JPH09504435A

JPH09504435A - ウシウイルス性下痢ウイルス（ｂｖｄｖ）抗原を有するウイルスベクター

Info

Publication number: JPH09504435A
Application number: JP7513263A
Authority: JP
Inventors: ハーネス，エリザベス・ジェイ; ワドリー，リチャード・シイ
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-10-31
Publication date: 1997-05-06
Also published as: NZ276234A; WO1995012682A2; EP0725831A1; AU688819B2; CA2172815A1; WO1995012682A3; MXPA94008605A; KR960705944A; AU1042395A; CN1134175A

Abstract

(57)【要約】本発明はウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）およびその治療のためのワクチンの分野に関連する。本発明は、ＢＶＤＶ抗原の発現のための、ウイルス、ワクチンおよびベクターとしての、生の弱毒化したウシ・ヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）の調製を記載する。糖タンパク質ｇｐ５３に対応する配列を含むＢＶＤＶｃＤＮＡクローンは、不活性化されたＢＨＶ−１ウイルスに挿入される。

Description

【発明の詳細な説明】ウシウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)抗原を有するウイルスベクター発明の背景発明の分野本発明はウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）およびその治療のためのワクチンに関する。情報の開示ファン・ジジ，エム(van Ziji，M.)ら、豚コレラ・ウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１を発現する、弱毒化生偽狂犬病ウイルスは、豚を、偽狂犬病および豚コレラの両方に対して保護する(Live Attenuated Pseudorabies Virus Expr essing Envelope Glycoprotein El of Hog Cholera Virus Protects Swineagain st both Pseudorabies and Hog Cholera)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(Jo urnal of Virology)、第６５巻、第５号、２７６４−２９６５（１９９１）。米国特許第４,７０３,０１１号、キット・エム(Kit M.)およびキット・エス(Kit S .)ウシ・ヘルペスウイルス−１のチミジンキナーゼ欠失変異体(Thymidine Kinas e Deletion Mutants of Bovine Herpesvirus-1)、１９８７年１０月２７日発行）、米国特許第４,８２４,６６７号、キット，エム．(Kit，M.)およびキット，エス.(Kit S.)、ウシ・ヘルペスウイルス−１のチミジンキナーゼ欠失変異体、それを含む感染性ウシ・鼻気管炎に対するワクチンおよびその産生ならびにその使用(Thymidine Kinase Deletion Mutants of Bovine Herpesvirus-1，Vaccines Against Infectious Bovine Rhinotracheitis Containing Same and Methods f or the Production and Use of Same)ら、１９８９年４月２５日発行。コレット，エム・エス(Colltt，M．S.)ら、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスによってコードされるタンパク質：ペスチウイルスのゲノミック・オルガナイゼーション(Pro teins Encoded by Bovine Viral Diarrhea Virus: The Genomic Organization of a Pestivirus)、バイロロジー(Virology) 、第１６５巻２００−２０８（１９８８）。コレット，エム・エス（Collett，M ．S.)ら、ペスチウイルスウシウイルス性下痢ウイルスの分子クローニングおよび塩基配列決定(Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the Pestviru s Bovine Viral Diarrhea Virus)、バイロロジー(Virology)、１６５巻、１９１ −１９９（１９８８）。背景ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)は、フラビウイルス(Flaviviridae)科に属するペスチウイルスである。これはヒツジ、ヤギ、およびとりわけウシにおいて多数の異なる疾患を引き起こす。症状は動物の年令、生理学上およびウイルス学上の状態に依存する。若い感受性の子ウシおよび若い成獣においては、これは、高い疾病率と低い死亡率によって特徴付けられる病気を引き起こす。症状は、熱、憂鬱、目と鼻の排出物、下痢および場合によっては口の潰瘍も含めてよい。これらの主な影響の他に、ウイルスはまた免疫抑制も引き起こす。一次的なＢＶＤＶ感染は通常比較的穏やかであるが、ウイルスは他の共に感染する微生物の病原性を静めるかあるいは増強する。より年取ったまたは感受性の動物においては、ＢＶＤＶは、より若い感受性の子ウシについて上記で記載されたものと類似の症状を引き起こす。加えて、妊娠した動物においては、ウイルスは子宮を越えて胎児に感染する能力を有する。この感染の結果は、胎児の年令および、免疫系が十分に完全である期であるかどうかに依存する。起こり得る感染の結果は、胎児の再吸収、流産、ミイラ化、先天的欠失、誕生時欠失、ＢＶＤＶがしつこく感染した子ウシおよび完全に正常な子ウシである。ＢＶＤＶがしつこく感染した子ウシは、このＢＶＤＶ病原性複合体の最も重要なセグメントを表す。しつこく感染した動物は、大量のウイルスを環境に落とし、これは感受性の動物を感染することができる。さらに、しつこく感染した動物は、子宮内でそれらに感染するウイルスに免疫寛容であるけれども、他の密接に感染するＢＶＤＶ生物型で感染させた場合、病気があらわれる。これらの感染は、低い疾病率によって特徴付けられ（なぜなら比較して言えば、ＢＶＤＶにしつこく感染した正常な子ウシを産生するような、妊娠のまさにその時期に感染した妊娠した動物は多くないであろうからである）、しかし高い生存率である。この病気の症状は粘膜病として公知であり、しばしば、大量の鮮血を含む水のような下痢から死ぬきわめて急性の状態として現れる。このウイルスの重要性およびウシの集団中に広く存在していることは、ＢＶＤＶ感染を防ごうとする試みにおける多くのワクチンの開発に結びついてきた。これらのワクチンは、不活化または弱毒化の伝統的な概念の上に立ってきたが、ＢＶＤＶのふるまいのために、それらは多くの顕著な欠点を有する。不活化したワクチン調製物は弱毒化生ワクチンほどは有効でないことは一般的に受け入れられる。不活化ワクチン調製物からの不活化抗体は外因性プロセッシングを受ける。動物への注入後、抗体は動物の可溶化タンパク質環境の一部となる。抗原は細胞飲作用機構により抗原提示細胞に入り、これはたいてい抗体を産生する。不運にも、抗体は細胞に入れないので、ふつう、ただ、成熟したウイルスが細胞から放出される際にウイルスの生活環を阻害するのみである。他方で、細胞内部で複製する生きたウイルスからの抗原は、内因性プロセッシングを受け、この機構により好ましい細胞媒介免疫応答がなされる。細胞媒介免疫応答はウイルスに感染した細胞を認識し、ウイルスの生活環を最も早い時期で阻害する能力を有する。細胞媒介応答は従って多くのウイルス感染への免疫学的欠失において非常に重要であると考えられている。細胞媒介反応のために、ワクチンのごとき弱毒化生産物はよい細胞媒介反応を誘導するはずである。ＢＶＤＶについては、生ワクチンを産生するためのウイルスの弱毒化は、ウイルスが野外単離株に普通関連する免疫抑制を引き起こすのを常に予防できるわけではない。ロス・ジェイ・エイ(Ross J．A.)およびカエバーレ・エム・エル(Kaeberle M．L.)、ＡＣＴＨ投与有無でのウシ・ウイルス性下痢ウイルスのワクチン株によって誘導される好中球およびリンパ球機能の抑制(Sup pression of Neutrophil and Lymphocyte Function Induced by a Vaccinal Str ain of Bovine Viral Diarrhea Virus With or Without the Administration of ACTH)、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベターナリ・リサーチ(American Journal of Veterinary Research)、第４４巻、２３６６−２３７２（１９８３）。ワクチンの免疫抑制反応停止の失敗は、ワクチンにとって深刻な欠点となる。動物の飼い主は、病気から保護するために動物にワクチンを注射するが、ワクチンの特性から、飼い主は動物を苦しめる他の病気への機会を提供する。このことによって、飼い主は、不活性化されたＢＶＤＶワクチンを使用せざるを得ず、これは、免疫系が作用する方法が、特に有効というわけではないからである。要約すれば、不活化ワクチンは安全であるが、特に有効であるわけではない一方で、弱毒化生ワクチンはより有効であるが、ある条件下ではあまり安全ではない。本発明は、弱毒化生ワクチンの有効性と、不活化ワクチンの安全性を合する。ウシ・ヘルペスウイルス１型（BHV-1）は、呼吸器の病気を起こす、もう一個のおもなウシの病原体である。従って、ＢＶＤＶと同様に、ＢＨＶ−１も粘膜表面において複製する。本発明者らは、ＢＶＤＶウイルスの主な糖タンパク質であるｇｐ５３をコードする遺伝子を採り、これに対して宿主は実質的な免疫反応を起こし、それをウシ・ヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）中で発現し、この組換えウイルス（ＢＨＶ／ＢＶＤＶｇｐ５３）は、ＢＶＤＶに対するワクチンとして用いられる。ドニス，アール・オー(Donis，R．O.)およびドゥボビ,イー・ジェイ(Dubovi，E．J.)