JPH10510424A - レクザイム及び糖質リガンドの同定浄化及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の種々の局面において、糖質リガンド及び該リガンドのベプチド擬態は提供され、特にレクザイムに結合し、そしてレクザイムはは提供され、特に糖質リガンド及びベプチド擬態に結合する。本発明の他の局面は、かかる糖質、擬態及びレクザイムを同定、浄化及び生成する方法。並びに種々の疾患を扱うかかる組成物の使用方法を含み、さらに細胞機能を変性するを含む。また本発明の他の局面は、かかるリガンド及び/又はレクザイムの糖質リガンド及びベプチド擬態を含む種々の疾患の診断を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 レクザイム及び糖質リガンドの同定浄化及び使用発明の背景 発明の分野 この発明は一般にグリコバイオロジ（glycobiology）の分野に関する。背景情報 多様な遺伝子生成物の主要組織適合性複合体（MHC）はコード化され、その多 くが病原性の微生物に対して身体の防衛で中央の役割をなす。かかる分子は、古 典の移植抗原及び構造上関連した分子、細胞中の異種のペプチドの移送のための 蛋白質、血清補完蛋白質、リンフォカイン腫瘍壊死α及び腫瘍壊死βシトクロム 、並びに熱ショック蛋白質を含む。 MHC遺伝子によってコード化された古典の移植抗原は高い多型性のグループ分 子であり、これらは移植された異種細胞及び組織の拒絶を決定することにおける それらの役割のために、元来発見されたものである。それ以来、実験的な仕事の 広範囲の本体が自己認識での古典の移植抗原のために役割を支持している。現在 受け入れられた範例では、「古い範例」の移植抗原は、免疫系の細胞による認識 のために、自己と異種蛋白質両方から生じたペプチドを提示するのに役立つ。 抗原の２つの別のグループ、クラスIとクラスII抗原はMHC中で遺伝子によって コード化される。クラスI抗原はすべての凝 集細胞上で事実上表現される。これら抗原は細胞毒素胸腺由来（Ｔ）リンパ球調 停細胞殺に基づいた免疫応答の介在で役割を演ずる。細胞毒素Ｔリンパ球はウィ ルス感染している細胞と腫瘍細胞を殺す役割をなす。クラスIMHC分子は、β２、 ミクログロブリン（β2M）として知られる１２kDa蛋白質と非共有に結合した約 ４５kiloDalton（kDa）Ｈ鎖で構成されている。古い範例は、細胞中で内因的統 合した自己及び異種蛋白質両方から由来したペプチド断片を提示するように、ク ラスI抗原を特徴づける。 クラスIは移植でのそれらの役割のために発見され、そしてそれらを「非古典 」分子と呼ばれ、「古典」分子と後に発見されたグループ分子から区別するため に、このように呼ばれる。非古典MHC分子をコード化する遺伝子は、これまでの ところMHC位置で識別された遺伝子の大多数から成り立つ。非古典MHC分子は、相 同性とＨ鎖がβ2M非共有それと関係づけた大規模な配列を有することにおいて全 体的に構造上古典移植抗原と関係がある。非古典クラスIMHC分子は、一般に、古 典MHC分子よりより低度に多型性であって、そしてそれらの組織分布でさらに制 限される。もし免疫系のいずれなら、非古典クラスIMHC分子のいくつかのタイプ は、それらの機能に関して問題を提起して、胃腸（ＧＩ）路で主に表現される。 MHCクラスII抗原は、身体で専門的な抗原提示細胞によって主に表現される。 かかる細胞は、マクロファージと身体の種々 の組織で分配された樹状細胞と同様、Ｂリンパ球を作り出して抗体に制限される 。細胞表面の上のクラスII分子は３３kDaのα鎖及び非共有関連づけられた２８k Daのβ鎖で構成されている。クラスII分子は、自己又は異種蛋白質からＴリンパ 球の専門的なクラスまで由来したペプチドを主に提示する機能をなし細胞毒素Ｔ リンパ球の発生を支援するものとして古い範例の下で理解されており、クラスII 分子は、菌性の感染に免疫を提供し、そしてカプセル化バクテリア感染に応答す る防御抗体の生成においてＢリンパ球を支援する。内因的合成蛋白質から生じた ペプチドを提示する古典クラスＩ分子と対照的に、MHCクラスII抗原は、周囲の 環境からの細胞によって引き受けた蛋白質から得たペプチド断片を提示する。 多様なヒトの自己免疫疾患がしばしば個体群でMHCのある特定の遺伝子を継承 する個体と結び付けられることを示された。これらの疾患の多くのために、つな がりはMHCコーディングクラスII組織適合性抗原の部位に局地的に制限される。 これらの疾患は、一卵性双生児の組のただ１人だけの子孫が疾患を有するかも知 れないので、MHC遺伝子の単純なメンデル(Mendelian)隔離によって継承されない 。この特徴は、その他遺伝因子又は環境要因が自己免疫の発生で役割を有し、MH Cの遺伝子がプロセスの重要な役割を演じていることを示唆する。 MHC遺伝子機能に対する古い範例は、自己免疫疾患でのMHC遺伝子の役割を説明 するいくつかの学説を提供する。それらは特 定なMHC遺伝子生成物によって自己免疫応答又は自己ペプチドの異常な認識を引 き出して細胞にクラスIIMHC分子の不適当な表現を含む。しかしながら、このよ うな学説は証明されなければならない。また、古い範例はヘモクロマトーシスと して知られているMHCによって関連づけられた鉄蓄積症の根拠を説明するために 有用な仮説を提供し損ねる。この疾患は動物研究からそしてMHCコード化クラス Ｉ分子を含むいくつかのクラスＩ遺伝子のゲノムの構造から知られ、これらの動 物でのβ2M遺伝子欠失が疾患をもたらすことから知られている。 開示は少なくともクラスＩのいくらか、クラスII抗原と他の関連した分子を含 めて糖質認識分子に関連している新しい範例であり、そしてその若干はIgGSFの ものである。この範例は糖質認識分子が認識するべき主要な機能を持って、そし て糖質構造を修飾変性することを規定する。ここには、存在する糖質認識におけ る問題を含んでいるMHCによって関連づけられた、そして他の疾患の治療に、そ して特に新しいアプローチを発展させる必要、新しい範例を利用するために組成 、装置と実験方法を提供する必要がある。発明の概要 本発明の種々の局面において、糖質リガンド及び該リガンドのペプチド擬態は 提供され、特にレクザイム(Leczyme)に結合し、そしてレクザイムはは提供され 、特に糖質リガンド及びペプチド擬態に結合する。本発明の他の局面は、かかる 糖質、擬 態及びレクザイムを同定、浄化及び生成する方法。並びに種々の疾患を扱うかか る組成物の使用方法を含み、さらに細胞機能を変性するを含む。また本発明の他 の局面は、かかるリガンド及び/又はレクザイムの糖質リガンド及ベプチドび擬 態を含む種々の疾患の診断を含む。 模範的な実施例では、免疫応答が患者に糖質リガンド又はペプチド擬態を与え ることによって調整される。もう１つの模範的な実施例では、ヘモクロマトーシ スがβ２ミクログロブリンに連合するべきその能力を減らすクラスＩMHC分子で 突然変異を検出することによって診断される。さらに他の模範的な実施例は、患 者の鉄又は他の金属の取り入れ異常な吸収が適切な糖質の摂取によって調整され る。発明の詳細な説明 本発明が多細胞生物で、ほ乳類を含めて自己認識分子と他の分子の機能のため に深遠な新しい範例の結果として生じる、そしてそれは食細胞崩壊細胞の別の固 体群を有する。新しい範例は多くのタイプの今までペプチド認識と提示構造とし て知られている自己認識分子が認識と糖質を含んでいる分子の修飾でいっそう主 要な機能を有すると考える。ここに、「糖質を含んでいる分子」を使ったように それらの少なくとも１つの単糖又は糖残基を有している分子を意味する。それで 、自己認識分子と新しい範例の他の分子が特別に糖質を含んでいる分子を拘束し て、そして糖質のそれ以上の添加に触媒作用を起こすことによ って又は既存の糖質残基の１又はさらに多くの化学的な修飾を促進することによ って化学的にそれを変性する能力を有する。それ故に、糖質を含んでいる分子は 自己認識と新しい範例の他の分子のために基質である。さらに、酵素的の修飾の 後に、自己認識と他の分子は特別に元来認められていて同等物又は変性する糖質 を含んでいる分子に分子により大きい親和性で結び付くことができる。 ここに使われるように、「レクザイム」が追加の糖質又は化学的に変性する糖 質で生成物をもたらしている糖質を含んでいる基質の化学的な修飾を促進できる 、そしてそれで特別に変性する基質を認識できるどんな細胞の蛋白質でも意味す る。用語「レクザイム」は同じ基盤分子で共にレクチンを結び付けている、そし て酵素的の活性を有することについての組合せから生じる。レクザイムの機能は 技術でよく知られている多β−／−βくのペプチド認識分子の特性を示している 。このような分子は、分子の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリ（IgGSF） の他の肢とともに、少なくともクラスＩとクラスII・MHCでコード化された分子 のいくらかを含む、そしてその若干は自己認識分子ではない。模範的なレクザイ ムがリン酸化を促進するそれら、アセチル化、カルボキシル化及び／又は糖質を 含んでいる分子の硫酸化を含む。レクザイムが細胞の中で、細胞表面の上に機能 できるか、又は細胞から分泌される。 レクザイムが分子の同じアイソフォームで酵素力と糖質を結 び付けている活性を示すことができる、又はこれらの活性は分子の異なったアイ ソフォームで別に存在できる。例えば、レクザイムの特異なＲＮＡスプライシン グが信号を含んでいるレクザイムの酵素的アクティブなアイソフォームが通常小 胞体又はゴルジ複合体のような、糖鎖形成と結び付けられた細胞でレクザイムを 場所に向けるという結果になることができる。特異なＲＮＡスプライシングが同 じく糖質認識能力を示して、そして信号を含んでいるレクザイムのアイソフォー ムが細胞からレセプターを細胞表面に又は外部に向けるという結果になることが できる。代わりに、細胞で又は細胞表面の上に表現されたレクザイムが同じ分子 で、糖質認識能力と同様、共に酵素的の活性を含んでいることができる。 クラスＩ又はクラスII分子で、そして多分他のレクザイムで、レクザイム機能 がMHCでコード化された分子の頂点で形成される溝での存在であり得る。古い範 例は溝をペプチドを結び付ける溝であると特徴づける、しかし新しい範例は溝が レクザイムによって修飾の後に糖質構造とその次の形式を認識するために主に作 用することを規定する。 レクザイムに特別に結び付く十分に浄化された糖質リガンドの組成が孤立し得 る。ここに使われるように、用語「糖質リガンド」は糖質部がレクザイムによっ て識別されるリガンドの一部である糖質を含んでいる分子を意味する。糖質リガ ンドが直鎖又は枝分れ鎖立体配置で結合される１又はそれ以上の糖残基 で構成されている。それ故に、糖質リガンドが単糖、二糖類、三糖類、オリゴ糖 又は多糖を含む。 多数の糖質残基で構成された糖質リガンドがそれぞれの残基の間にタイプとリ ンケージの位置設定の点で異なる。糖質リガンドを作り出すことに役立つ糖質残 基が、例えば、グルコース、ガラクトース、フコース、マンノースとシアル酸を 含む。リガンドの糖質残基が同じくアセチル化される、リン酸化、及び／又は技 術でよく知られている化学的な過程によって硫化すられた。糖質リガンドが同じ く化学的に脂質、糖脂質、蛋白質糖蛋白質、プロテオグリカン、グリコサミノグ リカン又は有機的な分子のような他の分子に接着させられることができる。この ような追加の分子はレクザイムに増やされた結合のような特徴を糖質リガンドに 提供できるか、又は生体内で安定性を増した。 糖質リガンドは、糖質リガンドを骨格構造に置いたものよりいっそう多くを有 することによって自然で多原子価であり得る。構造は血清アルブミンのような自 然の蛋白質であり得るか、又は合成のペプチドのような合成の分子であり得る。 構造に多数の糖質リガンドを結合するアプローチは技術的周知であって、そして 、例えば、ビオチン-アビジンリンケージ（Rothenberg et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．（USA）90:11939-11943（1993），which is incorporated herein by reference）を含む、そしてそれは参照によってここに含まれる。 新しい範例の応用がレクザイムの結果として生じて疾患状態 を扱う新しい方法を譲る。このような疾患状態は、例えば、自己免疫、ヘモクロ マトーシス、炎症、移植拒否反応と感染を含むかも知れない。上記の疾患状態の 多くで、疾患がリンパ球によって一部糖質構造の異常な認識の結果として生じる かも知れない。それで、個体の異常な認識分子に結び付くことができる糖質リガ ンドの摂取は疾患を調停して異常な認識を混乱させる手段を提供する。 特定なタイプの分子を変性するために、それらの能力を違う多様なレクザイム が存在する。この較差は一部レクザイムがそれらの基質のために有するレクチン 結合部の特異性における相違の結果として生じる。それで、レクザイム構造の一 部が基質のために認識部位である。レクザイムの触媒部位は基質認識部位と比べ て同じ場所か、又は基質認識部位と異なった場所であり得る。基質の修飾の後に 、レクザイムは基質認識部位とレクザイムの触媒部位両方によって又はリガンド の多価によって同格の結合のための起源の基質の上に変性する基質のために類似 か、又はより大きい結合親和性を示すことができる。 ここに提供されたレクザイムが構造上関連した分子の広範囲のグループを含む 、そしてその多くはIgGSFの中で含有されている。遺伝子のIgGSFシリーズは進化 の相同性（すなわち、共通の祖先）を共有する、しかし、遺伝学的に結合されて 、又は配位的規律正しくて、必ずしも機能上関連していない。IgGSFの生成物は １又はそれ以上の領域の存在によって定義された免 疫グロブリン（Ig）の基本的な構造単位に同一で、Ig相同性単位として知られて いる。これらの単位は長さにおいて約７０-１００残基の主要なアミノ酸配列に よって特徴づけられて、そしてIg中心団体として知られている三次構造を持続す る長さといくつかの他の比較的保存する残基に５０-７０残基にかかっている本 質的に不変のジスルフィドブリッジを含む(for review see Hunkapiller and Ho od，Immunol.，44:1-63，(1989))。 IgGSFの遺伝子は、免疫グロブリン、Ｔリンパ球レセプター、古典そして非古 典MHC分子、種々のＴリンパ球とＢリンパ球細胞表面分子すなわちβ2Mのような 、周知の免疫機能で多くの分子をコード化する。添加で、IgGSFは細胞-細胞接着 のためにレセプターとして作用することを知られるいくつかの細胞表面分子をコ ード化する。このような接着分子は、例えば、神経の細胞接着分子癌胎児抗原を 含む。もちろん、又は糖質リガンドの糖質部を変性しない、又は変性する生成物 を認識しないそれらのIgGSF分子はレクザイムではない。 IgGSFのレクザイムがMHC部位の中で位置している遺伝子によってコード化する それらを含む。ヒトで、MHCは染色体６の短い腕の上に位置しているＤＮＡの連 続の広がりにある。ヒトでの全部のMHCはＨＬＡ複合体と呼ばれる。ハツカネズ ミで、MHCは染色体１７の上に位置していて、そしてＨ-２、Ｑ、ＴとＭ複合体を 含んでいる。ここに使われるように、用語「MHC由来遺伝子産物」はそれがMHCの 中で位置している遺伝子によって 少なくともポリペプチドがコード化した（を含んでいるどんな分子でも意味する 。