質表面にＧＴＰ（Ｇタンパク質）を結合し、アデニル酸シクラーゼで活性化受 容体と結合する膜タンパク質に結合される受容体に該当する。「アデニル酸シク ラーゼ結合受容体」は、活性化される際に、酵素アデニル酸シクラーゼを直接活 性化する受容体に該当する。 以下の実施例は、本発明を例示する目的で示され、本発明の範囲または思想に 限定を設けるものとして解釈されるべきではない。 実施例１ プライマー設計 典型的な核受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの共通配列を認識する ように縮重ＤＮＡプライマーを設計した。５’プライマーＥＳ１１（配列番号３ ）は、ＤＮＡ結合ドメイ ンの保存アミノ酸ＣＥＧＣＫＡ（Ｇ）に基づいた縮重オリゴマー５’ＴＧＴＧＡ ＧＧＧＣＴＧＣＡＡ（Ｇ／Ａ）Ｇ（Ｃ／Ｇ）Ｃであった。第２の５’プライマー ＥＳ１２（配列番号４）ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡ（Ｇ／Ａ）Ｇ（Ｃ／Ｇ） ＣＴＴＣＴＴＣは、ＣＥＧＣＫＡ（Ｇ）配列に続く２つの保存フェニルアラニン 残基に相当するその３’末端に６つの追加ヌクレオチドを含む。アンチセンスプ ライマーＥＳ１５（配列番号５）ＡＡ（Ｇ）Ａ（Ｃ，Ｔ，Ｇ）ＣＣＡ（Ｃ，Ｔ， Ｇ）ＧＧＩＡＩＩＩＩＣ（Ｔ）ＴＴＴ（Ａ，Ｇ，Ｃ）ＧＣ（Ｇ）ＴＴは、典型的 な受容体のリガンド結合ドメインの半保存的アミノ酸配列ＦＡＫｘｘＰＧＦに相 補的であるように設計された。非保存アミノ酸（ｘｘ）に相当するヌクレオチド は、イノシン（Ｉ）残基で置換された。ＰＣＲ増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するために、核受容体スーパーファ ミリーの構成員により共有される２つの保存セグメントのアミノ酸配列にしたが って縮重オリゴヌクレオチドを合成した（ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８９９−８９５（１９８８）。）。ＤＮＡ結合ドメインのセグ メントにしたがって５’末端プライマー、ＥＳ１１およびＥＳ１２を設計した。 レチノイン酸受容体サブファミリーおよびビタミンＤ受容体のリガンド結合ドメ イン中の保存アミノ酸配列にしたがって３’末端でのプライマーＥＳ１５を作製 した。この保存領域は、２つの非保存アミノ酸残基を含有することから、イノシ ンヌクレオチドがこのプライマーの部分として使用された。骨肉腫細胞ＳＡＯＳ −２／Ｂ１０のｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡをプライマーＥＳ１１および ＥＳ１５で増幅し、増幅の第１回目の後種々のサイズの多重ＤＮＡ断片を生じた 。入れ子（nested）プライマーＥＳ１２および同じ３’末端プライマーＥＳ１５ を使用しながら反応の一部分を増幅の第２回目にかけた。 製造者推奨（ベデスダ・リサーチ・ラホラトリーズ）にしたがってモロニー逆 転写酵素ＲＴＨにより、骨肉腫細胞ＳＡＯＳ−２／Ｂ１０細胞から単離された２ μｇ総ＲＮＡからランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮ Ａ反応液（２５μＬ）を３００ｍＬ水中に希釈し、そして９５℃で５分間熱変性 させ、そして氷上ですばやく冷却した。アンプリタークキットおよびＤＮＡサー マルサイクラー（パーキン−エルマ ー−シータス）を用いた増幅反応に、ｃＤＮＡ（２．５μＬ）および第１プライ マー対ＥＳ１１およびＥＳ１５（各々０．５μＭ）を使用した。 プライマーＥＳ１１は、以下の配列（配列番号３）： （ここで、Ｒは、ＡまたはＧを表し、そして Ｓは、ＣまたはＧを表す。） を示し、 そしてプライマーＥＳ１５は、以下の配列（配列番号５）： （ここで、Ｎは、（１１、１４および２６位で）ＡまたはＣまたはＧまたはＴを 表し、Ｎは、（１７、１９、２０、２１および２２位で）イノシンを表し、Ｒは 、ＡまたはＧを表し、Ｓは、ＣまたはＧを表し、そしてＹは、ＣまたはＴを表す 。） を示す。 以下の増幅サイクルを行った：９４℃で１．５分間変性、６５℃で３分間アニ ーリング、７２℃で５分間伸長で３サイクル、９４℃で１分間変性、６０℃で３ 分間アニーリング、７２℃で５分間伸長で１５サイクル、および９４℃で１分間 変性、５ ７℃で３分間アニーリング、７２℃で５分間伸長で２０サイクル。 １回目の増幅の完了後、５μＬの反応液を第２のプライマー対：部分的な入れ 子オリゴマーＥＳ１２および同じ３’末端プライマーＥＳ１５（各々０．５μＭ ）を含む増幅反応緩衝液に添加した。 プライマーＥＳ１２は、以下の配列（配列番号４）： （ここで、Ｒは、ＡまたはＧを表し、および Ｓは、ＣまたはＧを表す。） を示す。 １回目の増幅サイクルに使用された同じプログラムで２回目の増幅を行った。 ５％ポリアタリルアミドゲルで増幅産物を分離し、臭化エチジウムにより染色し た。ＤＮＡ産物をゲルから単離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸 化し、そして平滑末端ライゲーションによりＰＵＣ１８ベクター中にクローン化 した。