JPH10510155A

JPH10510155A - 組み換え融合蛋白構築物を用いるペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH10510155A
Application number: JP8517724A
Authority: JP
Inventors: パートリッジ，ブルース・イー; スタウト，ジェイ・エス; ヘンリクセン，デニス・ビー; マニング，シェーン・ディ; デ・ラ・モッテ，レベッカ・エス; ホームクイスト，バートン; ワグナー，フレッド・ダブリュー
Original assignee: バイオネブラスカ・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1998-10-06
Also published as: AU700605B2; WO1996017942A1; EP0796335A1; AU4415896A; CA2206848A1

Abstract

(57)【要約】カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含む融合蛋白構築物を用いることによる、組み換えペプチドの単離および／または精製方法を提供する。該方法は、カルボニックアンヒドラーゼを含む融合蛋白構築物または融合蛋白構築物のフラグメントのいずれかを沈殿させることを含む。融合蛋白構築物を含む封入体、および融合蛋白を封入体の一部として発現させることを含むペプチドの製造方法も提供する。カルボニックアンヒドラーゼおよび特定の標的ペプチドを含む融合蛋白構築物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】組み換え融合蛋白構築物を用いるペプチドの製造方法発明の背景インビトロＤＮＡ操作および付随する遺伝情報の移行について開発が行われ、効果的な内在性蛋白および外来蛋白の微生物宿主における発現を可能にするテクノロジーとなるに至った。組み換えＤＮＡ法は蛋白およびペプチドの発現に関する選択、増幅および操作を可能にした。いずれの微生物宿主においてもすべての外来蛋白の発現は理論的には可能であるが、産生される蛋白の安定性は、しばしば、かかる実施を制限してきたし、低収率を招いてきた。詳細には、小型外来蛋白およびオリゴヌクレオチドは、大部分の細胞宿主においては簡単には過剰産生されない。宿主細胞における小型ペプチドの発現は、宿主がポリペプチドを同化する可能性を高める。この問題に対応して、小型ペプチドが、ペプチドマーカー（例えば、ベーターガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）のごとき第２の大型ペプチドとの融合蛋白として発現されている。得られる融合蛋白は容易には同化されないが、所望蛋白の単離および精製はしばしば非常に効率的でなくあるいは効果的でない。カラムクロマトグラフィー分離、例えば、アフィニティーカラムによる分離の使用を必要としない組み換えペプチドの単離および／または精製を可能にする方法の開発が特に望まれるであろう。典型的には、かかるカラムは高価であり、比較的限られた寿命を有する可能性がある。したがって、組み換えペプチドの単離および精製のための柔軟性のある、便利な方法に対する必要性が存在し続けている。発明の概要本発明は、カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含む融合蛋白構築物を用いる、組み換えペプチドの製造方法を提供する。典型的には、カルボニックアンヒドラーゼは哺乳動物のカルボニックアンヒドラーゼ（ｍＣＡ）である。カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的（variable）融合ポリペプチドを開裂部位により一緒に連結させることができる。開裂部位はアミノ酸またはアミノ酸配列であり、開裂剤による処理により選択的に開裂される蛋白構築物を生じるものである。開裂剤は、メチオニン残基のごとき特定の化学的開裂部位を認識する化学試薬、例えば、臭化シアンであってもよい。開裂剤は、特定のアミノ酸またはアミノ酸配列（「酵素的開裂部位」）に関する特異的ポイントにおいて構築物を開裂するエンドペプチダーゼであってもよい。本発明の１の具体例は、融合蛋白構築物を沈殿させることを含む、ペプチドの製造方法に指向される。沈殿した構築物を再可溶化することができる。開裂後、カルボニックアンヒドラーゼを含有するフラグメント（「カルボニックアンヒドラーゼフラグメント」）を、クロマトグラフィー、濾過により、あるいは好ましくは沈殿法により除去することができる。第２の具体例は、（ｉ）融合蛋白構築物を開裂して可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可溶性の可変的融合ポリペプチドフラグメントを得て、次いで（ｉｉ）カルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることを含む、ペプチドの製造方法を提供する。カルボニックアンヒドラーゼフラグメントは、カルボニックアンヒドラーゼを含み、他のアミノ酸残基、例えば、開裂反応により作られた相互結合ペプチド（interconnecting peptide）由来または化学的残基由来のものを含んでいてもよい。可変的融合ポリペプチドフラグメントは、少なくとも１コピーの標的ペプチドを含み、Ｎ末端もしくはＣ末端尾部配列または内部結合ペプチド（intraconnecting peptide）のごときさらなるアミノ酸残基を含んでいてもよい。可変的融合ポリペプチドフラグメントが１個よりも多い標的ペプチドのコピーを含む場合、典型的には標的ペプチドは、開裂部位を含む内部結合ペプチドによって連結されている。本発明の第３の具体例は、宿主細胞、例えば、イー・コリ（E.coli）宿主細胞において融合蛋白構築物を封入体の一部として発現させ、次いで、融合蛋白構築物を単離することを含む、ペプチドの製造方法を提供する。典型的には、融合蛋白構築物は少なくとも２コピーの標的ペプチドを含んでいる。しかしながら、融合蛋白構築物が、ＧＲＦ（１−４４）（配列番号：２０）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応する標的ペプチドを含んでいる場合、単一コピーの標的ペプチドのみを有する構築物を封入体の一部として発現させることができる。ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）は、それぞれ成長ホルモン放出因子、グルカゴン様ペプチド１および副甲状腺ホルモンに対応する選定アミノ酸を有するペプチドを表す。成長ホルモン放出因子のアミノ酸１−４４（ＧＲＦＲ（１−４４）（配列番号：２０））およびグルカゴン様ペプチド１のアミノ酸１−３６（ＧＬＰ１（１−３６）（配列番号：２４））に関する配列は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８１２５に開示されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。ヒト・副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１ −８４）（配列番号：２５））のアミノ酸１−８４に関する配列はHendy etal., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,78,7365(1981)およびT.Kimura et al.,BBRC,114,493( 1983)に開示されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明のもう１つの具体例は、融合蛋白構築物を開裂してカルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントを得ることを含む、ペプチドの製造方法を提供する。カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントを沈殿させる。沈殿したフラグメントを、有機成分を含む溶媒で抽出して可変的融合ポリペプチドフラグメントを回収することができる。また本発明は、宿主細胞、例えば、E.coli宿主細胞において発現された融合蛋白構築物を含む封入体を提供する。融合蛋白構築物はカルボニックアンヒドラーゼおよび標的ペプチドを含む。好ましくは、標的ペプチドは、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１ −３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列の少なくとも１つのコピーを含む。最後に、本発明は、カルボニックアンヒドラーゼおよび標的ペプチドを含む融合蛋白構築物も提供する。標的ペプチドは、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含む。図面の簡単な説明図１は、標的ペプチドの複数のユニットから形成された可変的融合ポリペプチドについての種々の公式を示す。発明の詳細な説明組み換えベクターと、宿主細胞または宿主生物という生合成装置との連携による外来蛋白の発現は、生化学的蛋白合成のためのよく知られた方法である。本発明は、新しく、ローコストで効率の高いペプチドの大規模生物学的合成方法を確立するためにカルボニックアンヒドラーゼをベースとした融合蛋白構築物と結び付いたこの発現方法の新規修飾を用いる。本発明方法は、化学的方法にのみ基づいたプロセス、すなわち、アフィニティークロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィー工程を必要としない組み換えペプチドの単離および／または精製のためのプロセスの設計を可能にする。また、融合蛋白構築物は、所望ならば、リガンド固定化アフィニティー分離法の使用を可能にする。本発明方法は、高価な機械類および試薬、長い合成時間、低い反応効率を除去し、さらに固相ペプチド合成法よりも不完全なコピーが少なく、高収率の生成ペプチドが得られる。本発明方法は、生物学的システムにより外来蛋白の発現を容易にすることのできる細胞の因子および生物学的成分の組み合わせを含む。発現された融合蛋白構築物は結合蛋白カルボニックアンヒドラーゼを含むので、細胞または生物の発現機構による標的ペプチドに対する特別な同一性の破壊を可能にしない。好ましい誘導的発現機構は、ペプチド構築物（そのようにしなければ宿主細胞に対して毒性を有しうる）の製造を可能にする。また本発明方法は、精製方法の効率、容量および収率に実質的に貢献する因子を含む。カルボニックアンヒドラーゼおよびカルボニックアンヒドラーゼを含む融合構築物の溶解特性は、他の構成成分からの可変的融合ポリペプチドの明確で完全な分離を容易にする。比較的低分子のカルボニックアンヒドラーゼは、融合構築物単位重量あたりの容量および効率を高めることを可能にする。該方法は特別な試薬または反応を必要としないので、望ましくない副産物の生成が回避される。標的ペプチドの性質およびコピー数によって融合蛋白構築物のサイズは変化するであろう。融合蛋白構築物は十分に大きくて宿主細胞による分解を回避するものであり（例えば、少なくとも約６０ないし８０個のアミノ酸）、宿主細胞により有効に発現されることができないほど大きいものではない。実際問題として、融合蛋白構築物は約５０００００までの分子量を有するであろうが、より大きな構築物も本発明の範囲内である。融合蛋白構築物が宿主細胞により発現されて蛋白配列におけるエラーの導入を回避できるように融合蛋白構築物のサイズを選択する。このことは、一定の構築物中に存在する標的ペプチドのコピー数に対して実際上の制限を課すものである。上で議論した因子により課せられる制限の範囲内で、個々の標的ペプチドのサイズおよび性質によって実際の数は変化するであろう。カルボニックアンヒドラーゼカルボニックアンヒドラーゼは種々のソースに由来する。適当なソースは脊椎動物であり、詳細には哺乳動物ソースのもの、例えば、ヒト・カルボニックアンヒドラーゼ（ｈＣＡ）、ラット・カルボニックアンヒドラーゼ、ネコ・カルボニックアンヒドラーゼ、ウマ・カルボニックアンヒドラーゼまたはウシ・カルボニックアンヒドラーゼを包含する。ヤギ、ネズミ、ブタおよびサルのごとき他の哺乳動物種由来のカルボニックアンヒドラーゼも本発明融合蛋白構築物の形成に用いることができる。適当なカルボニックアンヒドラーゼの例は、ヒト・カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ｈＣＡＩＩ；Taylor et al.,Biochemistry,9,2638(1970 )参照）である。