MHC由来遺伝子生成物であるレクザイムがクラスＩとクラスII分子を含む。ヒ トでレクザイムであるクラスＩとクラスII分子がHLA-DP、HLA-DN、HLA-DM、HLA- DO、HLA-DQ又はHLA-DRのようなHLA-Ｄ領域又はHLA-Ａの種々の対立遺伝子、HLA- ＢとHLA-Ｃ位置、又はHLA-Ｘ、HLA-Ｅ、HLA-Ｊ、HLA-Ｈ、HLA-ＧとHLA-Ｆ遺伝子 の中で遺伝子によってコード化される。 クラスＩMHC分子であるレクザイムは、β2Mと呼ぶ小さい非多型性蛋白質と非 共有に結び付けた約４５kDaの多型性Ｈ鎖又はα鎖を含んでいる。Ｈ鎖はヒトの ＨＬＡ複合体のＡ、Ｂ又はＣ部位で又は近くでそしてマウスＨ‐２複合体のＫ又 はＤ／Ｌ部位の中で又は近くで位置を定められるMHCコード化遺伝子産物である 。β2MはMHCの外に位置して異なった染色体の上にの遺伝子によってコード化さ れるけれども、クラスＩ分子のＨ鎖はMHC中に位置している遺伝子によってでコ ード化され、それによってMHCコード化遺伝子産物の定義の中にクラスＩ分子を 含める。 クラスIIであるレクザイムは、２８kDaβ鎖と非共有に結び付けた３４kDaα鎖 で構成されたMHC由来遺伝子生成物を含む。不変の鎖と呼ばれた追加の鎖が細胞 の形質膜に移送の間に一時的にクラスIIヘテロダイマーと結び付けられる。 レクザイムが膜内外部位と細胞質の尾を有することについて、 古典移植抗原の症例のように長所によって細胞表面の上に表現される。レクザイ ムが同じく若干の非古典クラスＩ分子に類似している方法で細胞表面に結合され る。例えば、非古典クラスＩQaとT1a分子の多くがホスファチジルイノシトール （ＰＩ）連関によって細胞表面に結合される、そしてQ10遺伝子の生成物は隠さ れるように思われる(Devlin et al.，EMBO J，4:369-374(1985))。Qaの大多数と T1a抗原は、膜内外ドメインと７番目のエクソンがQ1で存在しているそしてQ2遺 伝子生成物であるけれども、リン酸化を含めての細胞質のエクソンがエクソン７ に設置する古典クラスＩに欠ける(Thor et al.，J．Immunol.， 151:211-224 プ ローブ(1993))。 MHCクラスＩＨ鎖は、（α１、α２、及びα３）３つの外部ドメインの中に組 織化され、それぞれ約９０のアミノ酸、それぞれ、約４０のアミノ酸の膜内外ド メイン、そして約３０のアミノ酸の細胞質の核部分を含んでいる。β2MはＨ鎖の 外部の３αドメインにて大きさで類似である。MHCクラスＩ分子の細胞外部のエ ックス線結晶学の分析はα１とα２のドメインが相互作用することを示し、細胞 膜に最も外部であり、一方α３及びβ2Mドメインは相互作用して、そして細胞膜 に最も近位である。相互作用しているα１とα２つのドメインは深い溝を含んで いるか、又は分子の上面表面の上に位置していて割られてプラットホームを形成 する。 古典クラスＩMHC分子の機能のための古い範例はペプチド結 合部として分子の頂点で溝を解釈する。場所は十分に長さにおいて約８-２０残 基のペプチドを結び付けて、そしてある特定のＴリンパ系細胞によって認識のた めに自己と異種由来ペプチド両方を引き起こすのに十分大きい。MHC古典クラス Ｉ分子が溝の長さについてペプチドを拘束できる大規模な研究が見えた。また、 古典クラスＩ分子の結晶学の分析が細胞から浄化したＸ線はペプチドが溝で存在 であったことを表した。しかしながら、上に記述されるように、本発明での新し い範例はそれ、MHCが糖質リガンドを結び付けて同じく適している古典クラスＩ 分子のペプチド結合溝、を提供する。 クラスIIMHC分子であるレクザイムはクラスＩ分子で重要な構造的な特徴を共 有するそれらを含む。クラスII分子は外部のドメイン、膜内外部分と細胞質の核 部分を含んでいる膜結合糖蛋白質である。α鎖はα１とα２というラベル判別さ れた２つの外部のドメインを含んで、β鎖はβ１及びβ２のドメインの外部のド メインを含んでいる。エックス線結晶学はクラスＩ分子のα３ドメイン及びβ2M ドメインの相互作用に類似した膜近位構造としてα２及びβ２のドメインの相互 作用を示す。クラスII分子のα２及びβ２ドメインは分子の頂点で一緒になって 割れ目を形成し、これはクラスＩＨ鎖のα２及びα３ドメインβが形成する割れ 目に非常に類似している。広範囲の証拠がクラスII分子での溝が結び付いて、そ してＴリンパ系細胞によって認識のために自己と異種のペプチド両方を提示でき ることを 表す。ペプチドは八量体か又は単量体のペプチドが一般にMHC古典クラスＩ分子 から孤立させた長さにおいて、わずかにもっと長く１３−１８のアミノ酸からの クラスII分子から隔離されていた。上に論じられるように、本発明の新しい範例 はクラスIIMHC分子でのペプチド結合溝が、溝のように古典クラスＩMHC分子で、 同じく糖質リガンドを結び付けることに適していることを規定する。 レクザイムが同じく非古典クラスＩ遺伝子によってコード化されるかも知れな い。マウスで、レクザイムをコード化している遺伝子はMHC部位Ｑ、Ｔと下流に 古典組織適合性抗原のＭに位置している。HLA-ＦとHLA-Ｇのような周知の非古典 クラスＩ分子のためにヒトコーディングに類似の領域がある。非古典クラスＩ遺 伝子は全体的に古典クラスＩ遺伝子よりより低度に多型性であって、そして発現 の異なったパターンを見せる。Ｑ、ＴとハツカネズミのＭ複合体遺伝子は約４５ の遺伝子、限定された組織分布を有する非多型性分化抗原のためのコーディング から成り立つ。 非古典クラスＩMHC分子である周知のレクザイムが古典クラスＩMHC分子である レクザイムで比較で限定された組織分布を示す。例えば、QaとT1a抗原、Ｑの生 成物とＴ遺伝子、はリンパ球の固体群細区分の上に表現される(for review，see Flaherty et al． Critical Reviews in immunology，10:131-175(1990))。前 に、説得力がある機能が、それらが可能な制限要 素としてγσ６Ｔ細胞に勧められたけれども、非古典クラスＩ遺伝子の生成物に 割り当てられなかった(Hershberg et al．Proc．Nat，Acad，Sgi(USA)，87:9727 -31(1993))。QaとTLa抗原は同じく腸の上皮の上に表現されると伝えられたが、 その機能は知られていない(Wu et al，J．Exp．Med．174:213-218(1991); Hersh berg et al.，Proc．Natl．Acad．Sci，（USA）87:9727-97231(1990); Wang et al.，Immunogenet.，38:370-372(1993))。それらの機能は未知であった。本発明 の新しい範例は少なくと，もこれらの非古典クラスＩ分子の若干がレクザイムで あることを規定する。 非古典クラスＩ分子Q2は、マウスMHCの中で遺伝子によって作り出されて、（ 実施例Ｉ参照）鉄の移送に関係しているレクザイムの例である。この場合ムチン 又は他の糖質を含んでいる分子が鉄のキレータの役を務めて、そして順に同じく Q2遺伝子から表現されてレクザイムのためにリガンドを含んでいる。Q2のための 遺伝子はもう１つの遺伝子が最も見込みが高くムチンをコード化するという状態 で、頭対頭関係に位置している。両方の遺伝子は遺伝子の間に位置を定められた 単一プロモーター領域を共有し、プロモーターは構造上鉄代謝に含まれるβ−グ ロビンプロモーターに類似している。これらの２つの遺伝子の調和した調整はレ セプター／リガンドの考察で容易に理解される、そしてレクザイムと定義された レセプター／基質相互作用が新しい範例で作用する。興味深い事に、Q2遺伝子は ハツカネ ズミの異なった品種のQ2分子が際立ってアミノ酸配列を違うという状態で、大い に多型性であることにおいて他の非古典クラスＩ遺伝子から区別される。これら の較差にもかかわらず、ハツカネズミの別の品種からのQ2分子は、レクザイムと して、Q2がレクチン認識とそれぞれのQ2遺伝子産物の酵素的の機能のとおりに酵 素的そのリガンド／基質を変性することができて、そして結果として生じている 生成物を認識できるので、すべてそれらの共に調節された遺伝子産物のためにレ セプターとして作用する。それで、新しい範例で画定されるレクザイムの結合さ れた酵素的／認識の能力は大規模な遺伝的多型に直面してレセプター／リガンド 関係を維持する。 レクザイムが多様な酵素力で存在する。例えば、レクザイムがグリコシルヌク レオチドから蛋白質、糖質又は脂質のようなアクセプター分子まで（単糖又は糖 質）グリコシルグループの触媒の転移をもたらすグリコシル転移酵素酵素力を持 つことができる。しかしながら、すべてのグリコシル転移酵素がレクザイムであ るわけではない。 現在両方とも、細胞質でそして細胞の上に表現されることを前に知られている ただ１つだけのグリコシル転移酵素（β１，４-ガラクトシルトランスフェラー ゼ）がある(for a review see Shur，Curr，Opin，in Cell Biol.，5:854-863(1 993))。この酵素は糖質認識能力と糖質触媒活性の両方を持って、そして多様な 細胞-細胞と細胞-基質相互作用に関連させられた。細 胞表面の特徴がβ１,４-ガラクトシルトランスフェラーゼ形式を表現したがそれ が酵素的の修飾の後に生成する生成物のためにそれがもう結合活性を保たないと いうことである(Miller et al.，Nature，357:590-593(1992))。それで、この特 定な転移酵素は、それがその酵素的の生成物のために認識を示すことに失敗する から、レクザイムではない。 IgGSFのレクザイムがMHCの外に位置している遺伝子によってコード化される。 例えば、ＣＤ-１は構造でクラスＩMHC分子に関連づけられるIgGSF遺伝子の生成 物である、しかしＣＤ-１Ｈ鎖はMHCの外に遺伝子によってコード化される。Ｔ- ６ＣＤ-１分子は皮膚（ランゲルハンス(Langerhan)の細胞）で専門的な抗原提示 細胞によって表現される。この分子はＴ-６のために免疫機能を示しているMHCク ラス１１抗原とともに細胞の中に内面化される。別にレクザイムによって拘束さ れる十分に浄化された糖質リガンドを含む組成物が調製される。ここに使われる ように、「十分に浄化された」用語は比較的脂質、蛋白質、ヌクレイン酸、通常 糖質リガンドと結び付けられない糖質又は他の分子のような他の汚している分子 がない糖質リガンドを意味する。同じくここに使われるように、「特別に結び付 けられた」が意味する用語濃縮に達するべき十分な相補性を有することは少なく とも１０￣⁴のモルの十分なレクザイムの面前で基質を自由にした、そして好ま しくは１０￣⁶、モルであるか、又はより大きい。十分に浄化された糖質リガン ドが糖質源の高 純度化について又は化学的又は酵素的合成によって、例えば、よく知られている 生化学の実験方法を使って得られることができる。 本発明の糖質リガンドが糖蛋白質、プロテオグリカン、Ｎ-結合するか、又は 糖鎖形成の形式を０-結合した糖脂質又はムコ多糖のような分子を含んでいて周 知の糖質を含むことができる。プロテオグリカンが、例えば、ムチンとプロテオ グリカンがヒアルロン酸でグリコシル化したそれら、コンドロイチン硫酸、ヘパ リン、ヘパリン硫酸エステル又はデルマチン硫酸エステルを含む。糖脂質が、例 えば、アシルグリセロール、スフィンゴイドとセラミドを含む。 リガンドは十分に浄化された糖質を含んでいる試料として多様な源、流体、組 織又は細胞から得てもよい。これらの源はどんな植物種又は動物種どんなほ乳類 又はどんな微生物でもあり得る。糖質リガンドの源が細胞にレクザイム又は表現 される時糖質リガンドを含んでいる蛋白質をコード化する発現-ベクターを導入 することによって同じく変性された細胞を含むことができる。 糖質リガンドを含んでいる試料が糖質の化学的に作り出されたライブラリから 得られることができる。このようなライブラリは糖質を混ぜることによって自然 の源から作られることができる、そして酵素的作り出された源からまた、ライブ ラリからの個体糖質が糖質リガンドの構造的な決定で支援するべき螢光 性のラベルのような探知可能なラベルで印を付けられることができる。 糖質リガンドを含んでいる試料が技術でよく知られている実験方法によってさ らにリガンドを浄化するために処理される。このような実験方法は、例えば、複 合多糖の高純度化、化学的であるか、又は新陳代謝の手段によっての複合多糖を 判別すること、複合多糖からの糖質の解放と解放された糖質の構造の特性指摘を 含む（例えばAusabal et al，In Current Protocols in molecular Biology Vol ．2，chapter 17，(Green ２０ Publishing Associates and Wiley interacien ce，New York，1994); Fakuda and Kobata，Glycobiology: A practical Appro ach，(IRL Press，New York，1993参照）。両方ともは参照によってここに含ま れる。また、これらの実験方法は、糖質リガンドの配列を含めて、構造的な特性 指摘に役立つ。リガンドが組織又は細胞から浄化した糖質の構造の解明が直接の 化学合成又は酵素的合成又は自然の源からの高純度化によってリガンドの未来の 生産を可能にできる。 レクザイムに結び付く糖質リガンドがいくつかの実験方法によって識別される 。ある方法では、糖質リガンドを含んでいる試料は、リガンドの特定の結合を許 す適当な条件の下でリガンドに結び付く推定されるレクザイムレクザイムに接触 される。適当な状態が、例えば、適切な緩和物濃度と特定なレクザイムと糖質リ ガンドの結合を認めるｐＨと時と温度を含む。適当な 反応期間の後に、レクザイムに制約された糖質リガンドの量は放射性核種又は螢 光性のラベルのような探知可能な部分を糖質リガンドに付けて、そして、どんな 自由にされた糖質リガンドでもリガンド-レクザイム複合体から取り除かれた後 、レクザイムと結び付けられるラベルの量を測ることによって、例えば、決定で あり得る。 ここに使われるように、「探知可能なラベル」がその存在が物理的、化学的又 は分子の生物学の特徴のために検出される分子を意味する。探知可能なラベルが 、例えば、放射性同位体、螢光性の分子、酵素／基質器官系、又は視覚的に探知 可能な分子を含む。楽しい糖質分子に判別することのための方法は技術でよく知 られていて、そして例えば、放射性標識化する糖質で合成又はNaB（³H）₄での還 元を含む。(see，for example，Varki，supra，1994 and Rothenberg et al.，P roc，Natl．Acad．Sci．(USA)，90:11939-11943(1993)，both of which are inc orporated herein by reference，and Fukuda and Kobata，supra 1993)両方と もは参照によってここに含まれる。また、判別された糖質分子の調製法の一式は オックスフォードグリコシステム(Oxford GlycoSystem)(Rosedale，NY)のような 商業源から容易に利用可能である。 自由にされた判別されたリガンドをリガンド-レクザイム複合体から取り除く 方法が、例えば、レクザイムを頑丈なサポートに付けることに依存するかも知れ ない。