JPH0146111B2

JPH0146111B2 -

Info

Publication number: JPH0146111B2
Application number: JP3446781A
Authority: JP
Inventors: Chan Shin
Original assignee: Cetus Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1981-03-10
Publication date: 1989-10-05
Also published as: JPS56137896A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は分子生物学、詳細にはいわゆる組み
換えDNAに関する。この発明は、枯草菌などの
グラム陽性菌にクローンされた外来遺伝子を導入
することにより該遺伝子産生物を制御された条件
下に産生させる遺伝子組み換え菌の製造方法に関
し、これによつて外来遺伝子生産物の回収が促進
される。この発明は新規な遺伝子操作を加えたプラスミ
ドを開示する。これらの微生物の例はメリーラン
ド20852、ロツクビルのアメリカンタイプカルチ
ヤー（ATCC）にプダペスト条約下に寄託してあ
る。プラスミドpOG1196はATCCNo.31776；プラ
スミドpOG2165はATCCNo.31777；プラスミド
pOG2110はATCCNo.31778である。周知の如く、特定の蛋白質のアミノ酸配列は該
蛋白質に対する遺伝子に担持されているコードに
より決定される。DNAからメツセンジヤーRNA
を経て蛋白質を形成するための翻訳の過程におい
ては、DNAの中の３つずつのヌクレオチドで構
成される群、いわゆるコドン１つに対して１つの
アミノ酸（20個の可能なアミノ酸のうち）が上記
蛋白質鎖の対応する位置に置かれる。組み換えDNA技術の出現によつて、合成した
かあるいは１つの菌株または種から単離されたあ
らかじめ決められたヌクレオチド配列を他の菌株
または種の遺伝子に導入することによつて遺伝学
的変化が人為的に行なえるようになつた。既知ヌ
クレオチド配列を選択して、ヌクレオチド配列を
導入された菌株または種が翻訳の過程の一部分と
して該既知ヌクレオチド配列によつてコード化さ
れている蛋白質を生産するようにできる。このよ
うな操作を受けた菌株または種は通常の複製過程
において上記導入されたヌクレオチド配列をも複
製する。組み換えDNA技術は適当なDNA鎖（クローニ
ングベクター）を単離し、該クローニングベクタ
ーのDNAの２本の鎖を外来DNAを挿入したい位
置で切断することからなる。これを行うために、
特定タイプの蛋白質、いわゆる制限酵素が典型的
に使用される。制限酵素はDNAを特定のヌクレ
オチド配列で切断するであろうが、いくつかの制
限酵素については上記切断は必ずしも上記２本の
からみ合つたDNA鎖の同一の位置で生じるとは
限らない。そのような場合、もし２つの異なつた
タイプのDNAが同じ様に切断されると、各開裂
末端は互いに相補的であり、適当な条件下に並行
している相補的末端とくつつくであろう。次いで
これらの末端は酵素（リガーゼ）により結合され
る。このことは、どんなものから得られた２つの
DNA断片でも単一のDNA分子に組み込むことを
可能にする。 DNAベクターを単離し外来の断片を挿入した
ら、この組み換えDNAを適当な宿主微生物に入
れる。宿主微生物が挿入されたDNAを複製する
ためには、組み換えDNAが宿主微生物の遺伝子
系の一部となるように宿主に挿入する必要があ
る。いつたん外来DNAがうまく宿主微生物に組み
込まれ、その宿主微生物がクローニングされた遺
伝子の生産物を生産したら、その所望の生産物は
回収されねばならない。本発明以前は、この生産
物を回収するのに所望の生産物を生産する細胞を
殺す必要があつた。又、細胞は多くの異なる蛋白
質を含んでいるので、所望の生産物の単離方法が
困難あるいは複雑である。最終的には所望の生産
物は特に高いレベルで生産されている場合には宿
主細胞にとつて有害である。いくつかの場合、こ
のことより細胞が崩壊し、他の場合には細胞の防
御機構が活性化されて所望の生産物を分解してし
まう。今日までの組み換えDNA研究のほとんどは大
腸菌（E.coli）によつて行なわれており、大腸菌
はペリプラズミツク間隙（periplasmic space）
を封じる２層の細胞膜を有する細菌のグラム陰性
菌の１つである。大腸菌において生産された生産
物の多くはこのペリプラズミツク間隙に分泌され
る。ほんのわずかの生産物が生きている細胞から
成育倍地へ分泌されるにすぎない。一方、たとえば、単層の細胞膜のみを有するグ
ラム陽性菌群の一員である。枯草菌（B.subtilis）
は大量の蛋白質を生産し、これは生育倍地に直接
分泌される。大腸菌（E.coli）における遺伝子ク
ローニングの一般的研究手法は枯草菌（B.