カルボニックアンヒドラーゼは、修飾機能バージョンのカルボニックアンヒドラーゼであってもよい。修飾機能バージョンは、溶液の条件、例えば、特定のｐＨ、あるいは金属イオンもしくは塩濃度の関数として沈殿しうるカルボニックアンヒドラーゼの能力を保持しているであろう。約３.２ないし約６.０の間、より好ましくは約３.５ないし約５.５の間に溶液のｐＨを合わせることにより広範な溶液から沈殿しうる修飾バージョンが好ましい。典型的には、修飾機能バージョンは、阻害剤ベンゼンスルホンアミド、アセトアゾラミドまたはそれらの誘導体に強く結合するカルボニックアンヒドラーゼの能力も保持している。スルファニルアミドおよびアセトアゾラミド阻害剤に関するカルボニックアンヒドラーゼの結合特性についての詳細な議論は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４５１１にあり、参照により本明細書に記載されているものとみなす。適当に修飾されたカルボニックアンヒドラーゼの例は、（Ｉ）メチオニンを含まない、（ＩＩ）すべてまたはいくつかのグルタミン酸が別の負に帯電したアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸により置換されている、（ＩＩＩ）すべてまたはいくつかのアルギニンが別の正に帯電したアミノ酸、好ましくはリジンにより置換されている、（ＩＶ）すべてまたはいくつかのアスパラギンが別のアミノ酸、好ましくはグルタミンにより置換されている、（Ｖ）メチオニンが別のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、システイン、スレオニンまたはロイシンにより置換されている、あるいは（ＶＩ）システインが別のアミノ酸、好ましくはセリン、スレオニン、ロイシンまたはアラニンにより置換されている機能的置換変異体を包含する。カルボニックアンヒドラーゼの適当に修飾されたバージョンの例は、ｈＣＡＩＩのごときカルボニックアンヒドラーゼの機能的フラグメントを示すポリペプチド、例えば、ｈＣＡＩＩのシステイン２０５、アスパラギン２３１、メチオニン２４０またはロイシン２５０におけるＣ末端切断物あるいはプロリン２１またはグリシン２５におけるＮ末端切断物を包含するが、これらに限らない。機能的フラグメントは、ｐＨを調節することにより広範な溶液から沈殿するカルボニックアンヒドラーゼの能力を保持している。他の適当に修飾されたバージョンは、下記の置換を有するｈＣＡＩＩの置換変異体およびｈＣＡＩＩの機能的フラグメントの置換変異体を包含する：ｉ．すべてまたはいくつかのグルタミン酸残基が別の負に帯電したアミノ酸（ＡＡ）、好ましくはアスパラギン酸残基により置換されているｈＣＡＩＩｉｉ．すべてまたはいくつかのアルギニン残基が別の正に帯電したＡＡ、好ましくはリジン残基により置換されているｈＣＡＩＩｉｉｉ．［Ｎ１１Ｘ,Ｇ１２Ｘ］（アスパラギン、グリシン）、［Ｎ６２Ｘ,Ｇ６３Ｘ］、［Ｎ３２１Ｘ,Ｇ２３２Ｘ］、Ｍ２４０Ｘ（メチオニン）、またはＣ２０５Ｘ（システイン）におけるＡＡ位置についての１またはそれ以上の修飾であって下記のごとき修飾を有するｈＣＡＩＩまたはその機能的フラグメント（それらのＡＡ位置は一定のフラグメント中に存在する）：アスパラギンがグルタミンに変化、あるいはグリシンがアラニンに変化、メチオニンがアラニン、セリン、システイン、スレオニンまたはロイシンに変化、およびシステインがセリン、スレオニン、ロイシンまたはアラニンに変化。好ましくは、カルボニックアンヒドラーゼおよびカルボニックアンヒドラーゼを含んでいる融合蛋白は、約３.２ないし約６.０の間、好ましくは約３.５ないし約５.５の間、より好ましくは約４.０ないし約５.０の間に溶液のｐＨを合わせることにより広範な溶液から沈殿しうるものである。この方法を用いてカルボニックアンヒドラーゼが沈殿しうる溶液の例は、ポリエチレンイミン、尿素（例えば、少なくとも２Ｍ）またはグアニジン塩酸（例えば、少なくとも２Ｍ）を含む溶液を包含する。好ましくは、カルボニックアンヒドラーゼは、約３.２ないし約６.０のｐＨ範囲の外側では広範な溶液中で可溶性のままである。可変的融合ペプチド可変的融合ポリペプチドはいくつかの形態を有していてもよい（例えば、図１参照）。第１のものは単一の標的ペプチドを含む。第２のものは、アミノ酸または内部結合ペプチドにより連結された単一の標的ペプチドの複数の並んだユニットから構成される。この場合、通常には、内部結合ペプチドは、相互結合ペプチド（カルボニックアンヒドラーゼと可変的融合ポリペプチドとを連結する）とは構造および選択性において異なるが、必ずしも異なっているわけではない。異なる場合、それにもかかわらず内部結合ペプチドは、相互結合ペプチドと同じ一般的機能を有しており、その結果、酵素的または化学的性質を有する２種の異なる開裂剤が別々に可変的融合ポリペプチドをカルボニックアンヒドラーゼから開裂し、さらに個々の標的ペプチドを互いに開裂するであろう。第３の形態は、さらに内部の結合ペプチド（innerconnecting peptide）によって並んで互いに連結されているいくつかの（すなわち、２個またはそれ以上の）同一または異なる標的ペプチドから構成される単一ユニットである。４番目の形態は、内部結合ペプチドにより連結されている繰り返しのある複数の並んだユニットから構成されるものであり、各ユニットは、さらに内部の結合ペプチドにより連結された異なる個々の標的ペプチドの同じシリーズを含む。５番目の形態は、内部結合ペプチドにより連結されている並んだユニットの同じシリーズから構成されるものであり、各ユニットは、さらに内部の結合ペプチドにより連結されたいくつかの同一または異なる標的ペプチドを含み、標的ペプチドはユニットごとに繰り返さない。６番目の形態は、複数の同一の並んだユニットから構成されるものであり、各ユニットは、さらに内部の結合ペプチドにより連結されたいくつかの同一の標的ペプチドを含む。標的ペプチドは、生成物として望まれる天然または合成ペプチド、例えば、所望蛋白、オリゴヌクレオチドまたは低分子ペプチドの全体または一部を含んでいてもよい。本願の目的のためには、ペプチドは、ペプチド結合により連結された少なくとも２個のアミノ酸残基を含む。可変的融合ポリペプチド中の単一または複数の連結したユニットとして出現してもよい標的ペプチドの適当な具体例は、カルトリン、カルシトニン、インスリン、組織プラスミノゲンアクチベーター、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン、オキシトシン、バソプレッシン、ＡＣＴＨ、コラーゲン結合蛋白、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド、グルカゴン、プロインスリン、腫瘍壊死因子、サブスタンスＰ、脳ナトリウム排泄増加ペプチド、抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖、特に、Lerner,Science,246,1275 et seq.（１９８９年１２月）により特徴づけられているような単離可変領域のごとき個々の抗体鎖フラグメント（ＶＨまたはＶＬ）およびE.Ward et al.,Nature,341,544-546(1986)により特徴づけられているようなエピトープ領域を包含する（ここに、抗体、鎖、フラグメントおよび領域は、抗原性物質に対する天然の抗原性または免疫遺伝学的に得られた抗原性を有する）。望ましいポリペプチドのさらなる具体例は、甘味ペプチド、気分転換性ポリペプチド、神経成長因子、調節蛋白、機能性ホルモン、酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修飾酵素、構造ポリペプチド、神経ペプチド、心臓血管系、呼吸器、排泄器、リンパ器官、免疫、血液、生殖、細胞刺激および生理学的機能系に対する影響を及ぼすポリペプチド、白血病阻害因子、抗生物質ペプチドおよびに静細菌ペプチド（セクロピン、アタシン、アピダエシンのごとき）、殺昆虫、除草および殺真菌ペプチド、ならびにリゾチームを包含する。式： −ＴａｒｇＰ−（ＣＳ２）−［−（Ｌｎ１）_n−（ＣＳ１）_m−ＴａｒｇＰ−（ＣＳ２）−］_r ［式中、−ＣＳ１−および−ＣＳ２−は開裂部位、−（Ｌｎ１）−は連結配列、 −ＴａｒｇＰ−は標的ペプチド、ｎおよびｍは０または１、ｒは１から約１５０までの整数を意味する］を有するアミノ酸配列を含むペプチドは適当な可変的融合ポリペプチドに属する。標的ペプチドは、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）またはＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）に対応するアミノ酸配列を含んでいてもよい。−（ＣＳ１）−および−（ＣＳ２）−開裂部位は化学的開裂部位であっても酵素的開裂部位であってもよい。酵素的開裂部位はエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼにより認識されうる（例えば、ｒが１の場合は、−（ＣＳ２）−が構築物のＣ末端残基）。好ましくは、酵素的開裂部位はエンドペプチダーゼにより認識される。開裂部位融合蛋白構築物は化学的開裂部位または酵素的開裂部位を有していてもよい。融合蛋白構築物中に含まれていてもよい開裂部位または開裂部位（複数）は、存在する標的ペプチドの同一性に左右される。典型的には、標的ペプチドが開裂部位に対応するアミノ酸配列を含まないように開裂部位および標的ペプチドを選択する。次に、個々の開裂部位の選択を考える。いくつかの場合には、酵素的開裂反応の使用を回避するように開裂部位を設計してもよい。Ｓ−シアニル化剤（例えば、２−ニトロ−５−チオシアナートベンゼン）での処理後、または約３.０未満のｐＫ_aを有する酸での処理により開裂されうる化学的開裂部位を用いることによってこれを行うことができる。他の例において、特別な官能基、例えば、Ｃ末端α−カルボキシアミド基を導入するための標的ペプチドの修飾を可能にする開裂部位を用いることが望ましいかもしれない。化学的および酵素的開裂部位ならびにこれらの部位の１つに近接したペプチド結合の開裂を行うために用いられる対応する剤は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４５１１およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０８１２５に詳細に記載されており、それらの開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明において開裂部位として使用するのに適したペプチド配列（およびそれをコードしているＤＮＡ遺伝子配列）ならびにそれらの対応開裂酵素または化学的開裂条件の例を下表１に示す。示された遺伝子配列は、対応ペプチド配列をコードしている１の可能性である。同じペプチド配列をコードする他のＤＮＡ配列を構築してもよい。組み換えペプチドの製造組み換え融合蛋白構築物遺伝子を担持している発現ベクターで形質転換された宿主細胞を用いて融合蛋白構築物を発現させることができる。宿主細胞は原核もしくは真核宿主細胞または高等生物中の細胞であってよい。本発明の１の好ましい具体例において、宿主細胞はE.coliのごとき微生物宿主細胞である。融合蛋白構築物をコードしているＤＮＡセグメントを適当な基本となるベクター中に挿入することにより、蛋白精製構築物遺伝子を担持しているベクターを調製することができる。単一および多コピーの組み換え融合蛋白生成物の発現方法は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４５１１に開示されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。発現ベクターは、組み換え遺伝子ならびに転写、翻訳、表現型決定、一時的な発現調節または他の発現調節、ＲＮＡ結合および発現産物についての発現後加工のための適当な調節ＤＮＡ配列のごとき基本となるベクターセグメントを含んでいる。一般的には、プロモーター、オペレーター、調節配列および転写終止シグナルのごとき構造的特徴が発現ベクターに含まれている。宿主細胞または高等生物に適合し、上記特徴を提供するいずれかの基本となるベクターから発現ベクターを合成してもよい。発現ベクターの調節配列は、ある種の方法で、原核または真核宿主細胞または高等生物に適合または適用されるであろう。ポリペプチド構築物の分泌を引き起こす発現後調節配列が真核発現ベクターに含まれていてもよい。