本発明と蛋白質をこ のようなサポートに付ける方法で有用な頑丈なサポートは、技術でよく知られて いる(see for example Harlow and Lane，Antibodies: A laboratory Manual(Co ld Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988)。 これはこ参照によってここに含まれる。このような頑丈なサポートは、例えば、 セファロース(Sepharose)、アガロース又はポリスチレンを含む。 適当な反応期間の後にそしてどんな自由にされたラベルでも、例えば、洗うこ とによってサポートから取り除かれた後、堅実なサポートに置かれたラベルの量 はサポートの上にレクザイムに制約された糖質リガンドの量の直接の測定を提供 する。代わりに、サポートに制約された判別された糖質リガンドの量は自由にさ れたラベルの量を測ることによって反応期間の後に間接的に決定であり得る、そ してラベルの量からこれを引くことは反応の開始において添加する。 正確に、特別にレクザイムに、制御反応を結び付ける判別されたリガンドの量 がどこで行わせようと決定するために、すべての条件が、レクザイムが制御反応 に含められないこと以外、判別されたリガンドとレクザイムの間に結合反応のよ うに同じである、又はレクザイムは血清アルブミンのような無関係な蛋白質によ って取って代わられる。制御反応は堅実なサポートの上にレクザイムによりむし ろ堅実なサポートに結び付く判別されたリガンドの量のような非特異的に起こる 判別された糖質リ ガンドの結合の量を決定する。それで、条件の下で特別にレクザイムを結び付け たリガンドの量が試験したと決定するために判別された糖質リガンドとレクザイ ム両方を含んだ反応から得られた結合値から制御反応から得られた非特定の結合 値を引くことは必要である。 固体サポートを使うことについての利点は判別されたリガンドが、糖質リガン ドとレクザイムの間に結合親和性のより低いレベルを識別することを可能にして 、レクザイムと比較して過剰で加えられることである。公知のスキャッチャード (Scatchard)分析方法で、その両方ともが溶け得る２つの分子の間に結合親和性 を決定することができ、その両者は溶液又は固体サポートに付けられることがで きる。平衡透析はレクザイムへのリガンドの結合が、両方の分子が溶けている時 、決定であり得る実験方法の例である。 レクザイムに同じく判別された糖質リガンドの結合を測る方法は、レクザイム が細胞と結び付けられる時、実行できる。固体サポートの使用に類似した方法で 、細胞表面の上にレクザイムを表現する細胞は判別された糖質リガンドに結び付 けることができる。そして、適当な反応期間の後に、細胞は公知の遠心分離又は 濾過などの方法によって自由にされたリガンドから分離の技術で分離される。細 胞質でレクザイムを表現する細胞が、細胞膜が電話でレクザイムに糖質リガンド のアクセスを許すために十分に浸透化させられたなら、レクザイムに糖質リガン ド の結合を検出するために同じく使われる。抗原-抗体結合などの結合分析中に細 胞を使する分析方法は技術でよく知られ(see，for examPle，Harlow and Lane s upra，1988)、そして一般に結合に適用できる糖質の間にリガンドとレクザイム を分析する。 レクザイムを表現する細胞は当然クラスＩを表現するリンパ球又はクラスII・ MHCでコード化されたレクザイムのような、レクザイムを表現する細胞であり得 る。レクザイムを表現する細胞は同じく細胞にレクザイムをコード化している発 現-ベクターを導入することについての結果としてレクザイムを表現する細胞で あり得る。レクザイム(Leczyme)を表現する細胞が酵素によってそれらの周囲の 基質から解放細胞まで組織の機械的な中断又は組織の消化のような技術でよく知 られている実験方法によって生体上の源から得られることができる(see for exa mple，Freahney Culture of Animal Calls(Alan R．Liss，New York，1993)、 そしてそれは参照によってここに含まれる。細胞系となるレクザイムを表現する 細胞は公共の細胞倉庫、アメリカの代表株培養収集(American Type Culture Col lection)などから利用可能である。 ２つの分子の間の結合が、２つの分子のいずれかが探知可能なラベルを含んで いる時、行われることができることは技術でよく知られている。もしレクザイム が探知可能なラベルを含んでい、そして糖質リガンドが頑丈なサポートに置かれ るか、又はその時細胞によって表現されるなら、同じく頑丈なサポート 又は細胞に置かれたレクザイムに結び付く探知可能な判別された糖質リガンドの 同定は行われることができる。レクザイムが実験方法を蛋白質に判別するために 使うことによって楽しい判別される。これらの実験方法は技術でよく知られてい て、そして、例えば、ビオチニレーション又は放射性同位体の判別された前駆体 の協働を含む。糖質をリガンド-表現している細胞が組織又は臓器から得られる 細胞であり得るか、又は公共の倉庫から利用可能な細胞系のような細胞系であり 得る。 糖質リガンドを頑丈なサポートに付けることのための方法がリガンドの化学的 な性質に頼る。それで、吸着が糖質、ペプチド又は脂質建物を頑丈なサポートに 付けることに適した化学によって糖質リガンド吸着に接着させられて糖質部分又 は他の分子を通して達成され得る。糖質、蛋白質又は脂質を種々のタイプの頑丈 なサポートに付ける方法は技術でよく知られている。 リガンドがレクザイムに物理的特徴を測ることによっての探知可能なラベルの 間必要無しで決定される糖質、いずれか、の結合、リガンド、又は紫外線の吸収 のようなレクザイム。このような物理的特徴によって蛋白質又は糖質を数量化す ることのための方法は技術でよく知られている。リガンド又はレクザイムの物理 的特徴に続く能力は結合分析に応用でき、これは頑丈なサポート又は表現、が当 てはまられることができる結合がその使用を試みる又は表現細胞又は両方の分子 が溶けている時に用いることができる。もしリガンドがレクザイムの酵素力のた めに基質であるなら、それで糖質リガンドの結合はレクザイムに同じく評価され る。この場合、結合がミカエリス-メンテン(Michealis-Menten)式によって、例 えば、慎重な基質遺伝子変換運動学に従うことによって判断される(Devlin，Tex tbook of Biochemistry(Wiley-Liss Inc． New York，1992)、そしてそれは参照 によってここに含まれる。 レクザイムを結び付ける糖質リガンドを識別することのための方法がひとつの 浄化された糖質リガンド又は糖質リガンドの限定された数を使って行われること ができる、そしてそれは、上に記述されるように、従来の手法によって浄化され るか、又は結合試薬に結合によって浄化される。ここに使われるように、「結合 試薬」が糖質リガンドに特別に結び付くことができる化学的又は生物学の分子を 意味する。例えば、糖質リガンドに結び付くレクザイムがそのリガンドを浄化す るために使われる試薬である。同じく、抗体が、もしそれが糖質、蛋白質又は糖 質リガンドの脂質部で特別に反応できるなら、試薬であり得る。 浄化された糖質リガンドが同じく楽しいここに明らかにされた実験方法によっ て判別される。浄化されないリガンドがそれが頑丈なサポートに置かれ又は細胞 と結合によって表現されるなら、他の分子を含んでいる試料が使われるように、 結合で分析する糖質がレクザイムの結合を検出することによって決定される。こ の場合、もし浄化されない糖質であるなら、リガンドがレクザイム、高純度化と 次の結合が浄化された状態で糖質リ ガンドを得るために分析するリガンドが任せられることができる試料を含んで結 び付けることができる。 浄化されたレクザイムが浄化すること、クラスＩ又はクラスII分子のために技 術で知られて実験方法のような古典で、蛋白質又は糖蛋白質のための方法の高純 度化によって細胞から得られることができる。レクザイム(Leczymes)が同じくレ クザイムの表現を可能にするために分子の生物学の技術によって変性された細胞 から得られることができる。レクザイムをコード化している遺伝子が発現-ベク ターの中にクローンを作られて、そして次に宿主細胞に導入される。ベクターは 技術でよく知られていて、そして、例えば、プラスミド又はウイルスのベクター と同様、ベクターと発現-ベクターのクローンを作ることを含む(see，for examp le，Goedell，Methods in Enzymology，Vo1．185 Academic Press，New York，1 990)、そしてそれは参照によってここに含まれる。バキュロウイルスベクターは 昆虫細胞でレクザイムを表現して、そして細胞の上に今糖質リガンドの表現をも たらすために使われるベクターの例である。 同じくレクザイムをコード化している核酸分子を含んでいるベクターがプロモ ーター又はエンハンサー要素を含んでいることができる、そしてそれは構造、又 は誘導可能であり得て、そして、もし切望されるなら、特定で組織であり得る。 宿主細胞が技術で同じく周知である、そして適切な宿主細胞が特定なベクターが 使われるために選択される。例えば、バキュロウイル ス転送-ベクターがSF21細胞のような昆虫細胞系を感染させるためにバキュロウ イルスＤＮＡで使われる。安定した細胞系を作り出すこのような一変した細胞を クローンを作ることは表現されたレクザイムの源を提供できるか、又は表現され たレクザイムによって変性する糖質リガンドの源を提供できる。 レクザイムをコード化している遺伝子は高純度化又はレクザイムのそれ以上の 下流の処理を支援するために融合蛋白質として表現される。例えば、レクザイム は、CD22βレクチンを表現することに対して前に行われたように、免疫グロブリ ン分子のFc結合部位を形成するCH2又はCH3ドメインに融合されたキメラ蛋白質と して作り出される(Stamenkovic et al．Cell 66:1133-1144(1991))。商業源から 容易に利用可能な頑丈なサポートに制約された黄色ブドウ球菌からのプロテイン Ａ(ProteinA)の使用はFcを含んでいるキメラレクザイムを浄化するために使われ る。また、キメラレクザイムを含んでいる堅実なサポートは糖質リガンドの結合 を評価するために直接使われる。 レクザイムに結び付く糖質リガンドを識別することに対して上に記述された実 験方法は糖質リガンドに結び付くレクザイムを識別するために同じく使われる。 例えば、レクザイムを含んでいる試料がレクザイムにリガンドの特定の結合を許 すために適当な状態の下でレクザイムに結び付くと思われる糖質リガンドで接触 される。結び付いたために識別されるべきレクザイム(Leczymes)が含む、例えば 、浄化されたレクザイム又は蛋白質 の混合のような複合体混合物の中で含んでいられるレクザイムがcDNA発現ライブ ラリを作り出すライブラリ方法がよく知られているcDNA発現から技術を表現した (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)，which is incorporated herei n by reference)、そしてそれは参照によってここに含まれる。 糖質リガンドもアフィニティカラムと関連した科学技術によって浄化される。 例えば、糖質リガンドを含んでいる試料がリガンドを結び付ける試薬複合体の群 系を許す適当な条件の下で結合試薬で接触される。適当な条件、例えば、適切な 緩和物濃度と結合試薬に糖質リガンドの結合を認めるｐＨと時と温度を含む。合 成の試薬がその時そうであるリガンド-結合は、リガンドが複合体から切り離さ れる及び、洗って同じぐらいによってそんなものを分離法によっての試料の残り から分離した。 もう１つの例として、糖質リガンドに結び付くレクザイムが試薬がそのリガン ドを浄化するために使った結合を含むかも知れない。抗体が、もしそれが糖質、 蛋白質又は糖質リガンドの脂質部で特別に反応できるなら、同じく結合試薬を含 むことができる。 糖質リガンドの高純度化が、もし結合試薬がアガロースのような頑丈なサポー ト、セファロース(Sepharose)又はプラスチックに付けられるなら、達成され得 る。蛋白質又は糖質を頑丈なサポートに合体することのための方法は、レクザイ ムに糖質リガンドの結合を検出することに対して上に明らかにされて、 同じく結合試薬を頑丈なサポートに付けることに役立つ。 リガンドを結び付ける試薬複合体から糖質リガンドを切り離す方法が結合試薬 の性質に頼ることができる。例えば、もし結合試薬がレクザイムであるなら、そ の時複合体を切り離すための方法が糖質リガンドを結び付けるレクザイムで同じ 場所のために結合親和性を有する糖質構造で複合体の競合的抑制を含むことがで きる。結合試薬から糖質リガンドを切り離すことに役立つ他のよく知られている 治療が参照によってここに含まれるｐＨ、高い塩濃度又はカオトロピックの試薬 (see，for example，Harlow and Lane，supra，1988)，which is incorporated herein by reference and Varki，supra，1994)で、例えば、両極端を含む。上 記の明らかにされた実験方法によって浄化された糖質リガンドは、化学的又は酵 素的合成によってリガンドの未来の生産を可能にするために、上に記述されるよ うに構造的な分析に適している。 オリゴ糖又は多糖型の糖質リガンドに特別に結び付く抗体が、もしこのような 部分がリガンドに接着させられるなら、糖質に、又は蛋白質部分又は脂質部分に 作り出される。ムチンのペプチド骨格のような糖質リガンドのペプチド骨格のた めに特定の抗体が異なった細胞からムチンの源を浄化することに役立ち得る、又 は異なった個体から、ペプチド骨格がこれらの分子の糖質部より糖質を含んでい てペプチドの間に保存されるさらに多くであり得るので、蛋白質糖質又は脂質の ために特定のポリクロナ ール抗体、モノクローナル抗体、抗体断片又は同種のもの、のような抗体を作り 出すことのための方法は技術でよく知られている(See，for example，Harlow an d Lane supra，1988)。 レクザイムがそれによってレクザイムがこれらの実験方法で糖質リガンドに特 別に拘束する実験方法を使って浄化される、レクザイムを含んでいる試料がリガ ンド-レクザイム複合体の群系を許す適当な条件の下で糖質リガンドで接触され る。適当な状態、例えば、適切な緩和物濃度とレクザイムと糖質の結合を認める ｐＨと時と温度を含む。合成の試薬がその時そうであるリガンド-結合は、レク ザイムが複合体から切り離される及び、洗って同じぐらいによってそんなものを 実験方法によっての試料の残りから分離した。 レクザイムの高純度化が、もし糖質リガンドがアガロースのような頑丈なサポ ート、セファロース(Sepharose)又はプラスチックに付けられるなら、達成され 得る。糖質リガンドを、レクザイムに糖質リガンドの結合を検出することに対し て上に明らかにされたそれらのような、頑丈なサポートに合体することのための 方法は糖質リガンドを頑丈なサポートに付けることに役立つ。リガンド-レクザ イム複合体からレクザイムを切り離すことのための方法がリガンド-レクザイム 複合体から糖質リガンドを切り離すことに対してここに明らかにされた実験方法 を利用できる。 レクザイムを表現する細胞の機能を変性する糖質リガンドが 適当な状態の下で細胞と一緒に糖質リガンドを含んでいる試料と接触することに よって識別される、そしてそれは細胞の上にレクザイムにリガンドの特定の結合 を許す。