ＰｖｕＩＩ酵素を用いるプラスミドＤＮＡの消化によりクローンを同定し た。シーケナーゼ酵素キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）を使用 するジデオキシ鎖終止法による２本鎖ＤＮＡシーケンシングによりＤＮＡ挿入を 解析した。 この増幅は、各々２７０ｂｐおよび３２０ｂｐの２つの主要なＤＮＡ断片を生 じた。 実施例２ ｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング ＰＣＲ増幅から得られた断片をプラスミド中へクローン化し、シーケンシング した。ＤＮＡ配列により推定されたアミノ酸残基は、両方のＤＮＡ断片がステロ イドホルモンスーパーファミリーに属する真性で新規な受容体をコードし得たこ とを示した。完全なｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト骨肉腫ＳＡＯＳ−２／ Ｂ１０細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをするのに２７０ｂｐのＮＥ Ｒの増幅ｃＤＮＡ断片を使用した。全ての高度に陽性化されたクローンは同一で あり、増幅ＮＥＲ ＤＮＡ断片と適合する配列であった。 ヒトオリゴ−ｄＴｃＤＮＡライブラリーは、ランムダ・ライブラリアン・クロ ーニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用した骨肉腫ＳＡ ＯＳ−２／Ｂ１０細胞から単離された構築ＲＮＡであった。クローン化増幅産物 （ＮＥＲ） の［³²Ｐ］標識ＤＮＡプローブを用いたプラークスクリーニングにより、数種の 陽性クローンを同定した。ハイブリダイゼーション条件は、Ａ Ｓｃｈｍｉｄｔ ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：７４１１−７４１５（１９８４）に記載 されるとおりであった。ｃＤＮＡ挿入体を、クローニングベクターＰＵＣ１８の ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＤＮＡ配列データが利用できるようになった とき合成された１連のオリゴヌクレオチドを使用してジデオキシシーケンシング 法により両方の株の完全なＤＮＡ配列を決定した。ＮＥＲのクローニング ＥＳ１１およびＥＳ１５プライマーを用いてＳａｏｓ−２／Ｂ１０骨肉腫セル ラインのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡを増幅して、４０回目の増幅の後に多重 断片を得た。５パーセントの最初の増幅反応液を、ＥＳ１２およびＥＳ１５オリ ゴマーを用いてさらに３０回の増幅にかけた。ＥＳ１１を置換するプライマーＥ Ｓ１２は６ヌクレオチドより長く、そして３’末端で２つの保存フェニルアラニ ン残基をコードし、したがって増幅反応液に対し、さらなるレベルの特異性を導 く。２回目の増幅段階で、２つ以外の全てのＤＮＡ断片が排除された。２つの断 片、ｎｕｃ−Ｉ、３２０ｂｐ、およびＮｅｒ、２７０ｂｐをサブクローン化し、 シーケンシングした。シーケンス解析は、両方のＤＮＡ断片がステロイドホルモ ン受容体遺伝子の典型的なＤＮＡ結合ドメインと似ているが、公知の配列のいず れとも一致しないことを明らかにした。 驚くべきことに、その領域から誘導されたＥＳ１５プライマーの使用により推 定され得たとおり、２つの断片のうちのいずれもリガンド結合ドメインの配列を 含むものはなかった。その配列にわずか５３％の相同性を共有するか、５’ＥＳ １２オリゴマーが両方の方向で反応を開始させたことは後に分かった。 新規の推定上の核受容体ＮＥＲについての全長ｃＤＮＡクローンを得るために 、ＮＥＲ増幅ＤＮＡ断片を用いてＳａｏｓ−２／Ｂ１０細胞由来のｃＤＮＡライ ブラリーをスクリーニングした。数種のクローンを同定し、ｐＵＣ１８ベクター にクローン化した。最大のクローンの１つである２ｋｂのｎｕｃ−２−１０３を 十分に解析し、ヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を決定した。 ＮＥＲクローンのシーケンシングは、４６１のアミノ酸のポリペプチドをコー ドする長いオープンリーディングフレームを 明らかにした。推定されたタンパク質は、その構造の点で典型的なステロイド様 受容体に似ている。位置８７−１５４で、ＤＮＡ結合ドメインとして役割を果た すことが可能な推定上の「２重亜鉛フィンガー」構造を同定した。リガンド結合 ドメインを特徴づけるアミノ酸配列は、タンパク質のカルボキシル末端に向かっ て配置され、そして甲状腺またはレチノイン酸受容体でのように空間を占めた。 他の公知受容体配列と推定されたタンパク質の配列を比較すると、ＤＮＡ結合ド メインが５０−５６％相同性を全ステロイド様受容体と共有することを明らかに した。このドメインでの最高のスコアは、エステロゲン受容体については５６％ 、レチノイン酸ガンマー受容体およびミネラルコルチコイド受容体については５ ５％、およびレチノイン酸Ａおよびグルココルチコイド受容体については５４％ であった。