JPH10512664A - 尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、固体支持体上に固定化された捕獲剤及び被検体に結合するための結合剤を用いる、液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するための方法及びキットを開示する。この結合剤は各々の捕獲剤に結合することができる尾部を有する。好ましくは、捕獲剤及び結合剤は相補的オリゴヌクレオチドであり、捕獲剤はミクロスポットの形態において固定化される。尾部及び捕獲剤を用いることは、結合剤への被検体の結合が表面におけるよりむしろ溶液中においておこることを許容し、この方法に関連した速度を改良する。加えて、アッセイの使用者は尾部を支持体に付着させることにより、全体の支持体と共に用いるためにいずれの適した結合剤をも適合させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイ 発明の分野 本発明は、尾部を有する結合剤、特にオリゴヌクレオチド尾部を有する結合剤 を用いる結合アッセイに関する。これらの結合アッセイは、液体サンプル中の被 検体の濃度を決定するのに有用である。 技術的背景 固体支持体上に固定化され、被検体に特異的な結合部位を有する結合剤に液体 サンプルを接触させ、結合した被検体を有する結合剤を分離し、そして被検体に より占有されている結合剤の結合部位のフラクションを表す値を測定することに より、液体サンプル中の薬又はホルモンのような被検体の濃度を測定することが 知られている。典型的には、その後、被検体の周知の濃度を含む一連の標準溶液 から得られる値に対して、被検体により占有された結合部位のフラクションを表 現する値を比較することによって、液体サンプル中の被検体の濃度が決定され得 る。 過去においては、いわゆる競合又は非競合法のいずれかを用いる標識された発 現試薬での逆適定により占有された結合部位のフラクションの測定が通常行われ ていた。 競合法においては、結合した被検体を有する結合剤は典型的にはその被検体の 標識されたものであるか又はその結合剤の空の結合部位を認識することができる 抗イディオタイプ抗体である標識された発現試薬を用いて、同時又は連続的のい ずれかで逆適定される。発 現剤は、濃度が測定されている被検体と結合剤上の結合部位について競合すると 表現され得る。標識された被検体で占有されるに至った結合部位のフラクション は、その後上述のように被検体の濃度に関連し得る。 非競合法においては、結合した被検体を有する結合剤は、結合した被検体に、 又は結合剤上の占有された結合部位のいずれかに結合することができる標識され た発現剤で逆適定される。被検体により占有された結合部位のフラクションは、 その後標識された発現剤の存在を検出することにより測定され得、ちょうど競合 アッセイを用いるように、上述のように液体サンプル中の被検体の濃度に関連し 得る。 競合及び非競合法の両方において、発現剤は該発現剤が検出され得るようにマ ーカーで標識される。過去において種々のマーカー、例えば放射性同位体、酵素 、化学発光マーカー及び蛍光マーカーが用いられている。 イムノアッセイの分野において、競合アッセイは、バーソン及びヤロー（Bers on and Yalow）により説かれる、即ち“Methods in Investigative and Diagnos tic Endocrinology”(1973)111〜116 頁における設計原理に従って一般に行われ ている。バーソン及びヤローは、競合イムノアッセイの実行において、結合剤の 量がおおよそ30〜50％の低濃度の検出されるべき被検体に結合するのに用いられ る時に最大の感度が達成されることを提案した。非競合イムノアッセイにおいて 、液体サンプル中の100 ％に近い被検体に結合するのに十分な結合剤を用いて、 最大の感受性が達成されると一般的に考えられる。しかしながら、両方の場合に おいて、これらの広く受け入れられている指針に従って設計されたイムノアッセ イは、知られているサンプルの量並びに正確に知られて、もしくは一定であるこ とが知られて用いられる結合剤の量を要求する。 国際特許出願WO84／01031 号において、液体サンプル中の被検体の濃度は、被 検体に特異的な結合部位を有する少量の結合剤に、液体サンプルを接触させるこ とにより測定され得ることを私は開示した。