レクザイムにリガンドの結合に割り当てるべき適当な一定の時期の後に 、細胞はそれらの機能を決定するために評価される。レクザイムを表現する細胞 の機能を変性する糖質リガンドが細胞と一緒に接触される時、同じタイプのリガ ンドと接触しなかった細胞の機能とは違う機能をもたらす。 ここに使われるように、細胞への参照での「機能」は、細胞のために検出され る活性を含む。細胞の機能は問題の細胞の性質で変化できる。例えば、Ｔリンパ 球の機能はある特定のサイトカインの生産のような活性を含むことができる、細 胞の獲得がリンパ分解を調停した、抗体に依存する細胞を調停する能力がＢリン パ球産物抗体の為になるために細胞毒性又は能力を調停した。それで、Ｔリンパ 球の上にレクザイムに結び付いて、そしてその後細胞の機能をもたらすことがで きる特定な糖質リガンドが増加するか、又は上記のＴリンパ球機能のいずれでも 減少させることによってそうできる。もう１つの例として、胃腸管の上皮細胞へ の複合多糖の付加が鉄の吸収に影響を与えるであろう。 レクザイムを表現する細胞と一緒に糖質リガンドと接触することは細胞培養培 地で人工的に行われることができる。そのそれぞれが参照によってここに含まれ るリンパ系細胞又は他の細 胞の機能を測ることのための方法が、技術で、よく知られている(see for examp le，Colligan et al.，Curr．Protocols in Immunol，(Greene Publishing Asso ciates and Wiley Interscience，New York，1992); Mishell and Shiigi，Sel ected Meth，in Cell，immunol．(W. H. Freeman and Co.，New York，1980)， each of which are incorporated herein by reference)。 レクザイムを表現する細胞の機能を変性する糖質リガンドを識別することに対 して上に記述された実験方法は同じく細胞をレクザイム-表現して糖質の機能を 変性するレクザイムを識別することに役立つ。 レクザイムを表現する細胞の機能はレクザイムを結び付ける糖質リガンドで細 胞を縮小することによって変性される。また、発明はリガンドを結び付けるレク ザイムを細胞と接触することによって細胞をリガンド-表現して糖質の機能を変 性する方法に提供する。糖質リガンド又は細胞の機能を変性できるレクザイムの 同定は共に人工的な、そして生体上の使用を有する。例えば、リガンド又は減少 するか、又は疾患状態に関係している細胞の機能的な活性を増やすことができる レクザイムが疾患を扱うために個体に投与される。 レクザイムの糖質リガンド結合部に結び付くことができるペプチドがレクザイ ムにペプチドの結合を可能にする適当な条件の下でレクザイムで試験されるため にペプチド又はペプチドを 含んでいる試料と接触することによって、例えば、識別される。その後、レクザ イムはそうである糖質リガンドが周知であるという状態で、レクザイムに反応す る。反応はレクザイムを結び付ける糖質リガンドに適した条件の下で行われる。 代わりに、ペプチド、レクザイムと糖質リガンドは反応の開始において一緒に加 えられることができる。糖質リガンドは直接ペプチドとレクザイムを含んでいる 混合物に加えられることができるか、又は、どんな自由にされたペプチドでもレ クザイムから取り除かれた後、加えられることができる。反応の端部の後に、レ クザイムに接着する糖質の量は決定されて、そしてペプチドを含んでいなかった 制御試料でレクザイムに結び付いた糖質リガンドの量と比較される。もしペプチ ドを含んでいてレクザイムに試料で結合糖質リガンドの量が制御試料でレクザイ ムに結合糖質リガンドの量より少しであるなら、それでペプチドがレクザイムの リガンド結合部を糖質に制約されているようにして、それ故に糖質リガンドのペ プチド擬態であると結論される。 擬態が識別されるペプチド探知可能なラベルを含んでいる糖質リガンドと頑丈 なサポートに向かっているか、又は細胞によって表現されるレクザイムを利用す るフォーマットを試みる。レクザイムに結び付く糖質リガンドを識別することに 対してここに明らかにされた実験方法は生成するのに有益である糖質リガンドの ペプチド擬態を識別することに対してフォーマットを試みる。 画定されるペプチド配列が化学的に又は生物学の実験方法、組換えＤＮＡ技術 によって合成されるか又は生成される、（See，for example，Sambrook et al. ，supra，1989)。ペプチドの複合体混合物がペプチド擬態を識別するために同じ く使われる。このような複合体混合物は、例えば、画定される配列の混合を含む ことができるか、又は配列の半ランダムであるか、又はランダムなライブラリで あり得る。ビード又はマイクロタイタ皿又は生物生産の上に化学合成のような実 験方法によってペプチドライブラリを生成する方法そんなもの同じぐらい表面上 バクテリオファージの、参照によってここに含まれる技術でよく知られている(s ee，for example，Huse et al.，Science．246:1275-1281(1989)，which is inc orporated herein by reference)。 レクザイムの糖質リガンド結合部に結び付くことができるペプチドが同じく糖 質リガンドの機能的な特性のいくらかを持つことができる。このペプチドはそれ で糖質リガンドの機能的な擬態であると思われる。このようなペプチド擬態は細 胞の機能を変性するために使われることができて、そして擬態に結び付くことが できるレクザイムを含む疾患状態を扱うために同じく使われる。 細胞がレクザイムの発現を得るために細胞にレクザイムをコード化している発 現-ベクターを導入することによって糖質リガンドを作り出すために変性される 、そしてそれは細胞によっ て糖質リガンドの生産をもたらす。特定な糖質リガンドを作り出している細胞が 独自なタイプのリガンドを提供するために有用である、そしてそれは細胞から浄 化される。結合がリガンドを結び付けるレクザイムを識別するために分析する細 胞が有用な添加、そんなもので。 ヒト又は他の動物のような、個体での免疫応答は免疫応答が切望される抗原と レクザイムに結び付く糖質リガンドを使って調整される。レクザイムが含むよう に、例えば、免疫系に関係している主要組織適合性複合体分子、糖質リガンドの インジェクションと抗原は免疫応答を調整できる。ここに使われるように、「調 整」は増加又は減少を意味する。免疫応答における増加が抗原提示細胞に抗原が レクザイムによって目標を定められるように抗原に制約された糖質リガンドを与 えることによって得られることができる。 抗原が共有的糖質に又はどんな蛋白質又は技術でよく知られている実験方法を 使っているリガンドの脂質にでも抗原を接着させることによって糖質リガンドと 結び付けられることができる。共有的抗原を糖質リガンドに合体する実際の方法 はそれぞれの分子の自然が、カプリングであるか否かにかかわらず手法が抗原の 少しも重大な抗原決定基又は結び付けるべき糖質リガンドの能力に有害である及 び、合体されることをあてにするであろうその標的レクザイム。このような有害 な効果が結び付くことにおいて容易に評価される分析する上に記述されるように 。 １以上のひとつの抗原分子又は１以上のひとつの糖質リガンドが免疫原を作り 出すために一緒に合体される。このような分子はいずれか又は抗原又は糖質リガ ンドの両方とものために多原子価化することができて、そして抗原のひとつの分 子と糖質リガンドのひとつの分子を含んでいる免疫原より大きい免疫応答を引き 出すことに対して使われる。 個体で免疫応答を増やす方法は当業者よく知られていて、そして投薬量、摂取 のルート、使用のようなパラメータの最適化を必要とするについてアジュバント 又は摂取のスケジュールのパラメータを最適化する(see，for example，Harlow and Lane，chapter 5，supra，1988)。これらの同じ実験方法は糖質リガンドで 使用に適合させられることができる。増やされた免疫応答が管理した後で抗原を 得た、そして糖質リガンドが抗原と糖質リガンドの摂取の前に明らかにされるパ ラメータのレベルの上に統計学的に重要なレベルによって、免疫応答パラメータ が増加した時、達せられる。 糖質リガンドと結び付けられた抗原を与えた後で増加できる免疫応答パラメー タは抗体によって調停された応答又は細胞である-調停された応答を含む。抗体 免疫応答を測る方法が技術でそれらによく知られていて、そして共に人工的な、 そして生体上の実験方法によって、例えば、免疫グロブリンの検出を含む(seefo r example Harlow and Lane，supra，1988)。細胞の 免疫応答を測る方法は技術で同じくよく知られていて、そして生体上の実験方法 を含むそんなもの同じぐらい同種の遅延型過敏症と直接の細胞細胞毒性又は活性 化が分析する細胞のような人工的な実験方法の試験する(see,for example，Coll igan et al．supra，1992; mishell andShiigi，supra，1980)。 糖質リガンドと結び付けられた抗原が抗原に免疫応答を減少させるために同じ く使われることができて、そして特に免疫応答を減少させることのための方法が そうできる自己免疫疾患状態のような有害な免疫応答を扱うことに役立ち得る、 若干数の下で状態が一般に抗原に耐性の状態として言及された抗原に特定の免疫 不応答の長期の状態をもたらす。 糖質リガンドに接着させられた抗原を与えることによって抗原に免疫応答を減 少させることは抗原に個体を鎮圧するか、又は耐性を与えるために技術でよく知 られている実験方法を使って達成され得る。このような実験方法は口頭で、例え ば、低い投薬量の摂取、抗原の単量体の、そして非集塊する形式と糖質リガンド 又は摂取を含む。また、減少させられた免疫応答が同時にサイクロスポリンＡの ような免疫抑制剤と一緒に抗原と糖質リガンドを、特定なＴリンパ球細胞表面レ セプターにFKSO6又は抗体を与えることによって得られることができる。ヒト又 は動物で抗原に免疫応答を減少させるこのような試薬を使うことのための方法は 技術でよく知られている。 レクザイムを含んでいる疾患状態がレクザイムに結び付く糖 質リガンドの効果的な量を与えることによって扱われることができる。ここに使 われるように、用語「疾患状態」は、レクザイムが疾患過程で役割をするなら、 遺伝子であるか、又は習得されているか否かにかかわらず、どんな疾患でも含む 。ここに記述された実験方法を使って改善されるかも知れない疾患状態が同じく 炎症、移植拒否反応、を含んで、そしてそうしてもよい両方の遺伝学であるそし て環境の鉄蓄積症、自己免疫又は癌腫のような素地を有している疾患を含む。ま た、ここに記述された実験方法を使って改善されるかも知れない他の疾患状態が ウィルス、バクテリア、酵母又は寄生体のような病原菌の結果として生じている それらを含む。伝染性の試薬の入って、そして宿主の細胞を感染させる能力は宿 主の細胞の上に表現されてレクザイム又は糖質リガンドに結び付くことによって 存在できる。糖質のためのペプチド擬態が擬態が結び付くことができるレクザイ ムを含む疾患状態を扱うために同じく使われる。 レクザイムを含んでいる疾患状態が疾患状態に関係しているレクザイムとして 糖質リガンドのために類似の結合特異性を有しているレクザイムを与えることに よって扱われることができる。レクザイムによって処置に役立つ疾患状態は糖質 リガンドによって処置のために上に記述されたそれらを含む。それで、異常な自 己認識は、病んだ個体でレクザイムによって調停されて、レクザイムの摂取によ って扱われることができる。このようなレクザイムは異常な自己-反応的なレク ザイムを表現する 細胞によって標的細胞の上に発見された自然の糖質リガンドに結び付いて、そし て、従って、認識するべき自己-反応的なレクザイムを表現する細胞の能力を妨 げて、そして標的細胞に向かって異常型反応できる。 ヘモクロマトーシスとして知られている鉄の新陳代謝の疾患が同じく、鉄の代 謝での欠陥が、鉄で、高い濃度でレクザイム機能で根拠を持つことができるから 、ここに明らかにされた実験方法を使って扱われることができるそれが関連付け られた有毒な無機の分子が病態生理学多くの普通の疾患のものである。これらは 制限されないが、癌腫(Stevens et al，IL Encl．J．Mad.，319:1047(1988); St evens，et al.，Med，Oncol Tumor pharmacother，7:177-181(1990))，heart d isease(Kannel，et al.，1976; Sullivan，Laiacet，1:1293-1294(1981); Salon en，et al，Circulation 86:803-811(1992))，reperfusion injury（Zweier，J ．Biol，Chem.，263:1353-1357(1988)） and rheumatoid arthritis（Blake et al.，Arthritis Rheum.，27:495-501(1984)）を含む。病理学のデータ点配置が 、共同でヘモクロマトーシス、影響ヒトに知られている最も普通の遺伝病と呼ん だそのひどい鉄の過多がもたらす議論がない。 ヘモクロマトーシスが能動輸送でGI路から鉄の強化された吸収の結果として生 じる、しかし遺伝子又は根本的な新陳代謝の欠陥を起こしている遺伝子が現在未 知である。鉄の吸収に関して確実な遺伝子の同定が、いずれの鉄の過多で動物モ デルを発 展させることはGI路から鉄のアクティブな強化された吸収のためである及び、大 いにヘモクロマトーシスを理解することを容易にして、そして鉄の代謝の一般的 な機構について知識を増やすであろう。ここに明らかにされるように、MHCでコ ード化されたレクザイムがヘモクロマトーシスの病因に関係しているかも知れな い。 ヘモクロマトーシスが、症状が発展するまで、通常臨床の注意に持って来られ ない、そしていくつかの研究が、組織損害の発生が必ず器官機能を改善しなかっ た後、その鉄の撤去を示した(Cundy，et al.，clin，Endocrinol.，38:617-620( 1993); Westera et al.，Am．J．Clin，Path． 99:39-44(1993))。ヘモクロマ トーシスがそうである不十分診断して、そして大いに早い診断と効率的な処置で 利益を得るであろう疾患には不十分治療である(for reviews see Edwards et a l.，Hosp．Pract．Suppl.，3:30-36 1991); Edwards and Kushner，N．Engl，J ，Med.，328:1616-1620(1993))。 処理されていないヘモクロマトーシスが柔軟組織の細胞の鉄の過多によって特 徴づけられる、そしてそれは有毒であって、そして多くで（硬変を含めての、そ して肝臓癌腫の）ヘパトパシー、関節症、低ゴナドトロピン性性機能低下、骨髄 形成不全、皮膚疾患、糖尿病と心筋症を含めて種々の合併症のありそうな目的を 場合に入れる(for review see Halliday and Powell，Iron and Human Disease ，Lauffer，RB，(ed)．131-160(1992)) 。