発現ベクターが宿主細胞または高等生物に対して刺激効果を示し、その結果ポリペプチド構築物が宿主の通常の生合成発現よりも過剰発現されることが特に好ましい。典型的には、得られた組み換えベクターを用いる宿主細胞または高等生物の形質転換に使用される適当な基本ベクター中に組み換え遺伝子を挿入する。宿主細胞または高等生物中で可溶性生成物として、あるいは細胞中で不溶性の生成物として融合蛋白構築物を発現させることができる。別法として、融合蛋白構築物を、宿主細胞または高等生物により分泌される生成物として発現させてもよい。好ましくは、E.coliのごとき宿主細胞中で封入体、すなわち不溶性物質の凝集体の一部として融合蛋白構築物を発現させてもよい。封入体の一部として発現される融合蛋白構築物は、典型的には、２またはそれ以上のコピー数の標的蛋白を含む。カルボニックアンヒドラーゼをベースにした大部分の単一コピーの融合蛋白構築物は可溶性生成物として発現されることがわかっている。例えば、ｈＣＡＩＩおよび単一コピーの標的ペプチド（例えば、カルシトニン、サブスタンスＰ、アンギオテンシン、ＡＴＰａｓｅ−ＩＰ、εＳＵＡＴＰａｓｅおよびアスパラギンシンセターゼ）を含む単一コピーの融合蛋白構築物は、E.coli中で可溶性蛋白として発現される。驚くべきことに、しかしながら、いくつかの場合において、単一コピーのカルボニックアンヒドラーゼをベースとした融合蛋白が封入体の一部として発現されうることが見いだされた。詳細には、ｈＣＡＩＩおよび単一コピーのＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）またはＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）を含む融合蛋白は、E.co li BL21 F^-ompTrB^-mB^-（ＤＥ３）のごときE.coli宿主細胞において封入体の一部として発現される。本発明は、カルボニックアンヒドラーゼを含む融合蛋白構築物または融合蛋白構築物のフラグメントのいずれか（まとめて「ＣＡベースの蛋白」という）を沈殿させることを含む、組み換えペプチドの製造方法を提供する。ｈＣＡＩＩは、その無傷の形態の酵素のほぼ中性の溶液を酸性にした場合に沈殿することが知られている。ｐＨを低下させることは、無傷の酵素から亜鉛カチオンを除去し、実質的なコンホーメーション変化を誘発して沈殿を引き起こすと考えられている。驚くべきことに、カルボニックアンヒドラーゼ、詳細にはｈＣＡＩＩのごとき哺乳動物カルボニルアンヒドラーゼは、無傷の形態であるかどうかにかかわらず、ｐＨの関数としてこれと同じ溶解性の挙動を示すことが見いだされている。そのうえ、同様の方法でｐＨの関数としてカルボニックアンヒドラーゼを含む融合蛋白を沈殿させうることが見いだされた。典型的には、ｐＨを約３.２ないし約６. ０の間、好ましくは約３.５ないし約５.５の間、より好ましくは約４.０ないし約５.０の間に合わせることによって簡単にＣＡベースの蛋白を溶液から沈殿させることができる。ＣＡベースの蛋白を、高塩農度溶液、例えば、少なくとも約５％（ｗ／ｖ）の硫酸ナトリウムあるいは少なくとも約５％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム含有溶液から沈殿させてもよい。本発明の１の具体例において、融合蛋白構築物を沈殿させることを含む方法により、組み換えペプチドを単離する。可溶性生成物として発現された融合蛋白構築物または封入体の一部として発現された融合蛋白構築物に関して沈殿工程を行うことができる。後者の例において、沈殿工程の前に、例えば少なくとも約０. ５Ｍのクエン酸を含む溶液中で封入体を溶解する。融合蛋白構築物を種々の他の溶液、例えば、カオトロピック剤（例、グアニジン塩酸）または界面活性剤（例、ＳＤＳ）を含有する溶液、少なくとも約２Ｍの尿素を含有する溶液、あるいは少なくとも約１０.０のｐＨを有する溶液中で溶解してもよい。溶液のｐＨを約３.２ないし約６.０の間、好ましくは約３.５ないし約５.５の間に合わせることにより、融合蛋白構築物を上記溶液から沈殿させることができる。いくつかの場合に、ｐＨ調節以外に溶液への塩の添加によって沈殿効率を向上させることができる。適当な塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ランタニウムを包含する。Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｓｒ²⁺またはＣｏ²⁺のごとき２価金属イオンをｐＨ調節と組み合わせて沈殿効率を向上させてもよい。可溶化した融合蛋白構築物をアルカリ溶液から沈殿させる場合、典型的には、酢酸、ギ酸、クエン酸、リン酸および塩酸のごとき酸を添加することにより溶液のｐＨを調節する。ｐＨ調節による沈殿に対する別法として、十分量の硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのごとき塩を添加することにより、可溶化した融合蛋白構築物を沈殿させてもよい。いくつかの例において、組み換えペプチドの単離における最初の工程として、細胞残渣および核酸物質を粗細胞溶解物から除去することが有用であるかもしれない。典型的には、少なくとも約０.２５％、好ましくは少なくとも約０.３８％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を溶解物に添加することにより、これを行う。一般的には、ＰＥＩの添加は、存在する細胞残渣およびＤＮＡの約９０−９５％を沈殿させる。次いで、ＰＥＩ溶液のｐＨを約３.５ないし約６.０の間に合わせることにより簡単にｍＣＡベースの融合蛋白を上清から沈殿させることができる。例えば、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１０.５のｐＨを有する溶液に溶解することにより、沈殿した融合蛋白を再溶解させることができる。沈殿した融合蛋白を、カオトロピック剤、界面活性剤または少なくとも０.５Ｍのクエン酸を含む溶液のごとき他のタイプの溶液に再溶解してもよい。開裂後、カルボニックアンヒドラーゼ含有フラグメント（「カルボニックアンヒドラーゼフラグメント」）を、クロマトグラフィー、濾過または好ましくは沈殿法により除去することができる。上記のごとく、溶液のｐＨを約３.５ないし約６.０の間に再調整することにより簡単にカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることができる。所望であれば、別法として、リガンド固定化アフィニティー分離法を用いて、カルボニックアンヒドラーゼフラグメントを開裂生成物から分離してもよい。例えば、開裂生成物の溶液をベンゼンスルホンアミド化合物またはアセトアゾラミド化合物を包含する阻害剤（例えば、アフィニティーカラム）と接触させることにより、無傷または変性形態のカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを除去することができる。好ましくは、ベンゼンスルホンアミド化合物は、アミノ置換されたベンゼンスルホンアミド（例えば、４−アミノ−ベンゼンスルホンアミド）またはその誘導体のごときスルファニルアミド化合物を包含する。アセトアゾラミド化合物は５−アセトアミド−１,３,４−チアジアゾール −２−スルホンアミドまたはその誘導体である。本発明のもう１つの具体例において、組み換えペプチドの製造方法は、（ｉ）融合蛋白構築物を開裂して可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可溶性の可変的融合ポリペプチドフラグメントを得て、次いで（ｉｉ）カルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることを含む。カルボニックアンヒドラーゼフラグメントは、カルボニックアンヒドラーゼ以外に他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。典型的には、これらの他のアミノ酸残基は、融合蛋白構築物中に存在する相互結合ペプチド由来である。本発明に用いる適当な相互結合ペプチドは、化学的または酵素的開裂部位を含むアミノ酸配列を包含する。開裂後、典型的には、カルボニックアンヒドラーゼフラグメントは相互結合ペプチドまたはその誘導体の少なくとも一部を含んでいる。一般的には、誘導体は、開裂反応の副産物として生成される。例えば、メチオニン残基のＣ末端ペプチド結合において融合蛋白構築物を開裂することにより、Ｃ末端ホモセリン残基を有するカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを作ってもよいカルボニックアンヒドラーゼフラグメントの沈殿後に残存する上清フラクションを遠心分離により単離することができる。上清フラクションは可変的融合ポリペプチドフラグメントを含んでおり、所望であれば、ペプチドの単離に使用する慣用的方法により可変的融合ポリペプチドフラグメントをさらに精製する。可変的融合ポリペプチドフラグメントの回収率を向上させるために、沈殿したカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを、有機溶媒を含む溶媒で抽出してもよい。適当な溶媒は、アセトニトリル、プロパノール、クエン酸、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物のごとき有機成分を含む。例えば、有機溶媒を含む水溶液、例えば、５０％アセトニトリル水溶液および５０％ｎ−プロパノール水溶液を用いて抽出を行うことができる。開裂反応に供する前に、種々の方法により融合蛋白構築物を精製してもよい。例えば、リガンド固定化アフィニティー分離法を用いて、あるいは沈殿法により融合蛋白構築物を精製することができる。再生またはアフィニティー精製を必要とせずに、沈殿、濾過または遠心分離のごとき湿化学的分離法にのみ依存する方法によって組み換え融合蛋白構築物が得られる場合には、沈殿法による融合蛋白構築物の精製が好ましい。本発明の第３の具体例は、融合蛋白構築物をE.coli宿主細胞中で封入体の一部として発現させ、次いで、融合蛋白構築物を単離することを含む、組み換えペプチドの製造方法を提供する。典型的には、融合蛋白構築物は複数コピーの標的ペプチドを含んでいる。しかしながら、上記のように、１つのｍＣＡならびにＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）に対応する単一コピーのアミノ酸配列を含む融合蛋白構築物を発現することが可能である。E.coli宿主細胞中で封入体として発現されうる適当な単一コピーの融合蛋白の例は、ｈＣＡＩＩならびに単一コピーのＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＲＦ（１− ４４）（配列番号：２０）、ＧＬＰ１（１−３４）（配列番号：２６）ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）、ＧＬＰ１（７−３６）（配列番号：２７）、ＧＬＰＩ（７−３７）（配列番号：２８）、ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）、ＰＴＨ（１−３８）（配列番号：２９）およびＰＴＨ（１−８４）（配列番号：２５）のうちのいずれか１つを含む封入融合蛋白である。慣用的方法、例えば遠心分離により、封入体を粗細胞溶解物から単離することができる。５０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.８の溶液または１００ｍＭＥＤＴＡ溶液で封入体を洗浄して存在する細胞残渣および／または核酸物質を除去するような最初の精製工程に粗封入体を供することができる。種々の条件下で封入体を溶解することができる。例えば、約３.２未満のｐＨを有する酸性条件下の溶液（例えば、少なくとも約５００ｍＭのクエン酸を含む溶液）に封入体を溶解することができる。別法として、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液に封入体を溶解してもよい。少量のＮ−ラウロイルサルコシンのごとき界面活性剤を溶液に添加することにより、塩基性条件下での封入体の溶解を容易にすることができる。有効量の６ＮＨＣｌまたは尿素、あるいはＮ−ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウムまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）のごとき界面活性剤を含む溶液に封入体を溶解してもよい。