JPH10510052A - 腸の炎症状態を診断する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトの腸管の炎症状態を診断する方法であって、腸管腔におけるＮＯを測定することを特徴とする。得たＮＯ値を健常人の値または自己の他の時点での値と比較する。健康集団における腸の正常値に比べて、上昇した値は腸における炎症状態を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 腸の炎症状態を診断する方法 本発明の技術分野 本発明は、腸管（すなわち、小腸および大腸（結腸および直腸））の炎症状態 を診断する新規方法に関している。この方法の新規性は、腸内ガスにおける酸化 窒素（ＮＯ）がこのタイプの炎症の臨床関連指標であるとの私達の発見に基づい ている。 消化管のこの部位における炎症状態は、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病 などの炎症性腸疾患、腹腔疾患などの食物拒否症、食物アレルギーあるいは敗血 症によって生じる。 従来の技術 ＮＯが消化管の多くの箇所で生成し、生理的および病理的症状に関与している ことは知られている（Whittle G J R，消化管の生理、New York: Raven Press（ 1994）267-94）。 潰瘍性大腸炎におけるＮＯの病理的役割は示唆されており、活発な潰瘍性大腸 炎の患者では粘膜のＮＯ合成が増加することが示されている(Middleton ら、Lan cet341（1993）465-66; Boughton-Smith ら、Lancet 342(1993)338-40)。しかし 、これらの研究はインビトロで行われ、結腸および直腸の粘膜から採取した生検 でのＮＯ−合成活性を測定するのに、間接的なシツルリン検定を用いていた。こ れらの試験では、活性が存在する大腸粘膜の層を明らかにしていない。粘膜で形 成したＮＯは大腸腔に拡散する傾向にあるようであるが、そこに到達するために は、ＮＯは上皮細胞、上皮内細胞、例えば食細胞などの管腔細胞を含む表面層に おいて形成されねばならない。この非常に活性なＮＯが粘膜層の深部で形成され した場合は、拡散経路の間に破壊されてしまう。ここに示す結果は初めて、腸炎 症疾患におけるＮＯ−合成活性が結腸および直腸の管腔に次いで上皮細胞層に存 在することを明らかにする。 少量の亜硝酸塩をＮＯに変え得る腸細菌が存在することが認められている(Ji ら、Biochem．Arch．５（1989）61-66)。 空気路に関しては、呼気中のＮＯ濃度の変化が炎症状態で認められている(Alv ingら、WO 9502181; Alving ら、Eur．Resp．J．６（1993）1368-70; Hamidら、 Lancet 342（1993）1510-13; Karithonov ら、lancet 343（1994）146-147)。 ＮＯ値の増加は逆流気においても認められている(Alving ら、WO 9502181;Lun dberg ら、Gut 35（1994）1543-1546)。少し異なった測定方法によって、呼気中 のＮＯは肺から発生することが示唆されている(Gustafsson，WO-A-9305709およ び SE-A-91032433)。 本発明の対象 本発明の対象は、上記の腸管炎症状態の診断方法を含み、特にＮＯ生成とこれ らの状態との相関に関係する。 本発明およびその基になる発見 我々は、大腸および直腸に活発な炎症のある患者の結腸および直腸から採取し た管腔ガスのＮＯ濃度を測定することに成功した。これらの濃度を対照の健常人 から得た濃度と比較した。 われわれの発見によると、ＮＯ値は腸に炎症状態がある場合に増加する。用語 “健常人”は、腸粘膜に炎症のない者を意味する。 従って、発明方法は下記の工程を特徴とする。 ・ヒト腸管腔からガスのサンプルを採取する ・その酸化窒素（ＮＯ）量を測定する ・その値を健常人で得た値または他の時点で同一人で得た値と比較する 健常人の値に比較して高い値は、サンプルを得た者の腸における炎症状態の指 標である。他の時点での値、すなわち以前の値に比して、値が高くなっていると 、炎症状態が悪化していることを表している。反対に、値の低下は改善を意味す る。サンプル採取および測定方法は比較する同士、もちろん基本的に同じでなけ ればならない。 サンプルは空腹時の腸管腔から得るのが望ましいが、かならずしも空腹でなく てよい。