ほとんど保存されないリガンド結合ドメインは、３つの型のレチノイ ン酸受容体であるＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγと３８−４０％、ビタミンＤ受 容体と３８％、そして甲状腺ホルモン受容体と３３％の最高の相同性レベルを示 した。このドメインでのエステロゲン、アンドロケン、グルココルチコイドおよ びミネラルコルチコイドのリガンド結合ドメインに対する相 同性は著しく低かった。ＲＸＲレチノイン酸受容体型Ｘは、このドメインで中間 値である２８％相同性を示した。 ＮＥＲのアミノ酸末端（アミノ酸１−８７）が高含量の１７個のプロリン残基 および１０個のセリンを含むことは注目にあたいする。 実施例３ ノーザンブロット分析 グアニジンチオシアネートを使用することにより、または塩酸グアニジン法に より、種々の組織または列記のセルライン由来のＲＮＡを作製した（ＧＧＡ Ｎ ｅｍｅｔｈら，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ １８３：３０１−３０４（１９８９） 。ＪＭＣｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４−５２ ９９（１９７９））。（ＫＭ Ｒｏｓｅｎら，Ｆｏｃｕｓ １２、２３−２４（ １９９０））により記載されたとおり、ホルムアルデヒドアガロースケル電気泳 動によって、ＲＮＡサンプルを分析した。Ｎ−ハイボンド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）にブロットすることによりＲＮＡを移し、（Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔら ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：７４１１−７４１５（１９８４）。ＫＭ Ｒｏｓｅｎら，Ｆｏｃｕｓ １２：２３−２４（１９９０））により記載されるとおり、ＮＥＲの³²Ｐ−標識 ｃＤＮＡでハイブリダイゼーションした。 総ＲＮＡをラットまたはヒヒの組織から抽出し、フリッシュら（１９８９）に より記載されたとおり常套の方法によるＮｅｒ−Ｔの³²Ｐ標識プローブを用いて 電気泳動およびブロットハイブリダイゼーションにかけた。 骨肉腫Ｓａｏｓ−２／Ｂ１０細胞由来のＲＮＡをＮＥＲ標識化ＤＮＡプローブ を用いて解析すると、およそ２．３ｋｂの一本鎖転写物が明らかになった。同様 のＲＮＡ転写物を試験された全てのセルラインで検出した。異種のものから単離 されたＲＮＡの間で、ｍＲＮＡ分子のサイズについてのばらつきは観察されなか った。ノーザンハイブリダイゼーションにより、ＮＥＲ遺伝子発現の組織分布を 調べた。試験された全てのラットの組織または細胞にＮＥＲ ＲＮＡ転写物を検 出した。成体ヒヒの組織から単離されたＲＮＡで同様の結果が得られた。 推定上の新規核受容体ＮＥＲの部分をコードする標識化増幅ＤＮＡを用いてＳ ａｏｓ−２／Ｂ１０ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすると、数種の陽性 ｃＤＮＡクローンを生じた。この陽性クローンの配列解析から、ＮＥＲ受容体に ついての予 測全長ｃＤＮＡクローンに加えて、ＤＮＡ配列が予測ＮＥＲの推定上の受容体と 異なっている２つのクローンを得た。ｐＥ１００１と称する１つのクローンの配 列は、公知レチノイン酸受容体型アルファー（ＲＡＲα）の配列と一致した（Ｇ ｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１、９１−９４頁、１９８７）。第２のク ローン（ｐＥ１００５）の配列解析は、新新規レチノイン酸受容体Ｘ（ＲＸＲα ）として公表し、特徴づけられた新規核受容体の特性を示した（Ｍａｎｇｅｌｓ ｄｏｒｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３４５、２２４−２２９頁、１９９０）。つまり、 これらの結果は、ＮＥＲ受容体のｃＤＮＡがステロイドホルモン核受容体の１種 の公知および新規な構成員を同定するためのアッセイの道具として利用できるこ とを表す。 実施例４ ＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲハイブリッド 受容体の活性化 ＮＥＲ受容体についての推定上のリガンドを同定するために、誘導可能なホル モンの応答可能なエレメントを含むレポーター遺伝子の転写を誘導するＮＥＲの 潜在力が試験された。数種の応答可能なエレメントである甲状腺／レチノイン酸 、エストロ ゲン、ビタミンＤおよびグルココルチコイド／プロゲステロンエレメントを試験 した。ＣＶ−１およびＬ細胞でのトランスフェクション実験は、ＣＡＴレポータ ー遺伝子のリガンド依存の導入はないことを示した。リガンドについての研究を 促進するために、ハイブリッド受容体を構築した。 リガンド依存性転写アッセイは以下に記載のとおりであった。 