、感染したウシ細胞中のウシ・ウイルス性下痢粘膜病ウイルス糖タンパク質(Glycoproteins of Bovine Viral Diarrhoea Mucosal Disease V irus in Infected Bovine Cells)、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー (Journal of General Virology)、第６巻、１６０７−１６１６(１９８７)およびマガー，アール(Magar，R.)ら、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスタンパク質：細胞病原性および細胞非病原性株の不均一性および５３Ｋ糖タンパク質中性化エピトープの証拠(Heterogeneity of Cytopathogenic and Noncytopathogenic S trains and Evidence of 53K Glycoprotein Neutralization Epitope)、ベテラネリー・マィクロバイオロジー(Veterinary Microbiology)、第１６巻、３０３ −３１４。引用した文献を本明細書の一部とする。発明の要約ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）によって引き起こされる病気を予防するための、複製する非病原性ウイルスであって、該複製非病原性ウイルスは：ＢＶＤＶウイルスから得た遺伝子または遺伝子の組み合わせであり、該複製非病原性ウイルスは機能的に該遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現する。発明の具体例は以下のものを含む：複製非病原性ウイルスが弱毒化されるウイルスは、弱毒化ウシ・ヘルペスウイルス１型(BHV-1)、弱毒化アデノウイルス、弱毒化ウシ・乳頭炎ウイルス、弱毒化ウシ・乳頭腫ウイルス、または弱毒化偽狂犬病ウイルスから選択される。該複製非病原性ウイルスであるウイルスは弱毒化され、以下の遺伝子：ｇｐ４８、ｇｐ２５、ｐ１４キャプシドタンパク質、ｐ２０Ｎ −末端プロテアーゼおよびｐ１２５／ｐ８０タンパク質のあらゆる組み合わせを含み、発現する。弱毒化されているウイルスは、チミジンキナーゼ(ｔｋ)遺伝子を機能のないものにすることによって作り出した。該ウシ・ヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）中のｇｐ５３をコードする遺伝子または遺伝子の組み合わせに先行して、シグナルペプチドが挿入されているウイルス。ｇｐ５３をコードする遺伝子が、不活性化したチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子部位に挿入されたウイルス。無傷ウイルスＤＮＡの組換プラスミドからなり、該プラスミドが、ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含み、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の欠失を含むＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失中に挿入したプロモーター／ポリアデニル化シグナル、ｃ）ｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせに先行するシグナルペプチド遺伝子配列であって、その全てがプロモーターおよびポリアデニル化シグナル間に挿入されているものからなる、ウイルスを作製するのに使用する機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせであるウイルス。プラスミドが、プラスミドｐＨＡＳ４の特性を有するプラスミドから作製されるウイルス。シグナルペプチド遺伝子配列が、ここに引用して本明細書の一部とするペルマン，デイ(Perman，D .)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J．Mol．Biol.)第１６７巻、３９１−４０９（１９８３）に見いだされるシグナルペプチド配列によってよく特徴付けられた３９の実施例のいずれかのごとき、よく特徴付けられたシグナルペプチド配列のいずれかから採られたウイルス。該シグナルペプチド遺伝子配列が、偽狂犬病ウィルスｇIII遺伝子（ＰＲＶ）および／またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のいずれかから選択されるウイルス。プラスミドが、以下のプラスミド、ａ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３；ｂ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３；ｃ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ− ３：：ＢＧＨ／ｐ５３；またはｄ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇ／ｐ５３から選択されるウイルス。以下のウイルス、Ｔ１１−３、Ｔ１１−６、またはＴ１１− ８のいずれかから選択される、機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせの産物を産生するウィルス。プラスミドが：ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含むＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片であって。チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に欠失を有するもの、ｂ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失中のプロモーター／ポリアデニル化シグナル、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル中に挿入されたｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせ。プラスミドがｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３であるウイルス。以下のウイルス、Ｔ２−３＃３またはＴ２−２＃５のいずれか１つより選択されるウイルス。本明細書中に記載したウイルスの医薬上有効量および担体からなる、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス(BVD V)によって引きおこされる病気を予防するためのワクチン。上記記載のウイルスの医薬上有効量および担体からなる、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）によって引き起こされる病気を予防するためのワクチンであって、該担体はＢＨＶに対する抗体を含まない２.５ないし１５％の血清を含有する、生理学的に緩衝された媒体、すなわちｐＨ７.０ないしｐＨ７.４のものからなるワクチン。動物に、本明細書に記載されるウイルスまたはワクチンの医薬上有効量を投与することからなる、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）によって引き起こされる感染性病気に対し、動物を免疫する方法。ａ）ＢＶＤＶを引き起こす機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせの単離、ｂ）複製する非病原性ウイルスへの該遺伝子または遺伝子の組み合わせの挿入、ｃ）該遺伝子または遺伝子の組み合わせの産物を機能的に発現する生きたウイルスの選択：からなることを特徴とするウイルスの調製方法。プラスミドが、ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を有し、チミジンキナーゼ遺伝子に欠失がある、ＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）該プラスミドのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の欠失部分に、プロモーター／ポリアデニル化シグナルを挿入すること、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間にｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせを挿入すること、ｄ）生きたウイルスに挿入された、該機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを含む組換えウイルスであって、たいていの宿主において免疫抑制を起こさず、該機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現するものを産生するために、該プラスミドで細胞を感染させること：からなる、無傷ウイルスＤＮＡでプラスミドを組換えることからなる方法によって、ウイルスを作製するための、機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせが作られる、本明細書記載のウイルスの調製方法。プラスミドが、ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を有し、チミジンキナーゼ遺伝子に欠失がある、ＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）該プラスミドのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子への欠失部分に、プロモーター／ポリアデニル化シグナルを挿入すること、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間にシグナルペプチド遺伝子配列によって先行されるｇｐ５３または遺伝子の組み合わせを挿入すること、ｄ）生きたウイルスに挿入された、該機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを含む組換えウイルスであって、たいていの宿主において免疫抑制を起こさず、該機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現するものを産生するために、該プラスミドで細胞を感染させること：からなる、無傷ウイルスＤＮＡでのプラスミドの組換え方法によって、ウイルスを作製するための、機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせが作られる、本明細書記載のウイルスの調製方法。図面の簡単な説明図１外来遺伝子をＢＨＶ−１に挿入するシャトルベクターの構築。図２シグナルペプチド配列をＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子に付加するストラテジー。