上記のごとく封入体を溶液に溶解した後、溶液のｐＨを約３.５ないし約６.０の間、好ましくは約４.０ないし約５.０の間に合わせることにより可溶化した融合蛋白構築物を沈殿させうることを、意外にも見いだした。別法として、リガンド固定化アフィニティー分離法を含むプロセスにより、可溶化した融合蛋白構築物を単離してもよい。本発明のもう１つの具体例は、融合蛋白構築物を開裂してカルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントを得て、次いで、カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントの両方を沈殿させることを含む。沈殿したフラグメントを有機成分を含む溶媒で抽出して可変的融合ポリペプチドフラグメントを回収することができる。適当な溶媒は、アセトニトリル、プロパノール、クエン酸、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物のごとき有機成分を含む。以下の詳細な実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。実施例１．発現系の説明宿主細胞の起源、表現型および遺伝子型発現世細菌宿主E.coli BL21 F^-ompTr_B ^-m_B ^-（ＤＥ３）をNovagen,Inc.,Madison ,WIから得た。これらのE.coli細胞は、バクテリオファージＴ７プロモーターを含む発現ベクター中にクローンされた遺伝子を高レベルで発現する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むバクテリオファージ（ＤＥ３）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込んだ。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はｌａｃＵＶ５プロモーターおよびｌａｃＩ遺伝子産物により制御される。ｐＢＮ１の構築ｈＣＡＩＩ遺伝子を含有する発現ベクターｐＥＴ３１Ｆ１ｍｈＣＡＩＩを、フロリダ大学のP.J.Laipis博士から得た。Tanhauser et al.,Gene,117,113(1992) により記載されているようにしてｐＥＴ３１Ｆ１ｍｈＣＡＩＩが調製された。プラスミドｐＥＴ３１Ｆ１ｍｈＣＡＩＩは、ｐＵＣ由来のプラスミド骨格中のバクテリオファージＴ７プロモーターの下流のｈＣＡＩＩ（ヒト・カルボニックアンヒドラーゼＩＩ）に関するコーディング領域を含んでいる。２個の合成オリゴヌクレオチド５'−ＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴ−３'（配列番号：７）およびその相補的配列５'−ＡＧＣＴＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＡ−３'（配列番号：８）を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ３１Ｆ１ｍｈＣＡＩＩ中にクローンした。このプラスミドをｐＡ１と命名した。プラスミドｐＡ１を制限酵素ＳｓｐＩおよびＢｓｐＥＩで消化し、生じた末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化した。Ｔ７−ｈＣＡＩＩカセットを含有するｐＡ１消化物由来のＤＮＡフラグメントをｐＢＲ３２２（New Englan d Biolabs）のＳｃａＩ制限部位中にサブクローンし、かくしてテトラサイクリン耐性を付与したがアンピシリン耐性は付与しなかった。得られたプラスミドをｐＢＮ１と命名した。ｐＢＮ４の構築ｐＡ１プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位において開環し、合成オリゴヌクレオチド５'−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴ−３'（配列番号：９）およびその相補的配列５'−ＡＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡＡＴＴＣ−３'（配列番号：１０）をベクター中にクローンした。これらのオリゴヌクレオチドの挿入により、ユニークなＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位をｈＣＡＩＩのカルボキシル末端に含むＴ７−ｈＣＡＩＩカセットを得た。得られたプラスミドをｐＡ３と命名した。ｐＢＮ１ベクターをＥｃｏＲＩで消化し、１本鎖オーバーハングをポリメラーゼＩ大（クレノウ）フラグメントで充填した。新たに生じた平滑末端を有する直鎖状プラスミドを再連結し、かくしてＥｃｏＲＩ部位を破壊した。得られたプラスミドをｐＢＮ３と命名した。プラスミドｐＡ３を制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩで消化した。Ｔ７−ｈＣＡＩＩカセットを含有するｐＡ３消化物由来のＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩで消化したｐＢＮ１ベクター中にサブクローンした。得られたベクターをプラスミドｐＢＮ４と命名した。実施例２．ｈＣＡ融合構築物の接種調製Ｌ−ブロスを液体サイクルにセットしたオートクレーブで１２１℃、２０分滅菌した。グルコースおよびテトラサイクリンストック溶液を、０.２２μｍフィルターで濾過した。２個の２５０ｍｌの振盪フラスコそれぞれに下記溶液を入れた：５０ｍｌＬ−ブロス（１.０％トリプトン、１.０％ＮａＣｌ、０.５％酵母エキス）１.０ｍｌグルコースストック溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌテトラサイクリンストック溶液（５.０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ所望ｈＣＡ−融合構築物をコードしているベクターでトランスフェクションしたE.coli細胞融解接種物振盪フラスコを３７℃のインキュベーター振盪器（２００−２２０ｒｐｍ、１０−１４時間）においた。次いで、得られた溶液中の細胞の光学密度（Ｏ.Ｄ.）を５４０ｎｍで測定した。通常には、適当な読みを得るためには１：１.２５希釈が必要であった。次いで、２個の振盪フラスコのうちの１つを、次の振盪フラスコのセットに接種するために選択した。３個の５００ｍｌの振盪フラスコそれぞれに下記滅菌済み溶液を入れた：２００ｍｌＬ−ブロス（１.０％トリプトン、１.０％ＮａＣｌ、０.５％酵母エキス）４.０ｍｌグルコースストック溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）６００μｌテトラサイクリンストック溶液（５.０ｍｇ／ｍｌ）１.０ｍｌ最初の２個の振盪フラスコのうちの１つからの接種物３本の振盪フラスコを上記条件下のインキュベーター振盪器に置き、細胞を８ −１０時間増殖させた。次いで、得られた溶液の光学密度を５４０ｎｍで測定した（典型的には１：１.２５希釈）。次いで、３個の振盪フラスコ全部を用いてファーメンターに接種した。実施例３．６０ＬスケールでのｈＣＡ−融合構築物の醗酵生産醗酵培地をファーメンターに入れ、蒸留水で体積を４５.０Ｌに調節した。培地は以下のものを含有していた：１２００.０ｇカザミノ酸；３００.０ｇ酵母エキス；３０.０ｇＮａＣｌ；および０.１０ｍｌアンチフォーム。ファーメンターを１２１℃で２５分滅菌した。ファーメンターを３７℃まで冷却した。接種前に、下記溶液をファーメンターに添加した：グルコース（８００.０ｍｌＨ₂Ｏ中４８０.０ｇ）マグネシウム（２５０.０ｍｌＨ₂Ｏ中１２０.０ｇＭｇＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ）リン酸塩（３.０ＬＨ₂Ｏ中１２０.０ｇＫ₂ＨＰＯ₄および４６５.０ｇＫＨ₂ ＰＯ₄）テトラサイクリン（３０.０ｍｌ９５％ＥｔＯＨおよび２０.０ｍｌＨ₂Ｏ中０.９０ｇテトラサイクリン・ＨＣｌ）下記ミネラル混合物（４９０.０ｍｌＨ₂Ｏおよび１０.０ｍｌ濃塩酸中に溶解）：３.６ｇＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ３.６ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０.９０ｇＭｎＳＯ₄ ０.９０ｇＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ０.０９ｇＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０.１８ｇモリブデン酸０.３６ｇＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏテトラサイクリンおよびミネラル混合物溶液を除き、上記溶液のすべてを、液体サイクルとしたオートクレーブで２０分滅菌した。テトラサイクリンおよびミネラル混合物溶液を０.２２μｍのフィルターを通すことにより滅菌した。典型的にはこの時点でｐＨが約６.５に低下した。このことが起こった場合には、塩基（１４.８Ｎアンモニア水）を添加してｐＨを６.８に調節した。ｐＨ６.８に達した後、６００.０ｍｌの接種物をファーメンターに添加した。タイムゼロおよび醗酵期間中、下記パラメーターをモニターした：グルコース濃度（約２−５ｇ／Ｌに維持）；光学密度；ｐＨ（６.８が最適付近）；溶存酸素（４０％が最適付近）；および撹拌速度。醗酵期間中、温度を３７℃に維持した。初期溶存酸素濃度は９０％であったが、急速に低下して４０％となった。撹拌速度および酸素補充をを増加させることにより、醗酵期間中このレベルを維持した。酸素補充を開始した場合には、空気流入量を２０Ｌ／分に減少させた。初期グルコース濃度は約９ｇ／Ｌであったが、約６時間後に５ｇ／Ｌに低下した。グルコース濃度がこのレベルに低下したら、グルコースフィード（７０％ｗ／ｖグルコース）を用いてグルコース濃度を５ｇ／Ｌに維持した。１５−２０のＯ.Ｄ.が測定されるところまで醗酵が進行した時、培地フィードを開始した。培地フィード物は、５.０Ｌの蒸留水に溶解された１２００.０ｇカザミノ酸および３００.０ｇ酵母エキスからなっており、液体サイクルで２０分滅菌されたものであった。培地フィード物を１.０−１.５時間かけてファーメンターに添加した。醗酵がＯ.Ｄ.３０.０にまで進行した時、下記溶液をファーメンターに添加することにより醗酵を誘導した：イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ；２００ｍｌの蒸留水中２８.８ｇ）；ＺｎＣｌ₂（１滴の６ＮＨＣｌを含む５０ｍｌの蒸留水中０.８１８ｇ）。ＩＰＴＧ溶液を０.２２μｍのフィルターで滅菌した。ＺｎＣｌ₂溶液を、液体サイクルにしたオートクレーブを用いて２０分間滅菌した。添加後、ファーメンター中のＩＰＴＧ濃度は２.０ｍＭであり、ＺｎＣｌ₂濃度は１００μＭであった。次いで、アミノ酸混合物のフィードを開始した。アミノ酸フィード物は、２２５.０ｇＬ−セリン；７５.０ｇＬ −チロシン；７４.０ｇＬ−トリプトファン；７５.０ｇＬ−フェニルアラニン；７５.０ｇＬ−プロリン；および７５.０ｇＬ−ヒスチジンからなっており、１.５ＬＨ₂Ｏおよび５００ｍｌ濃塩酸の混合物に溶解されていた。インキュベーションを２.０時間継続し、次いで、醗酵ブロスを収穫タンクに移し、約５− １０℃まで冷却した。典型的には、醗酵収量は湿細胞ペーストとして６.５ないし９.５ｋｇの間であった（乾燥細胞重量は約１.０−１.５ｋｇ）。実施例４．６０Ｌ醗酵の収穫上記ファーメンターからの細胞懸濁液を十字クロスフロー膜で濃縮して体積を１０Ｌとした。濃縮細胞懸濁液を限界濾過し、３０Ｌの冷洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄ ｐＨ７.８、１.０ｍＭＥＤＴＡ、および０.１０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有）で洗浄した。次いで、細胞懸濁液を８Ｌにまで濃縮した。典型的には、細胞懸濁液の濃縮および洗浄には６−１０時間かかった。次いで、濃縮細胞懸濁液（細胞ペースト）を袋に詰めて、後の処理のために凍結するか、あるいは細胞溶解のためにタンク付きホモジナイザーに移した。実施例５．細胞溶解６０Ｌファーメンターから得られた細胞ペーストを冷洗浄バッファー（上記）で希釈して３２Ｌとし、得られた細胞懸濁液を５−１０℃まで冷却した。冷却細胞懸濁液を、Galin高圧ホモジナイザーを用いて１２０００ｐｓｉでホモジナイズした。