JPH10511401A

JPH10511401A - Ｇａｇｅ腫瘍拒絶抗原をコードする、単離、トランケート核酸分子

Info

Publication number: JPH10511401A
Application number: JP8521813A
Authority: JP
Inventors: デルブリュージェンピエールファン; デルエインドベノワファン; オリヴィエールデバッケル; ファルールティエリーボーン
Original assignee: ラドウィックインスティテュートフォアキャンサーリサーチ
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-11-04
Anticipated expiration: 2016-01-11
Also published as: CN1176647A; DE69626789D1; CA2210318A1; PT804467E; JP3180123B2; HK1008228A1; DE69626789T2; EP0804467B1; US5858689A; EP0804467A4; WO1996021673A1; ES2192602T3; ATE234858T1; CN1110503C; NZ302821A; AU4897096A; DK0804467T3; EP0804467A1; AU708840B2

Abstract

(57)【要約】腫瘍拒絶抗原前駆体の新規なファミリー及びそれらをコードする核酸分子が開示される。これら腫瘍拒絶抗原前駆体は、ＧＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体と称し、それらをコードする核酸分子はＧＡＧＥコード分子と称する。コード配列及び腫瘍拒絶抗原並びにそれらの前駆体分子の様々な診断治療用途が開示される。腫瘍拒絶抗原も示される。

Description

【発明の詳細な説明】ＧＡＧＥ腫瘍拒絶抗原をコードする、単離、トランケート核酸分子関連出願この出願は、１９９５年１月１０日出願の特許出願番号第０８／３７０，６４８の一部継続出願であり、１９９４年５月２７日出願の特許出願番号第０８／２５０，１６２の継続出願であり、１９９３年７月２２日出願の特許出願番号第０８／０９６，０３９号の一部継続出願である。これらの出願は全て参照として導入される。発明の分野本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に関し、特に本発明は、その腫瘍拒絶前駆体が、とりわけＨＬＡ−Ｃw6分子で表示される、少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原に変えられる遺伝子に関する。問題のこの遺伝子は、他の公知の腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列に関連するとは思われない。また、本発明は、ＨＬＡ−Ｃｗ６分子によって表示されるペプチド及びその使用に関する。また、本発明の一部はＨＬＡ−Ａ２９分子によって表示されるペプチド及びその使用である。背景及び従来技術外来の、即ち異種物質を認識して反応する哺乳動物の免疫系の過程は複雑なものである。この免疫系の重要な一面は、Ｔリンパ球又は「Ｔ細胞」応答である。この応答は、Ｔ細胞が認識して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主たる組織適合性複合体（ＭＨＣｓ）と称する細胞表面分子とペプチドとの複合体と相互反応する事を必要とする。このペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子を表す細胞によって変化させられる巨大分子由来のものである。これに関しては、メール等(Male et al.)のAdvanced Immunology(J.P．Lipincott Company，1997)、特に６〜10章参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互反応は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せの為の特異なＴ細胞を要求する事を制限する。特異なＴ細胞が存在しなければ、そのパートナー複合体が存在してもＴ細胞応答は存在しない。同様に、特異な複合体が存在せずＴ細胞が存在しても応答は存在しない。この機構は、外来物質に対する免疫系応答、自己免疫異常及び細胞異常に対する応答に含まれる。多くの研究が、蛋白質がＨＬＡ結合ペプチドに変えられるこの機構について注がれてきた。これに関しては、バリナガ(Barinaga)、Science 257:88 0(1992); フレモント等(Fremont et al.)、Science 257: 919(1992);マツムラ等 (Matsumura et al.)、Science 257: 927(1992);ラトロン等(Latron ey al.)、Sc ience 257:964(1992)を参照。又、Eegelhard，Ann．Rev．Immunol．12: 181-207 (1994)を参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するこの機構は、又癌に係わるものであった。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４(１９９２年５月22日出願、１９９２年11月26日公開(参考として組み入れられる))には、細胞表面で発現するペプチドに変えられ、特異ＣＴＬｓ（細胞溶解性Ｔリンパ球、以下「ＣＴＬｓ」という）による腫瘍細胞の溶解へと導く事の出来る一連の遺伝子が開示されている。この遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」、即ち「ＴＲＡＰ」分子をコードすると言われ、それから得られるペプチドは「腫瘍拒絶抗原」即ち「ＴＲＡｓ」と称される。この一連の遺伝子に関する詳しい情報については、トラバーサリ等(Traversar i et al.)、Immunogenetics 35: 145(1992); ファンデルブルッゲン等(van der Bruggen et al.)、Science 254: 1643(1991)を参照。又、米国特許第5,342, 774 号明細書を参照。参考として組み入れられる米国特許出願第938,334 号の開示では、ＭＡＧＥ− １遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ１分子で表されるノナペプチドに変えられる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードすると説明されている。この引用例は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの公知の特異性を与えた事を教示し、１つのＨＬＡ分子に結合し、他には結合しない特定のペプチドを期待させる。このことは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を保有するので重要である。