図３ｇｐ５３をＢＨＶ−１に挿入するための、５のシャトルプラスミドのマップ。ａ．実施例１：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３ｂ．実施例２：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３ｃ．実施例３：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３ｄ．実施例４：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ＢＧＨ／ｐ５３ｅ．実施例５：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII／ｐ５３図４ＢＨＶ−１／ｇｐ５３組換えウイルスの予想された転写マップ図５ＢＨＶ−１組換え体におけるｇｐ５３メッセンジャーＲＮＡの転写を示すノーザン・ブロット。図６ＢＨＶ−１組換え体中のｇｐ５３タンパク質の発現を示す免疫沈降。好ましい具体例の記述以下に使用される全ての単語は、当業者によって容易に理解されるであろう。多くの場合に、装置または試薬の製造者の名前は、その装置または試薬の名をあげた後の括弧内にあげられる。「プラスミド」、「クレノウ断片」、「再び連結した平滑末端」、「トリス」、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのごときキレート緩衝液のごとき試薬および緩衝液、および通常使用するクロマトグラフィーカラムのような通常使用する用語には、さらなる説明なしに言及する。本発明にて使用される化合物の構築の記載において、標準的な分子生物学的手法が使用され、本明細書中に記載されるごとく手短に名付けられる。これらの手法の詳細な説明は、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトーリ・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」（１９８９）、サンブルック (Sambrook)ら、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク (New York)または「カーラント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)」(１９９１)、オースベル，エフ・エム(Aurubel，F．M.)ら、編、ワイリー・インターサイエンス (Wiley Interscience)、ニューヨーク(New York)のごとき標準的ラボラトーリ・マニュアルに見いだすことができる。本発明は、弱毒化した生ワクチンの有効性を不活ワクチンの安全性と結び付けるものである。本発明者らは、ＢＶＤＶウイルスの主な糖タンパク質である、ｇｐ５３をコードする遺伝子をとり、これに対して宿主は実質的な免疫反応を起こし、これをウシ・ヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ）中で発現させ、この組換えウイルス（ＢＨＶ／ＢＶＤＶｇｐ５３）を、ＢＶＤＶに対するワクチンとして用いる。ウシ・ヘルペスウイルス（ＢＨＶ）は、呼吸器の病気を引き起こすもう１個のウシの主な病原体である。従って、ＢＶＤＶと共通して、ＢＨＶもまた粘膜の表面で複製する。ＢＶＤＶについては、複製は、主に腸粘膜界面で起こり、呼吸器界面では起こらない。ＢＨＶについては、優勢なのは呼吸器界面である。通常の粘膜免疫系は、１の界面で引き起こされる免疫反応は他の界面においても有効であるであろうことを確実とする。従って、本発明の組換えウイルス、ＢＨＶ／ＢＶＤＶｇｐ５３は、ウシ、ヒツジまたはヤギに、好ましくは鼻腔内経路を介して、投与する場合には、呼吸器粘膜にて複製し、免疫反応を起こす。ＢＨＶでのＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子の発現前に、チミジンキナーゼを、ウイルスを弱毒化することで公知の方法を用いて、ＢＨＶウイルスから除去した。ＢＨＶ、すなわち生で弱毒化したウイルスは、複製して細胞媒介反応を引き起こす。複製方法の一部として、ＢＶＤＶｇｐ５３は発現し、ウイルスが細胞内部にあるので、組換えウイルスのＢＶＤＶｇｐ５３部分の細胞媒介反応の正しいプロセッシングも起こる。最も重要なことには、この反応は、ＢＶＤＶウイルスの一部のみが存在する場合に、免疫抑制の起こり得る副作用の有無にかかわらず起こり得る。従って、本発明は、ＢＶＤＶの弱毒化生ウイルスワクチンの効率と不活化した調製物の安全性を合せる。方法の節中の実施例は本発明の範囲を限定するよう意図されたものでは決してない。全ての培地および緩衝溶液は、他に示されなければガラスで蒸留した水で調製された。組成物および投与−本発明のワクチンの医薬上有効量は、ウシ、ヒツジおよびヤキのごとき動物において、ＢＨＶ−１およびＢＶＤＶに対するワクチンとして、医薬上許容される担体または希釈剤と共に使用することができる。本発明において有用な、医薬上許容される担体または希釈剤の例は、ＢＨＶに対する抗体を含有しない、すなわち、ＢＨＶに血液反応陰性の、２.５ないし１５％血清を含有する、いかなる生理学的緩衝媒体、すなわち、約ｐＨ７.０ないしｐＨ７.４であるものも含む。ガンマグロブリンを含まない血清は、ガンマグロブリンを含む血清よりも好ましい。本発明中で使用される血清の例は、ウシ胎児血清、子羊血清、ウマ血清、ブタ血清、およびヤギ血清である。約０.５ないし約３.０％の量でのブタ・アルブミンまたはウシ血清アルブミン（以後「ＢＳＡ」）のごとき血清アルブミンを、血清の基質として用いることができる。しかしながら、ワクチン接種した動物におけるアレルギー反応を誘導するような担体または希釈剤内での外来タンパク質の使用は避けたほうが望ましい。ウイルスは、リン酸緩衝液、グルタメート、カシトン、およびシュークロースまたはソルボースを含有しているか、あるいはリン酸緩衝液、ラクトース、デキストランおよびグルタメートを含有する、通常の安定化溶液中に希釈することができる。本発明のワクチンウイルスは、−７０℃ないし−９０℃にて、または２℃ないし７℃にて凍結乾燥状態で、少なくとも１０⁵ないし１０⁶ＰＦＵ／ｍｌのタイターで保存することが好ましい。凍結乾燥したウイルスは、滅菌蒸留水で、使用するときに再構成するか、または、ゲンタマイシンおよびアムホテリシンＢまたはペニシリンおよびストレプトマイシンのごとき保存料を用いる。投与する有用な用量は、ワクチン接種する動物の、年令、体重および種類、ならびに投与様式に依存する。適当な用量は、例えば、約１０^4.5ないし１０⁷ＰＦＵ／動物、好ましくは約１０^4.5ないし１０^5.5ＰＦＵでありうる。本発明のワクチンは、鼻腔内、腟内、または筋肉内投与することができる。鼻腔内がより好ましい投与様式である。発明の効用−本発明は、使用者に、ＢＶＤＶによって引き起こされる病気の有効な予防ワクチンを提供することを目的し、ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、または腟内にて安全かつ有効に投与することができる。本発明のワクチンは、好ましくは予防を通じて、病気を治療する意図で作製する。予防するまたは予防によって、出願人は、宿主の病気の徴候が進展しないようにする、または病気の影響をやわらげる、すなわち、典型的な病気にかかった状態を避けることを意味する。予防は、病気の徴候を停止し、妨げ、または遅らせる決定的な活動を含む。予防には、以下の概念：妨げる、挫折させる、妨害する；途中で捕らえる、おそらくは禁じる、妨げるまたは起こらないようにするを含めることができる。起こらないようにするとは、病気の状態の徴候が起こらないか、病気の病原体が、病気の状態を引き起こす際に非常に効果がないことを示すであろう。予防または予防するとは、病気の状態を、その前で止めることを示し、病気を予防し、または妨げるための、見越した行動が起こるが、病気を起こす状態は除去されないことを意味する。本発明の有用性は、ワクチンの、さまざまな徴候における、ＢＶＤＶ病の広がりに対する、有効な保護を提供する能力によって示されるであろう。ワクチンがｇｐ５３、すなわちＢＶＤＶの主たる糖タンパク質を用い、これに対して宿主が実質的な免疫反応を引き起こすが、ワクチンは、治療された潜在的宿主に対して実質的な利点を与える。本発明の他の目的は子ウシおよび、妊娠の全ての期における妊娠した雌牛に対して安全に投与することのできるＢＶＤＶワクチンを提供することである。活性の測定−ワクチンはｇｐ５３、すなわちＢＶＤＶの主たる糖タンパク質を用い、この糖タンパクに対して宿主は実質的な免疫反応を起こす。他はｇｐ５３が高度に免疫原性であることを示してきた。ドニス，アール・オー（Donis，R． O.)およびドゥボビ，イー・ジェイ(Dubovi，E．J.)、感染したウシ細胞中の、ウシ・ウイルス性下痢−粘膜病ウイルスの糖タンパク質(Glycoproteins of Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease Virus in Infected Bovine Cells)、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー(Journal of General Virology)、第６８巻、１６０７−１６１６（１９８７）。実質的免疫反応を引き起こす薬剤は、有効なワクチンを作製することができることはよく知られている。マガー，アール(Magar，R.)ら、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスタンパク質：細胞毒性および非細胞毒性株の不均一性および５３Ｋ糖タンパク質中性化エピトープ(Heterogen eity of Cytopathogenic and Noncytopathogenic Strains and Evidence of 53K Glycoprotein Neutralization Epitope)、ベタラネリー・マイクロバイオロジー(Veterinary Microbiology)、第１６巻、３０３−３１４。本発明のワクチンは大量のｇｐ５３を発現する遺伝子を含み、これは図５に示される。本発明のワクチンは、ｇｐ５３の大量発現により、治療される潜在的な宿主に、実質的な利益を与えるであろう。好ましい化合物−ｔｋ欠失が有り、ｇｐ５３遺伝子を含む、弱毒化したＢＨＶ −１ウイルスであって、シグナルペプチドがｇｐ５３遺伝子に先行し、これはｇｐ５３遺伝子の豊富な量を発現するが、好ましい適当なワクチン候補であるはずである。シグナルペプチド配列は、適当な経路から採ることができるように思われる。我々は、インビボでｇｐ５３タンパク質の最良の局在化を確実とする２個の異なるシグナルペプチドを試験するよう選択する。我々は、実施例２で具体化する、我々が「Ｔ１１−６」と呼ぶもの、および実施例３で具体化する、「Ｔ１１−３」の２個の候補を選択する。