ホモジナイズした細胞ペーストを熱交換器に通して溶解物を１０℃まで冷却し、２回目のホモジナーザーに通した。実施例６．スロンビンストック溶液の調製融合蛋白の開裂反応に用いるスロンビンを、Calbiochemから凍結乾燥粉末形態で得た。Milli Q水に溶解して比活性として測定した場合に１ｍｇ／ｍｌの濃度とすることにより、この粉末を使用前に可溶化した。実施例７．ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）の製造ｈＣＡＩＩ、相互結合ペプチド、およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）をコードしているＤＮＡセグメントを含むＰＴＨ構築物をコードしている発現ベクターを調製することにより、単一コピーのＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）融合蛋白をコードしているＤＮＡセグメントの調製を行った。Operon Tec hnologies Inc,1000 Atlantic Ave.Alameda CA 94501から下記オリゴを得た。８つの合成ＤＮＡオリゴを得て、相補的配列をホスホリレーションし、アニーリングした。４つの２本鎖フラグメントを用いて、ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）が後に続くペプチド間リンカー（interpeptide linker）をコードしているＤＮＡフラグメントを調製した。このＤＮＡフラグメントを、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化し、ｐＡ１中に挿入して、ベクターｐＡ１：ＰＴＨ（１−３４）を作成した。制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩを用いて発現カセットをｐＡ１：ＰＴＨ（１−３４）から取り、同じ制限エンドヌクレアーゼで消化したベクターｐＢＮ１中に挿入した。この最終ベクターをｐＢＮ１：ＰＴＨ（１−３４）と命名した。ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白をコードしているＤＮＡを含有するベクターｐＢＮ１：ＰＴＨ（１−３４）で形質転換したE.coli細胞を調製し、培養し、上記手順により溶解した。ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白は、ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）配列のＮ末端に隣接したスロンビン開裂部位（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を介してＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）に対応するアミノ酸配列に連結されているｈＣＡＩＩを含んでいた。ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白は、E.coli BL21 F^- ompTr_B ^-m_B ^-（ＤＥ３）細胞中の封入体として発現された。封入体の精製６０Ｌの醗酵から得られた細胞溶解物を、４００ｍｌ／分として連続フローローターにて２００００ｇで遠心分離した。ペレットは３００−５００ｇの粗封入体を含んでいた。粗ｈＣＡ−ＰＴＨ封入体を２Ｍのクエン酸に６０ｍｇ固体／ｍｌの濃度として懸濁し（４−８リットル）、５０％パルス速度、出力７０％でソニケーションした。２００００ｇで遠心分離することにより可溶化封入体を清澄化した。ｐＨが４−５になるまで１０ＮＮａＯＨを添加することにより上清中のｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白を沈殿させた。沈殿したｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白を２００００ｇの遠心分離により集めた。次いで、沈殿したｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白を、４ないし８リットルのMilli-Q水中５％酢酸／４５％ＥｔＯＨで洗浄し、沈殿したｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白を遠心分離により再度集めた。次いで、ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白を、４ないし８リットルの１００ｍＭＥＤＴＡで２回洗浄し、次いで、４−８リットルのMilli-Q水で１回洗浄し、各洗浄後に遠心分離により蛋白を集めた。ＰＴＨ（１−３４）のスロンビン開裂２００ｍｌの５０ｍＭＮａＯＨおよび０.２５％のＮ−ラウロイルサルコシンを含有する溶液を、ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白のペレットを入れたビンに添加する。ビンを３７℃の水浴中に入れてペレットを暖めて（典型的には２−５分）ペレットの可溶化を促進する。すべての大きな塊が解離するまで材料をホモジナイズする。５０ｍＭＮａＯＨおよび０.２５％Ｎ−ラウロイルサルコシンを含有する溶液でｐＨを１１.６ないし１１.９に合わせる。得られた溶液をソニケーションして、すべてのｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白ペレットを溶解させた。典型的には、ソニケーションを出力１０、パルサー・オン、７０％デューティーサイクルで２分間行う（バッチが小さいと時間がかからない）。２８０ｎｍの吸光度により反応溶液の蛋白濃度を決定する。理想的には、濃度は６−７ｍｇ／ｍｌであるべきである（６０Ｌの醗酵物を８ないし１０Ｌにした場合）。濃度が９ｍｇ／ｍｌよりも高い場合には、５０ｍＭＮａＯＨ／０.２５％Ｎ−ラウロイルサルコシン溶液で希釈して６−７ｍｇ／ｍｌとする。蛋白溶液を激しく撹拌し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨを８−８.２に合わせる。溶液が濁っている場合にはガラス繊維フィルターで濾過する。次いで、溶液を０.４５μｍの酢酸セルロース膜で濾過し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより蛋白濃度を決定する。固体ＮａＣｌを添加して最終濃度２５０ｍＭとする。スロンビンストック溶液１ｍｇ／ｍｌを添加して、酵素に対する蛋白の比を５０００：１ｗ／ｗとする。次いで、溶液を３７℃の水浴プレートで撹拌する。バッファーＡ（９５％水、５％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））からバッファーＢ（９５％ＡＣＮ、５％水、０.１％ＴＦＡ）までのグラジエント溶離によるＣ８カラムを用いるＨＰＬＣにより反応をモニターする。ＰＭＳＦの添加により反応を停止する。典型的には、４６− ４８分の出発物質に対応するピークの消失により反応完結が決定される。ＰＭＳＦを９５％ＥｔＯＨに溶解し、激しく撹拌されている反応混合物に直接添加する。当該スロンビン開裂により、６０ｇのｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白から５.１ｇのＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）が得られる。スロンビン切断されたＰＴＨ材料のクエン酸沈殿得られたヒト・カルボニックアンヒドラーゼ（ｈＣＡ−ＰＴＨ融合蛋白の開裂により得られる）および残存未加水分解融合蛋白の両方を、十分量のクエン酸を添加して１５０ｍＭとすることにより溶液から沈殿させ、所望ペプチド（ＰＴＨ１−３４）（配列番号：２２）を溶液中に残す。沈殿物質を遠心分離により除去する。上清を０.４５μｍのフィルターで濾過し、次いで、−８０℃で凍結するか、あるいはＣ８カラムで直接脱塩する。当該工程におけるペプチドからの収率は８５％である。所望ならば、１０−７０％バッファーＢ（水性アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ））のグラジエントを用いる調製用Ｃ８カラムによるクロマトグラフィーによりＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）を精製してもよい。ここに、バッファーＡは０.１％ＴＦＡ、９５％水、５％アセトニトリルであり、バッファーＢは０.１％ＴＦＡ、５％水、９５％アセトニトリルである。別法として、最初に１０−７０％バッファーＢのグラジエントで溶離する調製用Ｃ８カラムによりＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）試料を精製してもよい。ここにバッファーＡは、５ｍＭＨＣｌ、９５％水、５％アセトニトリルおよびバッファーＢである。ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）をグラジエントを用いて脱塩する。ここにバッファーＡは１０ｍＭ酢酸であり、バッファーＢは５０％エタノール水溶液中１０ｍＭ酢酸である。実施例８．ＧＬＰ（７−３６）−ＮＨ₂（配列番号：２７）の製造６つの合成ＤＮＡオリゴ（１−６）をホスホリレーションし、相補鎖をアニーリングした。オリゴペアー１および２をｐＵＣ１９（New England Biolabs.MAから市販されている）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ間に挿入した。次いで、オリゴペアー３および４をこのベクターのＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ間に挿入し、ｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−２２）と命名されたベクターを得た。オリゴペアー５ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ間に挿入し、ベクターＰＢ５：ＧＬＰ（２１−３４）ＡＦＡを得た。ｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−２２）をＮａｒＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＰＢ５：ＧＬＰ（２１−３４）ＡＦＡをＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、オリゴ５および６を含有しているＰＢ５：ＧＬＰ（２１−３４）ＡＦＡ由来のフラグメントを切断されたｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−２２）中に連結することにより、オリゴペアー５および６を含有するフラグメントをｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−２２）に挿入してｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−３４）ＡＦＡを得た。ｐＵＣ１９：ＧＬＰ（７−３４）ＡＦＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＧＬＰ１（７−３４）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号：３０）が後に続くペプチド相互リンカーをコードしている配列を含むフラグメントをｐＡ４に移し、ベクターｐＡ４：ＧＬＰ（７−３４）ＡＦＡを得た。ｐＡ４中のｈＣＡＩＩ遺伝子はメチオニン −２４０がシステインに変化するように変異させられていた。次いで、発現カセットを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩを用いてｐＡ４：ＧＬＰ（７−３４）から消化して、同じ制限エンドヌクレアーゼで消化したベクターｐＢＮ１に挿入した。得られたベクターをｐＢＮ６：ＧＬＰ（７− ３４）ＡＦＡと命名した。ｈＣＡ−ＧＬＰ１（７−３４）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（「ｈＣＡ−ＧＬＰ１−ＡＦＡ」）融合蛋白をコードしているＤＮＡを含んでいるベクターｐＢＮ６：ＧＬＰ（７−３４）ＡＦＡで形質転換されたE.coli細胞を上記のごとく調製し、培養し、溶解した。