死亡した診断されたか、又は化学処理されていない患者の約２５％が肝がんが 開発するという状態で、合衆国の中に伝えられるところによればヘモクロマトー シスの１.５から２百万の活動中の症例がある。 処理されていないヘモクロマトーシスで、鉄が肝臓の肝細胞であまねく堆積さ せられる、そして肝生検と一緒にされた高い血清フェリチンレベルを有するトラ ンスフェリンの高い中和が現在利用可能な最も良い診断の試験を提供する(Fairb anks，Hosp，Pract.，26:17-24(1991))。鉄はlyscsomal小胞で肝細胞の細胞質で 、そして電子顕微鏡検査によって主に見いだされる、そしていっそうひどい症例 で、鉄がミトコンドリアで堆積させられる(for review see Iancu，Ped．Pathol .，10:291-296(1990))。アルコールと肝炎のような他の肝臓毒が鉄の成長によっ て起こされた損害を悪化させる(Piperno et al.,16:364-368(1992))。ヘモクロ マトーシスを有する患者が、増やされた肝臓損害のために、アルコール飲料を飲 まないこと、又は同じく成長がそうできる、鉄としての、タバコ製品を喫煙する ことは肺で起こることを知らせられる。 ヘモクロマトーシスが、人の染色体６の上に位置を定められて、ヒトのMHC（ ＨＬＡ複合体）のＡ位置に確実な遺伝子が結合される常染色体の劣性の疾患とし て文献で報告される(Simon and Brissot，Hepatol.，6:116-124(1988))。ヒト のHLA-A3(HLA-A3)への連関が症例の約７３％で文書化された。しかし ながら、他の起源の位置が同じく、特にアフリカ人(African)で、関連付けられ た(Gorduke et al.，N，Enal，J．Mad.，326:95-100(1992))and African-Americ an populations(Barton et al.，Blood，85:95a(1993))。 ヘモクロマトーシスがはるかに膵嚢胞性繊維症を越えているヒトで現在最も普 通の遺伝子の疾患として認知される、フェニルケトン尿症と筋ジストロフィーが 結合した(Leggett et al.，Clin，Chem.，36:1350-1355(1990))。この遺伝病の 高い出現率の間の１つの説明が多数の結合された遺伝子での突然変異が類似の表 現型を引き起こすということであるかも知れない。ヘモクロマトーシスがそれぞ れホモ接合体と約０.３と１３％のヘテロ接合体で頻度でヨーロッパの起源の個 体群で最もしばしば起こる。 数本のマーカが、最近記述されたD6S105を含めて、ヒトのMHC位置で識別され て、そしてＡ位置の１センチモルガン以内までヘモクロマトーシス遺伝子のゲノ ムの設定を(Jazwinska et al.，AM．J．Hum，Genet.，53:347-352(1993))、そし て多分HLA-Ｆ(Gasparini，et al.，Hum．Mol．Genot.，5:571-576(1993))に狭め た。他の人たちがHLA-Ａに２０-２００kb位置を定められた候補ヘモクロマトー シス遺伝子が末端小粒であると報告した(el Kahloun et al.，Hum，mol，reniet .，2:55-60(1993))。これらの候補遺伝子のいくつかがひとつの原稿であると思 われた間に、遺伝子の３つが、HCGＩＩ、ＩＶとＶＩＩ と呼ばれて、多複製遺伝子であることがわかった。それで、ヘモクロマトーシス 遺伝子の位置設定を決定することにおいてなされる進歩にもかかわらず、それは まだ分離していない。 動物モデルが鉄のために過多大部分が、それらが能動輸送で消化器官から強化 された鉄の吸収を反映しないので、完全にヘモクロマトーシスの研究に適してい ない。しかしながら、ハツカネズミ遺伝子のβ2M（β２−／−）コード化欠失(K oller et al.，gripnnp，248:1227-1230(1990); Zijlstra et al.，Natire，344 :742-746(1990))が、ヘモクロマトーシス研究のために優秀な動物モデルを提供 する。これらの動物は、生化学の判別がクラスＩ遺伝子産物が合成されているこ とを示しているけれども、細胞表面の上に探知可能なクラスＩ蛋白質が欠けてい る。β２−／−動物から活性化リンパ球がクラスＩ発現(Liao et al.，Science ，253:199-202(1991))で再び欠失を提案している始動させられたナチュラルキラ ー（NK）細胞によって溶解される。これらマウスは発生でのβ2Mの役割の研究に 元来開発された。ハツカネズミが発展して、そして通常繁殖した間に、それらは CD8＋Ｔ細胞の重要な数を生成し損ねた。従って、これらのマウスは、感染のコ ースが正常動物より長いけれども(Eichelberger et al.，J，Exp Med.，174:875 -878(1991)；Muller et．al.，Nature，255:1576-1579(1992))、比較的よく、ハ ツカネズミの戦闘ウイルス感染免疫学の観点から強烈に故意であった。それらは 異型移植を拒絶して、そして標準的なマウ スよりIg生産と抗体タイプをより速くクラス-取り替えることのより高いレベル を示す(Zijlistra et al.，J．Exp Med.，175:885-889(1992))。CD8＋Ｔ細胞が 出生において検出できないほど低いけれども、、研究が動物がCD8＋Ｔ細胞を生 成でき、そして細胞毒素のCD8＋Ｔ細胞応答が適切な状況下で載置されることを 示した(Apasov and Stikovsky，a．Immunol.，152:2087-2097(1994))。もう１つ のこれらの動物で報告された重要な異常がそれらが（２年より大きい）老年で高 血糖（グルコース＞３００ミリグラム／dl）を進展するということである。それ はβ２−／−ハツカネズミが、どんなにこの説明が疑いをさしはさまれたとして も、自己免疫糖尿病の開始を示唆する(Faustmixn et al.，Science，254:1756-1 761(1991))と関係がある）ハツカネズミがヒトのヘモクロマトーシスに類似の鉄 の過多を進展できるβ２−／−マウスが自然発生的に肝がんを進展させることが できる(Serreze et al.，Diabetes，43:505-509(1994); Wicker et al.，Diabet es，43:500-504 (1994))。 この観測は分子生物学データで結合したβ−ギャップ(GAP)遺伝子が（実施例 Ｉ参照）、ハツカネズミが鉄の過多を進展させるであろうことを示唆した。組織 の組織化学の検査がこれらのマウスから、この仮説を確証した。鉄がすべての動 物の肝臓で、そして腎、脾臓と動物の若干の肺で堆積させられているのを見いだ された。また、動物の１６％が肝がん又は肝臓壊死を有している肝臓病を進展し た。それで、β２-／-不十分なマウ スのための臨床の所見は十分にヘモクロマトーシスの病理に類似して、β２-／- マウスを人間のヘモクロマトーシスの基礎となっている機構の研究のための魅力 的なモデルとしている。もっと重要なことに、マウスがそれを証明するβ２−／ −2Mがこの疾患で役割をする。 β−ギャッププロモーターの能力はβ−ギャップ遺伝子と非古典クラスＩ遺伝 子の両方を共に調製し、レクザイムをコード化し、腸で表現されるがヘモクロマ トーシスでクラスＩレクザイムのために役割を支援する。調節された非古典クラ スＩ遺伝子によってβ−ギャップ(GAP)プロモーター糖質構造がそれと関係づけ たそれが認識して、そして変性できるレクザイムがそのギャップ(GAP)遺伝子産 物、後者が直接、又は間接的に鉄（すなわち、β−ギャップが鉄のキャリアであ る）を結び付ける。β2M表現の中断は非古典クラスＩ分子によって提供された、 レクザイム機能の調整の損失が鉄の過多とヘモクロマトーシスに導くという結果 になる。 糖質リガンド又はレクザイムがヘモクロマトーシスのような疾患状態、自己免 疫疾患、移植拒否反応、炎症又は感染の治療のために薬を調製するために使われ る。実験方法とここに明らかにされた組成によって扱われることができる自己免 疫疾患が脊椎炎を膠着するような全身の自己免疫疾患、多発硬化、リウマチ様関 節炎、強皮症、シェーグレン(Sjoegren)のシンドローム又は全身性エリトマトー デスとアジソン病のような器官特定 の自己免疫疾患、グッドパスチャー症候群、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、 特発性疾患の血小板減少紫斑、重症筋無力症又は悪性貧血を含むかも知れない。 ヒトでのヘモクロマトーシスが多分調停されるようにβ−ギャップ(GAP)は、疾 患に関係しているレクザイムが疾患過程を調整するために使われるかも知れない （時・から・につれて・ように）、糖質リガンドでレクザイム、そして次に処置 を、同じ又は類似の結合特異性でレクザイム又は競争している分子をプロモータ ー-駆動した。ヘモクロマトーシスに関係している非古典クラスＩレクザイムを 結合する糖質リガンドは、β−ギャップ(GAP)鉄キャリアへの結合を抑制するた めに投与され得る。 自己免疫のような疾患を扱うために糖質リガンドを使うことに対して後に続く 過程が最初に疾患過程に関係しているレクザイムの同定を必要とできる。その後 、レクザイムに結び付くことができる候補糖質リガンドがここに明らかにされた 実験方法によって識別される。それで、病んだ個体からの免疫がある自己反応性 細胞上のレクザイムが、自己反応性細胞の標的である個体の細胞の上に表現され た糖質分子を認識する時、かかる候補糖質リガンドはその時そうであり得るこの ようなが示された自己免疫反応を妨げることにおいて効率的なそれらを識別する ために人工的に試験できる。自己免疫反応は細胞増殖又はサイトカインの解放の ような細胞機能における増加によって判断される(see for example，Colligan e t al．supra，1992; Mish ell and Shiigi，supra，1980)。最も良い候補糖質リガンドはその時疾患を扱う ために薬として用いられることができる。 ヘモクロマトーシスの処置のためにここに明らかにされた実験方法は同じく多 くの他の医学の疾患又は鉄の過多の結果として生じている合併症の治療に適して いる。多数のレクザイム遺伝子が鉄の代謝の制御、突然変異のタイプを調停する ことにおいて含まれるので、その、遺伝子での位置設定と個体で突然変異させら れたレクザイム遺伝子の数とタイプは個体で鉄の過多の程度をもたらすことがで きる因子である。個体によって示される鉄の過多の程度が上記の因子に依存して いる（時・から・につれて・ように）、それでヘモクロマトーシスを扱うここに 明らかにされた方法は鉄の過多の結果として生じている他の疾患を扱うことに対 して同じく適用可能である。このような疾患は、例えば、（硬変、肝臓癌）ヘパ トパシー、関節症、低ゴナドトロピン性性機能低下、骨髄形成不全、皮膚疾患、 糖尿病と心筋症を含む(for review see Halliday and Powell，Iron and Human Disease，Lauffer，RB，(ed)．131-160(1992))。 ヘモクロマトーシス又は他の鉄蓄積症を調整するために、糖質リガンド又は擬 態が効果的な量で投与される。全体の効果的な量は比較的短い一定の時期の上に ひとつの投薬量として、巨丸剤として又は注入液によって被験体に投与されるか 、又は多数の投薬量がいっそう長期の一定の時期の上に投与される分別治療プロ トコルを使って投与される。当業者が被験者で１有効 量を得るように要求された糖質リガンドの濃縮が年齢と、摂取のルートと同様、 被験者の一般的な健康を含めての多くの因子と投与される治療と糖質リガンドの 化学的な形式の数に頼ることを知るであろう。これらの因子の考察で、当業者は 被験者が扱われることに関して効果的な量を得るように特定な量を調整するであ ろう。 糖質リガンド又はレクザイムが自己免疫疾患の治療がレクザイムを含むことに 関して生体内で同じく有用であり得る。自己免疫疾患で、リンパ系細胞の上に表 現されたレクザイムが、細胞の免疫である-指揮された破壊が自己-糖質リガンド を表現するという結果になって、自己-糖質リガンドを異種の糖質リガンドとし て認知できる。それで、糖質リガンド、異常な自己認識に関係しているレクザイ ムに結び付くことができる擬態又は他の競争している分子の摂取が症状又は自己 免疫疾患の中止で減少に導いてリンパ系細胞認識又は活性化を妨げることができ る。代わりに、自己反応性リンパ系細胞のレクザイムによって認識された自己- 糖質リガンドのために同じ又は類似の結合特異性を有するレクザイムの摂取が自 己免疫疾患を扱うために同じく使われる。 糖質リガンド又はレクザイムがウィルス、バクテリア、酵母又は寄生体のよう な病原菌の結果として生じている疾患状態を扱うために使われる。病原菌は、細 胞表面上の糖質構造又はレクザイムを認識できるそれら自身の外部レセプターを 表現する ように進展し、感染すべき細胞への菌試薬の参入ができるようにしている。それ で、病原菌にさらされた適切な糖質リガンド又は個体へのレクザイムの摂取が、 その後感染の程度を抑制して、そしてそれによって疾患の普及を減らして、標的 細胞に試薬の結合を妨げることができる。 糖質リガンド又は本発明のレクザイムが移植拒絶を扱うために使われる。拒絶 が移植受容株のリンパ球による異種の分子の認識に基づかせられるので、その時 異種の抗原認識に関係している移植受容株のリンパ球のレクザイムに結び付くこ とができる糖質リガンドを有する治療が移植拒絶に導いている認識を抑制できる 。同じく、異種の抗原認識に関係している移植受容株のリンパ球のレクザイムと して同じ又は類似の結合部特異性を有するレクザイムの摂取が移植拒絶に導いて いる認識を抑制できる。 糖質リガンド又は本発明のレクザイムが、薬物受容できる担体を含んでいる製 薬の組成として投与される時、特に有用である。薬物の受容できるキャリアは技 術でよく知られていて、そして、例えば、生理的に和らげられた塩類液のような 水溶液又は他の溶剤又はグリコールのような媒体、グリセロール、オリーブ油又 は注入可能の有機的な生で食べる野菜のような油を含む。 薬物受容できるキャリアが、例えば、安定することか、又は糖質リガンド又は レクザイムの吸収を増やすために行動をする 生理的に受容できる化合物を含んでいることができる。このような生理的に受容 できる化合物は、例えば、グルコース、ショ糖のような、糖質、アスコルビン酸 のようなデキストラン、抗酸化薬、又はグルタチオン、キレート剤、低分子量蛋 白質又は他の安定剤を含む、又は当業者が薬物受容できる担体の選択が、生理的 に受容できる化合物を含めて、例えば、組成物の摂取のルートに頼ることを知る であろう。 当業者が１薬そのことを知るであろう同じぐらい静脈内に、筋肉内に、皮下、 又は腹腔内リガンド又はレクザイムが経口で、又は非経口的直接の点滴注入によ って、例えば、含む種々のルートによって被験者に投与される糖質、そんなもの を含んでいる組成物。組成物はインジェクションによって又は挿管によって投与 される。製薬の組成は同じくリポソーム又はミクロスフェアの中に、もし切望さ れるなら、取り入れられる、又は他のポリマーマトリックスでマイクロカプセル 化される(Gregoriadis，Liposome Technology， Vol．1(CRC Press，Boca Rato n，FL，1984)、そしてそれは参照によってここに含まれる。リン脂質又は他の脂 質から成り立って、非毒性の、例のための、リポソーム、比較的作って、そして 投与することが容易な生理的に受容できる、そして代謝のキャリア。 