結果として、特異ＨＬＡ分子のパートナーとしての特定ペプチドの同定は、診断的且つ治療的結果を持つが、これらは、その特定のＨＬＡ表現型の個体にとって意味があるだけである。細胞異常が１つの特定のＨＬＡ表現型に限定されるものではなく、目標とされる治療が、組織における異常細胞の表現型の知識を要求するが故に、この分野では更に研究の必要性が存在する。参考として組み入れられる米国特許出願第8,446 号（１９９３年１月２２日出願）では、ＭＡＧＥ−１発現生産物は、第２のＴＲＡに変えられると言う事実が開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬＡ−Ｃクローン１０分子と表される。この開示は、与えられたＴＲＡＰは、複数のＴＲＡｓを生成する事が出来る事を示す。ここに参考として組み入れられる米国特許出願第994,928 号（１９９２年１２月２２日出願）では、チロシナーゼ、或る種の正常細胞(例えば、メラノサイト) によって産生される分子は腫瘍細胞に変えられ、ＨＬＡ−Ａ2 分子で表されるペプチドを生成する事が教示されている。全体を参考として組み入れる米国特許出願第08/032,978号（１９９３年３月１８日出願）では、チロシナーゼ由来のものではない第２のＴＲＡは、ＨＬＡ−Ａ 2 分子で表される事が教示されている。このＴＲＡは、ＴＲＡＰ由来のものであるが、非−ＭＡＧＥ遺伝子によりコードされている。この開示は、特定のＨＬＡ分子は、異なる資源由来のＴＲＡｓを表示してもよい事を示す。ここに参考として組み入れられる１９９３年６月１７日出願の米国特許出願08 /079,110号では、関連のない腫瘍拒絶抗原前駆体、所謂「ＢＡＧＥ」前駆体が開示されている。このＢＡＧＥ前駆体はＭＡＧＥファミリーとは関連がない。上で引用された論文、特許及び特許出願で提示される研究は、大部分はＭＡＧＥファミリー遺伝子及び関係のないＢＡＧＥ遺伝子に関するものである。ここにおいて、付加的腫瘍拒絶抗原前駆体が、細胞によって発現される事が見出された。これらの腫瘍拒絶抗原前駆体を、「ＧＡＧＥ」腫瘍拒絶抗原前駆体と称する。これらは、ＭＡＧＥファミリー遺伝子ともＢＡＧＥ遺伝子とも同族関係を示さない。斯くして、本発明は、ＴＲＡＰｓをコードする遺伝子、腫瘍拒絶抗原前駆体それ自身、及びこれらの利用に関するものである。この様に、本発明の他の対象物は、何処でも９〜１６のアミノ酸長であり、配列：（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_(1,2)は、１または２個のアミノ酸がＴｒｐ残基に対してＮ−末端であっても良い事を意味する）。これらのペプチドは折り曲げられて、そして／又はＨＬＡ−Ａ２９分子に結合するプチドに加工される。本発明は、更に以下の記述に従って詳述される。図面の簡単な説明図１は、ＣＴＬクローン７６／６を用いた細胞溶解の研究を示す。図２は、種々の形質移入体と比較対象物で得られた腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出アッセイを示す。図３は、クローンＣＴＬ７６／６の溶解性Ｔリンパ球により誘発される溶解を比較する。種々の長さのペプチドが、配列番号：４を含めてテストされた。図４は、ここで検討された６つのＧＡＧＥ遺伝子のｃＤＮＡの配列を表示する。図において、同一領域は、四角で囲まれている。又、翻訳開始部位及び停止コドンが例示される。実施例において述べられる様なポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマーは、矢印で例示される。図５は、ＧＡＧＥファミリーのメンバーに対する推定アミノ酸配列の配列を示す。同一領域は四角で示され、配列番号：４の抗原ペプチドが示される。図６は、各ＧＡＧＥｃＤＮＡが、ＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡと一緒にＣＯＳ細胞中に形質移入された時に得られた結果を示す。２４時間後、ＣＴＬ７６／６のサンプルが添加され、ＴＮＦ放出が２４時間後に測定された。図７は、ＨＬＡ−Ａ２９ｃＤＮＡ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ又はＧＡＧＥ配列で形質移入された、ＣＯＳ−７細胞でのＣＴＬ２２／２３の刺激を比較する。図８は、配列番号：２２を含む種々のペプチド及びそれらから誘導された種々のペプチドを使用して、⁵¹Cr放出研究によって得られた結果を表示する。好適な実施態様の詳細な説明実施例１メラノーマ細胞株、ＭＺ２−ＭＥＬを、標準の手順で、患者のＭＺ２から採取されたメラノーマ細胞から株化した。この細胞株は、例えば、ここにその全体を参考として組み入れるＰＣＴ出願ＰＣＴ／US９２／０４３５４（１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開）に開示されている。この細胞株が株化されたら、そのサンプルを放射線照射し、これを非増殖性にした。これらの照射細胞を、それらに対して特異な細胞溶解性T細胞クローン（ＣＴＬｓ）の単離に使用した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のサンプルを患者のＭＺ２から採取し、照射メラノーマ細胞に接触させた。この混合物を、メラノーマ細胞の細胞溶解につき観察し、メラノーマ細胞によって表示されるペプチドとＨＬＡ分子の複合体に対する特異なＣＴＬｓが、サンプル中に存在した事を示した。使用したこの細胞溶解アッセイは、ヘリン等(Herin et al.)、Int．J．Cancer 39: 390-396（1987）に従ったクロム放出アッセイであり、その記述は参考として組み入れられる。このアッセイをここに記述する。目標メラノーマ細胞は、in vitroで育成し、次いでDMEM中に10⁷細胞／mlで再懸濁し、10 mM HEPES と30% F CS で補充し、Ｎa(⁵¹Cr)O₄の200 μCi/ml で、37℃で45分間培養した。標識化細胞をDMEMで３回洗浄し、10mM HEPES を補充した。これを、次いで10 mM HEPES と10% FCS で補充したDMEM中に再懸濁し、その後、10³細胞を含む100 μl の液を、96ウエルマイクロプレートに分散した。ＰＢＬｓのサンプルを100 μl の同じ培地に添加し、アッセイを繰り返し行った。プレートを、100gで４分間遠心分離に掛け、８％CO₂雰囲気中で、37℃で４時間培養した。プレートを再度遠心分離に掛け、上澄み液の100 μl の液を収集し、計量した。⁵¹Cr放出の割合は、以下の様に計算した。％⁵¹Cr放出＝［（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）］ｘ１００ここで、ＥＲは、観察された、実験的⁵¹Cr放出、ＳＲは、200 μl の培地単独での10³標準化細胞を培養する事によって測定された自然放出、ＭＲは、100 μl の0.3%トリトン(Triton)X-100 を添加して得られる最大放出である。高いＣＴＬ活性を示したこれらの単核血サンプルを拡張し、限界希釈を介してクローン化し、同じ方法を使用して再度スクリーニングした。ＣＴＬクローンＭＺ２−ＣＴＬ７６／６はこの様にして単離した。このクローンを以後「７６／６」と称する。同じ方法を、メラノーマ細胞株同様に目標Ｋ５６２細胞を試験するのに使用した。