この“周囲の被検体(ambient analy te)”法において、結合剤の量が液体サンプル中の被検体の濃度に不十分な影響 しか与えない程度の少量であるなら、被検体により占有される結合剤上の結合部 位のフラクションがサンプルの量と効果的に無関係である。 このアプローチは、EP304,202 において更に精密化される。これは、WO84／01 0131におけるアッセイ中の感度及び発現の容易さが、Ｖがサンプルの容量であり Ｋが被検体に対する結合剤のアフィニティー定数である、固体支持体上の小さな 領域（又は“ミクロスポット”）上に位置した0.1 Ｖ／Ｋより少ない量の結合剤 を用いることにより改良されることを開示する。両方のこれらの引用において、 被検体により占有された結合部位のフラクションは、上述のように競合又は非競 合技術のいずれかを用いて測定される。 発明の概要 アッセイをより迅速かつ容易に行うことができる増加された速度を有する結合 アッセイを開発することの絶え間ない必要性がある。加えて、アッセイの使用者 が異なる群の被検体を検出するのに容易に適合させられ得る結合アッセイを提供 することが要求されるであろう。 従って、第１の態様において、本発明は液体サンプル中の被検体の濃度を決定 する方法であって、 （ａ）固体支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の 捕獲剤が、供された結合剤に特異的に結合することが できることを特徴とするステップと、 （ｂ）１以上の結合剤に前記液体サンプルを接触させるステップであって、各 々の結合剤が、結合部位のフラクションが被検体により占有されるに至るように 供された前記被検体に特異的な前記結合部位と、対応する捕獲剤に結合するのに 適合した尾部と、を有することを特徴とするステップと、 （ｃ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に結合するに至るように、ステップ （ｂ）と同時又は連続的のいずれかで、前記固定化された捕獲剤に前記液体サン プルを接触させるステップと、 （ｄ）被検体により占有された結合剤の前記結合部位の前記フラクションを測 定して前記サンプル中の前記被検体の濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法を提供する。 従って、本発明は、被検体の結合が固体基体の表面よりむしろ液相において起 こることを特徴とするアッセイを提供する。これは被検体と結合剤との反応の速 度を増加させる。 これにより、１つの実施形態において、結合及び捕獲剤に液体サンプルを同時 に接触させることにより、例えばただ一つの反応容器を用いて、ただ一つのステ ップにおいてアッセイを行うことが可能になる。あるいは特に液体が血清又は血 液であり、非特異的結合が誤差の重要な原因である場合に、結合剤及び捕獲剤の 連続的な接触が好ましい。これらの場合において、結合剤は第１の容器において 液体サンプルに最初に接触され得、その後サンプルは、捕獲剤が結合剤に結合し て固体支持体に結合するのを許容する第２の容器に移される。 第２の態様において、本発明は、支持体上に１以上の結合剤を固定化する方法 であって、各々の結合剤が、供された被検体に特異的 な結合部位及び捕獲剤に結合するのに適合した尾部を有し、 （ａ）支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の捕獲 剤が、供された結合剤の尾部に結合することができることを特徴とするステップ と、 （ｂ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に該捕獲剤の尾部を通して特異的に 結合するに至るように、支持体上に固定化された前記捕獲剤を有する前記支持体 に前記結合剤を接触させるステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する 。 上述の方法は、結合剤を支持体上に固定化された捕獲剤にさらす前に、前記結 合剤に前記尾部を付着させるステップを更に含むことができる。 このように異なる群の被検体を測定すること、及び結合剤がその尾部によって 個々に結合することができる、支持体上に固定化された捕獲剤を有する一般的な 前記支持体と共に適合された結合剤を用いることにおいて、アッセイの使用者が 使用のために結合剤を適合させることが可能である。 