レクザイムをコード化している発現-ベクターがレクザイムの結果として生じ ている疾患状態を扱うために生体内で投与される。例えば、貧血のような、突然 変異させられたレクザイム の結果として生じている疾患状態が鉄の移送に関係している機能的なレクザイム をコード化している発現-ベクターを与えて、そして消化管の細胞でベクターの 発現を得ることによって扱われることができる。 細胞の中の特定なレクザイムの表現のレベルは細胞によって表現された糖質リ ガンドの性質の上に影響を持つことができる。もし特定な糖質リガンドの発現が 疾患過程に関係しているなら、リガンドはリガンドを作り出すことに確実なレク ザイムの発現を減らすことによって細胞から排除される。それで、発現-ベクタ ーが細胞でレクザイム遺伝子又はメッセージに選択的に交雑して、そして、それ によって、細胞でレクザイムの表現に影響を与えることができる、適切な条件の 下で細胞に導入される時、発現-ベクターが抗感応核酸分子を作り出すことがで きるように、レクザイムの１部をコード化している、ヌクレオチド配列を補足す る抗感応ヌクレオチド配列をコード化している外生的の核酸分子を含んでいるこ とができる。例のために抗感応核酸分子は細胞でレクザイム遺伝子に交雑するこ とができて、そして減量するか、又はレクザイム遺伝子の転写を抑制できる。同 じく、抗感応分子はメッセージが細胞でレクザイムをコード化することに交雑す ることができて、そして減量するか、又は翻訳、処理と細胞安定性又はＲＮＡの 半減期を抑制できる。 発現-ベクターが同じく細胞に特別にレクザイム又は糖質リガンドのペプチド をコード化しているＲＮＡを割ることができ るリボザイムをコード化している外生的の核酸分子を導入することによって疾患 状態に関係しているレクザイムの又は糖質リガンドの発現をもたらすために使わ れる。それで、紹介すること、疾患過程に関係している細胞の中へのリボザイム によって、１つは疾患に関係しているレクザイム又は糖質リガンドの発現を減ら して、そして従って減量するか、又は疾患過程を抑制できる。抗感応核酸分子又 はリボザイムが化学的に合成されて、そして組換えＤＮＡ技術を使っている発現 -ベタターに取り入れられることができる。抗感応ヌクレイン酸分子又はリボザ イムが同じく発現-ベタターに取り入れられなかったいで細胞に直接加えられる ことができる。 細胞に発現-ベクターを導入することのための方法は技術でよく知られている 。このような実験方法は、その両方ともが参照によってここに含まれるSambrook と検査室マニュアル(Laboratory Manual)で記述される(W. H. Freeman and Co ．New York NY(1990)。例えば、それらはリン酸カルシウムのようなトランスフ ェクション実験方法、エレクトロポレーション、リポフェクション、又はウイル スの感染を含む。 組換えウイルスのベクターが例えば、哺乳動物の細胞に性感の核酸分子を導入 して（そのために）利用可能であって、そして含む組換え型、アデノウイルス、 ヘルペスウイルスとレトロウイルス由来ベクター。例えば、レクザイムがそうで あり得るコード化しているウイルスのベクターが遺伝情報とこれらの表 現の配送を可能にするウイルスの中にウイルスによって感染の後に続いている胃 腸の上皮細胞の中のレクザイムを包含する。同じく、抗感応配列又はヌクレオチ ド配列がレクザイムをコード化することに関して特定のリボザイムを含んでいる 組換え型ウイルスが類似の糖質が特異性を拘束するという状態で、疾患状態が調 停した抑制するべき個体で細胞にレクザイム又はレクザイムを導入できる。 組換え型ウイルス感染はウイルスのただある特定のタイプの細胞だけを感染さ せる自然の能力のために直接のＤＮＡ配送よりいっそう選択的であり得る。この 選択的なウイルスの感染のための自然の能力は入り混ざった細胞集団の中で感染 をただある特定の細胞字体だけに制限するために搾取される。例えば、アデノウ イルスが上皮の起源の細胞に主にウイルスの感染を限定するために使われる。ま た、レトロウイルスが独自なレセプター又はウイルスの遺伝子変性にそれ以上の 特異性を提供するリガンドの表現を可能にするために組換えＤＮＡ技術によって 変性される。高い感染率、安定した遺伝子の組込みと外生的の遺伝子発現の高い レベルを提供するレトロウイルスの配送システムは技術でよく知られている。 上記のように、組換え型のウイルス配送システムが存在し、これは遺伝情報を 選択タイプ細胞中に配送する手段を提供する。ウイルスの器官系の選択は望まし い細胞タイプが目標を定められることに依存し、他方ベクターの選択は意図的な 応用に頼る であろう。組換えウイルスのベクターは技術で容易に交換自在で、そして容易に 標準組換えＤＮＡ実験方法(see，for example，Krieger，Gene Transfer and E xpression: A Laboratory Manual，(W.H．Freeman and Company，1990); Goedd el，Methods in Enzymo1ogy，vol，185，(Academic Press，1990); and Stoker ，In Molec．Virol.，A Practical Approach（eds．Davison and Elliott，IRL Press，1993）を使っている当業者により、その３つが参照によってここに含ま れるすべてによって変性される。 レクザイムに基づいたヘモクロマトーシス又は他の鉄蓄積症ための遺伝子性の 疾病素質は、遺伝子によってMHC位置でコード化するクラスＩMHC分子のＨ鎖で突 然変異を検出するによって診断できる。これらの実験方法は鉄蓄積症の症状を有 している個体を診断するために使われる。個体Ｈ鎖での突然変異の積極的な診断 が疾患についてそして突然変異させられる特定なレクザイムを識別することによ って根本的な原因を実証するために有用である。突然変異させられたレクザイム の同定は疾患を扱うことに適した糖質を識別するためにここに明らかにされた実 験方法で使われる。鉄蓄積症を持っていないが寿命後半での鉄蓄積症が進展する 傾向を生ぜしめる突然変異を継承すると思われる個体には、ここに明らかにされ た実験方法によって同じく突然変異について試験することから利益を受けること ができる。 疾患のために診断の突然変異がヒトβ2MのためにＨ鎖の際立って減少した親和 性をもたらす。例えば、リン酸化のために信号の欠失をもたらす非古典クラスＩ Ｈ鎖での突然変異が、正確にリン酸化するＨ鎖がβ2Mそれと相互に作用するべき 鎖に必要であるので、ヘモクロマトーシスのために診断の突然変異である。ポリ ペプチドでセリン又はスレオニン残基をリン酸化するために細胞を合図するコン センサスアミノ酸配列は技術でよく知られている。同じくヘモクロマトーシスの ために診断の突然変異がリン酸化場所に近くのＨ鎖の領域で起こることができる 。このような突然変異はもしこの場所に加えられたホスファートグループが細胞 で取り去られることができないならβ2Mそれと結び付けるべきＨ鎖の能力を減ら すことができる。 非類型のクラスＩＨ鎖がそうであり得るリン酸化場所突然変異を検出するべき 実験方法が蛋白質の分析又は蛋白質をコード化している核酸の基礎を置いた。蛋 白質決定のために、非古典クラスＩ分子は個体の細胞又は身体流体の源から浄化 される、Ｈ鎖がβ2Mから離される。クラスＩMHC分子を浄化して、そしてＨ鎖か らβ2Mを離す方法は技術でよく知られている。孤立しているＨ鎖はその時アミノ 酸配列解明に任せられることができる、もしリン酸化場所がそうであった配列で あるなら決定するべきこのような蛋白質分析が突然変異させたペプチドマッピン グ又は他。このような蛋白質決定のための方法は技術でそれらによく知られてい る。 核酸配列での突然変異が種々の方法によって検出され、核酸配列、ポリメラー ゼ連鎖反応又はハイブリダイゼーションでヌクレイン酸を分析する。 これらは よく知られている。（see，for example，Sambrook et al.，supra，1989; Hame s and Higgins Nucleic Acid Hybridisation a practical approach(IRL Press ，New York，1985)，both of which are incorporated herein by reference) このような実験方法は、その両方ともが参照によってここに含まれる。 β2Mで突然変異させられたＨ鎖を減少させられた結び付けを検出するべき実験 方法がこれらの実験方法でヘモクロマトーシスのような鉄蓄積症を診断するため に使われる。この方法においてクラスＩMHC分子のＨ鎖は、個体から離されて、 そして突然変異しないようなＨ鎖にβ2Mと結び付けるに適した状態の下でβ2Mに 接触される。突然変異のために試験されているものに同じ又は類似のクラスＩＨ 鎖の非突然変異株の形式を含んでいる制御反応が並列に行われる。Ｈ鎖と接触し た後β2Mでに、適当な状態の下で、例えば、適切な緩和物濃度を含めて反応は培 養される、そして、十分なｐＨと時と温度はβ2Mそれと結び付けるべき制御Ｈ鎖 のためにである。個体から試験されているＨ鎖は、それがβ2Mと結び付けるこの Ｈ鎖のがそれがβ2Mと結び付ける制御Ｈ鎖の分画より際立ってより少しである時 、鉄蓄積症のために突然変異診断を持つと考えられる。 β2MとクラスＩＨ鎖のつながりが例えば、検出されが、それ は分子の１つをサポートと放射性核種のような探知可能なラベル又は螢光性のラ ベルを他の分子に付けることと、ラベルの量が発見した、中に、堅実なサポート と結び付けられる探知可能なラベルの量を測ることがβ2MとＨ鎖のつながりの量 を示すことによって、である。 次の実施例を示すが、本発明を制限しないように意図される。実施例１ βギャップ遺伝子のクローニング及び発現 この例は動物の種々の種からレクザイム遺伝子を識別同定して、そしてクロー ンを作るアプローチを提供し、鉄の新陳代謝疾患でのその役割を説明する。マウスβギャップ遺伝子のクローニング ゲノムαライブラリがＡ／ＪとBalb／ｃマウス肝臓からのＤＮＡの部分的HaeI II消化によって構成され、そしてベクターCharon4Aの中に断片のクローンを作っ た。ライブラリは離されたS15プローブでＨ-2Ld遺伝子(Margulies et al.，Natu re，295:168-170(1982)、それは参照によってここに含まれる。)から保護された 。S15は３’のクラスＩMHCマウスプローブであって、そしてアルファ-３ドメイ ンをコード化しているエクソン４の３６塩基対とイントロン(Evans et al.，Pro c，Natl．Acad，Sci，(USA)，79:1994-1998(1982))の４８６塩基対を含めて５２ ２塩基対から成り立つ。プローブはM13・RF pUC18から挿入を削除することによ って調製され、ジスルフィド架橋結合アク リルアミドジェル(Hansen，Anal，Biochem，116:146-3.51(1981))から断片を浄 化し、＞１０⁸cpm／αｇの比活性に³²ｐでニックトランスレーション(Rigby et al.，J，Mol．Biol，113:237-253(1977))によってラベリング判別することをし た。ライブラリが標準コロニー、ハイブリダイゼーション技術（詳細はSambrook et al.，Supra，1988を参照）を使って検査された。 １７の独自なαクローンがライブラリから隔離され、そして制限酵素消化マッ ピングに任せられた。BamHI消化とこれらのクローンのゲル電気泳動は、Ａ／Ｊ 品種から５と独自な５００塩基対（bp）BamHI制限断片を含んでいたBalb／ｃ着 色剤からの１を見せた（BB500）。独自な断片を含んでいる６つのクローンはBAM HI消化に任せられ、BB500断片はジェル浄化され、そしてM13ベクターMp18とmp19 の中にサブクーロン化した(Yanisch-Perron et al.，Gene 33:103-119(1985))。 ＤＮＡ配列が35S-ATPを使って連鎖停止反応実験方法(Sanger，et al.，Proc，Na tl． Acad，Sri，（USA）74:5463-5467(1977))によって決定された。反応は６％ の尿素-ポリアクリルアミド勾配ジェルの上に分析された。ＤＮＡ配列が組み立 てられ、そしてプログラム(Devereux，et al.，Nucleic Acids Res.12:387-395( 1984))がVAX-１１／７８５コンピュータ上で走らせるウィスコンシン大学コンピ ュータグループを使って解析された。 ＤＮＡ配列比較はBB500断片が９３％の配列相同性より大きく共有shareするこ とを明示した。BB500断片の中の部位は、ク ローン間に１００％の配列相同性を示し、β−ギャップ（グロビン類似プロモー ター）と呼ばれている、それはマウス、うさぎ又はヒトβ−グロビンプロモータ ーと配列相同性を共有する調節モチーフであるからである（詳細な比較のために 前述を参照）。未成年者と一緒に対配列が、にについて、をするというCCAAT要 素すぐに下流が削除されている８塩基対配列AAGAGGAGのβGAP4を除いて小部分を 有するすべての６つの断片（β−GAP1-６と呼ばれる）の間に近い類似性がある 。これらの配列間に他のマイナーな較差があり、そしてαクローンから離された それらは異なった制限パターン実証し、種々のαクローンがユニーク配列を含ん で、そしてクローニング人為結果ではないことを確認している。それで、Ａ／Ｊ 品種マウスはゲノムの中で少なくとも５の同一αギャップ(GAP)配列構造を含ん でいる。βギャップ(GAP)配列のマウス中染色体１７へのマッピング サザンブロット法は、BB500配列がマウスの染色体１７の上に位置している遺 伝子を識別することができたかどうか決定するために使われた。βGAP6BB500プ ローブを用い、いくつかのチャイニーズハムスター卵巣（CHO）マウスＯ抗体雑 種細胞系からのＤＮＡがサザンブロット法によって評価された。ゲノムＤＮＡは 培養細胞から隔離され、EcoR1と一緒に消化されて、０.８％のアガロースジェル 上に電気泳動され、そしてニトロセルロース膜に移され。BB500調査を有するハ イブリダイゼーションがMeinkofとWahl(Anal．Biochem，138:267-284(1985)) によって記述された状態でデキストラン硫酸エステル存在下で実行され、0.2X塩 化ナトリウムクエン酸ナトリウム緩和物、セ氏６０度のｐＨ７.０（SSC）で最終 の洗浄された。 BB500プローブは、マウスクロモゾーム15と１７からのＤＮＡを含んでいるHM2 7細胞系で、交雑して、そして全ゲノムのBALB／ｃＤＮＡと同じバンド模様を明 らかにした。BALB／ｃ染色体１７に欠ける細胞系HM65はハイブリッド可能のバン ドを欠いて、プローブがCHO ＤＮＡに非特異的に結び付かなかったことを表して いた。染色体１７以外のマウスクロモゾームを含んでいる他のCHO細胞系からの ＤＮＡはBB500プローブでサザンブロット法によって調べられ、そして否定的で あるのが分かった（示さず）。これらの結果は、それを示すβギャップ(GAP)配 列がすべてマウスの染色体１７に投影、マッピングしている。マウス(Murine)Ｑ／TL複合体でのβギャップ配列のマッピング βギャップ配列がマウスゲノムから離された事実は正確に配列の位置設定をマ ッピングするいくつかの強力な道具を提供した。