subtilis）に適用できるが、枯草菌に組み込まれ
た外来遺伝子の有用な生産物を生産させて成育倍
地に分泌させる試みは成功しなかつた。枯草菌は
プラスミドを介した形質転換の効率が大きく病原
性がないのでいく分大腸菌よりも好ましい。本発明の目的は添付図面を参照することにより
下記説明から明らかであろう。第１図はバチルス・リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）から得られたβ−ラク
タマーゼのための遺伝子を有するDNA断片の部
分的構造地図を示す全体図であり；第２図は第１図の断片中の多くのヌクレオチド
配列と該断片がコードする蛋白質中に存在するア
ミノ酸配列との対応関係を示す全体図であり；第３図は組み換えプラスミドを有する枯草菌
（Bacillus subtilis）菌株が生育するプレートの
典型的外見を示す概略図であり、該プレートはβ
−ラクタマーゼ活性を試験するPVA検定を行な
つた後の状態を示している。第４図は大腸菌（E.coli）プラスミドpOG2110
枯草菌（B.subtilis）プラスミドpOG1196および
二機能性プラスミドpOG2165の構造を説明する
全体図であり；第５図は組み換えプラスミドを有する種々の細
菌の菌株が生育するプレートの典型的外観を示し
ている図面であつて、該プレートはβ−クラタマ
ーゼ活性を試験するPVA検定後の状態を示して
おり；第６図はバチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）Pen Ｐ遺伝子の一部を構成する
ヌクレオチドの図式である。本発明の一態様として、枯草菌（B.subtilis）
にとつて生来のものでないあらかじめ決められた
蛋白質が枯草菌の形質発現によつて生産される。
プラスミドが導入されている枯草菌（B.subtilis）
の菌株を生育させるに適した生育倍地および条件
が与えられる。上記プラスミドは上記菌株におい
て複製でき、あらかじめ決められた蛋白質のため
の遺伝子を有している。この遺伝子はオペレータ
ー、プロモーターおよびリボゾーム結合位塩基配
列の制御下におかれるようにプラスミド中に位置
付けられ、方向付けられている。この蛋白質は宿
主菌株によつて分泌される輸送機構の制御下にも
おかれる。分泌の際、この蛋白質は生育倍地から
回収される。この発明の方法は転写及び翻訳過程を開始せし
めることが出来るヌクレオチド配列を有するクロ
ーニングベクター微生物を必要とする。オペレー
タ、プロモーターおよびリボゾーム結合位塩基配
列を提供するヌクレオチドは上記ベクター中に本
来存在するか、DNA組み換え技術を使用して独
立したDNA断片として挿入されるか、あるいは
重要な遺伝子を有する外来DNAの一部である。
少なくとも所望の蛋白生産物のための構造遺伝子
を有するであろう外来DNAをオペレーター、プ
ロモーターおよびリボゾーム結合位塩基配列の制
御下に転写し翻訳出来るようにクローニングベク
ター中に組み込む。挿入された外来DNAが正し
い翻訳を行えるように、挿入されたDNA中のヌ
クレオチドが正しい読み取り枠の中になければな
らない。さらに、クローニングベクターが、上記
オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結
合位塩基配列から正しい読み取り枠にある挿入さ
れた外来DNAへ読み取りと翻訳が確実に行なわ
れるに充分な数の、宿主細胞にとつて生来のヌク
レオチドを含有するのが望ましいかあるいは必要
である。この発明によれば、利用されるクローニングベ
クターは機能性輸送シグナルペプチド配列のため
のコドンからなるヌクレオチド配列からなる。輸
送シグナルペプチド配列は新しくつくられた蛋白
質上のアミノ酸の短いリーダー配列であるのがふ
つうである。輸送シグナルペプチド配列が作動す
るメカニズムはまだ完全には理解されていない
が、輸送蛋白質は細胞によつて排泄され、蛋白質
がつくられるにつれて細胞質から該つくられた蛋
白質をくつつけて引き出すものと考えられてい
る。輸送機能が輸送シグナルペプチド配列によつ
て遂行されると、該輸送配列は自然の過程によつ
て除去される。この発明によれば、外来DNAはこのDNAによ
つてコードされている蛋白質がシグナルコドンに
よつてコードされた輸送シグナルペプチド配列に
従つて輸送されるようにクローニングベクターに
挿入することができる。このようにクローン化し
た遺伝子生産物は望ましい場所に都合よく輸送さ
れ、そこから回収される。これはいくつかの有利
な点を有する。該場所は細胞の外なので、宿主細
胞を該遺伝子生産物の回収のために破壊する必要
はないので、遺伝子生産物を連続的に中断するこ
となく生産できる。又、細胞は非常に多くの蛋白
質を含有するのでクローン化した遺伝子の生産物
を排出する能力があると該生産物の単離および精
製が非常に簡単になる。結局、クローニングした
遺伝子の生産物は特に高いレベルで生産される場
合宿主細胞にとつて有害であるので、クローン化
した遺伝子の生産物を細胞膜の外から回収する能
力とはしばしば細胞を害さないという意義を有
し、もし回収能力がないと、細胞は防衛的酵素を
生産して遺伝子生産物を分解するであろう。外来DNAがクローニングベクターに挿入され
るべき正確な位置は輸送シグナルペプチド配列機
能が働くかにかかつている。いくつかの場合、輸
送シグナルペプチド配列は細胞の遺伝子自体の一
部として外来DNAのすぐ前に位置するかプラス
ミドにすでに存在するであろう。上記シグナル配
列自体は外来DNAの読み取り翻訳のために必要
なヌクレオチドの配列からなる。一方、輸送シグ
ナルペプチド配列が外来DNAのすぐ前に位置し
てはならない場合もある。そのような場合は開始
部位（外来のコドンによりコードされている）に
さらにいくつかのアミノ酸を有する所望のペプチ
ド配列を生成して必要な読み取り機能を提供する
必要がある。下記例はこの発明が使用できる他の特定例を説
明するものであつてこの発明の範囲を限定しよう
とするものではない。例１宿主微生物にとつて生来のものでない導入され
たあらかじめ決められた蛋白質を生産するため
のプラスミドの形成宿主微生物にとつて生来のものでないあらかじ
め決められた蛋白質を生産するためのプラスミド
を提供するために、バチルス・リケニフオルミス
（B.licheniformis）β−ラクタマーゼ遺伝子を有
するプラスミドベクターをつくり、枯草菌（B.