前者ウイルスは、ＵＣＶＲ−５８の名称で、ＡＴＣＣに寄託された。我々が「Ｔ１１−８」と呼ぶウイルスは、ｔｋ転写物の不完全な形を含むであろうし、このことは、これがワクチン候補として魅力的でないであろうことを示すであろうが、当然意味するというものではない。多くの現存する細胞系が、感染した子ウシから採った胎児・ウシ血清を含む培地中の継代からの非−細胞毒性ＢＶＤＶでしつこく感染する。この発明には、生で、弱毒化したウイルスは、汚染したＢＶＤＶを含まないことが必須である。化合物の調製ウシ・ヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）への遺伝子挿入のための、発現シャトルベクターの構築我々は、外来遺伝子をＢＨＶ−１に挿入させるための２個のシャトルベクターを構築した。本発明において、ＢＶＤＶ遺伝子のベクターとしてのＢＨＶ−１の効用を示すが、多くの他のウイルスが同じ役割を果たすことができる。ウシ、ヒツジおよびヤギからの他の例は、雌ウシ、ヤギおよびヒツジのポックスウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、および偽狂犬病ウイルスである。非−病原性ウイルスとは、宿主のうち１つの中で複製可能であるが、その種内の病気のいかなる徴候をも引き起こさないウイルスを意味する。このような非−病原性ウイルスは、自然変異によって病原性の親ウイルスから生じたかもしれないが、例えば、化学薬品または光によって非病原性ウイルスを産生するように突然変異を誘発させるか、組換えＤＮＡ技術の使用によって非病原性らすることもできるであろう。１）ウイルスの中性化ドメインのマッピング(M apping Neutralization Domains of Viruses)、イー・ウィマー(E．Wimmer)、イー・エイ・エミニ(E．A．Emini)およびディ・シイ・ディアモンダンド(D．C． D iamondand)、２）ワクチン産物の免疫原性および中性化抗体(Immunogenicity of Vaccine Products and Neutralizing Antibodies)、イー・ノルビー（E．Norby )。どちらの文献もノトキンズ(Notkins)およびオールドストーン(Oldstone)によって編集され、シュプリンガー−フェアラーク・ニューヨーク・インコーポレイテッド(Springer-Verlag New York Inc.)、１９８６によって発行された。我々はウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（エム，キット(M．Kit)ら、米国特許第４,７０３,０１１号（１９８３））を不活化することにより、ＢＨＶ−１を弱毒化する意図であるので、我々は挿入部位としてＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子を使用するよう決定した。このアプローチは、ウイルスｔｋの完全な不活性化を保証しただけではなく、我々が、確立された方法によって、組換えの、ｔｋ−陰性ウイルスを選択することを可能とした。エム・エフ・シフ(M．F．Shih)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc Natl Acad Sci USA)、８１：５８６７−５８７０（１９８４）。他の必要でない遺伝子の欠失のごとき、ＢＨＶ−１を弱毒化するための他の方法も、この具体的な発明に適切である。我々は、プラスミドｐＵＣ１８にクローン化したＢＨＶ−１のＨｉｎｄIII−Ａ断片の２.７ｋｂのSａｌＩサブフラグメントを含むプラスミドｐＨＡＳ４で開始した。イー・ペトロフキス(E．Peterovkis)、未発表データ。エム・エンゲルス(M．Engels)ら、ビールス・リス(Virus Res.) 、６：５７−７３（１９８６）；ジェイ・イー・メイフィールド(J．E．Mayfield) ら、ジェイ・バイロル(J．Virol.)、４７：２５９−２６４（１９８３）；エー・エル・メイアー(A．L．Meyer)ら、バイオキム・バイオフィズ・アクタ(Biochi m Biophys Acta)１０９０：２６７−９（１９９１）。図１に示されるように、このＳａｌＩ断片は、ＨＳＶ−１ＵＳＬ２４遺伝子に相同な上流遺伝子の一部と同様にｔｋ遺伝子全体、および糖タンパクＨ遺伝子の一部を含む。エル・ジェイ・ベロ(L．J．Bello)ら、バイロロジー(Virology)、１８９：４０７−４１４（１９９２）；ジェイ・ジー・ジャコブソン(J．G．Jacobson)ら、ジェイ・バイロル(J．Virol.)、６３：１８３９−１８４３（１９８９）；エム・キット(M．K it)ら、米国特許第４,７０３,０１１号（１９８３）；エイ・エル・メイアー(A ．L．Meyer)ら、バイオキム・バイオフィズ・アクタ(Biochlm．Biophys．Acta) １０９０：２６７−９（１９９１）。４２４ｂｐの欠失を、ｐＨＡＳ４をＢｇｌ IIおよびＸｈｏＩで消化し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（クレノウ）でうめ、得られた平滑末端断片に再び連結することによって、ｔｋ遺伝子に誘導した。この操作はＢｇｌII認識部位を復活させるが、ＸｈｏＩ部位は復活させない（図１）。得られたプラスミドはｐＨＡＳ４ΔＢＸと名付けられる。この欠失は、ｔｋ遺伝子の５’末端に重複する、ＵＬ２４ホモログの、前記で同定した転写開始部位を妨げないため、選択された。エル・ジェイ・ベロ(L ．J．Bello)ら、バイロロジー(Virology)、１８９：４０７−４１４（１９９２）；ジェイ・ジー・ジャコブソン(J．G．Jacobson)ら、シセェイ・ハイロル(J． Virol.)６３：１８３９−１８４３（１９８９）。ＢＨＶ−１内の多くの他の欠失が可能であろう。後のクローニング操作を容易にするために、我々は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸをＨｉｎｄIIIで消化し、クレノウで付着末端をうめ、平滑末端を再び連結した。我々は、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主中間体初期プロモーターおよびウシ・成長ホルモンポリアデニル化配列を含む１７７５ｂｐのカセットを得た。アール・ジェイ・ブリデュー(R．J．Brideau)ら、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー(J．Gen．Virol.)７４：４７１−４７７（１９９３）。これらの遺伝子の発現シグナルは通常多くの異なるシステムにおける外来遺伝子の高レベル発現のために用いられるが、他のプロモーター／ポリアデニル化シグナル対もまたこの目的で用いることができるであろう。ベクターｐ３ＣＬ−ＤＨＦＲ中のカセットは、唯一のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌII部位に結合し、プロモーターとポリアデニル化シグナル間に、外来遺伝子のクローニングのための唯一のＨｉｎｄIIIおよびＳａｌＩ制限部位を含む。ｐ３ＣＬ−ＤＨＦＲベクターをＥｃｏＲＩで消化し、ついでうめ、ＢａｍＨＩリンカー(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Blolabs)、ベバリー(Beverly)、マサチューセッツ(M assachusetts))。この操作によってＥｃｏＲＩ部位を復活させた。この構築物を次いでＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで消化し、放出したカセットをｐＨＡＳ４ΔＢＸのＢｇｌII部位に連結した（図１）。連結したものを、ＥｃｏＲＩ株ＤＨ５α に形質転換した。我々は、非対称の制限部位のマッピングにより、ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子に対して両方の向きにｐ３ＣＬインサートを含む組換えプラスミドを単離する。これら２個の構築物は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−１およびｐＨＡＸＳ４Δ−ＢＸｅｘ−３と呼ばれ、従って、ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子に結合した強いプロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびにＢＨＶ−１ゲノムヒの相同的組換えを可能とするフランキング領域を含む。図１．外来遺伝子をＢＨＶ−１に挿入するためのシャトルベクターの構築、ＰＰＨＡＳ４は、ＢＨＶ−１のＨｉｎｄIII−Ａ断片からの２.７ｋｇのサブフラグメントである。欠失させるべきＢｇｌII／ＸｈｏＩサブフラグメントを示す。ｐＨＡＳ４の欠失誘導体がｐＨＡＳ４ΔＢＸである。欠失したチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、暗く点刻した枠で示す。ＣＭＶ中間体初期プロモーターは明るく点刻した枠に示し、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルは点刻した枠で示す。最後に２個の発現シャトルプラスミドｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ１およびｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ３のインサートを示す。ＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子へのシグナルペプチド配列の添加非細胞変性株である株２７２４からのＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を含むｃＤＮＡは、以前から記載されてきた。ケネディー，エム(Kennedy，M.)ら、アブストラクツ・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・ベテラネリー・マイクロバイオロジスツ(abstracts of the American College of Veterinary Microbiologis ts)、１９９２ワークショップ。ＢＶＤＶのＲＮＡゲノムは通常１本の長いポリプロテインとして翻訳され、次いで、翻訳後さまざまなウイルスタンパク質に修飾されるので、ＢＶＤＶゲノムのｇｐ５３部位は、タンパク質が通常発現されている細胞表面へのタンパク質の輸送に必要な普通のシグナルペプチドを含まない。それにもかかわらず、ｃＤＮＡは無細胞系およびバキュロウイルス中の両方で発現に成功しているが、タンパク質は通常のシグナルペプチトが無いのにもかかわらず、両方の系で輸送され、グリコシル化され、とどめられているように思われた。