ｈＣＡ−ＧＬＰ１−ＡＦＡ融合蛋白は、ＧＬＰ１（７−３４）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号：３０）配列のＮ末端に隣接して存在するメチオニン残基を介してＧＬＰ（７−３４）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号：３０）に対応するアミノ酸配列に連結されているｈＣＡＩＩを含んでいた。ｈＣＡ−ＧＬＰ１−ＡＦＡ融合蛋白は、E.coli BL21 F^-ompTr_B ^-m_B ^-（ＤＥ３）中で封入体として発現された。封入体の精製細胞溶解物を２００００ｇの連続フローローターにて流量４００ｍｌ／分で遠心分離して、３００−５００ｇの粗封入体を含有するペレットを得た。粗ｈＣＡ −ＧＬＰ１−ＡＦＡ封入体を、溶解バッファーに固形分濃度２５％として懸濁し（１.２−２.０Ｌ）、Galinホモジナイザーで１３０００ｐｓｉでホモジナイズした。ホモジナイズした封入体を２００００ｇで遠心分離し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.５）溶液に再懸濁し、２回目のホモジナイズを行った。次いで、ホモジナイスした封入体を蒸留水に再懸濁した。得られた懸濁液をホモジナイズし、封入体を遠心分離により集める。精製封入体を１.５Ｍクエン酸に溶解し、遠心分離により清澄化する。ｐＨが４−５になるまでＮａＯＨを添加することによりｈＣＡ−ＧＬＰ１−ＡＦＡ融合蛋白を沈殿させ、遠心分離により単離した。ｈＣＡ−ＡＦＡの臭化シアン開裂ｈＣＡ−ＧＬＰ１−ＡＦＡ封入体を２.０Ｍクエン酸溶液に溶解して約３５− ４５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。濃ＨＣｌを用いて溶液をｐＨ１.０とし、全蛋白１ｇあたり０.２ｇの臭化シアン（ＣＮＢｒ）を添加した。ＨＰＬＣにより蛋白濃度を決定した。ＣＮＢｒ添加前に溶液にアルゴンを吹き込んでおいた。アルゴン雰囲気下で４−５時間開裂反応を進行させ、次いで、１ｇのＣＮＢｒあたり２ .２ｇのＤＬ−メチオニンを添加し、次いで、３０分撹拌することにより残存ＣＮＢｒを中和した。ＧＬＰ１（７−３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）の精製ＣＮＢｒ開裂反応で得られた溶液を、水中１０％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム溶液で１：１希釈してすべての蛋白およびペプチドを溶液から沈殿させた。試料を２００００ｇで１５分間遠心分離し、上清をデカンテーションした。蒸留水（２００ｍｌ）を各遠心バイアルに添加した。得られた混合物をホモジナイズし、２００００ｇで１５分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、同体積の５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）をペレット物質に添加した。試料をホモジナイズし、１０−１５分撹拌し、最後に２００００ｇで１５分遠心分離した。５０％アセトニトリル溶液での抽出を２回ないし３回繰り返して、ＧＬＰ１（７−３４）ＡＦＡ（配列番号：３０）をアセトニトリル溶液中９０−９５％の回収率で得た。抽出を５０％ｎ−プロパノールを用いて行ってもよい。ＤＯＷＥＸ−１への５０％ＡＣＮ抽出バッチの負荷 DOWEX-1（各２５０ｍｇのＧＬＰ１（７−３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）につき２５ｇ）を、５０％ＡＣＮ抽出溶液添加前に１０％ＡＣＮで前洗浄する。バッチ法でＤＯＷＥＸ−１に負荷し、２０分撹拌する。次いで、ＧＬＰ１（７ −３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）溶液からＤＯＷＥＸ−１を濾別する。低圧Ｃ８クロマトグラフィー５０％ＡＣＮ溶液を蒸留水で希釈して１２.５％ＡＣＮとし、Ｃ８樹脂へのＧＬＰ１（７−３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）の結合を容易にする。ペプチド溶液を低圧カラム中のＣ８樹脂上に負荷し、カラム体積の５倍の３０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ溶液でカラムを洗浄する。次いで、ＧＬＰ１（７−３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）を、蒸留水中５０％ＡＣＮ溶液で溶離する。５０％ＡＣＮ溶液を凍結乾燥してＧＬＰ１（７−３４）−ＡＦＡ（配列番号：３０）を得る。ＧＬＰ１（７−３６）ＮＨ₂（配列番号：２７）中へのＧＬＰ１（７−３４）ＡＦＡ（配列番号：３０）のトランスペプチデーションＧＬＰ１（７−３４）ＡＦＡ（配列番号：３０）（１ｍｍｏｌｅ）を、５ｍＭＣａＣｌ₂および４００ｍＭＧｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ₂を含有するＤＭＦ／Ｈ₂Ｏの５０／５０（ｖ／ｖ）溶液に溶解し、５ＭＮａＯＨを用いて溶液のｐＨを８. ０に合わせる。次いで、２ｍｇのＴＰＣＫ処理トリプシンを添加する。ＧＰＬ１（７−３６）ＮＨ₂（配列番号：２７）を生じるトランスペプチデーション反応は室温において２−３時間で完了する。所望ならば、水性アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ）バッファーのグラジエントを用いる調製用Ｃ８カラムでのクロマトグラフィーにより、ＧＬＰ１（７−３６）−ＮＨ₂（配列番号：２７）をさらに精製してもよい。実施例９．ＧＲＦ（１−４４）ＮＨ₂（配列番号：２０）の製造リンカーおよびペプチドのセグメントを含む８つのオリゴヌクレオチドをホスホリレーションし、相補的オリゴヌクレオチドペアー１および２、３および４、５および６、ならびに７および８をアニーリングした。オリゴヌクレオチドペアー１および２ならびに３および４を、ｐＴＺ１９Ｒベクター（Pharmacia Biotec h Inc.,NJから市販されている）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ部位間に同時に連結してｐＴＺ：ＧＲＦ（１−２９）を得た。オリゴヌクレオチドペアー５および６、ならびに７および８を、ｐＴＺ１９ＲベクターのＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に同時に連結してｐＴＺ：ＧＲＦ（２９−４４）Ａを得た。ｐＴＺ：ＧＲＦ（１−２９）およびｐＴＺ：ＧＲＦ（２９−４４）Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｍｎＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＴＺ：ＧＲＦ（１−２９）ベクターから１.９ｋｂのバンドを得て、そしてｐＴＺ：ＧＲＦ（２９−４４）Ａベクターから０.９ｋｂのバンドを得て、それらを連結することにより、遺伝子フラグメントを互いに隣接させて単一ベクター中にクローンしてベクターｐＴＺ：ＧＲＦ（１−４４）Ａを得た。プラスミドｐＡ１中の特定のコドンについての部位特異的突然変異により、ｈＣＡＩＩ中の３つのＡｓｎ−Ｇｌｙ部位（位置１０−１１、６１−６２および２３０−２３１に存在）をＧｌｎ１０−Ｇｌｙ１１、Ｇｌｎ６１−Ｇｌｙ６２およびＡｓｎ２３０−Ａｌａ２３１に変化させた。３つの変異すべてを連合してプラスミドｐＡ２を作成した。ｐＡ２ベクターをＥｃｏＲＶで消化した。ｐＴＺ：ＧＲＦ（１−４４）ＡをＤｒａＩおよびＥｃｏＲＶで消化した。ＧＲＦ遺伝子を含むフラグメントおよび直鎖状となったｐＡ２プラスミドを連結してｐＢＮ２：ＧＲＦ（１−４４）Ａを得た。ｈＣＡ−ＧＲＦ融合蛋白をコードしているＤＮＡを含んでいるベクターｐＢＮ２：ＧＲＦ（１−４４）Ａで形質転換したE.coli細胞を上記のごとく調製し、培養し、溶解した。ｈＣＡ−ＧＲＦ融合蛋白は相互結合ペプチドを介してＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａ（配列番号：３１）に対応するアミノ酸配列に結合したｈＣＡＩＩを含んでいた。相互結合ペプチドはスロンビン開裂部位およびエンテロキナーゼ開裂部位を含んでいた。エンテロキナーゼ開裂部位（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：２）はＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａ（配列番号：３１）配列のＮ末端に隣接して存在した。スロンビン処理後にｈＣＡ−ＧＲＦ融合蛋白が、ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａ（配列番号：３１）配列のＮ末端に接続された８個のアミノ酸の配列（Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：１９）を有するペプチドフラグメントを生じるようにスロンビン開裂部位（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）が存在していた。ｈＣＡ−ＧＲＦ融合蛋白は、E.coli BL21 F^-ompTr_B ^-m_B ^-（ＤＥ３）中で封入体として発現された。封入体の精製細胞溶解物を、４００ｍｌ／分として連続フローローターにて２００００ｇで遠心分離した。ペレットは３００−５００ｇの粗封入体を含んでいた。粗ｈＣＡ −ＧＲＦ−Ａｌａ封入体を２Ｍのクエン酸に６０ｍｇ固体／ｍｌの濃度として懸濁し（５−９リットル）、５０％パルス速度、出力７０％でソニケーションした。２００００ｇで遠心分離することにより可溶化封入体を清澄化した。ｐＨが４−５になるまで１０ＮＮａＯＨを添加することにより上清中のｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を沈殿させた。沈殿したｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を２００００ｇの遠心分離により集めた。次いで、沈殿したｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を、Milli-Q水中５％酢酸／４５％ＥｔＯＨで洗浄し、沈殿したｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を遠心分離により再度集めた。次いで、沈殿したｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を、１００ｍＭＥＤＴＡに２回再懸濁し、遠心分離により融合蛋白を集めた。洗浄され、沈殿したｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白を蒸留水に懸濁した。懸濁液をホモジナイズし、ｈＣＡ−ＧＲＦ− Ａｌａ融合蛋白を遠心分離により集めた。ｈＣＡ−ＧＲＦ融合蛋白のスロンビン開裂５０ｍＭＮａＯＨおよび０.２５％Ｎ−ラウロイルサルコシンを含有する溶液のうち２００ｍｌを、ｈＣＡ−ＧＲＦ−Ａｌａ融合蛋白のペレットを入れたビンに添加した。ビンを３７℃の水浴に入れてペレットを暖めた。ＮａＯＨ溶液をビンの壁に沿わせるようにビンを回転させてビンの壁からすべての固体物質を除去した。次いで、スラリーを適当なサイズのビーカーに注いだ。材料をホモジナイズしてすべての大きな塊を解離させ、ｐＨをモニターした。５０ｍＭＮａＯＨおよび０.２５％Ｎ−ラウロイルサルコシンの溶液を用いてｐＨを１１.６ないし１１.９の間に合わせた。溶液をソニケーションしてすべての封入体ペレットを解離させ、溶液を透明にした。バッチのサイズに応じてソニケーション時間を変更した。典型的には、１リットル以上のものは２分間、出力１０、パルサー・オン、７０％デューティーサイクルでソニケーションした（小さいバッチは時間がかからなかった）。反応溶液の蛋白濃度を測定した。濃度が９ｍｇ／ｍｌよりも高い場合には、溶液を５０ｍＭＮａＯＨ／０.２５％Ｎ−ラウロイルサルコシン溶液で希釈して蛋白濃度を６−７ｍｇ／ｍｌとした。蛋白溶液を激しく撹拌し、１ＭＴｒｉｓ− ＨＣｌでｐＨを８−８.２に合わせた。この時、溶液がわずかに濁っている場合には、ガラス繊維フィルターで濾過することにより溶液を清澄化した。清澄化した溶液を０.４５μｍの酢酸セルロース膜で滅菌濾過した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより蛋白濃度を決定した。