subtilis）および大腸菌（E.coli）の両方において
複製された。上記プラスミドはβ−ラクタマーゼ
遺伝子を有する3.5Kb（キロベース（Kirobase））
EcoR−Sst断片を精製し、これを大腸菌（E.
coli）プラスミドpOP1Δ6（Gelfand et al.、proc.
the Nat.Acad.Sci.USA（1978）75、5869−5873）
の複製機能を有する2.1Kb EcoR−Sst断片
と結合させることによつて形成された。適当な大
腸菌（E.coli）CS412菌体（C600rｋ⁻ｍｋ^＋Pr誘
導菌体）をこれで形質転換させ、形質発現のため
に適当な生育時間（90分）後に、Ap−耐性形質
転換株が得られた。３つのクローンからのプラス
ミドが得られた。pOG2110と断定されたプラス
ミドについてさらに特性をしらべた。第４図は
pOG2110において予期されかつ観察される限定
部位の位置を詳述するものである。枯草菌におい
てpOG2110を複製させるために、二機能レプリ
コンはpOG2110および枯草菌プラスミド
pOG1196を使用して形成された。pOG1196の形
成は第４図に総括されている。プラスミドpC194（Cm^R）およびpUB110（Km^R）
の全配列を有するキメラ性プラスミド（pCS832）
は、最初pC194の２つのMbo断片をBam Ｈ
切断pUB110と結合させることによつてつくら
れた。得られたプラスミドはpC194からのCm遺
伝子およびpUB110からKm（Nm）遺伝子を有し
ている。このプラスミドの大きさは7.5Kbであ
る。自然欠失突然変異体（プラスミドpCS1006）
はサブクローンのうちの１つから得られた。これ
はpC194において生じたHpa部位を失つてお
り、pC194複製域（Chang and Cohen、Molec.
Gen.Genet.、（1979）168、111〜115）に位置し
ていることが知られている。これはまだpUB110
の複製機能および２つのレジスタンスマーカーを
保持している。pCS1006の最大のHpa断片
（3.6Kb）を再循環させることによりプラスミド
pOG1196が得られた。このプラスミドはCm−耐
性のみを提供し、プラスミドpUB110からの複製
機能を有している。pOG1196の地図は第４図に
示されている。大腸菌プラスミドpOG2110および枯草菌プラ
スミドpOG1196は各々２つおよび３つのPvu部
位を有していた。等量のPvu切断pOG2110およ
びpOG1196プラスミドDNAを結合させ大腸菌
（E.coli）菌株CS412を形質転換させるのに使用し
た。Cm−耐性クローンを選択した。選択された
クローンはすべてAp−耐性でもあつた。Cm−耐
性Ap−耐性形質転換株の１つから単離された複
合プラスミドpOG2165をさらに研究した。この
7.5Kbプラスミドの地図は第４図に示されてい
る。プラスミドpOG2165は大腸菌と枯草菌の両
方において複製し、そのいずれの宿主にもCm−
およびAp−耐性を与える。プラスミドpOG2165を有する枯草菌および大
腸菌はバチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）β−ラクタマーゼ酵素の生産の
結果としてアンピシリンに耐性なのである。これ
はシエラツト（Sherratt）およびコーリング
（Colling）によつて開発されたPVAプレート検
定によつて示すことができる（参考文献９参照）。
そのような検定から得られた陽性の結果は第５図
に示されている。 pOG2165が枯草菌BD224中で増殖する場合、
結合した膜および分泌型の外来β−ラクタマーゼ
が合成される。この菌株により生産される量は使
用された生育条件に依存して変化する。
pOG2165は又枯草菌の菌株QB127（Kunst et al、
Bio.Chemie.（1974）56 1481−1490）中でも増殖
できる。QB127はレバンスクラーゼ
（levansucrase）、α−アミラーゼおよび細胞外蛋
白分解酵素のようないくつかのエキソエンチーム
を過剰生産せしめるsacU^h変異した菌株である
QB127（pOG2165）の培養物中に検出されるβ−
ラクタマーゼのレベルは同一条件下にBD224
（pOG2165）において検出されるβ−ラクタマー
ゼのレベルと同じ程度である。二機能プラスミドpOG2165自体は制限酵素Sst
、Hind、stおよびBglに対して特異的部
位を有する。DNAをBglおよびPst部位に挿
入するとバチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）β−ラクタマーゼ遺伝子を失活
させ、挿入物を担持しているクローンを同定する
ための確認容易な表現型を提供する。挿入されるべきDNA配列の正確の読み取り枠
が既知の場合はBgl部位にクローンすることに
よりβ−ラクタマーゼエキソエンチームの最初の
71個のアミノ酸残基およびリーダー配列を有する
融合蛋白質をつくり出すことができる。この方法
でつくられた融合蛋白質はアミノ末端にあるリー
ダー配列の存在によりバチルス・リケニフオルミ
ス（Bacillus licheniformis）菌体から分泌され
る。これらの点からpOG2165は外来遺伝子のク
ローニングおよび有効な形質発現ならびにそれに
続く枯草菌および大腸菌中の遺伝子生産物の分泌
のために有用なベクターである。一方、挿入されるべきDNA配列の正確な読み
取り枠が既知であつて、挿入がPst部位で行な
われる場合は、融合蛋白質は宿主微生物中に蓄積
するようにつくられる。Pst確認部位はシグナ
ルペプチドをコードしているヌクレオチド配列の
開始部分に位置しているので、外来遺伝子配列に
接する以前に該ヌクレオチド配列の一部分のみが
転写される。上記融合蛋白質が形質発現されて
も、上記シグナルペプチドのこの部分は通常のシ
グナルペプチドの分泌機能を提供するのには不充
分である。その結果としてPst部位に挿入され
た遺伝子の生産物は宿主微生物中に蓄積する。バチルス・リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis） Pen Ｐ遺伝子からなるヌクレ
オチド配列の一部が第６図に図式化されている。
β−ラクタマーゼプロモーター域はヌクレオチド
１および２２１oneとの間に位置するが、正確な
位置は未知である。シグナルペプチドを構成する
アミノ酸をコードするヌクレオチドはヌクレオチ
ド２２２で開始し、ヌクレオチド３２３で終了す
る。その結果、シグナルペプチドは34個のアミノ
酸からなる。Pst確認部位はヌクレオチド２５
９と２６４の間、すなわちシグナルペプチド鎖の
アミノ酸１３ないし１５にある。外来DNAをこ
のPst部位に挿入すると外来DNA生産物および
上記シグナルペプチド鎖の最初の14個のアミノ酸
から構成される融合蛋白質が形成されよう。その
ような融合蛋白質は形質発現されても細胞膜を通
過して輸送されないであろう。うまく分泌させる
にはシグナルペプチド全体あるいはシグナルペプ
チド鎖の少なくとも最初の26個のアミノ酸残基と
融合させる必要がある。例２バチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）は分泌型（エキソエンチーム）
として大量のβ−ラクタマーゼを生産する。この
蛋白質の分泌は細胞膜と単層の細胞膜を通過して
蛋白質を輸送するのを促進するアミノ酸リーダー
配列との間の相互作用の結果であると信じられて
いる。β−ラクタマーゼ遺伝子をクローン化し、
枯草菌中で複製できるプラスミドに挿入された。
これらのプラスミドを次いで枯草菌（B.subtilis）
宿主に入れて形質転換し、β−ラクタマーゼと分
泌させた。該分泌はまず枯草菌にとつての外来遺
伝子に形質発現させ枯草菌菌体から培地または生
育培地へ遺伝子生産物を輸送させることからな
る。バチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）菌株からのβ−ラクタマーゼ遺
伝子をクローンするために、バチルス・リケニフ
オルミス（B.licheniformis）菌株749／Ｃから全
染色体DNAを単離しEcoR制限エンドヌクレア
ーゼにより切断した。Marmurの方法（J.of
Molec.Biol.（1961）３、208−18）によつてバチ
ルス・リケニフオルミス（B.licheniformis）
749／Ｃから染色体DNAを調製した。大腸菌（E.
coli）プラスミドpSC101をKupersztochおよび
Helinski（Biochem.Biophys.Res.Commun.
（1973）54、1451−59）の菌体溶解澄明液をつく
る工程（cleared lysate procedure）により菌体
から単離した。3μgの染色体DNAおよび2μgの
pSC101DNAをエンドヌクレアーゼEcoRで切
断し、Hershfield、et al.proc.Natl.Acad.Sci.