本発明のこの態様において、結合剤が捕獲剤に結合されるに至った後に、液体 サンプルに支持体をさらすことによりアッセイが行われる。 いずれの態様においても、本発明は、結合剤がその尾部を通して基体に固定化 された捕獲剤に間接的に結合することを特徴とするアッセイを提供する。 好ましくは、前記捕獲剤は、前記結合剤の尾部を含む相補的配列にハイブリッ ド形成し得るオリゴヌクレオチド配列である。捕獲剤又は結合剤の尾として作用 するオリゴヌクレオチドは、アッセイ中に用いられる厳重な条件下において強く かつ特異的なハイブリッド形成を供するのに十分に長い。典型的には、少なくと も約８又は９ ヌクレオチドの長さの相補性オリゴヌクレオチドが用いられる。好ましい実施形 態において、オリゴヌクレオチドは好ましくは８〜30塩基、更に好ましくは16〜 20塩基の長さである。しかしながら極めて長いポリヌクレオチドを用いることは 好ましくない。というのは、これらは異なる捕獲剤に結合する特異性の消滅又は 自己ハイブリッド形成を導き、ヘアピンループ（二重鎖領域）を形成し得るから である。しかしながらアッセイ条件のセットに適したオリゴヌクレオチドの長さ 及び配列は、当業者により容易に決定され得る。 都合よくは、結合剤は被検体に特異的な結合部位を有する抗体である。従って 、支持体上の捕獲剤が液相の結合剤にさらされた時、結合剤は固体支持体に結合 するに至る。あるいは、被検体が核酸配列である場合、結合剤はオリゴヌクレオ チドであり得る。このように、本実施形態において、結合剤は、被検体とハイブ リッド形成することができる第１の配列と尾部として作用する第２の配列とを有 する。 好ましくは、液体サンプルの容量を知る必要がないように、WO84／01031 又は EP304,202 に開示されるアッセイに従って少量の結合剤が用いられる。このよう に液体サンプル中の被検体の周囲の濃度に重要な影響を与えないように、結合剤 の量は十分に小さいべきである。典型的には、５％未満の被検体に結合する量の 結合剤を用いることが好ましい。しかしながら、例えば２％又は１％の被検体に 結合する、より少量の結合剤を用いることは、更に、被検体の周囲の濃度を乱す ことを削減し、被検体濃度を決定することにおいて誤差を最小化することを助け る。 0.1 Ｖ／Ｋモル未満の結合剤を用いてEP304,202 に従ってアッセイを行う場合 、結合剤に対する被検体の結合のアフィニィー定数（Ｋ）は、標準的な実施に従 って測定される。これは、どれだけの量 の結合剤が0.1 Ｖ／Ｋモルを構成するかを決定するのに用いられるアフィニティ ー定数が、アッセイにおいて用いられる条件（例えば反応物、インキュベーショ ンの時間、pH、温度等）下で得られる値であることを意味する。 好ましくは各々の捕獲剤は、実質的に全ての供された結合剤に結合するために 過剰に用いられる。これはアッセイの感度を最大化して、そして用いられる結合 剤の量が知られる又は一定であることが知られる必要がある時、アッセイの使用 者はアッセイにおいて用いられる実質的に全ての結合剤が支持体上のその捕獲剤 に結合するに至ることを確信することができることを確実にする。 好ましくは、捕獲剤の分子は、例えばミクロスポットとして、分離した位置に おいて支持体上に固定化される。これは、支持体上の一連の位置における複数の 異なる捕獲剤を用いて、複数の異なる被検体が同時に測定されることを許容する 。捕獲剤がミクロスポットとして固定化される場合、アッセイの感度は、高密度 で捕獲剤を固定化することが改良され得、これによりシグナル対ノズル比が改良 される（例えば我々の同時係属出願PCT ／GB94／02814 を参照のこと）。0.1 〜 1.0 mlの次数のサンプル容量を仮定すると、ミクロスポットは好ましくは、１mm² 未満の領域と1000〜100000分子／μｍ²の結合剤の最終表面密度とを有する。 あるいは、供された捕獲剤は、被検体の濃度の一連の測定が同時に行われ得る ように、複数の位置において支持体上に固定化され得る。 好ましくは、被検体により占有される結合部位のフラクションは、上述のよう な競合及び／又は非競合法において発現剤を用いて検出される。発現剤は、結合 剤の占有された又は未占有の結合部位に、又は結合した被検体に結合することが でき、結合した発現剤が検 出されることを可能にするために標識される。好ましくは発現剤は標識された抗 体である。 