図１は、このＣＴＬクローンが認識してメラノーマ細胞株、即ちＭＺ２−ＭＥＬであってＫ５６２ではない株を溶解する事を示す。このクローンを、次いで、上に述べたと同じ方法で、他のメラノーマ細胞株及び自己由来ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞に対して試験した。図１は、エプシュタインバールウイルス(Epstein B arr Virus)(EBV)で形質転換された自己由来Ｂ細胞は溶解せず、しかもＭＺ２− ＭＥＬ３．０はＣＴＬクローン７６／６で溶解されるのに、抗原Ｆを発現しないこの細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ．４Ｆ^-突然変異株は溶解しない事を示す。故に、このクローンは、この抗原に対して特異的である事が明らかである。上に提示された結果は、ＨＬＡ分子がＴＲＡを表示する事とは無関係である。溶解した細胞株、即ちＭＺ２−ＭＥＬは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ６及びＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現する事が知られている。ここに報告されていないがこの実施例のプロトコールに従う実験では、ＨＬＡ分子Ａ２９、Ｂ４４及びＣクローン１０の発現を喪失したＭＺ２−ＭＥＬの補助株(subline)を試験した。この補助株は溶解し、存在している分子が、Ａ１、Ｂ３７又はＣｗ６の１つである事を示した。実施例２７６／６が、目標細胞と接触した時に腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)を産生するかを決定するために、更に検討を行った。使用した方法は、トラバーサリ等(Traversar i et al.)、Immunogenetics 35: 145-152（1992）、により開示された方法であり、その記述は参考として組み入れられる。要するに、ＣＴＬ株のサンプルを、培養培地で、目的とする目標細胞のサンプルと組み合わせた。２４時間後、この培養からの上澄み液を除去し、次いでＴＮＦ−感受性ＷＥＨＩ細胞上で試験した。細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ４３、即ち引用参考例におけると同様に上で検討されたＭＺ２−ＭＥＬ細胞株の補助株は、極めて強力な応答を与えた。これを次の実験に使用した。実施例３実施例２の結果は、ＭＺ２．ＭＥＬ．４３が目的物の目標抗原を表示した事を示した。そこで、これをｃＤＮＡライブラリー調製の為の全ｍＲＮＡ源として使用した。全ＲＮＡは、この細胞株から単離した。このｍＲＮＡを、良く知られた技術に従って、オリゴ-dT 結合キット(oligo-dT binding kit)を使用して単離した。ｍＲＮＡを確保したら、NotI部位を含むオリゴdTプライマーを使用して、逆転写でｃＤＮＡに転写し、次いで第２ストランド合成(second strand synthesis)を行った。このｃＤＮＡを、次いでBstXI アダプターに結合し、NotIで消化し、セファクリル(Sephacryl)S-500HRカラム上でサイズ画分化し、BstXI 及びｐｃＤＮＡ −Ｉ−ＡｍｐのNotI部位に間接的にクローン化した。この組み換えプラスミドを、次いでＤＨ５α大腸菌バクテリアの中にエレクトロポレーションした。１００の組み換えバクテリアの合計１５００プールをマイクロウエルに播種した。殆ど全てのバクテリアは挿入物(insert)を含んでいたので、各々は約100 のｃＤＮＡｓを含んでいた。それぞれのプールを飽和するまで増殖し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解及び酢酸カリウム沈殿で、フェノール抽出なしで抽出した。実施例４実施例３で開示したライブラリーの調製に続いて、ｃＤＮＡを、真核細胞に形質移入した。ここで述べられる形質移入を繰り返して行った。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１５，０００細胞／ウエルで、１０％ウシ胎児血清で補充したダルベッコ変性イーグルス培地(Dulbecco's modified Eagles Medium)(DMEM)において、組織培養平底マイクロウエル中に播種した。この細胞を、37℃で一昼夜培養し、培地を除去して、10% Nu血清、400 μg/ml DEAE −デキストラン及び100μM クロロキン、更に100ng のプラスミドを含むDMEM培地の50μl/ウエルで置き換えた。上で示した様に、この溶解研究は、ＨＬＡ分子が抗原を表示した事を立証しなかった。結果として、抗原（Ａ１、Ｂ３７、Ｃｗ６）を表示出来たＨＬＡ分子のそれぞれのｃＤＮＡを、細胞を同時形質移入する為に、別々に使用した。具体的には、ライブラリーでの形質移入で使用したのと同じプロトコールを使用して、ｐＣＤ−ＳＲαにクローン化されたＨＬＡ−Ａ１をコードする遺伝子の２８ng、ｐｃＤＮＡ−Ｉ−ＡｍｐでのＨＬＡ−Ｂ３７に対するｃＤＮＡの５０ng 、又はｐｃＤＮＡ−Ｉ−ＡｍｐでのＨＬＡ−Ｃｗ６に対するｃＤＮＡの７５ngを使用した。形質移入は、複数のウエル中で行ったが、ＨＬＡ−Ｃｗ６形質移入体の５００プールだけは、単一ウエル中で試験出来た。37℃での４時間培養の後、培地を除去し、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳの５０ｎｌで置き換えた。この培地を２分後に除去し、１０％ＦＣＳで補充したDMEMの２００μｌで置き換えた。培地でのこの変換の後、ＣＯＳ細胞を37℃で24-48 時間培養した。培地を、次いで捨て、1000〜3000のＣＴＬクローン７６／６細胞を、ＩＬ−２の２０〜３０Ｕ／ｍｌで補充した１０％プールヒト血清を含むイスコーブ(Iscove)培地の100 μl に添加した。上澄み液を24時間後に除去し、トラバーサリ等(Traversari et al.)、Immunogenetics 35: 145-152（1992）により開示された方法（その記述は参考として組み入れられる）により、WEHI細胞上でのアッセイで、ＴＮＦ含有量を決定した。ＨＬＡ−Ａ１で形質移入された１５００プール、及びＨＬＡ−Ｂ３７で形質移入された１５００プールは、１５〜２０ｐｇ／ｍｌ又は２〜６ｐｇ／ｍｌのそれぞれの濃度に対してＴＮＦ放出を刺激した。６０ｐｇ／ｍｌより多くを生成した一つのプールを除いて、大部分のＨＬＡ−Ｃｗ６形質移入体は３〜２０ｐｇ／ｍｌを生成した。このプールを次の研究の為に選択した。実施例５選択したプールのバクテリアをクローン化し、６００のクローンを試験した。プラスミドＤＮＡをそれらから抽出し、上に述べたのと同じ方法でＣＯＳ細胞の新しいサンプル中に形質移入し、この細胞を、ＣＴＬクローン７６／６の刺激の為に再度試験した。９４の陽性クローンが見つかった。これらの内の一つで、ｃＤＮＡクローン２Ｄ６と称するものを更に試験した。比較試験では、ＣＯＳ細胞は、ｃＤＮＡクローン２Ｄ６とＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ６単独又は２Ｄ６単独で形質移入した。対照細胞株ＭＺ２−ＭＥＬＦ^-とＭＺ２−ＭＥＬＦ⁺も使用した。