腸管から細菌を完全になくすることができないが、測定方法は有効に機 能する。サンプルは、例えば結腸鏡術の間、ガスを集積するシリンダを付け、例 えば結腸に入れたカテーテルを通じて採取する（結腸鏡には通常、腸管腔からの ガスサンプルを引き込み得る導管が装着されている）。サンプルはまた、Raabら が記載するのと同じ型の器具によっても採取し得る(Am．J．Gastroenterol．87 （1992）1453-1459)。Krog らも参照(WO-A-108013)。直腸に関しては、ガスサン プルは、例えば直腸内ガスをシリンダに吸引することにより直接集めることがで きる。サンプルはまた、例えば Odlind ら記載の装置を用いて、小腸管腔から採 取することができる(EP-A-455,368)。Raab ら及び Krog らの両者により示され た方法論は、結腸および直腸の分節についてのサンプル代表を得るのが可能であ ることを示している。 ＮＯ量は、濃度、絶対値または内的あるいは外的基準との相対値として定め／ 計算され得る。その量は、ＮＯと共に腸内ガス中に、望ましくは一定の値で、本 来的に存在する成分を標準とした値として表される（内的基準）。ＮＯ量は、空 気流を考慮したとき、時間単位当たり分泌された量としても計算され得る。Krog ら（WO-A-108013）および Odlind ら（EP-A-455,368）により記載されたバロン 法を用いたときは、得られた値は露出している粘膜領域に関係する。局所のＮＯ 産生は、基質Ｌ−アルギニンを経口的に、静脈にまたは局所的に、例えば低度の 炎症の検出を可能にする結腸鏡を経て、投与することにより増加し得る。 外来患者から腸内ガスを採取するには、直腸サンプルが望ましい（このような 患者について他の採取方法を排除するものではない）。直腸からの採取は、ガス が腸管内に自由に拡散し得る場合、ＮＯ値が直腸および結腸の両方の炎症を測定 することになる。Krog らの技法(WO-A-108013)を用いて、直腸の炎症を測定する ＮＯ値が得られる。 ガスサンプル中のＮＯの検定方法は、この分野でよく知られている。低い値が 対象であるので、化学発光検出法に基づくＮＯガス分析器が優先日の時点では望 ましい。例えば、Archer，FASEB J.，(1993)349-60 および Alving ら、WO 9502 181 参照。 試験 潰瘍患者 活発な潰瘍性大腸炎の６患者（２７−４８歳、平均３８歳）および粘膜に炎症 のない対照の１２患者（２６−６８歳、平均５９歳）（悪性腫瘍またはポリープ の疑いで結腸鏡が使用される）について、結腸鏡術の間、腸腔ガスを結腸および 直腸の種々の部位から薄いカテーテルを通して吸引した（６０ｃｌ、５秒以上） 。各患者において炎症が組織的に確認された。潰瘍性大腸炎の患者の内、２人は コルチコステロイドおよびサリチル酸塩を経口で服用し、２人はサリチル酸塩の みを服用し、残りの２人は試験の時点ではいかなる薬剤も服用していなかった。 各患者で結腸鏡術の前に、水浣腸および等張ポリエチレングリコール(Laxabone 商標、TIKA，Lund，スエーデン)の摂取を含む通常の措置がとられた。 吸引されたガスは直ちに化学発光検出ＮＯ分析器(CDL 700，ECO Physics，Dur nten，スイス)にかけられ、ＮＯのピーク値が記録された。ＮＯの検出限界は１ ０億分の一（ppb）であり、電磁流コントローラ（Environics Inc，Middleton， コネチカット，米国）を用いて、分析器はＮ₂中のＮＯの濃度が目盛り付けされ ている。ＮＯ値は、シリンダ中で３分間以上、大きく相違する濃度(5-25,000 pp b)で安定していた。化学発光検出はＮＯに非常に特異的であり、他の酸化窒素の 干渉がない(Archer，FASEB J．７（1993）249-60)。大気中のＮＯ値は４ppb 以 下であった。Mann-Whitney U 検定を非対比較のために使用した。 結腸中の管腔ＮＯ値は、各人の値を結腸の種々の部位（Ｓ字結腸、下行、横行 および上行結腸）についての平均Ｖｆとして計算したときに、潰瘍性大腸炎の患 者は(7741±1910)、対照（45±7）に比して１００倍以上（ｐＨ=0.0001）であっ た。結腸および直腸の種々の部位ごとの平均を表に示す。 いかなる部位においても２群間で重なり合うことは無かった。ＮＯ濃度はすべ ての結腸で増加した。最も高い濃度は炎症の最も激しい箇所から採取したガスで 見られたが、炎症症状のない結腸部位でもＮＯ値は有意に上昇した。