マーカーは、放射性同位体、酵素、化学発光マーカー又は蛍光マーカーであり 得る。蛍光染料マーカーを用いることが特に好ましい。というのは蛍光染料は検 出のための適切な色の範囲（励起及び発光波長）の蛍光を供するように選択され 得るからである。蛍光染料は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン及びテキ サスレッド(Texas Red)を含む。長期の蛍光期間を有する蛍光染料分子が用いら れ得、これにより、バックグラウンドの蛍光が減衰した後時間分解蛍光が蛍光シ グナルの長さを測定するのに用いられることを許容する。蛍光もしくは他のマー カーを含む、又は表面上にそれらを有するラテックス(Latex)ミクロスフィアー も本文脈において用いられ得る。マーカーからのシグナルは、レーザー走査共焦 顕微鏡を用いて測定され得る。 あるいは化学発光標識のような他の高度に特異的な活性標識を用いることもで きる。化学発光標識の場合、結合剤又は発現剤をマークするのに用いられる異な る化学発光標識からのシグナルは、例えばチャージカップルド（charge-coupled ）装置(CCD)を用いて同時に検出され得る。 結合剤（又はその部分）は、例えば発蛍光団を用いて便利に標識され得る。EP 271,974 に説かれる方法に従うと、これはアッセイの使用者が結合剤の量を知る こと又はそれが一定であることを知ることが必要でないことを意味する。これは 、結合剤からのシグナル及び被検体により占有される結合剤の結合部位のフラク ションを示すシグナルの比率が、被検体により占有される結合剤の部位のフラク ションに依存するが全量の存在する結合剤には依存しないからである。 あるいは、アッセイの使用者がサンプルの容量を知っているなら、アッセイが 周囲の被検体条件下で行われないようにより大量の結合剤を用いることができる 。これは、被検体の濃度が、発現剤上の１つの標識を用いて、そして結合剤の量 が一定であることを知るかもしくはその量が知られているような第２のマーカー で結合剤を標識するかのいずれかで決定されることを許容する。 （我々の同時係属出願PCT ／GB94／02813 に開示される）このアプローチの変 形において、２つの標識された発現剤、即ち結合剤の未占有の結合部位に特異的 に結合することができる第１の発現剤、並びに占有された結合部位もしくは結合 した被検体に結合することができる第２の発現剤を用いることができる。このよ うに、いずれのマーカーからのシグナルも被検体により占有された結合部位のフ ラクションを表し、一方シグナルの総計は用いられた結合剤の全量を表す。 この方法は、固定化された結合剤の量における変化が直ちに補正され得るので 、結合剤の一定量が用いられることを知る必要性を避けることもできる。これら の環境下において、サンプル容量Ｖは知られているか、又は一定であるかのいず れかでなければならない。 これは、２つの標識された発現剤がサンプル中の被検体の濃度にいかに関係する かを示す以下の式から判断され得る。 占有された結合剤結合部位に対して向けられた発現剤をマークする標識により 発せられるシグナルをSoとし、 未占有の結合剤結合部位に対して向けられた発現剤をマークする標識により発 せられるシグナルをSuとし、 占有された又は未占有の部位に対する各々のシグナルに関する定数を各々ε_o 及びε_uとし、 Ｋ＝被検体と結合剤との間の反応を支配する有効平衡定数とする 。 そして、サンプル中の被検体濃度をＹとすると、 Ｙ＝（S_o／ε_o）〔ε_u／(KSu)＋１／Ｖ〕 Ｖが知られていると仮定すると、この等式は２つの未知の定数、So及びε_u／ Ｋを含む。一連の周知の被検体濃度についてシグナルSo及びSuを決定することに より、これらの定数は決定され得、未知の被検体濃度は、対応するSo及びSuの決 定から見積もられる。このようにこのアッセイは周知の被検体条件下で作業を行 う必要がない。 周囲の被検体条件下において、１／Ｖ項は無視することができ、So／Suは周囲 の被検体濃度に比例する。 