ＣＴＬ上澄み液中へのＴＮＦ放出は、上で引用した様にＷＥＨＩ細胞上でそれを試験する事によって測定した。生き残っているＷＥＨＩ細胞の数は、細胞の培養後の光学濃度をＭＴＴを使用して測定した。図２は、ＨＬＡ−Ｃｗ６とｃＤＮＡ−２Ｄ６で形質移入したＣＯＳ細胞と、細胞株ＭＺ２−ＭＥＬＦ⁺が、ＣＴＬクローン７６／６からのＴＮＦ放出を刺激した事を示した。これは、ＨＬＡ−Ｃｗ６が対象のＴＲＡを表示した事を示している。実施例６ｃＤＮＡ−２Ｄ６を、公知の技術に従って配列分析した。配列調査は、プラスミドインサートが、既知の遺伝子又は蛋白質に対して相同性を示さない事を明らかにした。配列番号１は、以後「ＧＡＧＥ」と称する同定された遺伝子の為のｃＤＮＡヌクレオチド情報を表す。推定上のオープンリーディングフレームは、この分子の５１〜４６７の塩基の所に位置している。この配列の最初の２つの塩基は、ｃＤＮＡ配列を運ぶベクター由来のものであり、ｃＤＮＡそれ自身の一部ではない。実施例７ｃＤＮＡの配列分析に続いて、実施例６の様に、正常組織の細胞がこの遺伝子を発現したかを決定する為の実験を行った。これを決定する為に、以下に示す様に、ノーザンブロッティング(Northern blotting)を、組織及び腫瘍細胞株上で行った。このブロッティング試験は、配列番号１の完全な配列のｃＤＮＡを使用した。次いでＰＣＲを使用して結果を確認した。実施例８上に述べたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及びＧＡＧＥ遺伝子情報を利用して、正常組織と腫瘍についての詳細な分析を行った。先ず始め、全ＲＮＡを、慣用の方法を使用して特定のサンプルから採取した。これを、ｃＤＮＡの調製の為に使用した。このｃＤＮＡを作製する為に使用したプロトコールは、逆転写酵素バッファー５ｘの４μｌ、各ｄＮＴＰの１μｌ、（１０ｍＭ）、ジチオスレイトールの２μｌ（１００ｍＭ）、ｄＴ−１５プライマーの２μｌ（２０μｍ）、ＲＮアジン(RNasin)(40 単位／μｌ）の0.5 μl 及び MOMLV 逆転写酵素(200単位／μｌ)の１μｌを一緒にする事を含む。次に、6.5μｌのテンプレートＲＮＡ（１μｇ／3.25μｌ水、又は合計２μｇのテンプレートＲＮＡ）を添加した。混合物の全容量は20μｌであった。これを混合し、42℃で60分間培養し、その後氷上で冷却した。次いで、合計80μｌの水を添加し、合計100μｌとした。この混合物を、ＰＣＲに使用するまで−２０℃ で貯蔵した。ＰＣＲを行う為のプライマー５′−ＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＧＣＣＴ−３′ （センス）及び５′−ＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡ−３″ （アンチセンス）配列番号２及び３をそれぞれ使用した。この試薬は、３０．５μｌの水、５μ ｌのＰＣＲバッファー１０ｘ、１μｌの各ｄＮＴＰ（１０μＭ）、２．５μｌの各プライマー（２０μＭ）、及び０．５μｌの重合酵素「ダイナザイム(Dynazym e)」（２単位／μｌ）を含み、全容量を４５μｌとした。ｃＤＮＡの５μｌ全部を添加した（これは１００ｎｇの全ＲＮＡに相当した）。この混合物を組合せ、鉱油１滴で層状にした。この混合物を熱循環系(thermocycler block)に移し、９４℃に予熱し、増幅を３０サイクル行った。各サイクルの内容は次の通りであった。最初の変性：９４℃、４分変性：９４℃、１分アニーリング：５５℃、２分エクステンション：７２℃、３分最終エクステンション：７２℃、１５分このサイクルの後、１０μｌの液を、１．５％アガロースゲル上に流し、臭化エチジウムで染色した。上に示したプライマーを使用して増幅されたｃＤＮＡは、２３８塩基対合フラグメント(pair fragment)を生成する。汚染ゲノムＤＮＡが存在しても、その増幅はない。結果を以下の表２に示す。これらの結果は、ＧＡＧＥを発現する唯一正常な組織は睾丸であり、一方、メラノーマ、肺、乳房、喉頭、咽頭、サルコーマ、睾丸精上皮腫、膀胱及び結腸を含む多数の腫瘍がこの遺伝子を発現する事を示している。この様にして、ＧＡＧＥ遺伝子の発現NI対して、これらの腫瘍のどれについても分析が出来る。実施例９先の実施例で参照された核酸分子の同定は、ＨＬＡ−Ｃｗ６分子で表示され、ＧＡＧＥ遺伝子由来の免疫拒絶抗原の決定に係わる更なる研究につながる。発現ベクターｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ中のＧＡＧＥの完全なｃＤＮＡは、制限内ヌクレアーゼＮｏｔＩ及びＳｐＨＩで消化され、次いで、供給者の指示に従って外ヌクレアーゼで消化した(Erase-a-base System，Promega)。この処理は、３′末端で始まる、一連の漸進的欠失を発生した。欠失生産物は、ｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰに戻し結紮され、次いで、公知の技術を使用して、大腸菌株ＤＨ５ａｌｐｈａ′ＩＱの中にエレクトロポレイトした。形質転換体はアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選択した。プラスミドＤＮＡを、各組み換え体クローンから抽出し、次いで、ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードするベクターと共に、ＣＯＳ−７細胞中に形質移入した。プロトコールは上述のプロトコールに従って使用した。次いで、形質移入体をＴＮＦ放出アッセイ中でテストした。これは、ネガティブ及びポジティブなクローンの分離を許した。全てのネガティブクローンは全てのＧＡＧＥ配列の欠失を示した。最も小さなポジティブクローンは、配列番号１の最初の１７０ヌクレオチドを含んでいた。この配列の分析は、オープンリーディングフレームがヌクレオチド５１で開始する事を示した。この様に、このフレームはＧＡＧＥ−ＴＲＡＰの最初のアミノ酸をコードする配列を含む。実施例１０次いで、ＴＲＡペプチドをコードする領域を更に正確に定義する為の追加実験を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、これを行う為に使用された。２つのプライマーを合成した。最初のプライマーは、ＢａｍＨＩ部位の上流に位置するプラスミドベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ内の配列に対して２０ｍｅｒ相補的であった。第２のプライマーは、３′末端で配列番号１のヌクレオチド１０２〜１１９を含み、５′末端でＸｂａＩ制限部位を含む１１ヌクレオチドの範囲を含む２９ｍｅｒであった。増幅に続いて、ＰＣＲ生産物をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、プラスミドｐｃＤＮＡ−３のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位にクローン化した。組み換え体コロニーは、実施例４によって、ＣＯＳ−７細胞中に、ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードするｃＤＮＡで以て形質移入され、上述のＴＮＦ放出アッセイがＣＴＬを使用して行われた。