我々は、しかしながら、さまざまなシグナルペプチドの有無のどちらの場合にも、ＢＨＶ−１中のｇｐ５３の発現を見積もることに決定した。シグナルペプチドをコードする塩基配列をｇｐ５３遺伝子に付けるために、我々は、以下のように部位特異的突然変異によって、ｇｐ５３の５’末端にＢａｍＨＩ部位を誘導した：ｇｐ５３遺伝子を平滑末端化して、プラスミドｐＳＰ７２ (プロメガ・コーポレイション、マディソン、ウィスコンシン(Promega Corp.，M adison，Wisconsin))の、うめたＢａｍＨＩ部位に連結し、次いで、得られたプラスミドから全てのＢａｍＨＩ部位を除去する。我々は、製造者の注意に従い、合成オリゴヌクレオチドと「ダブル・テイク」サイト・ディレクテッド・ミュータジェネシス・キット、ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリフォルニア(“Doubl e Take”site directed mutagenesis kit，Stratagene，La Jolla，CA)、を用いて、ｃＤＮＡによって用いられる開始コドンから１１塩基目のＣを、Ｇに置換する一塩基置換を行った。この塩基置換は、ｇｐ５３のアミノ酸配列を変化させることなく、唯一のＢａｍＨＩ部位を遺伝子に導入する（図２、Ｂ節）。塩基変化は塩基配列決定によって変化し、得られたプラスミドはｐＰ５３ｍｕｔと呼ばれた。我々は、ＰＲＶｇIII遺伝子（エイ・ケイ・ロビンズ(A．K．Robins)ら、ジェイ・バイロル(J．Virol.)５８：３３９−３４７（１９８６））およびウシ・成長ホルモンから(アール・ピイ・ウォイチック(R．P．Woychik)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acids．Res.)１０：７１９７−７２１０（１９８２）)のシグナルペプチドをコードするｐＰ５３ｍｕｔ配列中に挿入する。（図２Ａ節）。２個のシグナルペプチドをコードしている相補的なオリコヌクレオチドは、アニールしたオリゴがＳａｌＩ付着末端５’およびＢａｍＨＩ付着末端３’（図２、Ａ節）を持つように合成された。これらのシグナルペプチドカセットを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したｐＰ５３ｍｕｔに連結し、ＤＨ５α 中に形質転換した。我々は、塩基配列決定によって、シグナルペプチドカセットの正しい挿入を確認した。よく特徴付けられたシグナル配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドは本発明にて用いることができる。よく特徴付けられた２９のシグナルペプチド配列の例は、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J．Mol．Biol.)、第１６７巻、３９１−４０９（１９８３）に見い出される。引用して一部とする。これらおよび他のいかなるよく特徴付けられたシグナルペプチドも、本発明の具体例として使用するのに適しているはずである。図２．ＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子の付加的なシグナルペプチド配列のためのストラテジー。Ａ節：ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）および偽狂犬病ウイルスｇII I（ＰＲＶｇIII）のシグナルペプチド配列に対応する合成ヌクレオチド。相補的オリゴヌクレオチドを、アニールした対が５’末端のＳａｌＩおよび３’末端のＢａｍＨＩを有するように合成した。シグナルペプチドの推論されるアミノ酸配列も示す。各々の場合において、シグナルペプチドに予言された切断部位は、終末から３アミノ酸のアラニン（Ａ）のちょうど後ろにある。２個のアミノ酸残基（ＢＧＨ中のＦ，ＰおよびｇIII中のＰ，Ｓ）は正しい切断を確実とするために、シグナルペプチド上に残されている。Ｂ節：ＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子をコードするｃＤＮＡの部位特異的突然変異。ｇｐ５３ｃＤＮＡの最初の６０塩基および対応するアミノ酸配列を示す。矢印で示される１の塩基対を、枠内に示される配列中のＢａｍＨＩ制限部位を作り出すため変える。この変化はアミノ酸配列を変えない。ｃＤＮＡを、次いで、示すようにＢａｍＨＩで消化して、Ａ節で示されるシグナルペプチド配列のいずれかへの、枠の合う連結を可能とした。ｇｐ５３に加えた他の発現遺伝子断片生ウイルスベクター中の他のＢＶＤＶ遺伝子または遺伝子の組み合わせの発現もまた本発明の具体例である。これはワクチン接種された動物が免疫反応を起こすことのできるあらゆる、そして全てのＢＶＤＶタンパク質を含むであろう。例は、他の２のＢＶＤＶ表面糖タンパク質、ｇｐ４８およびｇｐ２５(コレット，エム・エス(Collet，M．S.)ら、バイロロジー(Virology)１６５：２００−２０８(１９８８)、Ｐ１４キャプシドタンパク質（チール，エイチ・ジェイ(Tiel，H ．J.)ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J．Virol.)６５：４７０５−４７１２（１９９１））、およびｐ２０Ｎ−末端プロテアーゼを含むが、これらに限定されない。ウィスカーシェン，エム(Wiskerchen，M.)ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J．Virol.)６５：４５０８−４５１４（１９９１）。タンパク質のこのグループは、ｇｐ５３遺伝子と同時に、１のｃＤＮＡ分子から共に発現することができ、発現したポリプロテインは別々のタンパク質に正確にそれ自体処理されるであろう。ワクチン中で発現するもう１のＢＶＤＶタンパク質候補は非構造ｐ１２５／ｐ８０タンパク質(デレート，デイ(Deregt，D.)ら、キャン・ジェイ・マイクロバイオル(Can．J．Microbiol.)３７：８１５−１２２(１９９１) )であって、これは感染した雌ウシ中での顕著な抗体反応を起こさせる。ＢＨＶ−１発現ベクターへのＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子の挿入添加したシグナルペプチド配列を有する、または有さないｐ５３遺伝子を、ベクターおよびインサートのすべてのそれぞれの付着末端をうめ、次いで平滑末端連結することにより、ｐＨＡＳ４ΔＢＳｅｘ−１およびｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ− ３のＨｉｎｄIII挿入部位へ連結した。この連結物をイー・コリ(E．coli)株ＤＨ５α中で形質転換した。我々は、結局、少なくとも２の異なるシグナルペプチドについて我々が最も効率的な発現を達成したことを確実とするためにさまざまな向きでのＢＨＶ−１中のｇｐ５３の発現を推測することを欲した。ジゴキシジェニン−ｄＵＴＰでラベルしたｐ５３インサートをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションによって、形質転換したコロニーをスクリーンした。「ジーニアス」・ディエヌエイ・ハイブリダイゼーション・システム(“Geuius”DNA Hybridization system)（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ(Boeringer Mannheim Biochemicals(BMB)，India napolis，IN)）をこれおよび本発明の特徴付けに記載される全ての他のＤＮＡハイブリダイゼーションに用いた。陽性組換え体を、次いで、制限酵素分析でスクリーンし、ＣＭＶプロモーターおよびＢｇＨポリアデニル化シグナルに対して正しい向きにあるｇｐ５３遺伝子を持つものを探した。５のプラスミドを単離し、これらは図３Ａ−Ｅに図式的に描かれている。これらの記載は次の通りである。実施例１．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３：は、ＣＭＶプロモーターと、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−３のＢＧＨポリアデニル化シグナル間に挿入したＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子で、添加したシグナルペプチドを含まないものを含む。この構築において、もとのｇｐ５３遺伝子を、部位特異的突然変異より前に、挿入した。図３Ａ参照。このプラスミドを次いでウイルスＴ２−３＃を構築するのに用いた。実施例２．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３：は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−１に挿入したＢＧＨシグナルペプチドが先行する変異したｇｐ５３遺伝子を含む。図３Ｂ参照。このプラスミドは、ウイルスＴ１１−６を作り出すのに用いた。このウイルスは寄託された。実施例３．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３：は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−１に挿入したＰＲＶｇIIIシグナルペプチド配列が先行する変異したｇｐ５３遺伝子を含む。図３Ｃ参照。このプラスミドは、ウイルスＴ１１−３を作り出すために用いた。このプラスミドは寄託された。実施例４．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ＢＧＨ／ｐ５３：は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−３に挿入したＢＧＨシグナルペプチド配列が先行する変異したｇｐ５３遺伝子を含む。図３Ｄ参照。実施例５．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII／ｐ５３：は、ｐＨＡＳ４ΔＢＸｅｘ−３に挿入したＰＲＶｇIIIシグナルペプチド配列が先行する変異したｇｐ５３遺伝子を含む。図３Ｅ参照。このプラスミドは、ウイルスＴ１１−８を作り出すのに用いた。このプラスミドは寄託された。図３Ａ−Ｅ．ｇｐ５３のＢＨＶ−１への挿入のための５のシャトルベクターの完全なマップ。ｇｐ５３遺伝子は密なバンドとして示され、ＢＨＶ−１配列は暗い点刻のバンドとして示され、ＣＭＶプロモーター領域は明るい点刻のバンドとして示され、ＢＧＨポリアデニル化シグナル領域は斜線のバンドとして示される。プラスミドベクター、ｐＵＣ１８は、薄い線で示される。各場合に、ＢＨＶ− １ｔｋの転写のもとの方向に対するｇｐ５３の転写方向が示される。様々なシグナルペプチド配列が示される。ａ．実施例１．