USA（1974）71、3455−59に記載されている方法
でT4DNAリガーゼで結合し、大腸菌（E.coli）
菌株CS412（C600のｒｋ⁻ｍｋ^＋Prｏ⁻誘導体）の適当
な細胞にCohen、et al.Proc.Natl.Acad.Sci.、
USA（1972）69、2110−14の方法によつて組み込
まれた。 10μg／mlのアンピシリンに耐性の形質転換体
を選択し、組み換えプラスミドpTB2を有する上
記形質転換体の１つをさらに研究した。プラスミ
ドpTB2はpSC101ベクター上に4.2Kb（キロベー
ス対）EcoR断片を有している。このプラスミ
ドは宿主にテトラサイクリン（pSC101上のマー
カー）およびアンピシリン耐性を与え、培地中の
アンピシリンを分解する機能的酵素としてのβ−
ラクタマーゼ遺伝子生産物をつくることが示され
る。 β−ラクタマーゼ遺伝子は上記4.2キロベース
対のEcoR断片上にある。種々の制限酵素およ
び遺伝子クローニングを使用してこの断片を分析
すると、第１図において部分的に地図として示さ
れているようなβ−ラクタマーゼのための遺伝子
の構造が導かれてくる。バチラス・リケニフオル
ミス（B.licheniformis）菌株749／Ｃから得られ
るβ−ラクタマーゼの主たる配列はすでに決定さ
れている（R.J.Meadway、Ph.D.、エジンバラ大
学論文）。既知アミノ酸配列から、Gly−Pro（116
−117の位置）配列がヌクレオチド配列GGN−
CCNに対応し、これはエンドヌクレアーゼSau96
（GGNCC）のための確認配列である。同様
に、Trp−Pro（222−223の位置）配列はヌクレオ
チドコドンTGG−CCNによつてコードされ、該
コドン内に中央のテトラヌクレオチド配列GGCC
が認められ、エンドヌクレアーゼHae
（Roberts，DNA Insertion Elements、Plasm
ds、and Episomes、1977、Bukhari、Shapiro
and Adhya、Cold Spring Harbor Lad、p757）
によつて開裂される。供給者（マサチユーセツツ州01915、ビバーリ
イのニユーイングランド・バイオラブズ・インコ
ーポレーテツド（New England Biolads、Inc.）
1978カタログ）によつて特定されている条件を使
用して第２図に示されているよな数々のエンドヌ
クレアーゼによつて上記4.2Kbクローン化断片が
分析された。切断されたDNAをSharp、et al.
Biochemistry（1973）12、3055−63によつて記載
されているようにアガロースゲル上で分析し、ア
クリルアミドゲル（Maxam and Gillert、Natl.
Acad.Sci.、USA（1973）73、3942−46）の上で
分析した。地図化するためのデータは第２図にま
とめてある。Sau96部位およびHae部位は完
全なβ−ラクタマーゼ遺伝子配列を含有する
2.3Kb Pvu断片に局在していた。これら２つ
の部位はヌクレオチド320個離れており、これは
上記蛋白質配列データにおいてアミノ酸106個離
れているのと一致する。 β−ラクタマーゼ遺伝子を含むヌクレオチド配
列を固定後、該遺伝子を種々のバチルス
（Bacillus）プラスミドおよび枯草菌（B.
subtilis）−大腸菌（E.coli）融合プラスミドを使
用して枯草菌に導入した。プラスミドはpUB110
およびpC221誘導プラスミドであつた。この組み
換えプラスミドを有する上記枯草菌株は、アンピ
シリンに耐性となるばかりでなくPVAプレート
上でのβ−ラクタマーゼ反応が陽性である。（第
３図参照）さらに、β−ラクタマーゼ活性は菌体
をとり除いた後も培養物中に検出された。この活
性は、枯草菌の外来遺伝子がうまく形質発現した
ばかりでなく細胞膜を通して蛋白質が培養物すな
わち成育培地中にうまく輸送されたことを示して
いる。 β−ラクタマーゼ遺伝子を含むEco Ｒ断片
を大腸菌（E.coli）について上述した方法を使用
して枯草菌プラスミドベクターpUB110
（Gryczan and Dubnau、Proc.Natl.Acad.Sci.、
U.S.A.、（1978）75、1428−1432）およびpC221
（Ehrlich、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA（1977）
74、1680−82）の各EcoR部位にクローンした。
同様に、β−ラクタマーゼ遺伝子を含む2.3Kb
Pva断片はPva部位およびTac部位におい
てpUB110にクローンされた。結合DNA調製物（ligated DNA
preparations）を使用してChangおよびCohen、
Molec.Gen.Genet.、（1979）168、111−115の方
法（参考文献７参照）によつて枯草菌菌株
BD224（recE4、trpC2、thr5）を形質転換した。
継代プレート上でアンピシリンに耐性の形質転換
株を選択し試験した。β−ラクタマーゼの生産は
２つの方法によつて検出される。１つはSherratt
およびCollins（J.Gen.Microbiol.（1973）76、217
−230）によつて開発された感受性プレート検定
であり、他はRossおよびＯ Callaghan（Meth.in
Enzymology、（1975）43 6.9〜85）によつて記
載されているヨードメトリツク検定である。アン
ピシリンに耐性の枯草菌クローンは上記２つの方
法に陽性の結果を与えた。さらに、ヌクレオチド
−ラクタマーゼ活性も菌体を除去した後の培地に
検出された。このことは、β−ラクタマーゼが生
産されただけでなく枯草菌から排出されたことを
示す。外来遺伝子を枯草菌内にクローニングし、該遺
伝子に細胞内蛋白質として機能的形質発現をさせ