ＴＮＦ放出が観察され、「ミニ遺伝子」(minigene)がＴＲＡに対して処理された事を示した。ミニ遺伝子、即ち、配列番号１のヌクレオチド１〜１１９、ヌクレオチド５１〜１１９から始まるコード領域は、配列番号１のｃＤＮＡの最初の２３アミノ酸をコードした。この情報は、次に行う実験の基礎として役立った。実施例１１配列番号１の最初の２３アミノ酸を基にして２つのペプチドを合成した。これらは、であった。各ペプチドを、以前にＨＬＡ−Ｃｗ６で形質移入したＣＯＳ−７細胞中にパルスし、ＴＮＦ放出が誘起されるかを決定する為に、ＣＴＬ７６／６と結合した。ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を、以前に２４時間ＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡで形質移入されているＣＯＳ−７細胞に添加した。３７℃で、９０分間培養後、培地を捨て、３０００ＣＴＬを、ＩＬ−２を２５単位／ｍｌ含む１００μｌの培地に添加した。１８時間後、上澄み液のＴＮＦ含有量を、ＷＥＨＩ−１６４−１３細胞の毒性の決定を介してテストした。第二のペプチド（配列番号１３）は、３０ｐｇ／ｍｌより多いＴＮＦを誘発する事が分かった。一方、第一のペプチド（配列番号１２）は１０ｐｇ／ｍｌ未満のＴＮＦを誘発する事が分かった。第二のペプチドは次の実験に使用した。実施例１２配列番号１３を基にして様々なペプチドを合成し、以下に表示されるその内の幾つかについてテストした。これらのテストを行う為に、⁵¹Crラベル化ＬＢ３３ −ＥＢＶ細胞（ＨＬＡ−Ｃｗ６ポジティブ）を、次のペプチドの１つで培養した。ペプチド濃度を、図３で示され様に変化させ、ＣＴＬ：ＬＢ３３−ＥＢＳの比（エフェクター：ターゲット比）を１０：１とした。⁵¹Cr放出は３７℃での培養４時間後に決定した。ポジティブ（“Ｆ⁺”，MZ2-MEL.3.1）に対する溶解水準及びネガティブ（“Ｆ⁺”，MZ2-MEL.2.2.5）コントロール細胞は図３に示される。配列番号４のオクタマーが最高のペプチドであり、腫瘍拒絶抗原である事が明らかとなった事が分かった。これは、オクタマーが、人間のＭＨＣ分子の表示中に含まれる事を報告した最初のものである。上述の、１９９での、Ｈ−２Ｋ^b及びＨ−２Ｋ^K分子に対してエンゲルハートによって報告されたマウス系に対しては幾つかの前例が存在する。又、配列番号５及び配列番号６のノナマーは、配列番号４のオクタマーより少ない範囲であるにもかかわらず、ＣＴＬ溶解を誘発した。ここに報告されていない結果では、第二のＣＴＬがテストされた（ＣＴＬ８２／３１）。このＣＴＬは、ＭＺ２−Ｆを表示する細胞を溶解する事が知られている。それは、配列番号４のペプチドでのパルスに続いて、ＨＬＡ−Ｃｗ６ポジティブ細胞をまた溶解した。実施例１３前記ＧＡＧＥのＤＮＡが独特のものであるかどうか見出すために、ＭＺ２−ＭＥＬ４３由来のＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリー（ＧＡＧＥのクローニングに使用したのと同一のライブラリー）を、ＧＡＧＥのｃＤＮＡ由来のプローブとハイブリダイズさせた。プローブは配列番号１の２０〜３２８番目の部位間の３０８塩基対のＰＣＲ断片であった。２０の陽性のｃＤＮＡを得た。そのうちの６つを完全に配列決定した。それらはＧＡＧＥ配列と非常に高い関連性を有していたが、わずかに異なっていた。６つのクローンのうちの２つは互いに同一であったが、その他のものは互いに全く異なっていた。したがって、ＧＡＧＥとは異なるが、高い関連性を有する５つの新規の配列を同定した。それらをＧＡＧＥ−２、３、４、５及び６と呼び、それぞれを配列番号１４〜１８に示す。その他の１４のクローンを、５’末端について部分的に配列決定したところ、その配列は６つのＧＡＧＥのｃＤＮＡの１つに対応していた。これらのｃＤＮＡとＧＡＧＥ−１間の主要な差異は、配列番号１のＧＡＧＥ配列の３７９〜５２１番目の部位に位置する１４３塩基対のストレッチ（stretch ）が存在しないことである。５’末端の最初の１１２塩基対がその他のＧＡＧＥと全く異なっているＧＡＧＥ−３を除いて、配列の残りの部分は１９の異なる部位におけるミスマッチ（mismatch）を示したのみであった。このＧＡＧＥ−３のｃＤＮＡ領域は長い反復（repeat）かつヘアピン構造を含んでいた。腫瘍拒絶抗原前駆体に相当する推定したＧＡＧＥ−１タンパク質は、最後の７つの残基がＧＡＧＥ−１の相同な残基とは異なる、その他の５つのタンパク質よりもアミノ酸約２０個分長い（図５）。タンパク質配列の残りの部分は１０のミスマッチのみを示した。これらの中の１つは、配列番号４の抗原ペプチドに対応する領域内に存在した。ペプチド配列をＧＡＧＥ−３、４、５及び６について修飾を行い、２番目の部位はＲに代わりＷにした。実施例１４２番目の部位における変化がペプチドの抗原性に影響するかどうかを評価するために、６つのＧＡＧＥのｃＤＮＡのｃＤＮＡを、独立して、ＨＬＡ−Ｃｗ６のｃＤＮＡと共にＣＯＳ細胞に形質移入し、形質移入体を、ＣＴＬ７６／６による認識について、前記のように試験した。ＧＡＧＥ−１及びＧＡＧＥ−２を形質移入した細胞のみが認識され、これは、ＧＡＧＥ−３、４、５及び６によりコードされた修飾ペプチドは、本実験の情況においては、抗原性でなかったことを示している。前記のその他１４のクローンの５’末端の配列解析は、それらの中の７つが抗原性ペプチドをコードする配列を含み、したがってそれらはＧＡＧＥ− １又はＧＡＧＥ−２のいずれかに相当するだろうということを示した。実施例１５腫瘍サンプルにおけるＧＡＧＥ発現を試験するために前記で使用したＰＣＲプライマーは、ＧＡＧＥ−１又は２と抗原ＭＺ２Ｆをコードしないその他の４つのＧＡＧＥのｃＤＮＡとを識別することができなかった。ＧＡＧＥ−１及び２を特異的に増幅し、ＧＡＧＥ−３、４、５及び６を増幅しないプライマーの新規なセットを調製した。これらのプライマーは以下に示すとおりである。これらのプライマーを、前記したように、以下に示す温度条件でポリメラーゼ酵素を使用したＲＴ−ＰＣＲ反応において用いた。９４℃で４０分間９４℃で１分間、５６℃で２分間、７２℃で３分間を３０サイクル７２℃で１５分間この解析結果を表３に示す。更なる研究において、全てのＧＡＧＥ遺伝子を増幅する新規のプライマーを設計し、正常組織において、それらは全く発現しないことを確認した。これらのプライマーは以下のとおりである。ＶＤＥ４４及びＶＤＥ２４プライマーを用いたＰＣＲに関する限りでは、これらを厳密に使用した。結果を表４に示す。結果より、精巣を除いて、正常組織は陰性であったことを確認した。実施例16 ここで報告しない作業において、細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２２／２３（Van der Eynde ら、Int．J．Cancer 44:634-640(1989); 参考としてここに導入する）は、メラノーマ細胞MZ2-MEL.3.1.を認識しなかったことが判明した。このメラノーマ細胞ラインが、Van der Bruggen らにより、Eur．J．Immunol．24: 2134-2140(1994)において、MHC 分子、HLA-A29 、HLA-B24、及びHLA-Cw ^*1601の発現を失っていることが報告された。