第１のキットの態様において、本発明は、上述のような方法において、液体サ ンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するためのキットであって、該キットが 、 （ａ）固体基材に付着し、結合剤に特異的に結合することができる捕獲剤を複 数の位置に有する前記固体基材と、 （ｂ）１以上の結合剤であって、各々の結合剤が被検体に特異的な結合部位と 、１以上の捕獲剤に結合するのに適合した尾部と、を有することを特徴とする結 合剤と、 （ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合した被検体又は未占有 の結合剤結合部位に結合することができるマーカーを有する１以上の発現剤と、 を含むことを特徴とするキットを提供する。 第２のキットの態様において、本発明は、１以上の被検体の濃度を決定するた めのアッセイを適合させるためのキットであって、前記１以上の被検体が、 （ａ）各々が結合剤への付着のためである１以上の尾部と、 （ｂ）固体基材に付着され、尾部に特異的に結合することができる１以上の捕 獲剤を複数の位置に有する固体基材と、 を含み、アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることにより、前 記捕獲剤が上述のような方法において付着された固体基材と共に用いられ得る結 合剤を供することを特徴とするキットを提供する。 図面の記載 本発明の好ましい実施形態は、以下に説明される添付された概略図を参照する ことにより記載されるであろう： 図１は、捕獲剤が２つのミクロスポットにおいて固定化されている、２種類の 前記捕獲剤及び２種類の結合剤を用いて液体サンプル中の２つの被検体を検出す るためのアッセイを示す； 図２は、捕獲剤が結合剤に結合するに至っている図１のアッセイを示す； 図３は、第２の標識された抗体を用いて結合剤の占有率を決定する非競合法を 示す； 図４は、後述の実験的な例からのTSH 濃度に対してプロットされたシグナルの グラフを示す。 詳細な記載 図１〜３は、異なる被検体６，８に特異的な結合部位を有する２種類の結合剤 ２，４が用いられる結合アッセイを示す。各々の結合剤２，４はオリゴヌクレオ チド尾部12，16が供された抗体10，14を含む。オリゴヌクレオチド尾部は異なる ヌクレオチド配列を有し、その配列は、ミクロスポットの形態で固体支持体22上 に固定化された捕獲剤18，20の配列の１つに相補的である。この例において、オ リゴヌクレオチドは８ヌクレオチド長である。 このアッセイにおいて、サンプル中の２つの被検体６，８は、該被検体６，８ のフラクションが抗体10，14に結合するに至るように結合剤２，４にさらされる 。この反応は液相中でおこるので抗体10，14と被検体（抗原）６，８の間の反応 の速度は最適化される。 最初の抗体／被検体反応と同時又は連続的に、液体サンプル及び結合剤は、固 体支持体22上に固定化された捕獲剤18，20を有する前記固体支持体22にさらされ る。これは結合剤２，４のヌクレオチド配列12，16が支持体22上に固定化された 捕獲剤18，20の相補性配列に結合することを許容する。これを図２に示す。しか しながら、捕獲剤16，18は実質的に全ての結合剤10，14が支持体22に結合するこ とを確実にするため、一般的に過剰に用いられる。このように、図２及び３にお いて、捕獲剤28の１分子が未占有のものとして残る。 結合剤２，４の結合部位のフラクションは、その後慣用の逆適定技術を用いて 決定され得る。このように図３において標識された抗体24，26は、各々占有され た結合剤２，４の存在をマークするために、非競合技術において用いられる。抗 体24，26は、マーカー（非表示）で標識されるので、結合剤２，４の結合部位の フラクションが、その後決定され得る。次にこれは、例えば一連の周知の被検体 濃度の溶液を用いて得られた結果を参照することにより、液体サンプル中の被検 体の濃度が見い出されることを許容する。 図１〜３に示されるアッセイは、固体支持体22上に固定化された捕獲剤18，20 を有する同様の前記固体支持体22を用いて、被検体のいずれの対の濃度を測定す るのに適合され得る。これは、結合剤がミクロスフィアー18，20の１つに特異的 に結合するであろうように、被検体をオリゴヌクレオチド尾部12，16に結合させ るのに適した結合剤を提供することにより行われ得る。このように、アッセイの 使用者は、ミクロスポットの全部の配置と共に、用いるための結合剤を適合させ ることができるであろうことが考えられる。 実施例 試薬： １）Scottish Antibody Production Unit(SAPU)からのマウスIgG(モノクロー ナル抗TSH)。 ２）Sigma からのウサギIgG、ヤギ抗マウスIgG(全体の分子)及びヤギ抗ウサギ IgG(全体の分子)抗体。 ３）Molecular Probesからの0.1 μｍ径で黄色／緑色蛍光（ex 490：em 515nm ）のスルフェートフルオスフィアー（Sulfate Fluospheres)及び0.1 μｍ径で赤 色蛍光（ex 580：em 605nm）のスルフェートフルオスフィアー(Sulfate Fluosph eres)。 ４）Oswell DNA Serviceからのオリゴヌクレオチド： ａ）５′−ビオチン修飾を有するCACACACACACACACACA（ポリ−CA） ｂ）５′ホスホロチオエート修飾を有するGTGTGTGTGTGTGTGTGT（ポリ−GT） ｃ）５′−ビオチン修飾を有するGAGAGAGAGAGAGAGAGA（ポリ−GA） ｄ）５′−ホスホロチオエート修飾を有するCTCTCTCTCTCTCTCTCT（ポリ−CT） ５）Pierceからのスルホ− LC −SPDP｛スルホスクシニミジル６−〔３′−（ ２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド〕ヘキサノエート｝。 ６）Pharmacia からのPD10カラム及びセフアデックスＧ200（Sephadex G200） 。 ７）Sigma からのRIA グレードウシ血清アルブミン(BSA)、Tween20、アジ化ナ トリウム、無水オルトリン酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム 、EDTA及びTrizma。 ８）Vector Laboratories からのアビジンDX(Avidin DX)。 ９）Amiconからのセントリコン−30(Centricon−30)及びセントリプレップ−3 0(Centriprep−30)濃縮器。 10）NIH USA からの甲状腺刺激ホルモン(TSH)。 スルフェートフルオスフィアーへの抗マウスIgG 及び抗ウサギIgG 抗体の吸着 １）２％(10mg)の0.1 μｍ黄色／緑色フルオスフィアーの0.5ml分割量を、0.5 ml の0.1 Ｍリン酸緩衝液pH7.4 中に溶解された２mgのヤギ抗マウスIgG 抗体に 添加した。２％(10mg)の0.1 μｍ赤色フルオスフィアーの0.5ml 分割量を0.5ml の0.1 Ｍリン酸緩衝液pH7.4 中に溶解された２mgのヤギ抗ウサギIgG 抗体に添加 した。両方の標品を室温で一晩振とうした。 ２）この２つの標品を、MSE 高回転21超遠心機(MSE High-Spin21 Ultra-centr ifuge)において、８℃で10分間遠心した。 ３）各々のペレットを１％BSA を含むリン酸緩衝液２ml中に分散させ、室温で １時間振とうし、上述のように遠心した。 ４）各々のペレットを0.5 ％Tween20 を含むリン酸緩衝液２ml中に分散させ、 室温で30分間振とうし、上述のように遠心した。 ５）各々のペレットを２mlのリン酸緩衝液中に分散させ、上述のように遠心し た。 ６）各々のペレットを２mlのリン酸緩衝液中に分散させ、上述のように遠心し た。 ７）各々のペレットを0.1 ％アジ化ナトリウムを含む１％BSA の２ml中に分散 させ、４℃で保存した。 オリゴヌクレオチドへのマウスモノクローナルIgG 及びウサギIgG の接合 １）３mgのスルホ−LC−SPDPを１mlのPBS ／EDTA中に溶解された4.6mg のマウ ス抗TSH モノクローナル又はウサギIgG に添加して室温で30分間振とうした。 ２）この活性化された抗体をPD10カラムで未処理のSPDPから分離した。このサ ンプルをPBS ／EDTAで溶出して0.5ml フラクションを収集した。 ３）この活性化された抗体を含む第１のピークからのフラクションをプールし て、セントリコン−30濃縮器を用いておおよそ10μｌまで濃縮した。 ４）５′−ホスホロチオエート修飾されたポリ−GTオリゴヌクレオチド100nM を活性化されたマウスモノクローナルIgG 14.8nMに添加した。５′−ホスホロチ オネート修飾されたポリ−CTオリゴヌクレオチド58.3nMを活性化されたウサギIg G 8.7nM に添加した。両方の標品をPBS ／EDTAで１mlにして、室温で一晩振とう した。 ５）オリゴヌクレオチド接合マウスおよびウサギIgG 標品をセファデックスG2 00カラム(1.5×45cm)で未反応のオリゴヌクレオチドから分離した。