ることはKeggins Proc.Natl.Acad.Sci.USA
（1978）75、1423−1427にすでに示されている。
しかし、この研究において、クローンされた遺伝
子は通常野性型枯草菌（Wild type B.subtilis）
の細胞内に存在する酵素のためのコードを有する
遺伝子であつて、枯草菌にとつて生来のものでな
い遺伝子をうまく形質発現させ、これらの遺伝子
の生産物をうまく分泌させることについては示さ
れていない。この例によつて示されたβ−ラクタマーゼ遺伝
子についての研究は新しい機能、つまりβ−ラク
タマーゼ生産機能が遺伝子クローニング技術によ
つて枯草菌に導入できることを初めて示したもの
である。さらに、この例は外来遺伝子生産物を枯
草菌細胞膜の障壁を通して外来蛋白質（エキソプ
ロテイン）として分泌させることができることを
初めて示したものである。市販されている有用な
生産物であるβ−ラクタマーゼはこの酵素を他の
手段では生産できない菌株によつて生産される。例３例２に記載されているバチルス・リケニフオル
ミス（B.licheniformis）β−ラクタマーゼ遺伝
子は、大腸菌（E.coli）において複製され得るプ
ラスミドにも挿入した。これらのプラスミドを例
２において枯草菌について記載したと同一の方法
を使用して大腸菌宿主に入れて形質転換した。こ
れらのプラスミドを有する大腸菌菌体は、バチル
ス・リケニフオルミス（B.licheniformis）β−
ラクタマーゼ酵素生産の結果としてアンピシリン
に対して耐性である。これはSherrattおよび
Collinsによつて開発されたPVAプレート検定
（参考文献９参照）によつて示される。バチルス・リケニフオルミスβ−ラクタマーゼ
遺伝子を有するプラスミドが大腸菌内で増殖する
場合、該β−ラクタマーゼの分泌型は枯草菌にお
けるように倍地に輸送されない。大腸菌は細菌細
胞膜を囲む細胞壁を有するので外来蛋白生産物は
細胞膜と細胞壁を隔離しているペリプラズミツク
間隙（periplasmic space）に輸送される。β−
ラクタマーゼエキソエンザイムは原形質の周囲の
間隙に蓄積され、次いで適当な方法により回収さ
れる。例４バチルス・リケニフオルミス（B.
licheniformis）のβ−ラクタマーゼは、枯草菌
または大腸菌において機能することができるシグ
ナルペプチド配列の唯一の源ではない。上述の如
く、多くの蛋白質（特に成熟核において）は細胞
膜を通して輸送される。“シグナル領域
（region）”の正確なアミノ酸配列は実際には輸送
された種々の蛋白質によつて異なるが、これらの
シグナル域の折り重ねられた構造（Chou and
Fasman Ann.Rev.Biochem.（1978）47、251〜
276の法則によつて予測できる）は非常に類似し
ている。このように輸送シグナルペプチド配列に
対する要件は非バチルス（Bacillus）シグナルペ
プチド類によつて満たされ得るが、シグナル配列
をコードしているDNA断片はバチルスプロモー
ターおよびリボゾーム結合位塩基配列から下流の
方へ正しく位置している。所望の遺伝子生産物のために使用できる上記の
ような成熟核輸送シグナル配列の１つはインシユ
リンＢ鎖に先立つシグナルすなわち先駆体配列
（presequence）である。（種々のインシユリン鎖
Ａ、ＢおよびＣは単一のポリペフチドとしてつく
られ、組立てられ、内質網状組織で処理され、細
胞によつて排出される。）しかしながら、インシ
ユリン先駆体配列には、外来DNAのクローン化
した遺伝子と結合させるのに使用できるシグナル
ペプチド配列のすぐ後の便利な制限部位がない。
しかしながら、インシユリンのシグナル配列の最
後の５つのヌクレオチドはAGGCTであつてイン
シユリンＢ鎖自体の最初のヌクレオチドはＴであ
る。これらの６つのヌクオチドはいつしよになる
とAGGCTTであつて制限酵素Hindのため確認
配列であるAAGCTTとは１つのヌクレオチドが
異なる。この酵素は２つのAsの間を切断する。
外来DNAが同じ酵素Hindを使用あるいは半
Hind部位二機能性リンカー（half Hind
site bifunctional linlcer）を使用してクローン
化され、あるいは分離される場合、上記外来
DNAが挿入されると上記配列はもとにもどる。単一のヌクレオチドGxをＡに変換して米国特
許出願第133150号（Bahlによる）に記載された
方法によつてHind部位を提供することができ
る。この工程では変換すべきヌクレオチドを露出
し、変え、配列を再構成する。この変換によりシ
グナル配列の次のアミノ酸ないし最後のアミノ酸
が変化することはない。 DNA結合はHershfield et al.Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1974）71、3455−3459に記載されてい
るようにして達成できる。逆転写酵素はBahl et
al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1977）74、966−
970によつて記載されるようなDNAポリメラーゼ
として使用できる。形質転換はCohen et
alProc.Natl.Acad.Sci.USA（1973）70、3240−
3244によつて記載されるように進行する。例５上記例４に記載された方法は技術的に便利であ
るが、成熟核リーダー配列に関するものであつ
て、一般的開発にのみ有用であり得る。商業的立
場からのもつとも有用な研究が原核（細菌）宿主
についてなされているのがふつうである。ほんの
少しの上記の如きシグナル配列のみが原核系につ
いて知られているだけであるが、よく特性がしら
べられている１つの配列はTEMβ−ラクタマー
ゼからの配列である。（SutcliffeProc.Nath.