これらのMHC分子の一つによるトランスフェクトによって、ラインが、CTL 22/23 に感受性となるがどうかを決定するための研究がなされた。HLA-A29 は、最初に試験された分子である。このために、市販の抽出キットを使用しかつ指示に従って、HLA-A29^*細胞ラインMZ2-MEL.43からポリＡ⁺ ＲＮＡを抽出した。標準方法を使用してmRNAをcDNAに変換し、サイズ分画し、次いで、プラスミドpcDNA-I/Amp のBstI及びNotI部位に単一方向で挿入した。プラスミドをE.コリー株 DH5α5'IQ中にエレクトロプレートし、アンピシリン（50μg/ml）で選択した。細菌をニトロセルロースフィルター上にプレートし、複写した。フィルターを調製し、40℃において以下の配列を有する³²P 標識プローブを使用して、6xSSC/0.1% SDS/1x のDengardt's溶液中で一夜ハイブリダイゼイションした。プローブは、ほとんどのＨＬＡ配列の出発コドンを囲む配列である。フィルターは、室温で５分間それぞれ6xSSC 中で二度、43℃で6xSSC 中で二度洗浄した。陽性の配列は、次いで、以下のプローブによってスクリーニングした。このプローブは、³²P で標識したものである。この配列は、免疫学的に興味のある配列及びタンパク質のKabat Database（参考としてここに導入する）を参照することによって決定すると、HLA-A29 に特異的である。このデータベースは、 NCBI(USA)又はWeb Soltｅ（インターネット）WWW.NCBI.NLM.N1H.GOV．において入手可能である。フィルターは、室温で５分間それぞれ6xSSC で二度洗浄し、次いで42℃で二度、6xSSC（１回の洗浄当たり５分間）で洗浄した。実施例17 陽性のHLA-A29 クローンが単離されると、上記DEAE- デキストリンクロロキン法を使用して、これらをCOS-7 にトランスフェクトした。即ち、1.5x10⁴のCOS-7 細胞を、HLA-A29 を含有するプラスミドpcDNA-I/Amp 50ng、及び上記GAGE配列の一つに対するcDNAを含有するcDNA若しくはそれぞれプラスミドpcDNA α-I/Amp 又はpcDSR-α中の従来のMAGE又はBAGE配列の一つ100ng で処理した。トランスフェクタントは、次いで、37℃で24時間インキュベートした。次いで、トランスフェクタントは、上記実施例４の最後に説明した分析を使用して、CTL によるTNF 産生を刺激する能力について試験した。この研究の結果を示す図７は、トランスフェクタントとして、GAGE-3、4 、5 及び6 並びにHLA-A29 のいずれかを使用することによってTNF 産生の高いレベルが達成されることを示す。これとは対照的に、GAGE-1及び2 は、CTL クローン22 ／23を刺激しないことから、GAGE−３、４、５及び６は、HLA-A29 分子によって提示される抗原に対して処理されかつCT22／23によって認識されることが結論される。実施例18 GAGE-3、4 、5 及び6 がHLA-A29 + 細胞によって提示されるペプチドに対して処理され、一方、GAGE-1及び2 は、そうでないという事実は、GAGE-3、4 、5 及び6 に共通し、GAGE-1及び2 には存在しないアミノ酸配列に関する推論されるアミノ酸配列の検討を示唆する。この配列は、以下のものとして特定される。このペプチドを合成し、凍結乾燥し、次いで、水中における１容量のＤＭＳＯ及び９容量の10ｍＭの酢酸中に溶解した。この方法は、合成された他のペプチドに対して使用し、以下で検討した。ペプチド（配列番号21）を、上記で説明した方法に従って、⁵¹Cr放出実験で試験した。このペプチドは、溶解を引き起こすことが分かった。連続する欠失を調製し、再び⁵¹Cr放出分析を使用して、溶解を引き起こす能力について試験した。この作業は、図９に説明した。溶解を引き起こす最短のペプチドは、以下の通りであった。この配列は、GAGE-3〜6 のすべてに共通する。詳細に述べれば、GAGE-3のアミノ酸10〜18及びGAGE-4、5 及び6 のアミノ酸9 〜17がこのペプチドに対応する。図９に示されるペプチドファミリーの番号、例えば、配列番号21及び22で示される番号は、トーバート(Toubert)ら、「HLA-A29 ペプチド結合モチーフ」、Abs tract No.4183，Ninth International Congress of Immunology，July 23-29，1 995，San Francisco，CA（参考としてここに導入する）によって提示されるデータと一致しない。トーバートらによれば、少なくとも、HLA-A29と結合するペプチドの３位にPhe 残基が必要である。ここに示されるように、そのような場合には該当しない。前述のサンプルは、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子の単離を示す。この「ＴＲＡＰ」をコードする分子は、然しながら、上に示した引用例に記載された、以前に開示されたＭＡＧＥ及びＢＡＧＥコード配列とは相同ではない。故に、本発明の一観点は、配列番号１〜６及びそのフィラグメント、例えば、ヌクレオチド１〜１７０、及び配列番号１の５１〜１７０、又は腫瘍拒絶抗原に加工されるその他のフラグメントで示すヌクレオチド配列を含む単離核酸分子である。この配列番号１〜６の配列は、引用例に開示されたそれら遺伝子のいずれの配列と比較しても分かる通り、ＭＡＧＥでもなければＢＡＧＥコード配列でもない。また、本発明の一部は、非−ＭＡＧＥ及び非−ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするが、ストリンジェント条件下において前述開示の配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に対して交雑する核酸分子でもある。ここで使用される「ストリンジェント条件」と言う言葉は、当該分野においてはよく知られているパラメーターであり、更に詳しくは、ここで使用される「ストリンジェント条件」とは、１ＭＮａＣｌ１％ＳＤＳ及び１０％デキストラン硫酸中での、６５ ℃、１８時間でのハイブリダイゼーションを意味する。この後、２ｘＳＳＣで、５分間、室温でのフィルターの２回洗浄及び、６５℃で、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、３０分間の１回洗浄が行われる。他の条件、試薬等が使用でき、同じか又はより高い程度のストリンジェンシーとなる。当業者は、この様な条件についてはよく知っているであろうから、ここには開示しない。本発明は、原核（例えば、大腸菌）、又は真核（例えば、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞）である宿主細胞及び細胞株を形質移入するのと同様に、発現ベクターにおける配列の使用を包含する。発現ベクターは、関連配列、即ち上に開示されたそれらがプロモーターに操作的に結合される事を要求する。ヒト白血球抗原ＨＬＡ− Ｃｗ６及びＨＬＡ−Ａ２９共に、それらの遺伝子由来の腫瘍拒絶遺伝子を表示する事が見出されているので、発現ベクターも又ＨＬＡ−Ｃｗ６又はＨＬＡ−Ａ２９の１つをコードする核酸配列を含むことが出来る。