２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度とするに十分なＮａＣｌを激しく撹拌しながら添加した。酵素に対する蛋白の比を５０００：１とするに十分なスロンビンストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、得られた混合物を、３７℃の水浴中、撹拌プレート上で撹拌した。Ｈ₂Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡバッファーのグラジエントで溶離するＣ８カラムを用いるＨＰＬＣにより反応をモニターした。融合構築物のピークが本質的に消失した時に（通常には４６−４８時間）ＰＭＳＦを添加して最終濃度０ .１ｍＭとすることにより反応を停止した。ＰＭＳＦを９５％ＥｔＯＨ中に溶解し、激しく撹拌されている反応混合物に直接添加した。ｈＣＡ−フラグメントのクエン酸沈殿９０ｍＭのクエン酸で沈殿させることにより、融合蛋白の開裂により生じたヒト・カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび残存している未切断融合蛋白を溶液から除去し、中間体ペプチドＬｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａを溶液中に残した。スロンビン切断溶液の体積を目盛り付きシリンダーで測定した。１Ｍクエン酸ストック溶液を添加してクエン酸最終濃度を９０ｍＭとした。溶液を激しく撹拌しつつ、ゆっくりと添加を行った。凝集物質を遠心分離し、上清を０.４５μｍのフィルターで濾過した。濾過した上清を−８０℃で凍結するか、あるいは脱塩のためにＣ８カラムに直接乗せた。沈殿によるペレットを９０ｍＭクエン酸（ｐＨ３.０−３.１）で洗浄した。１−２グラムのｈＣＡの各ペレットに１５０ないし２００ｍｌの間のクエン酸溶液を添加した。ペレットをホモジナイズし、洗浄により得られた上清を０.４５ μｍのフィルターで濾過し、保存した。洗浄されたペレットを捨てた。上清を− ８０℃で保存するか、あるいはＣ８カラムで直接脱塩した。Ｌｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−ＡｌａのＣ８脱塩Ｌｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａの９０ｍＭクエン酸溶液を調製用Ｃ８カラムに直接負荷した。水性エタノール／酢酸バッファーのグラジエントでカラムを溶離した。Ｌｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａ含有フラクションを集め（典型的には純度９０−９５％）、蒸発により溶液を濃縮して２１−１５ｍｇ／ｍｌとした。得られた溶液をトランスペプチデーションを行うまで−８０℃で保存した。Ｌｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−ＡｌａのトランスペプチデーションＬｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａペプチドの濃度を、１ｍＭのＧＲＦ標準物質を用いてＣ８ＨＰＬＣにより決定した。ペプチド溶液を水で希釈して３ｍＭのＬｄｒ−ＧＲＦ（１−４４）−Ａｌａとした。ＥＤＴＡおよびリン酸ナトリウムを添加し（それぞれ、５ｍＭ；１.９ｍｇ／ｍｌおよび２５ｍＭ；３.６ｍｇ／ｍｌとした）、１ＭＮａＯＨでｐＨを６.０に合わせた。２−ニトロフェニルグリシンアミド［ＯＮＧＰＡ］（２５０ｍＭ；８９.０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１ＭＮａＯＨでｐＨを再度６.０に合わせた。カルボキシペプチダーゼＹ（「ＣＰＤ−Ｙ」；２μｌ／ｍｌ）を添加し、暗所にて３５−４０℃で撹拌した。Ｌｄｒ −ＧＲＦ−ＯＮＧＰＡを生じる反応の程度をＨＰＬＣによりモニターした。約１ −２時間後、アセトニトリルを添加して最終濃度１５％ｖ／ｖとすることにより反応を停止した。ＣＰＤ−Ｙトランスペプチデーションで得られた試料をＣ８ＨＰＬＣカラム上に負荷し、２０％エタノール、１０ｍＭリン酸ナトリウム,ｐＨ６.８のバッファーで洗浄して未反応ＯＮＧＰＡを除去した。次いで、カラムを５０％エタノール、１０ｍＭリン酸ナトリウム,ｐＨ６.８のバッファーで溶離し、Ｌｄｒ−ＧＲＦ− ＯＮＧＰＡのピーク部分を集めた。Ｌｄｒ−ＧＲＦ−ＯＮＧＰＡの光分解１ｍＭのＧＲＦ標準物質を用いるＣ８ＨＰＬＣによりＬｄｒ−ＯＮＧＰＡペプチド濃度を決定し、５０％エタノールで希釈して１ｍＭＬｄｒ−ＧＲＦ−ＯＮＧＰＡ（６.０ｍｇ／ｍｌ）とした。重亜硫酸ナトリウム（５ｍＭとした）および安息香酸ナトリウム（５０ｍＭとした）を添加し、１ＭＮａＯＨで溶液のｐＨをを９.５に合わせた。溶液にアルゴンを１０−１５分間吹き込んだ後、循環式水浴で２０−２５℃に維持しながら混合物に照射した（波長＞３０５ｎｍ；２００−２１０Ｗの中圧水銀ランプ）。反応中、アルゴンを一定流量に維持し、反応物を一定速度で撹拌した。ＨＰＬＣにより反応をモニターした。約１−２時間後、酢酸でｐＨを５.５に低下させることにより反応を停止した。Ｌｄｒ−ＧＲＦ−ＮＨ₂に対するエンテロキナーゼ開裂プロトコール光分解反応で得られたＬｄｒ−ＧＲＦ−ＮＨ₂の溶液を水で１：５に希釈した（１.０ｍｇ／ｍｌペプチド）。Triton X-100を添加して最終濃度を０.１％とした。コハク酸および塩化カルシウムを添加して、それぞれ濃度を５０ｍＭ（５ .９ｍｇ／ｍｌ）および２ｍＭ（０.３ｍｇ／ｍｌ）とし、１０ＭＮａＯＨで溶液のｐＨを５.５に合わせた。０.４５μｍの膜で溶液を濾過した後、５.０ｍｇ／ｍｌのDowex 1樹脂を添加した。アニオン交換Dowex 1樹脂を反応物に添加してＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号：３２）配列を含むペプチドを結合させた。このことは、基質特異性を改善しつつ所要エンテロキナーゼ濃度を低下させるのみならず、反応速度および正味の収率を増加させることがわかった。１：３０００の比のエンテロキナーゼ酵素（１０ｍｇのペプチドに対して１μｌ）を添加し、反応物を一定速度で撹拌しながら３５−４０℃の水浴に維持した。２０−２４時間後、Ｌｄｒ−ＧＲＦ−ＮＨ２をＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ２（配列番号：２０）に変換する開裂反応は７０−８０％完了した。反応混合物を濾過してDowex 1を除去し、アセトニトリルを添加して再収納ど１５％にすることにより反応を停止した。精製の準備ができるまで試料を−８０℃で保存した。所望ならば、Ｃ８カラムを用いる調製用ＨＰＬＣにより生成物ＧＲＦ（１−４４）− ＮＨ２（配列番号：２０）の精製を行ってもよい。実施例１０．可溶性ｈＣＡ融合蛋白構築物の発現によるペプチドの製造ｈＣＡ−９ＡＡ融合蛋白をコードしているＤＮＡを含むベクターで形質転換されたE.coli細胞を上記手順により調製し、培養することができる。ｈＣＡ−９ＡＡ融合蛋白は、相互結合ペプチドを介してアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（「９ＡＡ」）（配列番号：３３）に連結されたｈＣＡＩＩを含んでいる。相互結合ペプチドはエンテロキナーゼ開裂部位を９ＡＡ（配列番号：３３）配列のＮ末端に隣接した位置に含んでいる。ｈＣＡ−９ＡＡ融合蛋白は、E.coli BL21 F^-ompTr_B ^-m_B ^-（ＤＥ３）において可溶性蛋白として発現されうる。ファーメンターからの細胞ペーストを冷洗浄バッファーで希釈し、５−１０℃ まで冷却する。冷却された細胞懸濁液を、Galin高圧ホモジナイザーを用いて１２０００ｐｓｉでホモジナイズする。細胞ペーストを熱交換器に通し、１０℃まで冷却してから２回目のホモジナイザー処理を行う。９５％エタノール中のＰＭＳＦストック溶液を添加してＰＭＳＦ最終濃度０.０５ｍＭとする。溶解物を約８℃まで冷却し、１２０００ｐｓｉのホモジナイザーに通し、保存用タンクに溜めた。溶解物をさらに１２０００ｐｓｉのホモジナイザーに通した後、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）の５％ｖ／ｖｐＨ７.５溶液を添加してＰＥＩ濃度を０.３５％にすることができる。得られた混合物を２０分撹拌し、２００００ｘｇにおいてWestfaliaにより清澄化する。清澄化された溶液を０.２２μｍのPall フィルターシステムで濾過する。ｐ−アミノメチルベンゼン−スルホンアミド−アガロース樹脂を入れたアフィニティーカラムを０.１ＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄（ｐＨ８.７）溶液で平衡化する。ＰＥＩ沈殿法により清澄化された上清をカラム上に負荷し、一連のＴｒｉｓ− ＳＯ₄バッファー溶液でカラムを溶離する。融合蛋白構築物を含有するカラムフラクションをプールする。氷酢酸を用いて溶液のｐＨを４.０まで低下させることにより、蛋白構築物をプールしたフラクションから沈殿させる。沈殿した融合蛋白構築物を遠心分離により単離し、凍結乾燥することができる。沈殿した融合蛋白構築物を、５０ｍＭＴｒｉｓおよび１ｍＭＣａＣｌ₂を含有するｐＨ８.０のバッファーに溶解する。混合物をソニケーションしてすべての融合蛋白構築物を溶解させる。溶液を０.４５μｍの膜で濾過した後、５.０ｍｇ／ｍｌのDowex 1樹脂を添加した。１：３０００の比のエンテロキナーゼ酵素（ペプチド１０ｍｇあたり１μｌ）を添加し、反応物を一定速度で撹拌しながら３５−４０℃の水浴に２０−２４時間維持した。反応混合物を濾過してDowex 1 を除去し、アセトニトリルを添加して最終濃度を１５％とすることにより反応を停止した。３：１体積の１５％（ｖ／ｖ）酢酸を溶液に添加し、得られた混合物を３０分撹拌し、そのことにより、ｈＣＡを含むペプチドフラグメントを沈殿させる。遠心分離によりｈＣＡフラグメントを除去し、９ＡＡ（配列番号：３３）ペプチドを含む上清を得る。上清をＣ８カラムで脱塩し、−８０℃で保存してもよい。本発明を種々の特別な好ましい具体例と方法を参照して説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲内にあるかぎり、多くの変更および修飾を行ってもよいことが当業者に明らかであろう。本明細書中のすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の通常の技術レベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、参照により、それぞれの刊行物および特許出願が参照により個々に別個に示されるのと同程度に本明細書に記載されているものと見なされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/605 Ｃ０７Ｋ 14/605 14/635 14/635 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヘンリクセン，デニス・ビーアメリカ合衆国68503ネブラスカ州リンカーン、ノース・フォーティフォース・ストリート343番アパートメント723 (72)発明者マニング，シェーン・ディアメリカ合衆国68154ネブラスカ州オマハ、シーウォード・プラザ11206番アパートメント2217 (72)発明者デ・ラ・モッテ，レベッカ・エスアメリカ合衆国68502ネブラスカ州リンカーン、サウス・トゥエンティフィフス・ストリート1209番 (72)発明者ホームクイスト，バートンアメリカ合衆国68526ネブラスカ州リンカーン、ウエスト・レイクショア・ドライブ442番 (72)発明者ワグナー，フレッド・ダブリューアメリカ合衆国68461ネブラスカ州ウォールトン、ボックス77ビー、ルート１番

Claims