Ｓｃｈｍｉｄｔら，「ペルオキシソーム増殖因子および脂肪酸により活性化さ れるステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの新たな構成員の同定」、Ｍ ｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６（１０）：１６３４−４１、１９９２、および Ｂｏｉｅら，「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のエナンチオ選択的活性 化」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（８）：５５３０−４、１９９３で、Ｇ Ｒ／ｍＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＵＣキメラ受容体の構築について記載されている おとり同一の発現プラスミド背景で同様のハイブリッド受容体ＧＲ／ＮＥＲ、Ｇ Ｒ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲを実質的に作製した。 簡潔に言うと、ＤＮＡ結合ドメインを含むマウスのグルココルチコイド受容体 （ｍＧＲ）のアミノ末端部分を核受容体ＮＥＲ、ｈＮＵＣ−Ｉ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ら、１９９２）、ｍＰＰＡ Ｒ（ＩｓｓｅｎｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ、１９９０）の推定上のリガンド結合 ドメインに融合させて、予測のキメラ受容体ＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよび ＧＲ／ＰＰＡＲを形成した。ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲハイブリッド受 容体について記載されているとおり、ＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体を構築した（Ｓ ｃｈｍｉｄｔら、１９９２、およびＢｏｉｅら）。ＮＥＲ受容体のアミノ酸Ａｒ ｇ¹⁵⁶およびＧｌｕ¹⁵⁶をコードするｃＤＮＡ配列をＸｈｏ Ｉ制限部位に変換し 、それは、ＤＮＡ結合ドメインをコードしたＧＲ ｃＤＮＡ配列にライゲーショ ンするために後で使われた。その結果、ＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａｒｇ¹⁵⁶ およびＧｌｕ¹⁵⁶をアミノ酸残基Ｓｅｒ¹⁵⁵およびＨｉｓ¹⁵⁶で置換した。 ＳＶ４０基本発現ベタターの制御下で、ヒトＮＵＣＩ受容体（ｐＪ３ＮＵＣＩ ）のｃＤＮＡおよび天然型マウスグルココルチコイド受容体（ｐＳＶ２ＷＲＥＣ ）を発現させた（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９２。Ｂｏｉｅら，１９９３。）。レ ポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターに結合したグルココルチコイドホルモ ン応答エレメント（ＧＲＥ）の２つのタンデムリピート（反復配列）によりホタ ルのルシフェラーゼの発現を調節す るプラスミドｐＪＡ３５８だった（Ｂｏｉｅら，１９９３）。 記載のとおりＣＯＳおよびＣＶ１細胞の一過性トランスフェクションを行った （Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９２）。細胞を、活性炭処理した牛血清を補充した無フ ェノールレッド培地で１２穴の皿の中に載せた（１ｍＬに１．５×１０⁵）。次 の日に、リン酸カルシウム沈殿として、０．１２ｍＬのＤＮＡ（１０μｇ／ｍＬ ）（５μｇ受容体ＤＮＡおよび５μｇレポータープラスミド）をその細胞に加え た。トランスフェクション３０分後に、その細胞にリガンドを加えた。次の日（ １８時間）、その細胞を洗浄し、新たなリガンドを加えた。２４時間後、細胞抽 出物を作製し、ルシフェラーゼアッセイ系（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ウ ィスコンシン）を用いてルシフェラーゼ酵素活性についてアッセイした。３重に 各トランスフェクションを行い、オートクリニルマット（ＡｕｔｏＣｌｉｎｉｌ ｕｍａｔ）（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｎａｓｈｕａ、Ｎ．Ｈ．）を用い、２重に各サ ンプルのルシフェラーゼ活性を測定した。 トランスフェクトされた細胞を、ＴＯＦＡを、２μＭ、１０μＭ、２０μＭお よび５０μＭで、オレイン酸を５０μＭ、および３００μＭで処理した。その結 果を以下の表１に表す。 ＴＯＦＡは、用量依存的にＧＲ／ＮＵＣ、ＧＲ／ＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＥＲ ハイブリッド受容体により仲介される発現を刺激する。