ベクターが両方のコード配列を含む場合は、いずれか１つを正常に発現しない細胞を形質移入するのに使用出来る。腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例えば、宿主細胞か既にＨＬＡ −Ｃｗ６及びＨＬＡ−Ａ２９の１つ又は両方を発現する時は、単独で使用出来る。勿論、使用する事の出来る特定の宿主細胞についての制限は存在しない。２つのコード配列を含むベクターは、所望ならはＨＬＡ−Ａ２９又はＨＬＡ−Ｃｗ６発現細胞で使用され得る如くに、腫瘍拒絶抗原前駆体の遺伝子はＨＬＡ−Ａ２９又はＨＬＡ−Ｃｗ６を発現しない宿主細胞で使用出来る。本発明は又、当業者が所望の発現ベクターを調製出来る様な所謂発現キットを包含する。その様な発現キットは、前に議論したコード配列のそれぞれの少なくとも別々の部分を含む。所望により、必要とされる前述の配列が含まれる限りにおいて、他の成分を添加してもよい。本発明の核酸分子及びＴＲＡＰｓを、前述開示のＭＡＧＥ及びＢＡＧＥと区別する為に、本発明は、遺伝子とＴＲＡＰｓのＧＡＧＥファミリーと称する。それ故、ここにおいて「ＧＡＧＥ」が使用される時は常に、前述開示の配列によってコードされた腫瘍拒絶抗原前駆体を意味する。「ＧＡＧＥコード分子」及び類似の言葉は、核酸分子それ自身を述べるのに使用される。ここにおいて開示される発明は、多数の用途を有し、その幾つかがここに開示される。第一に、本発明は、当業者がＴＲＡＰの発現或いは腫瘍拒絶抗原の発現で特徴付けられる、例えばメラノーマの様な疾患を診断する事を可能とする。これらの方法は、ＴＲＡＰ遺伝子及び／又はそれら由来のＴＲＡｓ、例えばＨＬＡ −Ｃｗ６又はＨＬＡ−Ａ２９で表示されるＴＲＡの発現の決定を含む。前者の場合は、その様な決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含む任意の標準核酸決定アッセイ又は標識ハイブリダイゼーションプローブを用いたアッセイにより行う事が出来る。後者の場合は、ＴＲＡ及びＨＬＡの複合体の為の結合パートナー、例えば抗体を使用したアッセイが特に好ましい。他の方法は、上に開示されたタイプのＴＮＦ放出アッセイである。このアッセイを行う為には、睾丸細胞は通常はＧＡＧＥを発現しないので、これらが存在しない事を確かめる事が好ましい。然しながら、このことは、睾丸と他の細胞は常法により区別する事が出来るから、必須ではない。又、非−睾丸性サンプル中に睾丸細胞を存在させる事は、実際には不可能である。ＴＲＡＰ遺伝子の単離は又、ＴＲＡＰ分子それ自身、特に配列番号２〜６によりコードされたアミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子の単離を可能とする。ＴＲＡとして、又はＴＲＡとＨＬＡ、例えばＨＬＡ−Ｃｗ６又はＨＬＡ−Ａ２９の複合体として存在した時のこれら単離分子は、アジュバントの様な物質と結合して、ＴＲＡＰ分子の発現で特徴付けられる疾患治療に有用なワクチンを造ることが出来る。アジュバントの例としては、フロイントの完全、不完全なアジュバント、死菌百日咳微生物(killed B.pertussis organisms)(BCG)、又は、Bacille Calmente- Guerin 、Al(OH)₃、ムラミルジペプチド及びその誘導体（例えばスクワレンの様な代謝性オイルに乳化される）、モノホスホリルリピドA(MPL)、キーホールリムペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)、QA-7、QA-19 及びQA-2 1(QS-21 ともいわれる)の様なサポニン抽出物（これらは、米国特許第５,０５７ ,５４０号明細書に記載されており、ここに参照として導入される）、ＭＴＰ− ＭＦ５９、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル〕−Ｎ．Ｎ，Ｎ− トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、カチオン性アンフィフィルＤＯＴＭＡ(cationic amphiphile DOTMA)、DOPEの様な天然ホスホリピド及びそれらの組合せが挙げられる。この列挙は、包括的なものを意味するものではなく、当業者はこの列挙に意見を述べる事が出来る。全ての追加のアジュバントはここに包含される。更に、ワクチンは、それらの表面でＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を表示する細胞、例えば非−増殖性癌細胞、非−増殖性形質移入体等から調製出来る。細胞がワクチンとして使用される全ての場合において、これらは、ＣＴＬ応答を用意するのに必要な成分の１つ又は両方のコード配列で形質移入された細胞、又は形質移入なしに両分子を発現する細胞であり得る。更に、ＴＲＡＰ分子、その会合ＴＲＡｓは、ＴＲＡとＨＬＡの複合体同様に、当該分野において公知の標準的な方法を使用して、抗体を産生するのに使用出来る。ここで使用される「疾患」とは、腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するあらゆる病的状態を意味する。その様な疾患の例には、癌、特にメラノーマがある。メラノーマは、色素産生細胞の癌として良く知られている。上に例示した様に、配列番号４で表示されたものの様な腫瘍拒絶抗原は、本発明の一部である。又、本発明の一部は、８〜１６のアミノ酸を含む分子の様なポリペプチドであり、このポリペプチドは配列番号４で示したアミノ酸配列を含む。実施例が示す通り、配列番号４のオクタマーより長いこれらのペプチドは、癌細胞を表示し、それによって表示されるＨＬＡ−Ｃｗ６によって、配列番号４の腫瘍拒絶抗原中に加工される。この表示は、複合体を表示する細胞に接触した体液サンプルに存在する細胞溶解性Ｔリンパ球による溶解へとつながる。同様に、配列番号２２より長いペプチド、例えば配列番号２１の様なペプチドは適当なＴＲＡ中に加工され、ＨＬＡ−Ａ２９ポジティブ細胞の様な癌細胞によって表示される。この様に、本発明の他の目的物は、何処においても９〜１６のアミノ酸の長さであり、配列：（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸である）を含むペプチドである。これらのペプチドは折り曲げて、そして／又はＨＬＡ−Ａ２９分子に結合するペプチドに加工される。これらのペプチドが、腫瘍拒絶抗原に加工されるという事実は、実施例で例示された。この特性は、他のパラメータの関連性において、特にメラノーマのようなガンの、病理学的な状態の診断を確認する場合において、活用することができる。例えば、研究者は血液または尿の中に抗体を加えて調べることにより、生理学的な変化を観察することができ、かつこれにより、本明細書に記載したＣＴＬ増殖法を用いてメラノーマの診断を確認することができる。それ自体で、本発明のペプチドを用いて、ＨＬＡタイプアッセイを行うことができる。よく知られていることであるが、皮膚移植、臓器移植などが必要な場合、移植片が拒絶される可能性を最小にするように、ＨＬＡタイプの確認を行わなければならない。本発明のペプチドを使用して、個体がHLA-CW6 またはHLA-A29 陽性であるか否か決定し、それにより適当なドナーを選択することができる。