コルチコス テロイドまたはサリチル酸塩を投与した潰瘍性大腸炎患者における管腔ＮＯ濃度 は、対照に比較して非常に高く、また無投薬の漬瘍性大腸炎の患者と相違がなか った。 クローン病 クローン病の２患者について、上記と同じ方法を用い、結腸ＮＯ値を測定した ところ、約１０００ｐｐｂであった。このように、この疾患の結腸ガス中のＮＯ 値は中程度とみられる。 ＮＯ合成の免疫組織化学 ＩＢＤ患者および対照者の結腸鏡術の間、ＮＯシンターゼの存在および場所を 免疫組織化学的に確認するために、粘膜生検がなされた。簡単に述べれば、腸粘 膜組織標本を、固定し凍結した後、１４μｍの厚さの切片にする。誘発ＮＯシン ターゼの存在が家兎ポリクローナル抗血清を用いて確認された。この抗血清は、 喘息患者の炎症した気管支上皮を染色し、対照を染色しない(Hamid ら、Lancet 342（1993）1510-1513)。視覚化のためには、蛍光物ＦＩＴＣと共役しているヤ ギ−抗−家兎−ＩｇＧ−抗体を用いた。この方法により、誘発ＮＯシンターゼ が潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者の腸上皮においてのみ発見され、対照患 者においては見いだされなかった。しかし、染色には出来不出来があり、すべて の標本では見られなかった。 考察 管腔ガス中のＮＯは腸粘膜において産生されるようであり、ＮＯ−シンターゼ 活性について報告されている(Boughton-Smithら、Lancet 342（1993）338-340) 。 この段階では、細菌の一部の株が亜硝酸塩からＮＯを製造できるので、いくら かの管腔ＮＯが細胞由来かもしれないとのことを除外し得ない(Ji ら、Biochem ．Arch．５（1989）61-66)。しかし、この研究においては、細菌は主なＮＯ源で はない。なぜなら、すべての患者が結腸鏡術の前に注意深く準備され、糞便は見 られなかったからである。細菌のより一般的な性質は硝酸塩を亜硝酸塩に還元す る能力である。更に、硝酸塩も亜硝酸塩も食物のありふれた成分である。従って 、亜硝酸塩および硝酸塩は腸管における局所的ＮＯ産生の特異的な標識とならな い。炎症大腸の患者における非炎症領域から採取した管腔ガスにみられる高ＮＯ 濃度は、大腸炎において結腸が弛緩および膨張している、すなわち、結腸の各部 分が行き来しやすくなり、腸内ガスが均一に分散するとの事実におそらく因るも のであろう。 腸粘膜からの生検における炎症の組織的な分析が一般的炎症状態の代表的なも のでないだろうことは、よく知られている問題である。ガス中のＮＯはより一様 に分布するだろうから、この方法は、疾患すなわち粘膜の炎症領域と罹患領域の 炎症程度とを、よく相関せしめ得る。クローン病におけるＮＯの低い値はこの一 つの例示である。なぜなら、クローン病に比して潰瘍性大腸炎においては上皮の 広い部分が通常罹患しているからである。全粘膜において無傷の腸管腔でのＮＯ の直接測定、および全粘膜におけるＮＯ−シンターゼ活性の間接的測定のいずれ も(Middleton ら、Lancet 341（1993）465-66; Boughton-Smith ら、Lancet 342 （1993）338-40)、ＮＯ産生が腸に炎症のある患者おいては対照患者におけるよ り非常に大きいことを示す。 しかし、２人の潰瘍性大腸炎患者におけるＮＯ産生の差異は、直接管腔法を用 いたときに非常に大きくなった（４−８倍に比し１００倍）。更に、クローン患 者において間接法ではＮＯ−シンターゼ活性が増加しないが、われわれの直接法 は管腔ＮＯの約２０倍に増加した値を示した。間接法で全粘膜におけるＮＯ産生 を測定すると、粘膜のすべての層からの正常ＮＯ産生が寄与し、背景値を増加し 、群間の差異を小さくする。他方、管腔ＮＯ測定は粘膜の最も表面の部分のみで のＮＯ産生を反映し得、深い粘膜構造部で産生されるＮＯは、例えば粘膜血管中 のヘモグロビンにより捕捉されるので、管腔に達しない。したがって、このこと は、炎症状態において管腔ガス中に検出されるＮＯ産生が非常に表面の粘膜層に 存在するものであることを示唆している。腸でのＮＯガス測定は、ＮＯ産生が正 常の上皮においては全く起きないので、炎症の鋭敏な尺度であり得る。 活性な潰瘍性大腸炎は誘発ＮＯシンターゼの活性増大に関連している。これは 、誘発ＮＯシンターゼがステロイド感受性であるとの伝統的な考え（Moncada ら 、Pharmacol．