Acad.Sci USA（1976）75、3747−3741）この配
列は先駆体の配列プロセシングのための位置に何
ら便利な制限部位がない以外はクローニングされ
た遺伝子に付加するには理想的である。シグナル
配列にもつとも近い制限部位はMbo部位であ
つて16個の外来アミノ酸をクローン化遺伝子生産
物に結合させる。しかしながら、TTTGCTであるシグナル配列
の末端部分は上述の技術の１つによつて
TTTGATに変換できる。この後者の配列が
TEMβ−ラクタマーゼ遺伝子の最初のいくつか
の下記ヌクレオチドに沿つて読まれる場合、Bcl
（TGATCA）のための制限部位が存在する。
これにより最後のアミノ酸がAla（アラニン）か
らAsp（アスパラギン酸）に変わり、外来DNAの
最初の付加されたヌクレオチドが何であるかに依
つて１つの外来アミノ酸、すなわち、Glu（グル
タミン酸）またはHis（ヒスタミン酸）のどちら
かを上記遺伝子生産物に付加させる。ヌクレオチド鎖を上記の如く変化させるために
は、上記方法を使用して短い断片を合成する。上
記シグナル配列より上流に制限部位（Tha）が
あり、下流に制限部位Mboがある。さらに下
流にはtaq部位が存在する。Thaの制限条件は
Mc Connell et al.、Nucleic AcidRes（1978）
５、1729−1939に記載された条件に従い、Mbo
の制限条件はGelinas et al.、J.Mol.Biol
（1977）114：169〜179に記載された条件に従い、
Taqの制限条件はSato et al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA（1977）74；542〜546に記載され
た条件に従う。ただし、Mboに関しては、
DNAはデオキシアデノシンメチラーゼを欠く宿
主細胞GM119において調製されて各部位
（regions）のメチル化を避け、Mbo切断を防止
する。この後者の関係でMarinus and Morris、
Mutat.Res.（1975）28、15〜26を参照されたい。
別法としては、制限エンドヌクレアーゼSAU
3A、すなわちMboのイソチゾーム
（isoschizome）を使用してDNAを宿主から単離
することができる。したがつて、この発明は外来のクローニングさ
れた遺伝子生産物の制御された蓄積のための方法
およびベクターを提供することが理解されよう。
これらの生産物を宿主細胞の外に移動すなわち輸
送すれば生産物を最小の制限を伴なうに止めて回
収でき、宿主細胞または遺伝子生産物自体のいず
れかの分解あるいは破壊のおそれをなくす。本明細書の記載から、該明細書に記載した発明
の外に種々の変形が可能であることは当業者には
明らかであろう。そのような変形も本発明の範囲
内にあるものとみなされる。本発明に関する参考文献は次のとおりである。１ Bahl、C.P.、Wu、R.、Stawinsky、J.and
Narang、S.A.、Proc.Nat.Acad.Sci.、USA、
（1977）74、966−970. ２ Chang、A.and Cohen、S.、Molec Gen.
Genet．、（1979）168、111−115. ３ Chou、P.Y.and Fasman、G.D.、Ann.Rev.
Biochem.、（1978）、47、251−276. ４ Cohen、S.N.and Chang、A.C.Y.、Proc.
Nat.Acad.Sci.、USA、（1972）、69、2110−
2114. ５ Cohen、S.N.、Chang、A.C.Y.、Boyer、H.
W.and Helling、R.B.、Proc.Nat.Acad.Sci.、
USA、（1973）70、3240：3244. ６ Ehrlich、S.D.、Proc.Nat.Acad.Sci.、USA、
（1977）74、1680−1682. ７ Gelinas、R.E.、Myers、P.A.and Roberts、
R.J.、J.Molec.Biol.、（1977）114、169−179. ８ Gelfand、D.、Shepard、H.、O′Farrell、P.
and Polisky、B.、Proc.Nat.Acad.Sci.、
USA、（1978）75、5869−5873. ９ Grycazn、T.J.、and Dubnau、D.、Proc.