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３ｂ．実施例２．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３ｃ．実施例３．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３ｄ．実施例４．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ＢＧＨ／ｐ５３ｅ．実施例５．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII／ｐ５３これら、およびＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子のＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子への全ての他の可能な挿入は、本発明の具体例である。これらのプラスミドおよびこの方法で作り出されたあらゆるプラスミドは、「第一のプラスミドベクター」として公知であり、本発明のウイルスワクチンを作り出すために用いるプラスミドベクターである。ｇｐ５３遺伝子の、ＢＨＶ−１「アイオワ(Iowa)」への導入ｇｐ５３を含む５の発現シャトルプラスミドを、ＸｂａＩで線状化し、カイ(C ai)によって修飾された(ダブリュー・カイ(W．Cai)ら、ジェイ・バイロル(J．Vi rol.)６１：７１４−７２１(１９８７))標準的なＣａＰＯ₄法（アール・エル・グラハム(R．L．Graham)ら、バイロロジー(Virology)、５２：４５６−４６７( １９７３)）によって、ＢＨＶ−１株アイオワ（ｔｋ陽性）からの単位長ＤＮＡによって、ウシ・タービネート(Turbinate)細胞に共トランスフェクトした。細胞をＡＴＣＣから得た。トランスフェクションしたものを次いで、１００μｇ／ｍｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン(ＢＤＵＲ、シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ミズーリ(Sigma Chemical Company， St．Louis，Missouri))の存在下、１４３ｔｋ^-細胞(エス・ケイ・ミッタル(S.K ．Mittal)ら、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイオロジー(J．Gen．Virol.)、７０：（１９８９）またはラブ(Rab(BU))細胞(エス・キット(S．Kit)ら、バイロロジー(Virology)、１３０：３８１−３８９（１９８３）)のいずれかでの２周りの選択に付し、もはやｔｋを発現しないウイルスを単離する。これは以前記載された標準的方法である。エム・キット(M．Kit)ら、米国特許第４,７０３,０１１号（１９８３）。ＢＨＶ−１の成長に許容である他のｔｋ^-細胞系も用いることが出来る。ＢＤＵＲの２回の継代後、なお細胞変性効果を示すトランスフェクションされたものを、１％低融点アガロースの完全培地下、ＢＴ細胞に感染させ、単一のプラークを得た。各々のトランスフェクションについて多くの単一のプラークをピックアップし、ウイルスＤＮＡを、ドット−ブロットＤＮＡハイブリダイゼーションによってｐ５３遺伝子からスクリーンした。全てのトランスフェクトされたものがＢＤＵＲ継代を生き延びたわけではないが（特に１４３ｔｋ^- 細胞、なぜならこれらの細胞はＢＨＶ−１ウイルスの成長に最低限許容であるのみであるからである）、生き延びなかったものは１００％組換えウイルスを与える。４の異なる組換えウイルスを単離し、さらに特徴付けた：実施例１．Ｔ２−３＃３およびＴ２−２＃５（２の同一な、しかし独立して単離されたウイルスクローン）：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３に含まれるインサート配列が再結合したＢＨＶ−１「アイオワ」。ＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を有し、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナル間に存在する添加したシグナルペプチド配列が無いもので、ＢＨＶ−１ｋ遺伝子と同じ向きでの転写の向き。実施例２．Ｔ１１−６（このウイルスは、ＵＣＶＲ−５８の名で、ＡＴＣＣに寄託された）：ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３中に含まれるインサート配列が再結合したＢＨＶ−１「アイオワ」。ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナル間に位置するＢＧＨシグナルペプチド配列を伴うＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を有し、ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子に対して反対の向きである転写の向きである。実施例３．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３に含まれるインサート配列が再結合したＴ１１−３：：ＢＨＶ−１「アイオワ」。ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナル間に位置するＰＲＶｇIIIシグナルペプチド配列を伴うＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を有し、ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子に対して反対の向きである転写の向きである。実施例５．ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII／ｐ５３に含まれるインサート配列が再結合するＴ１１−８：：ＢＨＶ−１「アイオワ」。ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナル間に位置するＰＲＶｇIIIシグナルペプチド配列を伴うＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を有し、ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子に対して同じ向きである転写の向きである。「アイオワ」ＤＮＡおよびプラスミドｐＢＨＶｔｋｅｘ３：：ＢＧＨ／ｐ５３、実施例４の共トランフェクションからウイルスは単離されなかったが、このプロフェティック(prophetic)なウイルスは容易に作製することが出来るであろうし、これおよびチミジンキナーゼ遺伝子に挿入したＢＶＤＶｇｐ５３遺伝子を含む他のいかなるＢＨＶ−１ウイルスも本発明の具体例である。我々はこれらのウイルスのそれぞれからＤＮＡを精製し、プローブとしてｇｐ５３遺伝子およびＣＭＶプロモーター／ＢｇＨポリアデニル化カセットの両方を用いてサザンハイブリダイゼーションにより正しい向きでの正しい挿入をチェックした（データは示されない）。ウイルスの全て４個が、制限断片の大きさに基づいて、予言されたごとく欠失し、完全なプロモーター／遺伝子／ポリアデニル化カセットを含んでいた。対照として、これらの感染したものについては、我々は、ＢＨＶ−１「アイオワ」単位長ＤＮＡでｐＨＡＳ４ΔＢＸプラスミドを感染し、４２４ｂｐの欠失を持つｋ−陰性の子孫を単離した。（サザンハイブリダイゼーションによって変化させることが出来た）。このウイルスをＩｏｗａΔＢＸと名付ける。これらのウイルスの全ては、ＢＴ細胞での２回の限界希釈で精製した。現存する多くの細胞系が、感染した子ウシから採った胎児ウシ血清を含む培地での継代からの非細胞変性ＢＶＤＶに許容感染する。本発明には、生の、弱毒化したワクチンが、混入したＢＶＤＶを持たないことが必須である。ＢＶＤＶ配列を持たないＢＨＶ−１ウイルスが、非細胞変性ＢＶＤウイルスで汚染していないことを確実とするために、我々は、各ウイルス（親株ＩｏｗａおよびＩｏｗａΔ ＢＸを含む）からＤＮＡを調製し、クローン化したＲＮａｓｅ（アールエヌエース・ワン、プロメガ・コーポレイション、マディソン、ウィスコンシン（RNase ONE，Promega Corporation，Madison，Wisconsin）を用いて、ＤＮＡ調製物に、大規模なＲＮＡｓｅ処理をした。ＢＶＤＶはその遺伝物質としてＲＮＡのみを持つので、この操作により、ウイルスＤＮＡ調製物由来のいかなる可能な混入ＢＶＤＶ配列も除去するはずである。我々は、次いで、これらのＲＮＡｓｅ処理したウイルスＤＮＡを、保証されたＢＶＤの無いＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトし、トランスフェクトしたものから拾ったウイルスプラークを、さらに操作するために用いた。ｇｐ５３組換え体の転写分析我々は、ＲＮＡを組換えウイルスおよび親のＢＨＶ−１株Ｉｏｗａのそれぞれから調製し、ｇｐ５３の転写を、ノーザン・ハイブリダイゼーションによって見積もった。用いられた可能なｍＲＮＡ分子種およびプローブの図表を図４に示す。図４．ＢＨＶ−１／ｇｐ５３組換え体の予言された転写物は図表５で後に示す。２個のプローブは、１）ｇｐ５３ｃＤＮＡおよび２）ｐＨＡＳ４のＳａｌＩ／ＢｇｌII部分（マップの上に示す）。第一のマップは、ウイルスＴ１１−３およびＴ１１−６からの予言された転写物を示し、第二のマップは、Ｔ１１−８からの予言された転写物を示す。ｔｋおよびＵＬ２４の転写開始の部位を参考のために示す。ｇｐ５３組換えウイルスは、³²Ｐでラベルしたｇｐ５３プローブとハイブリダイズする１.６ｋｂのｍＲＮＡ分子を作り、この大きさは、ＣＭＶプロモーターにおける転写開始およびＢｇＨポリアデニル化シグナルの終結に対して予言された、図５、プローブ１。Ｔ２−３＃３およびＴ２−２＃５ウイルスは示されない。付加的な主たるバンドとして、Ｔ１１−３およびＴ１１−６は８.５ｋｂの転写物を作り、Ｔ１１−８およびＴ２−３＃３は５.６ｋｂの転写物を作った。これらの転写物は組換えウイルスに特有なものであり、ＣＭＶプロモーターで開始し、ＢｇＨポリアデニル化シグナルを読み通してＵＬ２４またはｔｋ／ｇＨポリアデニル化シグナルのそれぞれで終結するｍＲＮＡ分子と矛盾しない。上流および下流プローブとのハイブリダイゼーションによってこれらの長いｍＲＮＡ分子の同一性を確実とした。ｐ５３プローブはＩｏｗａ、ＩａΔＢＸまたは偽感染ＲＮＡにはハイブリダイズしなかった。定量対照として、我々はプローブｐＨＡＳ６、すなわちｔｋオープンリーディングレームの下流に記され、ｇＨ遺伝子の内部にある８６７ｂｐのＳａｌＩ断片を用いた。エイ・エル・メイアー (A．L．Meyer)ら、バイオキム・バイオフィズ・アクタ(Biochim Biophys Acta) 、１０９０：２６７−９（１９９１）。