ＴＯＦＡと対照的に、リ ガンドＷｙ１４６４３およびオレイン酸は、それらの予測される受容体の特異性 を維持し、ＧＲ／ＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＵＣにより仲介される発現を活性化し たが、ＧＲ／ＮＥＲキメラにより仲介されるものは活性化しなかった。しかし、 ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびグルココルチコイド受容体と 相互作用しない天然型ＮＵＣＩの同時インフェクション後に、ＴＯＦＡは、ＭＭ Ｔ Ｖ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を刺激しないので、転写の一般的刺 激因子としては作用しなかった。ＴＯＦＡがＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポータ ー遺伝子でのみ、またはその発現がＳＶ４０のプロモーターの制御下にあるレポ ーター遺伝子でのみインフェクトされた細胞でのルシフェラーゼの発現を刺激し ないという事実により、ＴＯＦＡの特異的作用がさらに示された。 実施例５ 脂肪酸阻害剤によるＧＲ／ＰＰＡＲの活性化 実施例４に記載されるとおり、ＣＯＳ細胞中でＧＲ／ＰＰＡＲにより仲介され るリガンド転写アッセイを行った。ＴＯＦＡおよびセルレニンを用いて０．１、 １、１０および１００μＭで細胞を処理した。１０μＭ以上のセルレニンの濃度 では細胞に毒性を示した。 最初にＴＯＦＡは脂肪酸合成の阻害因子として開発された（パーカーら、１９ ７７）。その後、ＴＯＦＡと構造的に関係のない脂肪酸合成の阻害因子であるセ ルレニンが、ＴＯＦＡにより誘導された転写の活性化性状をまねることができる かかどうかを試験した。脂肪酸合成を阻害する濃度で、セルレニンは ＧＲ／ＰＰＡＲにより仲介された転写を刺激しなかった。これらの結果は、脂肪 酸合成の阻害自体が、この受容体ファミリーに対するＴＯＦＡの作用に起因して いないようであることを示唆する。 結果を以下の表２に表す。 実施例６ ＣＶ１細胞内でのドーパミンおよびＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲの活性化 ＴＯＦＡが、ＰＰＡＲファミリー（ＮＵＣ−１およびＰＰＡＲ）および関連の ないＮＥＲ受容体の構成員のリガンド結合ド メインによって仲介された転写を活性化することが分かった。その後、ＣＶ１細 胞内のこれらの受容体により仲介された転写を刺激して生じるドーパミンとＣＯ ＵＰ−ＴＦおよびプロゲステロン受容体との相互作用（Ｐｏｗｅｒら，１９９１ 、１９９１、１９９２）に類似するリガンド非依存的様式で、ＴＯＦＡが、これ らの受容体と間接的に相互作用できる可能性がある。したがって、ｃＡＭＰレベ ルの上昇をドーパミンでの処理に対する応答を得ることにより測定すると同様に して、機能性ドーパミンＤ１受容体を発現するＣＶ１細胞内でＴＯＦＡおよびド ーパミンによるＧＲ／ＮＥＲの活性化を試験した。ＴＯＦＡはＣＶ１細胞中のＧ Ｒ／ＮＥＲキメラによって仲介されたルシフエラーゼの発現を刺激した。 実施例４に記載されるとおり、ＣＯＳ細胞の代わりにＣＶ１細胞を使用してリ ガンド依存性転写アッセイを行った。トランスフェクトされたＣＶ１細胞を、指 示さた濃度で、ドーパミン、ＴＯＦＡで、またはＴＯＦＡおよびドーパミンの組 合せで処理し、ルシフェラーゼ活性について試験した。 結果を以下の表３に表す。結果は、ＣＯＵＰ−ＴＦおよびプロゲステロン受容 体での作用から予測されるとおり、ドーパミ ンがＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を刺激しなかったことを示す。対照的に 、ドーパミンがＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体により仲介される転写を抑制したこと が分かる。さらに、それは、ＴＯＦＡにより転写の刺激を部分的に阻害した。Ｇ Ｒ／ＮＥＲが、有為なレベルのドーパミンＤ１受容体を発現しないＣＯＳ−７細 胞にトランスフェクトされたときは、この抑制は見られなかった。これらの結果 は、ドーパミン受容体シグナル伝達経路およびＮＥＲ受容体経路の間に雑音があ ることを示す。 実施例７ ＣＯＳ−７細胞でのドーパミンおよびＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲの活性化 実施例４に記載のとおり、リガンド依存性転写アッセイを行った。トランスフ ェクトされたＣＯＳ細胞をドーパミン、ＴＯＦＡで、またはＴＯＦＡおよびドー パミンの組合せで、指示された濃度で処理して、ルシフェラーゼ活性について試 験した。 結果を以下の表４に表す。 実施例８ ＧＲ／ＮＥＲでのルシフェラーゼ発現の活性化の際のドーパミンＤ１受容体アン タゴニストＳＣＨ２３３９０の作用 ドーパミンによるルシフェラーゼ発現の抑制をさらに特徴づけるために、Ｄ１ ドーパミン受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０が、ドーパミンにより誘導さ れた抑制を妨げるかどうかを試験した。