Rev．43（1991）109-141）に明らかに一致していない。なぜなら 、われわれの研究および以前の研究（Boughton-Smith ら、Lancet 342（1993）3 38-40）において、コルチコステロイド処置患者は非処置者とＮＯ産生に関して は相違しなかったからである。これは粘膜におけるＮＯ−産生細胞へのステロイ ドの不完全な浸透を反映しているか、ステロイド耐性誘発ＮＯシンターゼの存在 が分かっていないのか、いずれかである。われわれの研究では、サリチル酸塩は ＮＯ産生に関与しないようであった。しかし、サリチル酸塩処置の全患者が継続 中の処置にもかかわらず、潰瘍性大腸炎に苦しんでいたことを指摘しなければな らない。このように、処置がより効果的であり、潰瘍の活性化が生じないような 他の潰瘍性大腸炎患者において、サリチル酸塩がＮＯ合成に関与するかどうかは 、われわれには分かっていない。これらの急性症状および高ＮＯ値の患者につい て処置が明らかにうまくいっていないので、腸内ＮＯの測定は新薬の試験に利用 できよう。 腸に炎症状態がある患者でみられるＮＯ産生の増加は、組織に有益か、それと も有害か、いまなお明らかでない。ＮＯおよび後の反応生産物は、過剰に産生す ると、宿主細胞に対して細胞毒作用を有するであろう(Tepperman ら、Am．J． Physiol．265（1993）G214-G218)。一方、高濃度の管腔ＮＯは、例えば、鼻空気 路(Lundberg ら、Eur．J．Resp．7（1994）1501-1504)および胃(Lundbergら、Gu t 35（1994）1543-1546)に、局所組織に損傷を与えることなく、正常に存在する 。更に、ＮＯは、宿主保護メカニスムにおいて、例えば、その静菌作用により重 要な役割を演じていることが示唆されている(Moncada ら、Pharmacol．Rev．43 （1991）109-141)。このことは、活性な潰瘍性大腸炎の患者において、活性でな い疾患の患者および対照者に比して、細菌数の減少がみられるとの以前の知見に より支持される(Hartley ら、J．Medica1．Microbiol．36（1992）96-103)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１２月１８日 【補正内容】 請求の範囲 １．腸管腔から採取したガスサンプルのＮＯを測定し、得た値を健常人の値ま たは同一人の他の時点での値と比較することを特徴とする、ヒト腸管における炎 症状態の診断法。 ２．サンプルを空の腸管腔から採取することを特徴とする、請求項１の方法。 ３．サンプルを結腸の管腔から採取することを特徴とする、請求項１−２の方 法。 ４．サンプルを直腸の管腔から採取することを特徴とする、請求項１−２の方 法。 ５．増加した値を潰瘍性大腸炎の一つの指標とすることを特徴とする、請求項 １−４の方法。 ６．増加した値をクローン病の一つの指標とすることを特徴とする、請求項１ −４の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルヴィング，チェール スウェーデン、エス−757 57ウプサラ、 スペッツヴェーゲン40番 (72)発明者 ヴェイツバリィ，エドヴァード スウェーデン、エス−114 39ストックホ ルム、ナイブロガータン24番 (72)発明者 ルンドバリィ，ヤン スウェーデン、エス−182 64ジュールシ ョルム、ヘレヴェーゲン10番 (72)発明者 ルンドバリィ，ヨン スウェーデン、エス−113 31ストックホ ルム、サンクタ・エリクスガータン116番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．腸管腔内のＮＯを測定し、得た値を健常人の値または同一人の他の時点で の値と比較することを特徴とする、ヒト腸管における炎症状態の診断法。 ２．ガスサンプルを管腔から採取し、サンプル中のＮＯを測定することを特徴 とする、請求項１の方法。 ３．サンプルを空の腸管腔から採取することを特徴とする、請求項１−２の方 法。 ４．サンプルを結腸の管腔から採取することを特徴とする、請求項１−３の方 法。 ５．サンプルを直腸の管腔から採取することを特徴とする、請求項１−３の方 法。 ６．増加した値を潰瘍性大腸炎の指標とすることを特徴とする、請求項１−５ の方法。 ７．増加した値をクローン病の指標とすることを特徴とする、請求項１−５の 方法。