ウイルスの全てが３.１ｋｂのｇＨｍＲＮＡ分子の当量を作った（データは示されない）。このプローブは、Ｔ１１− ８およびＴ２−３−３中のさらに長いｐ５３ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、Ｉｏｗａ中の４.３ｋｂのｔｋｍＲＮＡ分子にもハイブリダイズし、これはｇＨ転写物と３’末端が同じである。エル・ジェイ・ベロ(L．J．Bello)ら、バイロロジー（Virology）、１８９：４０７−４１４（１９９２）。ｇｐ５３挿入物の上流の転写パターンを調査するために、我々は、上流のＳａｌＩ部位から、組換えウイルスの欠失の開始であるｔｋ遺伝子のＢｇｌII部位までのｐＨＡＳ４断片からなるプローブを用いた（プローブ２）。しかしながら、このＲＮＡ分子は、ベロ(Bello)ら（エル・ジェイ・ベロ(L．J．Bello)ら、バイロロジー(Virology)、１８９：４０７−４１４（１９９２））によって記載され、野生株Ｉｏｗａ中のｔｋｍＲＮＡ分子と同時に移動する。我々は、さらに一本鎖プローブを用いて、この共移動するｍＲＮＡを見積もることはしなかったが、我々は、プローブｐＨＡＳ６でＩｏｗａＤＮＡの４.２ｋｂのみのｔｋ転写物を検出し、これらの他のウイルスは野生型の大きさのｔｋ転写物を作れないのにもかかわらず、上流のプローブで全てのウイルスＲＮＡ中の類似の大きさの転写物を検出した。Ｔ１１−３およびＴ１１−６において、上流のプローブにはｔｋｍＲＮＡ分子の切り縮めた形は検出せず、ＵＬ２４ｍＲＮＡ分子および８. ５ｋｂのｐ５３ｍＲＮＡ分子にハイブリイダイズした。Ｔ１１−８において、他方では、該プローブは、約５.０、３.７、１.８および１.０ｋｂの４個の付加的な（小さい方の）バンドにハイブリダイズした。図５．ＢＨＶ−１組換えウイルス中のｇｐ５３メッセンジャーＲＮＡの転写を示すノーザン・ブロット。第一のパネルは、プローブ１にハイブリダイズする転写物、すなわちｐｇ５３ｃＤＮＡを示し、第二のパネルは、プローブ２にハイブリダイズする転写物、すなわちｐＨＡＳ４のＳａｌＩ／ＢｇｌＩのサブフラグメントを示す。キー：Ｍ＝偽感染細胞，Ｉ＝ＢＨＶ−１“Ｉｏｗａ”感染細胞、３,６,８＝Ｔ１１−３，Ｔ１１−６およびＴ１１−８感染細胞。キロベース（ｋＢ）でのＲＮＡの大きさの標準が、それぞれのパネルの左側に示される。ＢＨＶ−１中のｇｐ５３タンパク質の発現我々は、免疫沈降(ＩＰ)によって、ＢＨＶ−１組換体中のｇｐ５３タンパク質中の発現を見積もった。ＩＰの詳細な方法は、「カーラント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)」、オースベル，エフ・エム(Ausubel，F．M.)ら、編、ワイリー・インターサイエンス(Wiley Interscience)、ニューヨーク(New York)に見い出すことが出来る。ＢＨＶ−１組換え体に感染したＢＴ細胞は、代謝的に、³⁵Ｓ−メチオニン(アメルシャム，アーリントン・ハイツ，イリノイ(Amersham，Arlington Heighs，I llinois))でラベルした。ウイルス感染細胞を溶かし、可溶性タンパク質をＢＶＤＶに対するウシまたはヤギの超免疫血清と反応させた。ＶＭＲＤ、プルマン(P ullman)、ワシントン(Washington)。抗原／抗体複合体は、沈澱したstaph A（イムノプリシピチン、ギブコ／ビーアールエル、ガイタースバーグ、メリーランド (Immunoprecipitin，Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)、またはプロテインＡセファロース４Ｂ(protein A sepharose 4B)(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン(Pharmacia，Uppsala，Sweden))のいずれかで沈澱させた。免疫活性なタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）およびフルオログラフィーによって分析した。図６は、シグナルペプチド配列によって先行されるｇｐ５３遺伝子を持つ組換えウイルスの３個すべてが、顕著な量のタンパク質を作ることを示す。我々は、ｇｐ５３遺伝子を持ち、シグナルペプチドを欠く、Ｔ２−３＃３、またはＴ２−２＃５からのｇｐ５３のいかなる発現も検出出来なかったけれども、このウイルスは顕著な量のｇｐ５３メッセンジャーＲＮＡを合成した。ｔ２−３＃３およびＴ２−２＃５は独立して単離されたクローンであって、このことにより、ある特定のウイルスがｇｐ５３発現を排除するという欠点を持つという可能性を除外する（データは示されていない）。ｇｐ５３がＴ２−３から合成されるが、急速に分解されるか、我々の抗体が、該タンパク質の処理されない形を検出しないという可能性が残っている。図６．ＢＨＶ−１組換え体中のｇｐ５３の発現を示す免疫沈降タンパク質。ラベルしたタンパク質はポリクローナルのウシ−抗−ＢＶＤＶ血清で沈降するが、この血清はまた、ＢＨＶ−１抗体との少ない反応を示す。キー：３,６,８＝Ｔ１１−３，Ｔ１１−６，およびＴ１１−８感染細胞タンパク質，ＩＡ＝ＢＨＶ−１ “Ｉｏｗａ”感染細胞タンパク質、Ｍ＝偽感染細胞タンパク質、ＭＷ＝キロダルトンでのおおよそのタンパク質分子量標準。Ｔ１１−３、Ｔ１１−６およびＲ１１−８のｇｐ５３タンパク質バンドは広く、タンパク質が処理されていることを示し、これらは等価であるが、ＮＡＤＬ中のｇｐ５３タンパク質と同一ではないように思われる（データは示さない）。Ｎ −グリカナーゼ（ゲンザイム、ケンブリッジ、マサチューセッツ(Genzyme，Camb ridge，Massachusetts)での消化による、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬおよびＢＨＶ−１の発現するｇｐ５３タンパク質からの、Ｎ−結合糖の除去によっても、タンパク質中のサイズの違いは分析出来ず、タンパク質の大きさの違いに比例した還元は、ｇｐ５３の天然および組換え型が同じように処理されることを示した。組換えおよび天然のタンパク質のわずかな大きさの違いは、ＢＨＶ−１ウイルス中のｇｐ５３遺伝子が、異なるＢＶＤ株からきている事実によるものかもしれないし、これらの株においては、ｇｐ５３がわずかに異なる大きさであるか、あるいは、ｃＤＮＡｇｐ５３クローンが、ＢＶＤＶポリプロテインから天然のｇｐ５３に処理される正確なアミノ酸数を含まないのかもしれない。本発明は、寄託した細胞系による範囲または、本明細書中に開示される具体例に限定されるべきでなく、本発明の１の例示として意図されるべきであり、本発明の範囲に機能的に等価であるか、あるいはその中にある。実際、本発明の様々な修飾が、本明細書に示され記載されるものに加え、上記記載から、当業者に明らかであろう。このような修飾は、添加したクレームの範囲内に入るよう意図される。ヌクレオチドおよびペプチドの全ての塩基対およびアミノ酸残基数および大きさはおおよそのものであって、記述の目的で使用した。全ての文献を引用して本明細書の一部とする。遺伝物質の寄託当業者は、書かれた記載のみを用いることによって、本発明の様々な具体例を再構築することが出来るはずである。しかしながら、可能性を確実とする完全さのために、および他者が本発明を行い用いる全ての機会を与えるために、本発明のある遺伝構築物は、ブタペスト条約に従う認識された寄託所に寄託されている。１のウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビレ、メリーランド、郵便番号２０８５２、アメリカ合衆国(12301 Parklawn Drive，R ockville，Maryland，zip code 20852，USA)に寄託した。この寄託物は、アップジョン・カンパニー(Upjohn Company)によってＵＣＶＲ−５８と名付けられ、寄託所によって以下の番号を与えられた、ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２４３６、これは「Ｔ１１−６」、または「実施例２」としても知られる、本明細書記載のウイルスに対応する。この寄託物は、１９９３年１０月２８日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)によって受領された。いくつかのプラスミドを、１８１５ノース・ユニバーシティ・ストリート、ペオリア、イリノイ、郵便番号６１６０４、アメリカ合衆国(1815 North Univer sity Street，Peoria，Illinois，zip code 61604，USA)のアメリカ合衆国農務省のアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション(Agr icultural Research Service Culture Collection)(NRRL)に寄託した。１のプラスミドは、アップジョン名ｐＵＣ１５６４、イー・コリ(E．coli)培養ＵＣ１５０８５を与えられ、これは、ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII＼ｐ５３を意味し、これは、「Ｔ１１−３」、または「実施例３」としても知られる、本明細書中で記載されるウイルスを作り出すのに用いるプラスミドに対応する。このプラスミドは以下の番号で寄託所に渡された、ＮＲＲＬＢ−２１３５０。もう１個の寄託物は、アップジョン名ｐＵＣ１５６５、イー・コリ培養ＵＣ１５０８６であって、ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII＼ｐ５３を意味する。これは、「Ｔ−１１−８」、または「実施例５」としても知られる、本明細書中で記載されるウイルスを作製するのに用いるプラスミドに対応する。このプラスミドは、寄託所によって、以下の番号を与えられた、ＮＲＲＬＢ−２１３５１。両方のプラスミドが、１９９４年１０月２６日に、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション・ディポジトリ(Agricultural Research Servi ce Culture Collection depository)によって受領された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＢＶＤＶウイルスから採取される遺伝子または遺伝子の組み合わせであって、複製非病原性ウイルスが機能的に遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現する、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスによって引き起こされる病気を予防するための該複製非病原性ウイルス。２．該複製非病原性ウイルスが弱毒化された請求項１記載のウイルス。３．