実施例４に記載されるおとり、ＭＭＴＶ −ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＪＡ３５８）およびＧＲ／ＮＥＲキメラ 受容体を用いてＣＶＩ細胞を同時インフェクトした。ドーパミンＤ１受容体アン タゴニストＳＣＨ２３３９０の量を増加させなから、５０μＭドーパミンを用い て、または用いずに細胞を処理した。 以下の表５に示される結果は、ＳＣＨ２３３９０を用いた処理がドーパミンに より起こったルシフェラーゼ発現の阻害を逆転できることを示す。さらに、Ｄ１ ドーパミンアンタゴニストＳＣＨ２３３９０は、ＧＲ／ＮＥＲにより仲介された 転写を刺激した。さらにこれは、ＮＥＲ受容体およびドーパミン受容体シグナル 伝達経路の間の潜在的相互作用を確認する。 実施例９ ＴＯＦＡによるＰＣ１２細胞の神経突起の分化の刺激 神経系でのＴＯＦＡの影響をさらに研究するために、ＰＣ１２細胞の分化にお けるＴＯＦＡの作用を試験した。９５％の空気と５％ＣＯ₂の水で飽和した雰囲 気で、３７℃で一夜かけて１０％ウマ血清、５％子牛血清、５０ｇ／ｍＬストレ プトマイシン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンを補充したＲＰＭＩ培地中のコラーゲン 被覆プレートまたは皿上に、およそ１００−２００／ｍｍ²の密度で、ＰＣ１２ 細胞をプレートに載せた。１．５％血清、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含有する 新たなＲＰＭ^Iに 培地を取り替えて、指示された濃度のＴＯＦＡまたは等量のビヒクル（ＤＭＳＯ ）を最終濃度０．１％ＤＭＳＯにした。 処理の間の異なる時点で、細胞を写真撮影するかまたは１０％ホルマリンで固 定した。ＴＯＦＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理して４日後、形態を調べた 。バイオクアントイメージングシステムの助けをかりて神経突起を有する細胞の 数、および神経突起の平均長さを測定した。ＴＯＦＡでの処理のみでは、ＰＣ１ ２細胞での神経突起の成長を誘導しなかった（データは示されず）。しかし、以 下の表６に示されるとおり、ＮＧＦだけでも、神経突起を有する細胞の数で１５ ％の増加を誘導し、これらの成長は２０μｍの平均長に達した。ＮＧＦおよびＴ ＯＦＡで処理すると、神経突起を有する細胞の含有率は７８％に増加した。１０ μＭ ＴＯＦＡの濃度で、最大の神経突起生成が観察された。ＴＯＦＡの追加は 、用量関連的に発達した神経突起の長さをも増加させた。 ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）または種々の濃度のＴＯＦＡで、１００ｎｇ／ ｍＬ ＮＧＦの存在下で、４日間細胞を処理し、その後、１０％ホルマリンで固 定した。８つの穴から得た少なくとも８０の細胞を各グループについて解析した 。結果を平均値±ＳＥＭとして示した。^aｐ＜０．０１対ダネット試験によるビ ヒクル。 実施例１０ ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト（ＳＣＨ２３３９０）誘導カタレプシーに 対するＴＯＦＡの作用 ０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）で、ラットを前処理し た。２４時間後、ドーパミンＤ１アンタゴニ ストであるＳＣＨ２３３９０ ０．５ｍｇ／ｋｇでラットを試験し、そしてカタ レプシーの持続期間（duration）を観察した。 改変したバー法により、カタレプシーを測定した（ＵｎｄｉｅおよびＦｒｉｅ ｄｍａｎ、１９８８）。直径１．１ｃｍ、長さ５０ｃｍのスチール製バーを、可 動表面の１０ｃｍ上の高さに吊るした。そのバーの周りの台の３面を茶色の厚紙 で仕切り、台の表面上のライニングは、厚紙壁と同じ色であるように選択された 。動物の後脚を台の上に自由に載せ、尾を後ろに垂らし、そして前脚をバーの上 に載せた。ラットがバーの上にいた時間の長さを記録して、現在の打ち切り時点 １２０ｓまで記録した。以下の行動：（１）台の上に２つの前脚を載せたまま動 物が逃げた、（２）動物が両方の後脚でバーの上に登るかまたは越えた、（３） 動物がバーにそってまたはの周りでの動きを始めたかのいずれかが観察されれば 、時間を数えた。続いて、各々がバーに５ｓ首尾よく終えるのを１のスコアであ るとして、時間の読みをスコアに移した。各観察時で、１群の動物全てについて のカタレプシースコアを平均し、その観察時間でのその群の平均スコアを得た。 さらに、全ての観察時での各動物についてのスコアを加えてその動物についての 総スコアを得た。この最 後の群の数の平均は、群の平均総スコアと称された。 Ｗｉｎｅｒ Ｂ．Ｊ．：、実験的設計での統計則（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ）によ り概説された統計的手段に従ってコンピュータによりカタレプシースコアを解析 した。ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１０−４２８頁、１９７１ 。