第一に、マウスMHCは大いに描 写され、特に非古典クラスＩ領域に関して特徴的で、第二に、正確に指摘される MHCにおける遺伝子の位置に、ハツカネズミの共通遺伝子系統が存在する。共通 遺伝子系統が一緒に近親婚のハツカネズミの繁殖品種によって元来的に発展させ られた。染色体交差の次世代品種は多くの品種を作り出し、これらは１つの品種 からMHCの１部を含み、そしてもう１つの品種からMHCの残りを含んでいた。従 って、品種の間にて制限断片長染色体多型を比較して、そして横じま模様バンド パターンが所定のMHC位置（１９８６）に結合されるかどうか決定することは可 能である(例えばKlein，Natural History of the Major Histocompatibility Co mplex，50-73(1986)参照)。RFLP分析は、種々のマウス品種から浄化されたゲノ ムのＤＮＡを得、EcoRIでＤＮＡを消化し、上述されるようにβGAP6BB500プロー ブでサザンハイブリダイゼーション法を行うことよって行われた。サザンブロッ ト法は、プローブが試験されたマウス品種（表１）のＤＮＡから１０の異なった バンドまでを識別したことを示した。これらのバンドの４つ、３０kb、２０kb、 １６kbと１０.５kb、がMHC位置の中でマッピングされた。RFLP分析は、少なくと も４から６の複製がβギャップ配列／ゲノム試験したマウスの品種に依存いるこ と示された。またRFLPパターンの遺伝分析は、２０kb及び１６kbβギャップバン ドがＴ部位にマッピングされるとともに、３０kb及び１０.５kbβギャップバン ドがQ1とQ4の間Ｑ部位にマッピングされることを示した。また、RFLP染色体多型 を示さなかったβギャップ配列の２つは古典クラスＩ遺伝子に末端的telomeric にマッピングされた。 非古典クラスＩ遺伝子直接隣接βギャップ配列の位置画定 βギャップ遺伝子配列の２つはQ1とQ4の間Ｑ部位にマッピングされ、C57BL／ ６（Ｈ−２ｂ）１ライブラリから隔離されたQ1及びQ2遺伝子ＤＮＡ配列分析によ って、直接Q3とQ2に結合された。配列は、未知の遺伝子（現在としてβギャップ 遺伝子定義する）でQ1及びQ2遺伝子両方が頭対頭立体配置に結び付けられ、遺伝 子両方が単一プロモーター／エンハンサー部位によって転写的に調節され、反対 のＤＮＡ撚糸から約２５bp離れて位置を定めたCAAT及びTATAボックスの対によっ て画定される２つのプロモーターを有する、ことを示した。それで、そこなわれ ないプロモーターと普通の調節部位を有しているが、クラスＩ及びβギャップ遺 伝子は反対の撚要素strandから転写され、クラスＩ遺伝子Q1又はQ2が頂上の５’ から３’まで転写され、βギャップ遺伝子が底の５’から３’まで転写されるで あろう。 A／J（H-2*，Watts et al．EMRO 1-8:1749-1759(1980)）からのTL遺伝子と同 様、C57BL／６からのQ1とQ2遺伝子の配列分析は、βギャッププロモーターと調 節部位がすでに古典クラスＩ遺伝子の調整に関係していると知られた典型的な古 典クラスＩ型の５’調節配列に取って代わっていたことを表した。Q2遺伝子が腸 で検出される遺伝子産物を表現することが周知であるので(Wang et al.，Immuno genet.，38:370-372(1993))、βギャッププロモーターは活性プロモーターであ る。これらの結果はβギャッププロモーターが若干の非古典クラスＩ遺伝子の 表現を調節することを示す。 遺伝子の共同調整を有する頭対頭遺伝子構造の立体配置はバクテリアからヒト まで及んでいる微生物で前に記述され、共同調整が広く採用された方策であるこ とを表している。（Brickman et al.，J．Molec．Biol.，212:669-682(1990)；X u and Doolittle，Proc，Natl．Acad，Sci，(USA)，87:2097-2101(1990)；Lenna rd and Fried，Meolec．Cell．Biol.，11:1281-1294(1991)；Heikkila et al.， J．Biol，Chem.，268:24677-24682(1993); Fererjian and Kafatos，Dey．Biol. ，161:37-47(1994); Sun and kitchinｍan，Nucleic Acids Res.，22:861-868(1 994)）原核細胞及び真核細胞両方の器官系、相互作用で間に、又は２つの遺伝子 生成物の代謝経路での連関が提案された(Galvalas，et al.，Mol，Call，giol. ，13:4784-4792(1993)；Lightfoot et al.，Br．J．Cancer，69:264-2673(1994) )。これまで研究したβギャップクローンにおいて、Q1とQ2遺伝子はまだそれら 自身のCAATとTATA要素を所有し、そしてそれはただ欠如している調節典型的な古 典クラスＩエンハンサー部位に過ぎないことは気付かれるべきである。種に渡るギャップ配列構造の保存 βギャップ配列が保存されることを明示するために、ゲノムＤＮＡの種々の種 の「動物園しみZoo blot」これらの遺伝子の多数の複製を含んでいる、ヒトを含 めた種々の種がEcoRIで消化されて、そしてマウスβGAP6BB500プローブを使って サザン ブロット法によって分析された。低厳格下でブロットはヒト、ねずみ、マウス、 犬、うさぎ及び猿からのＤＮＡでのバンドに多様性があることを検出、示した。 これは、βギャップ配列の多数の複製がヒトを含んでいる多くの種において見い だされたことを示す。また、βギャップ多重遺伝子族の保存ではマウスとヒトの 種分化に先行し、従って最近の遺伝子重複又は再配列の生成物ではない。種間配 列相同性の証明は、一般に、エクソンと調節部位が保存される傾向があるから、 重要である。追加実験は、うさぎ、ハツカネズミ、ニワトリ及びヒトでβギャッ プの配列相同性を示す。それで、維持される相同性の特定の部位のパターンは、 βギャップ配列が選択的な圧力によって維持されることを示唆する。βグロビンのβギャップ配列及びプロモーター間の相同性 ５００bpβギャップクローンの６個すべて中の配列は、マウス、うさぎ及びヒ トのβグロビンプロモーター調節要素に顕著な配列と位置の相同性を示す。βグ ロビンプロモーターの１０６bp部位をする中の重要な調節要素が描写されている (Myers et al.，Science 232:613-618(1986); Stuve and Myers，Mol，Cell Bio l，6:3350-3358(1990))。中和突然変異誘発及び５’欠失プロモーターを使って 、マイヤース(Myers)と彼の同僚は４つの調節配列を識別するために使った一連 の突然変異株を構成した。４つの調節モチーフは、位置−９５及び−２６の間に 位置を定められ、CACCC要素（−９５から−８７に位置）を含 み、それぞれ、CCAAT及びTATAボックスモチーフは−７９から−７２及び−３０ から−２６で含んで、そして、Ｉ１bp繰り返し要素がCCAAT及びTATAボックス（ −５３から−３２に位置）間に位置を定められ、２つの未完全複写繰り返し要素 （βDRE）を含んでいる。これらβDREがグロビン遺伝子の表現に欠くことができ ないという事実は欠失の研究によって示された。 ６の５００bpβギャップ配列と種々の種からのβグロビンプロモーター配列の 比較は、βグロビン調節要素にいくつかの顕著な配列相同を示した。５つの調節 モチーフについて見いだされたこの領域でのβギャップ配列の分析は、βグロビ ンプロモーターにて知見された。これらは、位置−１２７から−１２３の間に５ ’CACCC赤血球要素を含み、それぞれ、CCAAT及びTATAボックスモチーフでは−１ ０９から−１０５及び−３０から−２６で含んで、そして、キャップコンセンサ ス配列位置cap consensus sequence positionsでは−１３から−１０で含まれ、 第４以上の複合体調節要素にを置くと１０及び１１bp配列のβ−グロビンβDRE を含む（塩基対ナンバリングが差し込まれたギャップでの配列配列から決定され て、そして転写の開始場所から本当の塩基対位置を反映しない）。 全βギャップクローンにおいて、４つのβDRE調節モチーフの２つがCCAAT及び TATA要素によって−５４及び−３２間に置かれ、そして２つの他のβDREはTATA ボックスの上流にすぐに見いだされた（−１１から＋１と＋３から＋１２の位置 ）。こ れらのβDREすべてが配列で保存され、さらにそれらの２つが定められた位置に 保存される（−５４と−３２）。βDREsがβギャップおいて保存されることは、 多数の種（マウス、ラビット、チキン、及びヒト）からのグロビン中で保存され 、１億年以上の進化をカバーすることは重要である。この進化の保存の観測はβ ギャップ遺伝子が古い遺伝子であることを示す。 βギャップクローンからの一般に信じられている最終の調節モチーフはAGARAA である（ヌクレオチド−８２から−７７）、これは転写結合ファタターＮＦ-E1 のためのＤＮＡコンセンサス配列と全く同じである。このＤＮＡ結合蛋白質（Ｎ Ｆ-E1a、ｂ及びｃ）の系統群は多くの遺伝子の赤血球及び／又はＴ細胞特定表現 に含まれ、マウスとチキン成体βグロビン、ヘム経路酵素ポルホビリノーゲン（ PGB）脱アミノ酵素、Ｔ細胞レセプター及び白血病ウイルスHTLVIII）を含んでい る。 βギャップとマウスβグロビンプロモーターの間の相同性の領域の細かい調査 はいくつかの以下の特徴を明らかにする。 １）２６塩基対の１８が−３５から−１０の位置において一致して、コンセン サスTATAモチーフ（１９９０）を含むこと(Bucher，J．Mol，Biol，212:563-578 (1990))、 ２）それで部位を含むことであるβ−ギャップCCAATのボックスを含む領域、 −１１３から−１０９の位置はが赤血球細胞でのβ−グロビンに適切な発現のた めに不可欠であることを示されたβ−グロビン調節要素CACCCを含んでいること 、 ３）CCAAT要素の完全な一致が−１０９から−１０５の位置に存在すること、 ４）第４の一致している領域は−６４から−４５の位置においてCCAAT及びTAT Aボックスの間に位置を定められたβDRE要素を含むこと（この部位はギャップに 一致しない１９の１６bpを含んでいる）、 ５）Bucher(Bucher，supra，1990)によって定義されるようなコンセンサスキ ャップ場所配列並びに一般に信じられている転写の開始場所がヌクレオチド−１ ３から＋１において識別されることである。 他の一般に信じられている調節配列はβ−ギャッププロモーターにて明白であ る。位置−６８と−３７間とTATA要素の５つのヌクレオチド末梢を始める位置は 、４つのパリンドロームである。５つの塩基対繰り返しTCAGAは２４塩基対の中 で２度現われる。これらの繰り返しはグロビンのような不完全な直接の繰り返し 要素の側面に置いて、そして中で見いだされる（−５７から−４７位置）。１２ bp、１５bp並びに−６７から−５６及び−５１から−３７の位置不完全な二分染 色体対称を有する２つのより長いパリンドロームは、それぞれ、それぞれ７bpの 小さい内部のパリンドローム、CCTCAGG（−６６から−６０）、５bp繰り返し、 並びにTCAGA（−４６から−４２）を含んでいる。２つの大きい１２と１５bp未 完全パリンドローム、βグロビン不完全直接繰り返し要素と２つのTCAGAパリン ドロームの 繰り返しを結合しているβギャップ３３bpβDRE状部は、マウスβグロビンプロ モーターに約５０の％（１６/３３）ヌクレオチド配列相同性を示す。胃腸管でのβギャップ配列から下流での遺伝子表現 βグロビン調節モチーフとβギャッププロモーター間に維持される相同性の特 定の部位パターンは、1)配列は共通の先祖の遺伝子から分岐し、そして2)維持さ れた領域中にいるβ−ギャップ配列がそれらの各遺伝子の表現の調整で重大な役 割をすること、を示唆する。また、鉄代謝、赤血球特定調節配列の発生、及びこ れらの遺伝子のヘモクロマトーシスに関してヒトの位置に近い近接に親密に関係 している遺伝子のプロモーターへの相同性は鉄代謝でのβ−ギャップ遺伝子のた めにに役割を示す。 βギャッププロモーターが下流にメッセージを調節することを証明するために 、関連遺伝子が転写メッセージをコード化することを示すことは緊急である。さ らに、このようなメッセージは、もしそれらがヘモクロマトーシスの病因に関係 しているなら、鉄の吸収に関係している組織、すなわち胃腸管、で表現されるべ きである。 ノーザンブロット法は、胃腸管を含めて種々の臓器からポリＡ＋ＲＮＡで行わ れた。ブロットはβ−ギャップ（Q2b）コスミッドクローンから生じたプローブ を使って展開された。全細胞ＲＮＡは製造業者指示(Gibco/BRL，Gaitherburg，M D)に従ってTRIzol（トレードマーク）試薬実験方法によって調製され、 ポリＡ＋又はmRNAはオリゴdTセルロースクロマトグラフ法(Strategene，San Die go，CA)．によって浄化された。ＲＮＡがホルムアルデヒド-アガロースジェル上 に分析されて、そして、前述されるように、ZetaBind膜に移された(Evans，et a l.，Proc，Natl．Acad，Sci，（USA）81:5532-5536(1964))。プローブのために 使われたβギャップ配列を含んでいるコスミッドクローンはαライブラリから得 られた。クローンはApaL1とKpnIとで消化され１０kb断片をもたらした。断片はB amRIで部分的に消化され、β−ギャップ配列を含む２kb断片及びβ−ギャップ遺 伝子のためのコーディング配列をらに下流に含んでいる８kb断片をもたらした。 多分散系メッセージの存在を示したノーザンブロット法は組織中で胃、十二指 腸、空腸、大きさで４-５kbと８つkbの腎からの生産した。腎はただ８kbバンド だけが支配するという状態で、より少ない多分散性を示した。これらの結果はβ −ギャッププロモーター、そして上流にβギャップコーディング配列が胃腸管で 表現されて、そしてその多重遺伝子族について空腸の５Ｋｂメッセージが最も卓 越している肢と結び付けられることを表す。このプローブも腎と胃でバンドを認 識し、βギャップ系統群の関連の肢を提案した事実は、他の組織で作用している ことがあり得る。 ノーザンブロット法によって検出したβギャップmRNA生成物が大きさと複雑さ は、大きい蛋白質の系統群のためのβ−ギャ ップ遺伝子コーディングと一致している。これらの特徴は、分子のイオン輸送系 統群よりむしろムチン蛋白質系統群のようである。そうするためにβ−グロビン プロモーター相同性、特定の赤血球の調節器の発生、ヒトでのヘモクロマトーシ スに関して近い非古典クラスＩ及びβ−ギャップ遺伝子の確実な配列と位置、及 び鉄代謝の遺伝可能の疾患は、鉄の代謝におけるβ−ギャップ遺伝子と非古典ク ラスＩ遺伝子そのために役割を示す。この情報とこの開示事実では、β2M-ノッ クアウトマウスが肝がんの異常に高い出現率を有するがこれらのマウスがヘモク ロマトーシスに類似している新陳代謝及び病的な条件を有するという了解に導い たことを明らかにした。マウス未熟ライブラリからのマウスβギャップnDNAsの隔離 Ａ−βギャップコスミッドプローブがマウス未熟のcDNAライブラリ（Stratege ne αZAPExpress一式）を検査するために使われる。ノーザンブロット法は、β ギャッププローブによって識別されて調べられた組織で表現されるメッセージを 示すために使われる。