このタイプのアッセイは、実施が簡単である。本発明のペプチドを対象となる試料に接触させ、それにより該試料中の細胞と結合体が、試料を取り出した個体がHLA- CW6 またはHLA-A29 陽性であるか否かを示すのである。このようなアッセイを最適化するように、本発明のペプチド自体をラベルし、該ペプチドをラベルしたリンカーに共役または他の結合をさせ、あるいは該ペプチドを固相に固定するなどする。他の標準的な方法も、当業者にとり明らかであろうし、本明細書に記載する必要はないであろう。この開示を基にした治療手段は、ＴＲＡ表現細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２９又はＨＬＡ−Ｃｗ６細胞の溶解へと導く、被験者の免疫系での応答を前提条件とする。その手段の１つは、結果において異常細胞の表現型を持つ被験者に対する、複合体に対して特異なＣＴＬｓの投与である。in vitroでその様なＣＴＬｓを発生させる事は当業者の技術範囲内である。特に、血球の様な細胞のサンプルは、複合体を表示する細胞に接触させ、増殖の為の特異ＣＴＬを誘発する事かできる。標的細胞は、例えば上に述べたタイプのＣＯＳ細胞の様な形質移入体であり得る。これらの形質移入体は、それらの表面において所望の複合体を表示し、目的のＣＴＬと結合した時に、その増殖を刺激する。ここで使用した様なＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細胞同様に広く利用できる。養子免疫細胞移入と言われる治療法(Greenberg，J．Immunol．136(5): 1917(1 986); Riddel et al.，Science 257: 238(7-10-92); Lynch et al.，Eur．J．Im munol．21: 1403-1410(1991); Kast et al.，Cell 59: 603-614(11-17-89))を詳述する為に、所望の複合体を表示する細胞をＣＴＬｓと結合して、それらに特異なＣＴＬｓを増殖させる。増殖したＣＴＬｓを、次いで関連ＨＬＡ分子を含む特定の複合体を表示する或る種の異常細胞で特徴付けられる細胞異常性を持つ被験者に投与する。このＣＴＬｓは異常細胞を溶解し、それによって所望の治療目標を達成する。前述の治療は、被験者の異常細胞の少なくとも幾つかは、関連ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を表示する事を仮定している。これは、関連する配列、この場合はＧＡＧＥ配列のＲＮＡ発現細胞の同定法及び特定のＨＬＡ分子を表示する細胞の同定法が非常に良く知られているため、極めて容易に決定出来る。関連複合体を表示する細胞が前述のスクリーニング法で同定されたならば、それらはＣＴＬｓを含む患者からのサンプルと結合出来る。細胞を表示する複合体が、混合ＣＴＬサンプルによって溶解されれば、ＧＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原が存在しており、被験者は、上に示した治療手段にとって適切な候補者であると推定出来る。養子免疫細胞移入は、本発明に関して利用できる治療法の唯一の形態ではない。ＣＴＬｓは、又多数の手段を用いてin vivo でも誘発する事が出来る。１つの手段、即ち複合体を表示する非−増殖性細胞の使用は、上に詳しく述べられている。このアプローチで使用される細胞は、複合体を正常に発現する細胞、例えば照射メラノーマ細胞又は複合体の発現に必要な遺伝子の一方又は両方を形質移入された細胞であってもよい。チェン等(Chen et al.,)、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 88: 110-114（January，1991）は、治療的養生法において、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現する形質移入細胞の使用を示して、このアプローチを実証している。様々な細胞のタイプが使用出来る。同様に、目的の遺伝子の一方又は両方を含むベクターが使用出来る。ウイルス又はバクテリアベクターは特に好ましい。これらの系では、目的の遺伝子は、例えばワクチニアウイルス又はバクテリアＢＣＧによって運はれ、この物質は、事実上宿主細胞を「感染」させる。この細胞は目的の複合体を表示することとなり、そして自己由来のＣＴＬｓによって認識され、次いで増殖する。類似の効果は、目的のＨＬＡ／ペプチド複合体を表示する細胞を表示するＨＬＡＬ−Ｃｗ６中への導入を促進するために、腫瘍拒絶抗原又はそれ自身の前駆体をアジュバンドと結合する事により達成出来る。ＴＲＡＰは、ＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生成する為に変えられ、一方ＴＲＡは更なる変更を必要とせずに表示される。本発明の他の特徴は、当業者にとっては明らかであり、ここに繰り返すまでもないであろう。使用された言葉及び表現は、記述の為の言葉として使用されるもので、限定の為のものではなく、表示及び開示された要旨又はその一部のいかなる均等物をも排除する為の言葉及表現の使用を意図するものではなく、様々な変更が本発明の範囲内において可能である事が認識される。

【手続補正書】【提出日】１９９７年９月２９日【補正内容】明細書第38頁の“請求の範囲”の前に以下の文章を追加する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者ファンデルエインドベノワベルギーベー1200 ブリュッセルアベニューイッポクラート 74 ユセエル 7459 (72)発明者デバッケルオリヴィエールベルギーベー1200 ブリュッセルアベニューイッポクラート 74 ユセエル 7459 (72)発明者ボーンファルールティエリーベルギーベー1200 ブリュッセルアベニューイッポクラート 74 ユセエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．９〜１６個のアミノ酸から成り、配列番号：２３を含む単離ペプチド。２．配列番号：２３から成る請求項１記載の単離ペプチド。３．配列番号：２１から成る請求項１記載の単離ペプチド。４．配列番号：２２から成る請求項１記載の単離ペプチド。５．ＨＬＡ−Ａ２９分子と配列番号：２３との複合体に対して特異な、体液サンプル中の溶解性Ｔリンパ球の存在を決定する方法であって、その表面上にＨＬＡ −Ａ２９を存在させる細胞サンプルを、前記ポリペプチドを配列番号：２３に加工するのに好ましい条件下で、配列番号：２３から成るポリペプチドと接触させ、配列番号：２３のポリペプチドを前記ＨＬＡ−Ａ２９分子に結合させ、前記溶解性Ｔリンパ球を含むと考えられる体液サンプルを、配列番号：２３とそれらの表面上のＨＬＡ−Ａ２９との複合体を表示している前記細胞に接触させ、前記サンプル中での前記溶解性Ｔリンパ球の存在の決定として、（ｉ）溶解性Ｔリンパ球によって放出された腫瘍壊死因子の少なくとも一つ、又は（ｉｉ）前記複合体を表示している前記細胞の溶解を決定する事を特徴とする方法。６．腫瘍壊死因子の放出を決定する事を含む、請求項５記載の方法。７．放射性ラベル化クロムの放出を決定する事によって溶解を決定する事を含む、請求項５記載の方法。