Nat.Acad.Sci.、USA、（1978）75、1428−
1432. 10 Hershfield、V.、Boyer、H.W.、
Yanofsky、C.、Lovett、M.A.and Helsinki、
D.R.、Proc.Nat.Acad.Sci.、USA、（1974）
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E.J.、Proc.Nat.Acad.Sci.、USA、（1978）75、
1423−1427. 12 Kunst、F.、Pascal、M.、Lepesant−
Kejzlarova、J.、Lepesant、J.、Billault、A.
and Dedonder、R.、Bio.Chemie.、（1974）
56、1481−1490. 13 Kupersztoch、Y.and Helinski、D.、
Biochem.Biophys.Res.Commun.、（1973）54、
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208−218. 16 Maxam.A.and Gilbert、W.、Proc.Nat.
Acad.Sci.、USA、（1973）73、3942−3946 17 McConnell、D.J.、Searcy、D.G.and
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５、1729−1739. 18 Meadway、R.J.Ph.D.Thesis、University
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Harris、J.I.、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、
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J.、Biochem.、（1973）12、3055−3063 23 Sherratt、D.J.and Collins、J.F.、J.Gen.
Microbiol.、（1973）、76、217−230. 24 Sutcliffe、J.G.、Proc.Nat.Acad.Sci.、
USA、（1978）75、3737−3741.

【図面の簡単な説明】

添付図面は下記説明から明らかであろう。第１図はバチルス・リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）から得られたβ−ラク
タマーゼのための遺伝子を有するDNA断片の部
分的構造地図を示す全体図であり；第２図は第１
図の断片中の多くのヌクレオチド配列と該断片が
コードする蛋白質中に存在するアミノ酸配列との
対応関係を示す全体図であり；第３図は組み換え
プラスミドを有する枯草菌（Bacillus subtilis）
菌株が生育するプレートの典型的外見を示す概略
図であり、該プレートはβ−ラクタマーゼ活性を
試験するPVA検定を行なつた後の状態を示して
いる。図中Ｂなる符号は枯草菌を示す。第４図は
大腸菌（E.coli）プラスミドPOG2110、枯草菌
（B.subtilis）プラスミドpOG1196および二機能性
プラスミドpOG2165の構造を説明する全体図で
あり；第５図は組み換えプラスミドを有する種々
の細菌の菌株が生育するプレートの典型的外観を
示している図面であつて、該プレートはβ−ラク
タマーゼ活性を試験するPVA検定後の状態を示
しており；第６図はバチルス・リケニフオルミス
（B.licheniformis）Pen Ｐ遺伝子の一部を構成す
るヌクレオチドの図式である。

Claims

【特許請求の範囲】１グラム陽性宿主菌において自律的複製を行う
ことができるクローニングベクターを作成し、該
ベクターはあらかじめ決められた蛋白質のための
遺伝子を有し、該あらかじめ決められた蛋白質は
上記宿主菌にとつて生来のものではなく、該遺伝
子は上記ベクターにおいてオペレーター、プロモ
ーターおよびリボゾーム結合位塩基配列によつて
制御されるように位置付けられかつ方向付けられ
ており、上記あらかじめ決められた蛋白質はバチ
ルス分泌リーダー配列の１部分からなる外来輸送
機構により制御されており、該輸送機構によつて
上記蛋白質が上記宿主菌から分泌され、そして該
ベクターを上記宿主菌に導入することからなる、
あらかじめ決められた蛋白質を形質発現により生
産することができるグラム陽性菌を製造する方
法。２自律的複製ができるベクターをつくる部分で
あつて、クローニングベクターがpC221、
pUB110、pC194、pUB112、pT127、pOG2165、
pOG2110、pCS1006、pOG1196、pCS832および
それらから誘導されたプラスミドからなる群から
選択されたプラスミドから得られる部分からなる
特許請求の範囲第１項記載の方法。３上記遺伝子または上記あらかじめ決められた
蛋白質がβ−ラクタマ−ゼオペレーター、プロモ
ーターおよびリボゾーム結合部位塩基配列によつ
て制御される特許請求の範囲第１項記載の方法。４あらかじめ決められた蛋白質が哺乳類の蛋白
質である特許請求の範囲第１項記載の方法。５あらかじめ決められた蛋白質が哺乳類のホル
モンである特許請求の範囲第１項記載の方法。６あらかじめ決められた蛋白質がβ−ラクタマ
ーゼである特許請求の範囲第１項記載の方法。７輸送機能がβ−ラクタマーゼ遺伝子の一部に
よつて提供される特許請求の範囲第１項記載の方
法。８輸送機能が真核生物のインシユリンシグナル
ペプチドの一部によつて提供される特許請求の範
囲第１項記載の方法。９上記クローニングベクターが制限酵素SStI、
Hind、PstIおよびBglに対して各々１つの特
異的部位を有する特許請求の範囲第１項記載の方
法。