陽性信号を与えるクローンが隔離され、特徴付けされ、そ して浄化される。選択されたものから浄化されたＤＮＡがEcoRIで消化されて、 そしてサザンブロット法分析に任せられる。ブロットはβギャップ遺伝子を含ん でいることを確かめる８００bpβギャッププローブで探査される。ヒトのβギャップ遺伝子のクローニング sCOSコスミドベクターで作り出されたヒトのゲノムＤＮＡラ イブラリは、sCOS（Strategene，San Diego CA）でのマウスゲノムのライブラリ を作り出すことに対して前に記述されるように用意ができている。ヒトのsCOSコ スミッドライブラリからのβ−ギャップ遺伝子ヒトの隔離はクラスドＩMHCプロ ーブでクローンを検査することによって行われる。プローブはHLA-A2遺伝子のエ クソン４と５から生成され、大いにを保存されたＭβ結合ドメインと膜内外領域 をコード化する。クラスＩ配列を含んでいる選択されたクローンが発見され、そ してこれらのクローンからのコスミッドは、制限酵素EcoR1で浄化され切られて 、０.７％アガロースジェルで動かされ、そして帯電したナイロン膜上にブロッ トされる。ブロットは、縞にされ、クラスＩプローブで交雑され、そしてが探査 する８００bpβギャッププローブで再交雑される。実施例II ヘモクロマトーシス類似β2Mノックアウトマウス発展鉄過多例 この例はMHCでコード化されたレクザイム機能が遺伝学的に削除された動物モ デルで鉄の欠失を分析する方法を提供する。また、これらのマウスはヘモクロマ トーシスとアテローム硬化のような種々の鉄の関連した疾患、関節炎又は癌腫の 治療の上に糖質リガンドの生体上の有益を評価することに役立つ。 β2Mノックアウトマウス中の鉄過多に関連しているデータはRothenbergとvola nd、１９９４年に含有されている。１２−１８カ月間年寄りのノックアウトハツ カネズミからの組織の組織 学上検査は、標準食物の上に含まれて、肝の壊死の証拠を明らかにした。組織の さびじみは、すべての動物の肝臓そして腎又は動物の約１０％の肺における鉄の 成長を明らかにした。標準食物は350mg／kg鉄の炭酸塩を含んでいる。動物が、 鉄の炭酸塩のほかに、１０ミリグラム／kg鉄硫酸エステルを含んでいる「種畜食 物breederdiet」上に置かれた時、鉄蓄積が劇的に上昇した。動物での鉄の成長 は最も年寄りの動物で見られる鉄の最も高いレベルで年齢に関連していた。一緒 にこれらのデータはそれを示すβ2M-ノックアウトマウス食物及び年齢に関連し た鉄過多を進展する。また我々は動物が肝がんを進展することを示した、そして 他の人たちがもっと年寄りの動物が糖尿病(Faustman et al.，Science 254: 175 6-1761(1991))を進展すると報告した。この病理学のデータ点配置はヒトのヘモ クロマトーシスを反映する。 発明が上に提供された例に参照で記述されたけれども、種々の修飾が発明の精 神から外れないでされると理解されるべきである。したがって、発明はクレーム によってだけ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/45 ＡＤＷ Ａ６１Ｋ 45/00 39/39 ＡＢＤ 47/48 Ｚ 45/00 48/00 ＡＤＤ 47/48 Ｃ０７Ｈ 1/08 48/00 ＡＤＤ Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｈ 1/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/74 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/48 ＡＢＥ 33/566 37/52 ＡＤＷ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．レクザイムに特に結び付く実質的に浄化された糖質リガンドを含んでいる 組成物。 ２．さらに前記糖質リガンドに結合されたポリペプチドあるいは脂質部分を含 んでいる請求項１の組成物。 ３．前記糖質リガンドがオリゴ糖である実質的に浄化された糖質リガンドを含 んでいる組成物。 ４．前記糖質リガンドが多糖である実質に浄化された糖質リガンドを含んでい る組成物。 ５．レクザイムに結び付く糖質リガンドを同定する方法であって、 ａ． リガンドに結び付くと推測されるレクザイムと糖質リガンドを含んで いる試料とを接触させる行程と、 ｂ． リガンドとレクザイムの結合が起こったかどうか検出する行程と、を 含む方法。 ６．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項５の方法。 ７．前記MHC由来遺伝子産物はクラスＩ分子である請求項６の方法。 ８．前記MHC由来遺伝子産物がクラスＩＩ分子である請求項５の方法。 ９．前記MHC由来遺伝子産物が非古典クラスＩ分子である請求項５の方法。 １０．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項５の方法。 １１．前記糖質リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項５の方法。 １２．前記糖質リガンドあるいは前記レクザイムが探知可能なラベルを含んで いる請求項５の方法。 １３．前記糖質リガンドあるいは前記レクザイムが細胞と結び付けられる請求 項５の方法。 １４．糖質リガンドに結び付くレクザイムを同定する方法であって、 ａ． レクザイムに結び付くと推測される糖質リガンドとレクザイムを含ん でいる試料と接触させる行程と、 ｂ． レクザイムとリガンドの結合が起こったかどうか検出する行程と、を 含む方法。 １５．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項１４の方法。 １６．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項１４の方法。 １７．前記糖質リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項１４の方法。 １８．前記糖質リガンドあるいは前記レクザイムが探知可能なラベルを含んで いる請求項１４の方法。 １９．前記糖質リガンドあるいは前記レクザイムが細胞と結 び付けられる請求項１４の方法。 ２０．結合剤に特別に結び付く糖質リガンドを浄化する方法であって、 ａ． 糖質リガンドを含んでいる試料と前記リガンドが結合できる結合剤と 接触させ、リガンド結合剤複合体を形成する行程と、 ｂ． 前記複合体を前記試料の残りから分離する行程と、 ｃ． 前記複合体から前記リガンドを切り離し浄化されたリガンドを得する 行程と、を含む方法。 ２１．前記結合剤がレクザイムである請求項２０の方法。 ２２．前記結合剤が抗体である請求項２０の方法。 ２３．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項２０の方法。 ２４．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項２０の方法。 ２５．前記糖質リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項２０の方法。 ２６．糖質リガンドに特別に結び付くレクザイムを浄化する方法であって、 ａ． レクザイムを含んでいる試料と前記レクザイムが結合できる糖質リガ ンドと接触させ、リガンドレクザイム複合体を形成する行程と、 ｂ． 前記複合体を前記試料の残りから分離する行程と、 ｃ． 前記複合体から前記レクザイムを切り離し浄化されたレクザイムを得 する行程と、を含む方法。 ２７．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項２６の方法。 ２８．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項２６の方法。 ２９．前記糖質リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項２６の方法。 ３０．レクザイム発現細胞の機能を変性する糖質リガンドを同定する方法であ って、 ａ． レクザイム発現細胞と糖質リガンドを含んでいる試料とを接触させる 行程と、 ｂ． その後前記細胞を分析しその機能を決定する行程と、 を含む方法。 ３１．レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項３０の方法。 ３２．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項３０の方法。 ３３．前記糖質リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項３０の方法。 ３４．糖質リガンド発現細胞の機能を変性するレクザイムを同定する方法であ って、 ａ． 糖質リガンド発現細胞とレクザイムを含んでいる試 料とを接触させる行程と、 ｂ． その後前記細胞を分析しその機能を決定する行程と、を含む方法。 ３５．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項３４の方法。 ３６．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子である請求項３４の方法。 ３７．レクザイム発現細胞の機能を変性する方法であって、記細胞をレクザイ ムを結び付ける糖質リガンドと接触させる行程を含む方法。 ３８．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項３７の方法。 ３９．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項３７の方法。 ４０．オリゴ糖リガンドがポリペプチドあるいは脂質部分に接着させられる請 求項３７の方法。 ４１．糖質リガンド発現細胞の機能を変性する方法であって、記細胞を糖質リ ガンドを結び付けるレクザイムと接触させる行程を含む方法。 ４２．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項４１の方法。 ４３．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項４１の方法 ４４．レクザイムの糖質リガンド結合部に結び付くペプチドを同定する方法で あって、 ａ． レクザイムと知られる糖質リガンドとを接触し、レクザイムを、識別 されるペプチドを含んでいる試験試料に結び付ける行程と、 ｂ． 反応後にレクザイムに結合したオリゴ糖リガンドの量を決定する行程 と、 ｃ． 試験試料にて結合したオリゴ糖リガンドの量と制御試料で結合したオ リゴ糖リガンドの量とを比較する行程と、を含み、制御試料で結合したオリゴ糖 リガンドの量に対する試験試料にて結合したオリゴ糖リガンドの量の減少量がレ クザイムへのペプチドの結合を示すことを特徴とする方法。 ４５．前記ペプチドと前記レクザイムが前記オリゴ糖リガンドの接触に先だっ て接触する請求項４４がの方法。 ４６．前記オリゴ糖リガンドあるいは前記レクザイムが探知可能なラベルを含 んでいる請求項４４の方法。 ４７．前記レクザイムあるいは前記オリゴ糖リガンドが細胞と結び付けられる 請求項４４の方法。 ４８．前記試験試料がペプチドライブラリを含んでいる請求項４４の方法。 ４９．糖質リガンドを作り出す細胞を変性する方法であって、レクザイムをコ ード化する発現ベクターを細胞に導入する行程を含み、前記発現によって細胞に よるオリゴ糖リガンドの生産 をもたらすことを特徴とする方法。 ５０．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項４９の方法。 ５１．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項４９の方法。 ５２．個体で抗原に対する免疫応答を調整する方法であって、請求項１のオリ ゴ糖リガンドと抗原を投与する行程を含む方法。 ５３．前記投与することが抗原に免疫応答における増加をもたらす請求項５２ の方法。 ５４．前記投与することが抗原に免疫応答における減少をもたらす請求項５２ の方法。 ５５．前記投与することがさらに免疫鎮圧剤を含む請求項５２の方法。 ５６．前記抗原と前記オリゴ糖リガンドが共有的接着されている請求項５２の 方法。 ５７．アジュバントが前記抗原と前記オリゴ糖リガンドとともに投与される請 求項５２の方法。 ５８．レクザイムを含んでいる疾患状態を扱う方法であって、請求項１のオリ ゴ糖リガンドの効果的な量を投与する行程を含む方法。 ５９．前記疾患状態がMHCによって結合された疾患である請求項５８の方法。 ６０．前記MHC結合疾患が自己免疫疾患である請求項５８の 方法。 ６１．前記MHC結合疾患がヘモクロマトーシスである請求項５８の方法。 ６２．前記疾患状態が感染である請求項５８の方法。 ６３．前記疾患状態が移植拒絶である請求項５８の方法。 ６４．レクザイムを含んでいる疾患状態を扱う方法であって、疾患状態に含ま れるレクザイムとして糖質リガンドのために類似の結合特異性を有しているレク ザイムの効果的な量を投与する行程を含む方法。 ６５．前記レクザイムがMHC由来遺伝子産物である請求項６４の方法。 ６６．前記レクザイムが非MHC由来遺伝子産物である請求項６４の方法。 ６７．前記疾患状態がMHCによって結合された疾患である請求項６４の方法。 ６８．前記MHC結合疾患が自己免疫疾患である請求項-６７の方法。 ６９．前記MHC結合疾患がヘモクロマトーシスである請求項６４の方法。 ７０．前記疾患状態が感染である請求項６４の方法。 ７１．前記疾患状態が移植拒絶である請求項６４の方法。 ７２．ヘモクロマトーシスに対する遺伝子の疾病素質を検出する方法であって 、β２ミクログロブリンと結び付けるべきＨ 鎖の能力を減らすクラスＩMHC分子のＨ鎖での突然変異を検出する行程を含む方 法。 ７３．前記突然変異がホスファートグループの添加のために信号を排除する請 求項７２の方法。 ７４．前記突然変異は、β２ミクログロブリン結び付くMHCクラスＩ分子のＨ 鎖の能力の減少の結果として生じるヘモクロマトーシスの診断のため脱リン酸化 される前記Ｈ鎖のリン酸塩基の能力を排除する請求項７２の方法において、 ａ． 試験される個体からクラスＩMHCのＨ鎖を分離する行程と、 ｂ． クラスＩMHCＨ鎖をβ２ミクログロブリンに結べ付けるに適した状態 の下でＨ鎖をβ２ミクログロブリンへ接触させる行程と、 ｃ． β２ミクログロブリンへのＨ鎖のつながりを検出する行程と、を含み 、β２ミクログロブリン制御Ｈ鎖のつながりと比較したβ２ミクログロブリンへ のＨ鎖のつながりの減少がヘモクロマトーシスの診断であることを特徴とする方 法。 ７５．蛋白質と糖質の補完相互作用を通して自己を非自己から区別する能力を 有し、かつ免疫グロブリン分子あるいはＴ細胞受容分子ではない蛋白質。 ７６．患者の胃腸管経路から金属の異常な吸収によって特徴づけられる患者の 疾患を扱う方法であって、IgGSF中で遺伝子によってコード化された蛋白質に特 に結び付く糖質の治療量の 摂取を含んでいることを特徴とする方法。 ７７．前記金属が鉄である請求項７６の方法。 ７８．患者の自己免疫疾患を扱う方法であって、糖質囮の治療量を与える行程 を含み、糖質囮がIgGSFの中で遺伝子によってコード化された蛋白質に特に結び 付いていることを特徴とする方法。