一般的に、付与された一対較について、処理群の間の差異を検出するための２ つの尾のダネットまたはスチューデントのｔ試験により行われる適切な解析で観 察にかけた。 データを以下の表７に示す。 上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がＳＣＨ２３３９０で誘導されたカタ レプシーの持続期間を少なくとも２５倍まで 明らかに増加させたことを示す。 実施例１１ ムスカリン様受容体作動薬（ピロカルピン）誘導カタレプシーに対するＴＯＦＡ の作用 ０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）でラットを前処理した 。２４時間後、ムスカリン様コリン作動性受容体の作動薬であるピロカルピン１ ６ｍｇ／ｋｇ でラットを試験し、実施例１１に記載されるとおりにカタレプシ ーの持続期間を観察した。 データを以下の表８に示す。 上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がピロカルピンで誘導されたカタレプ シーの持続期間を３倍まで明らかに増加させたことを示す。 実施例１２ ドーパミンＤ２受容体アンタゴニスト（ハロペリドール）薬誘導カタレプシーに 対するＴＯＦＡの作用 ０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）でラットを前処理した 。２４時間後、ドーパミンＤ２受容体のアンタゴニストであるハロペリドール０ ．１ｍｇ／ｋｇでラットを試験し、実施例１０に記載されるとおりにカタレプシ ーの持続期間を観察した。 データを以下の表９に示す。 上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がハロペリドールで誘導されたカタレ プシーの持続期間を有意には増加させなかったことを示す。 上述の明細書は、例示する目的で提供された実施例とともに本発明の範囲を教 示するものであるが、本発明の実施は、以下の請求の範囲およびその均等物の範 囲内で、ここに記載された手段およびプロトコールの通常の変形、一致、変更、 欠失、または追加の全てを包含することが理解されるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ ，ＵＺ (72)発明者 フリードマン，イータン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19129、 フイラデルフイア、クイーン・レイン・ 2900 (72)発明者 ハロウエイ，エム・キヤサリン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ロダン，ギデオン・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 シユミツト，アズリエル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ボーゲル，ロバート・エル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物を投与することよりなるＧタンパク結合 受容体の調節因子の活性を増強する方法。 ２． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、Ｇタンパク結合受容体との固有活性 を有しない請求項１に記載の方法。 ３． Ｇタンパク結合受容体が、（ａ）ドーパミンＤ１受容体、および（ｂ）ム スカリン様受容体から選択される請求項１に記載の方法。 ４． Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニス トである請求項３に記載の方法。 ５． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストが、ＳＣＨ２３３９０： である請求項４に記載の方法。 ６． Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ムスカリン様受容 体作動薬である請求項３に記載の方法。 ７． ムスカリン様受容体作動薬が、ピロカルピン、メタコリン、カルバコール 、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリンから選択される請求項６に 記載の方法。 ８． ムスカリン様受容体作動薬が、ピロカルピンである請求項７に記載の方法 。 ９． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２− フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項１に記載の方法。 １０． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物を投与することよりなる神経成長因子 ＮＧＦの作用を増強する方法。 １１． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項１０に記載の方法。 １２． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物を投与することよりなるアルツハイマ ー疾患を治療する方法。 １３． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項１２に記載の方法。 １４． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物およびドーパミンＤ１受容体アンタゴ ニストを投与することよりなる請求項１２に記載のアルツハイマー疾患を治療す る方法。 １５． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストがＳＣＨ２３３９０： である請求項１４に記載のアルツハイマー疾患を治療する方法。 １６． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト、およびＮＥＲ受容体を活性化す る化合物の量を増強するドーパミンＤ１受容体を投与することよりなる運動不全 を治療する方法。 １７． 運動不全が、失調症、遅発性ジスキネジア、およびジル・ド・ラ・テュ ーレット症候群から選択される請求項１６に記載の方法。 １８． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストがＳＣＨ２３３９０： である請求項１６に記載の方法。 １９． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項１６に記載の方法。 ２０． ５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸の量を増強しなが ら、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストおよびドーパミンＤ１受容体を使用す ることよりなる精神病を治療する方法。 ２１． 精神病が精神分裂病である請求項２０に記載の方法。 ２２． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストが、ＳＣＨ２３３９０： である請求項２０に記載の方法。 ２３． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項２０に記載の方法。 ２４． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト、およびＮＥＲ受容体を活性化す る化合物の量を増強するドーパミンＤ１受容体を使用することよりなる悪心を治 療する方法。 ２５． ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストが、ＳＣＨ２３３９０： である請求項２４に記載の方法。 ２６． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項２４に記載の方法。 ２７． ドーパミンＤ１受容体作動薬、およびＮＥＲ受容体を活性化する化合物 の量を増強するムスカリン様受容体を使用することよりなる高眼圧症を治療する 方法。 ２８． ムスカリン様受容体作動薬が、ピロカルピン、メタコリン、カルバコー ル、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリンから選択される請求項２ ７に記載の方法。 ２９． ムスカリン様受容体作動薬が、ピロカルピンである請求項２８に記載の 方法。 ３０． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項２７に記載の方法。 ３１． Ｇ蛋白質増強量の、ＮＥＲ受容体を活性化する化合物および薬学上許容 しうる担体を含有する医薬組成物。 ３２． Ｇ蛋白質増強量の、ＮＥＲ受容体を活性化する化合物と、薬学上許容し うる担体と、Ｇタンパク結合受容体の調節因 子とを含有する請求項３１に記載の医薬組成物。 ３３． ＮＥＲ受容体を活性化する化合物が、５−（テトラデシルオキシ）−２ −フランカルボン酸： または薬学上許容しうるその塩またはエステルである請求項３２に記載の医薬組 成物。 ３４． Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、（ａ）ドーパミンＤ１受容体アン タゴニスト、および（ｂ）ムスカリン様受容体作動薬から選択される請求項３３ に記載の医薬組成物。 ３５． Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニ ストＳＣＨ２３３９０： である請求項３４に記載の医薬組成物。 ３６． Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ピロカルピン、 メタコリン、カルバコール、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリン から選択されるムスカリン様受容体作動薬である請求項３４に記載の医薬組成物 。 ３７． ムスカリン様受容体作動薬が、ピロカルピンである請求項３６に記載の 医薬組成物。