該複製非病原性ウイルスが、弱毒化したウシ・ヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、弱毒化したアデノウイルス、弱毒化したウシ乳頭炎ウイルス、弱毒化したウシ・乳頭腫ウイルス、または弱毒化した偽狂犬病ウイルスから選択される請求項２記載のウイルス。４．該複製非病原性ウイルスが、弱毒化されており、以下の遺伝子：ｇｐ４８、ｇｐ２５、ｐ１４キャプシドタンパク質、ｐ２０Ｎ−末端プロテアーゼおよびｐ１２５／ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子のいかなる組み合わせも含み、それを発現する請求項２記載のウイルス。５．該複製非病原性ウイルスが、弱毒化されており、以下の遺伝子：ｇｐ４８、ｇｐ２５、ｐ１４キャプシドタンパク質、ｐ２０Ｎ−末端プロテアーゼおよびｐ１２５／ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子のいかなる組み合わせも含み、それを発現する請求項３記載のウイルス。６．弱毒化が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を機能しないものにすることによってなされる請求項２記載のウイルス。７．弱毒化が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を機能しないものにすることによってなされる請求項３記載のウイルス。８．弱毒化が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を機能しないものにすることによってなされる請求項４記載のウイルス。９．弱毒化が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を機能しないものにすることによってなされる請求項５記載のウイルス。１０．該複製非病原性ウイルスがウシ・ヘルペスウイルス１型である請求項９記載のウイルス。１１．該複製非病原性ウイルスがｇｐ５３、すなわちウシウイルス性下痢ウイルスの糖タンパク質をコードする遺伝子を含みそれを発現する請求項１０記載のウイルス。１２．シグナルペプチドがウシ・ヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）中のｇｐ５３をコードする遺伝子または遺伝子の組み合わせに先行して挿入された請求項１１記載のウイルス。１３．ｇｐ５３をコードする遺伝子が不活性化されたチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子部位に挿入された請求項１２記載のウイルス。１４．ウイルスを作製するために用いる、機能的に発現する遺伝子または遺伝子の組み合わせが、無傷のウイルスＤＮＡを持つ組換えプラスミドを発現し、該プラスミドが：ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含み、かつチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中に欠失があるＢＨＶ−１ゲノミックＤＮＡ断片、ｂ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失シグナル中に挿入されたプロモーター／ポリアデニル化シグナル、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間に全て挿入されたｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせに先行するシグナルペプチド遺伝子配列からなる請求項１３記載のウイルス。１５．該シグナルペプチド遺伝子配列が、ペルマン・デイ(Perlman，D.)らジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J．Mol．Biol.)第１６７巻、３９１−４０９（１９８３）に見い出されるシグナルペプチド配列によってよく特徴付けられた３９の実施例のいずれかのごとき、よく特徴付けられたシグナルペプチド配列のいずれかから採られたものである請求項１４記載のウイルス。１６．シグナルペプチド遺伝子配列が偽狂犬病ウイルスｇIII遺伝子（ＰＲＶ）および／またはウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）から採られた請求項１５記載のウイルス。１７．プラスミドが、以下のプラスミド、ａ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ＢＧＨ／ｐ５３；ｂ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−１：：ｇIII／ｐ５３；ｃ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ＢＧＨ／ｐ５３；またはｄ）ｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｇIII／ｐ５３から選択される請求項１６記載のウイルス。１８．機能的に発現する遺伝子または遺伝子の組み合わせの産物を産生する該ウイルスが以下のウイルス、Ｔ１１−３、Ｔ１１−６、またはＴ１１−８のいずれかから選択される請求項１７記載のウイルス。１９．該遺伝子または遺伝子の組み合わせがＴ１１−６である請求項１８記載のウイルス。２０．ｇｐ５３をコードする該遺伝子が不活性化チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子部位に挿入された請求項１１記載のウイルス。２１．ウイルスを作製するために用いる、機能的に発現する遺伝子または遺伝子の組み合わせが、無傷のウイルスＤＮＡを持つ組換えプラスミドよりなり、該プラスミドが：ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含み、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中に欠失があるＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失中に挿入されたプロモーター／ポリアデニル化シグナル、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間に挿入されたｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせからなる請求項２０記載のウイルス。２２．該プラスミドがプラスミドｐＨＡＳ４の特徴を持つプラスミドから作製される請求項２１記載のウイルス。２３．該プラスミドがｐＢＨＶｔｋｅｘ−３：：ｐ５３である請求項２２記載のウイルス。２４．該ウイルスが以下のウイルス、Ｔ２−３＃３またはＴ２−２＃５の１から選択される請求項２３記載のウイルス。２５．請求項１記載のウイルスの医薬上有効量および担体からなることを特徴とする、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＤＶＤ）によって引き起こされる病気を予防するためのワクチン。２６．請求項１記載のウイルスの医薬上有効量および担体からなり、該担体は、ＢＨＶに対する抗体を含まない２.５ないし１５％の血清を含む、約ｐＨ７.０ないし７.４のあらゆる生理学的培地からなるウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＤＶＤ）によって引き起こされる病気を予防する請求項２５記載のワクチン。２７．動物に請求項１記載のウイルスの医薬上有効量を投与することを特徴とする動物を感染病に対して免疫する方法。２８．ａ）ＢＶＤＶを引き起こす機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせを単離し、ｂ）複製非病原性ウイルスへ該遺伝子または遺伝子の組み合わせを挿入し、ｃ）該遺伝子または遺伝子の組み合わせの産物を機能的に発現する生ウィルスを選択することを特徴とする請求項１記載のウイルスの調製方法。２９．ウイルスを産生するため使用される機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせが、無傷ウイルスＤＮＡを持つプラスミドの組換えよりなる工程により生産され、該プラスミドが：ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含み、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中に欠失があるＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）該プラスミドのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失中にプロモーター／ポリアデニル化シグナルを挿入すること、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間にｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせを挿入すること、ｄ）普通の宿主では免疫抑制を起こさず、機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現する生ウイルスへの機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせが、組換えウイルスを作り出すために細胞をプラスミドでトランスフェクトすることを特徴とする請求項１１記載のウイルスを調製する方法。３０．ウイルスを産生するため使用される機能的発現遺伝子または遺伝子の組み合わせが、無傷ウイルスＤＮＡを持つプラスミドの組換えよりなる工程により生産され、該プラスミドが：ａ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含み、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中に欠失があるＢＨＶ−１ゲノムＤＮＡ断片、ｂ）該プラスミドのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子欠失中にプロモーター／ポリアデニル化シグナルを挿入すること、ｃ）プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間にｇｐ５３遺伝子または遺伝子の組み合わせを挿入すること、ｄ）普通の宿主では免疫抑制を起こさず、機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせを発現する生ウイルスへの機能的遺伝子または遺伝子の組み合わせが、組換えウイルスを作り出すために細胞をプラスミドでトランスフェクトすることを特徴とする請求項１２記載のウイルスを調製する方法。