【特許請求の範囲】１．カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含む融合蛋白構築物を沈殿させることを特徴とするペプチドの製造方法。２．約３.２ないし約６.０のｐＨにおいて融合蛋白構築物を溶液から沈殿させることを特徴とする請求項１の方法。３．融合蛋白構築物を沈殿させることが、さらに溶液に塩を添加することを特徴とするものである請求項２の方法。４．塩が２価金属カチオンを包含するものである請求項３の方法。５．融合蛋白構築物を沈殿させることが、溶液に酸を添加することを特徴とするものである請求項２の方法。６．融合蛋白構築物を沈殿させることが、溶液に塩基を添加することを特徴とするものである請求項２の方法。７．硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを含む溶液から融合蛋白構築物を沈殿させることを特徴とする請求項１の方法。８．カオトロピック剤を含む溶液から融合蛋白構築物を沈殿させることを特徴とする請求項１の方法。９．カオトロピック剤がグアニジン塩酸を含んでなるものである請求項８の方法。１０．尿素を含む溶液から融合蛋白構築物を沈殿させることを特徴とする請求項１の方法。１１．融合蛋白構築物を単離することが、沈殿した融合蛋白構築物を再可溶化することを含むものである請求項１の方法。１２．少なくとも約１０のｐＨを有する溶液において沈殿した融合蛋白構築物を再可溶化することを特徴とする請求項１１の方法。１３．約３.２未満のｐＨを有する溶液において沈殿した融合蛋白構築物を再可溶化することを特徴とする請求項１１の方法。１４．カオトロピック剤または界面活性剤を含む溶液において沈殿した融合蛋白構築物を再可溶化することを特徴とする請求項１１の方法。１５．さらに融合蛋白構築物を開裂して可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可溶性の可変的融合ポリペプチドフラグメントを得ることを特徴とする請求項１の方法。１６．さらにカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることを特徴とする請求項１５の方法。１７．さらにカルボニックアンヒドラーゼフラグメントの溶液を、ベンゼンスルホンアミド化合物またはアセトアゾラミド化合物を含む支持体に接触させることを特徴とする請求項１５の方法。１８．可変的融合ポリペプチドが、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）、およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含んでなるものである請求項１の方法。１９．さらに融合蛋白構築物を宿主細胞中で封入体の一部として発現させることを特徴とする請求項１の方法。２０．さらに封入体を溶解して可溶化融合蛋白構築物を得ることを特徴とする請求項１９の方法。２１．クエン酸を含む溶液に封入体を溶解することを特徴とする請求項２０の方法。２２．カオトロピック剤または界面活性剤を含む溶液に封入体を溶解することを特徴とする請求項２０の方法。２３．少なくとも約１０のｐＨを有する溶液に封入体を溶解することを特徴とする請求項２０の方法。２４．可変的融合ポリペプチドが少なくとも２コピーの標的ペプチドを含むものである請求項１の方法。２５．可変的融合ポリペプチドが式： −ＴａｒｇＰ−（ＣＳ２）−［−（Ｌｎ１）_n−（ＣＳ１）_m−ＴａｒｇＰ−（ＣＳ２）−］_r ［式中、−ＣＳ１−および−ＣＳ２−は開裂部位、−（Ｌｎ１）−は連結配列、 −ＴａｒｇＰ−は標的ペプチド、ｎおよびｍは０または１、ｒは１から約１５０までの整数を意味する］を有するアミノ酸配列を含むものである請求項２４の方法。２６．標的ペプチドが、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含むものである請求項２５の方法。２７．カルボニックアンヒドラーゼが開裂部位によって可変的融合ポリペプチドに連結されているものである請求項１の方法。２８．開裂部位が化学的開裂部位である請求項２７の方法。２９．開裂部位が、エンドペプチダーゼにより認識される酵素的開裂部位である請求項２７の方法。３０．カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含む融合蛋白構築物を開裂して可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可溶性の可変的融合ポリペプチドフラグメントを得て；次いでカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることを特徴とするペプチドの製造方法。３１．さらに沈殿したカルボニックアンヒドラーゼフラグメントを溶媒で抽出してさらなる量の可変的融合ポリペプチドフラグメントを回収することを特徴とし、溶媒が有機成分を含むものである請求項３０の方法。３２．有機溶媒がアセトニトリル、プロパノール、クエン酸、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物を含んでなるものである請求項３１の方法。３３．さらに融合蛋白構築物を単離することを特徴とする請求項３０の方法。３４．融合蛋白構築物を単離することが、融合蛋白構築物を沈殿させることを含むものである請求項３３の方法。３５．約３.２ないし約６.０のｐＨにおいて溶液から可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることを特徴とする請求項３０の方法。３６．可溶性カルボニックアンヒドラーゼフラグメントを沈殿させることが、さらに溶液に塩を添加することを特徴とするものである請求項３５の方法。３７．塩が２価金属イオンを包含するものである請求項３６の方法。３８．融合蛋白構築物を単離することが、融合蛋白構築物の溶液を、ベンゼンスルホンアミド化合物またはアセトアゾラミド化合物を含む支持体に接触させることを含むものである請求項３３の方法。３９．融合蛋白構築物溶液を支持体に接触させることが、スルファニルアミド化合物を含むアフィニティーカラムに融合蛋白構築物溶液を通すことを含むものである請求項３８の方法。４０．さらに融合蛋白構築物を宿主細胞中で封入体の一部として発現させることを特徴とする請求項３３の方法。４１．融合蛋白構築物を単離することが、融合蛋白構築物の溶液にＰＥＩを添加することを特徴とするものである請求項３３の方法。４２．さらにＰＥＩ溶液のｐＨを約３.２ないし約６.０の間に調節し、そのことにより融合蛋白構築物を沈殿させることを特徴とする請求項４１の方法。４３．酵素的開裂部位を介してカルボニックアンヒドラーゼが可変的融合ポリペプチドに連結されており；融合蛋白構築物を開裂することが、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、ユビキチン開裂酵素、スロンビン、トリプシン、レニン、ズブチリシン、キモトリプシン、クロストリパイン、およびS.aureusのＶ８からなる群より選択されるエンドペプチダーゼで融合蛋白構築物を処理することを含むものである請求項３０の方法。４４．融合蛋白構築物を開裂することが、塩化ナトリウムを含む溶液に溶解された融合蛋白構築物をスロンビンで処理することを特徴とするものである請求項４３の方法。４５．融合蛋白構築物を開裂することが、融合蛋白構築物の溶液にアニオン交換樹脂を添加し、次いで、融合蛋白構築物をエンテロキナーゼで処理することを特徴とするものである請求項４３の方法。４６．化学的開裂部位を介してカルボニックアンヒドラーゼが可変的融合ポリペプチドに連結されており；融合蛋白構築物を開裂することが、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ＢＮＰＳ−スカトール、Ｓ−シアニル化剤および約３.０未満のｐＫ_aを有する酸からなる群より選択される化学的開裂剤で融合蛋白構築物を処理することを含むものである請求項３０の方法。４７．融合蛋白構築物を含んでなる、E.coli宿主細胞中で発現される封入体であって、融合蛋白構築物がカルボニックアンヒドラーゼおよび標的ペプチドを含むものであり、該標的ペプチドがＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含むものである封入体。４８．融合蛋白構築物が少なくとも２コピーの標的ペプチドを含むものである請求項４７の封入体。４９．標的ペプチドがＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）に対応するアミノ酸配列を含むものであり；スロンビンにより認識される酵素的開裂部位を含む相互結合ペプチドを介してカルボニックアンヒドラーゼが標的ペプチドに連結されているものである請求項４７の封入体。５０．標的ペプチドがＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）に対応するアミノ酸配列を含むものであり；さらに融合蛋白構築物がスロンビン、エンテロキナーゼおよびカルボキシペプチダーゼＹからなる群より選択される酵素により認識される酵素的開裂部位を含んでなるものである請求項４７の封入体。５１．標的ペプチドがＧＲＦ（１−４４）（配列番号：２０）に対応するアミノ酸を含むものである請求項４８の封入体。５２．標的ペプチドがＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）に対応するアミノ酸配列を含むものであり；さらに融合蛋白構築物がトリプシンにより認識される酵素的開裂部位を含んでなるものである請求項４７の封入体。５３．標的ペプチドがＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）に対応するアミノ酸配列を含むものであり；さらに融合蛋白構築物がメチオニン残基を含んでなるものである請求項４７の封入体。５４．融合蛋白構築物をE.coli宿主細胞中で封入体の一部として発現させ、融合蛋白構築物はカルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含むものであり；次いで、融合蛋白構築物を単離することを特徴とするペプチドの製造方法。５５．可変的融合ポリペプチドが、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含む標的ペプチドを含んでなるものである請求項５４の方法。５６．可変的融合ポリペプチドが少なくとも２コピーの標的ペプチドを含むものである請求項５４の方法。５７．カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含んでなる融合蛋白構築物であって、可変的融合ポリペプチドが標的ペプチドを含むものであり、標的ペプチドがＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＬＰ１（７ −３４）（配列番号：２１）およびＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）からなる群より選択されるペプチドに対応するアミノ酸配列を含むものである融合蛋白構築物。５８．可変的融合ポリペプチドが、ＧＲＦ（１−４１）（配列番号：２３）、ＧＲＦ（１−４４）（配列番号：２０）、ＧＬＰ１（１−３４）（配列番号：２６）、ＧＬＰ１（７−３４）（配列番号：２１）、ＧＬＰ１（７−３６）（配列番号：２７）、ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号：２８）、ＰＴＨ（１−３４）（配列番号：２２）、ＰＴＨ（１−３８）（配列番号：２９）およびＰＴＨ（１ −８４）（配列番号：２５）からなる群より選択されるペプチドに対応する標的ペプチドを含むものである請求項５７の融合蛋白構築物。５９．請求項５７の融合蛋白構築物をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる組み換え遺伝子。６０．請求項５７の融合蛋白構築物をコードしている核酸配列を含んでなる発現カセットであって、ベクターにおいて核酸配列がプロモーター機能配列に作動可能に連結されているものである発現カセット。６１．請求項６０の発現カセットを含んでなる発現ベクター。６２．請求項５７の融合蛋白構築物をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる組み換え遺伝子を含んでなる形質転換細胞。６３．カルボニックアンヒドラーゼおよび可変的融合ポリペプチドを含む融合蛋白構築物を開裂してカルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントを得て；カルボニックアンヒドラーゼフラグメントおよび可変的融合ポリペプチドフラグメントを沈殿させ；次いで沈殿したフラグメントを有機成分を含む溶媒で抽出し、そのことにより可変的融合ポリペプチドフラグメントを回収することを特徴とするペプチドの製造方法。６４．有機溶媒がアセトニトチル、プロパノール、クエン酸、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物を含んでなるものである請求項６３の方法。６５．可変的融合ポリペプチドが少なくとも２コピーの標的ペプチドを含むものである請求項６３の方法。