このサンプ ルをPBS ／EDTAで溶出して２mlフラクションを収集した。 ６）オリゴヌクレオチド接合抗体を含む第１のピークからのフラクションをプ ールして、セントリプレップ−30濃縮器を用いておおよそ500 μｌに濃縮して４ ℃で保存した。 オリゴヌクレオチド接合抗体が、ミクロスポットとして固相上に配された相補 的オリゴヌクレオチドのみとハイブリッド形成するであろうことの論証 １）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイターウエル （Dynatech black Microfluor microtitre wells）を0.1 Ｍ重炭酸緩衝液pH8.5 中のアビジンDX 50 μｌで５μｇ／mlの濃度で室温で５分間コートした。 ２）0.01Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコートされたマイクロタイタ ーウェルを室温で１時間、200 μｌの１％BSA でブロックして、同じ緩衝液で再 び洗浄して乾燥させた。 ３）0.1 ％BSA 中で0.025nM ／mlの濃度の２つの５′−ビオチン修飾されたポ リ−CA及びポリ−GAオリゴヌクレオチドの各々の0.25μｌドロップレットを、ア ビジンコートされたマイクロタイターウェルの反対側に配し、湿った雰囲気下で 30分間、反応させた。その後、ドロップレットを吸収して、このマイクロタイタ ーウェルをリン酸緩衝液で洗浄した。 ４）ポリ−GT接合マウスモノクローナルIgG 及びポリ−CT接合ウサギIgG の各 々0.25μｇ／mlを含むTris−HCl アッセイ緩衝液の50μｌ分割量を対照マイクロ タイターウェル（かわりに未接合のマウス及びウサギIgG を含むアッセイ緩衝液 50μｌを対照ウェルに添加した）以外全てに添加し、湿った雰囲気下で１時間、 振とうして、0.05％Tween20 を含むリン酸緩衝液で洗浄した。 ５）0.3 μｇ／mlヤギ抗マウスIgG 抗体接合黄色／緑色フルオスフィアー及び 0.6 μｇ／mlヤギ抗ウサギIgG 抗体接合赤色フルオスフィアーを含むTris−HCl アッセイ緩衝液の200 μｌ分割量を全マイクロタイターウェルに添加し、室温で １時間振とうし、リン酸−Tween20 緩衝液で洗浄して、アルゴン／クリプトン(A rgon／Krypton)レーザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。結果 励起：488DF10 発光：525DF35 サンプル 黄色／緑色シグナル 対照 13.3 ±0.5 アビジン…Ｂ−ポリ−CA…ポリ−GT−マウス IgG ミクロスポット 100.9 ±10.9 アビジン…Ｂ−ポリ−GA…ポリ−CT−ウサギ IgG ミクロスポット 16.9 ±0.3 励起：568DF10 発光：585EFLPサンプル 赤色シグナル 対照 22.0 ±0.2 アビジン…Ｂ−ポリ−CA…ポリ−GT−マウス IgG ミクロスポット 24.0 ±0.4 アビジン…Ｂ−ポリ−GA…ポリ−CT−ウサギ IgG ミクロスポット 99.8 ±2.7結論 （１）ポリ−GTオリゴヌクレオチドで標識されたマウスIgG は、相補的ビオチ ン化ポリ−CAとのみハイブリッド形成し、同じマイクロタイターウェル上に配さ れた非相補的ビオチン化ポリ−GAオリゴヌクレオチドミクロスポットとはハイブ リッド形成しなかった。 （２）ポリ−CTオリゴヌクレオチドで標識されたウサギIgG は、相補的ビオチ ン化ポリ−GAとのみハイブリッド形成し、同じマイクロタイターウェル上に配さ れた非相補的ビオチン化ポリ−CAオリゴヌクレオチドミクロスポットとはハイブ リッド形成しなかった。 オリゴヌクレオチド標識された抗体ミクロスポットの抗原結合の論証 １）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイターウェルを0.1 Ｍ重炭 酸緩衝液pH8.5 中のアビジンDX 50 μｌで５μｇ／ml の濃度で室温で５分間、コートした。 ２）0.01Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコートされたマイクロタイタ ーウェルを室温で１時間、200 μｌの１％BSA でブロックして、同じ緩衝液で再 び洗浄して乾燥させた。 ３）0.1 ％BSA 中で0.025nM ／mlの濃度の５′−ビオチン修飾されたポリ−CA オリゴヌクレオチドの0.25ドロップレットをアビジンコートされた各々のマイク ロタイターウェル上に配し、湿った雰囲気下で30分間反応させた。その後、ドロ ップレットを吸引して、このマイクロタイターウェルをリン酸緩衝液で洗浄した 。 ４）ポリ−GT接合抗TSH マウスモノクローナルIgG 0.25μｇ／mlを含むTris− HCl アッセイ緩衝液の50μｌ分割量をこのマイクロタイターウェルに添加し、湿 った雰囲気下で１時間、振とうして、0.05％Tween20 を含むリン酸緩衝液で洗浄 した。 ５）Tris−HCl アッセイ緩衝液中のTSH 標準の200 μｌ分割量（0，0.1，0.3 及び1.0 μＵ／ml）を３回重複でウェルに添加し、室温で１時間インキュベート してリン酸−Tween20 緩衝液で洗浄した。 ６）50μｇ／ml抗TSH 発現抗体接合黄色／緑色スルフェートフルオスフィアー の200 μｌ分割量を全マイクロタイターウェルに添加し、室温で１時間振とうし 、リン酸−Tween20 緩衝液で洗浄して、アルゴン／クリプトンレーザーを備えた 共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。 結果及び結論 ポリ−GTオリゴヌクレオチド標識された抗TSH マウスモノクローナルIgG は、 それを、アビジンコートされたマイクロタイターウェルに結合したビオチン化さ れた相補的ポリーCAオリゴヌクレオチド を通して固相に配された結合抗体として用いた時、標準曲線の作成が成功したこ とにより証明されるように十分に機能することができた（図４を参照のこと）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月２６日 【補正内容】 請求の範囲 １．液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するための方法であって、 該方法が、 （ａ）固体支持体上に１以上の捕獲剤を固定化させるステップであって、各々 の捕獲剤が、供された結合剤に特異的に結合することができることを特徴とする ステップと、 （ｂ）１以上の結合剤に前記液体サンプルを接触させるステップであって、各 々の結合剤が、結合部位のフラクションが被検体により占有されるに至るような 供された前記被検体に特異的な結合部位を有し、そして対応する捕獲剤に結合す るのに適合した尾部を有することを特徴とするステップと、 （ｃ）前記ステップ（ｂ）と同時又は連続的のいずれかにおいて、前記結合剤 が該結合剤各々の捕獲剤に結合するに至るように、前記固定化された捕獲剤に前 記液体サンプルを接触させるステップと、 （ｄ）被検体により占有された供された結合剤の前記結合部位の前記フラクシ ョンを表す値を決定することにより、前記液体サンプル中の被検体の濃度を決定 するステップと、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブ リッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴 とする方法。 ２．支持体上に１以上の結合剤を固定化する方法であって、各々の結合剤が、 供された被検体に特異的な結合部位を有し、そして捕獲剤に結合するのに適合し た尾部を有し、前記方法が、 （ａ）支持体上に１以上の捕獲剤を固定化させるステップであって、各々の捕 獲剤が、供された結合剤の前記尾部に結合することが できることを特徴とするステップと、 （ｂ）前記結合剤が該結合剤の尾部を通して該結合剤各々の捕獲剤に特異的に 結合するに至るように、前記支持体上に固定化された前記捕獲剤を有する前記支 持体に前記結合剤を接触させるステップと、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブ リッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴 とする方法。 ３．前記方法が、前記支持体上に固定化された前記捕獲剤に前記結合剤をさら す前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステップを更に含むことを特徴とする 請求項２に記載の方法。 ４．前記オリゴヌクレオチドが８〜30塩基長であることを特徴とする請求項１ 〜３のいずれかに記載の方法。 ５．前記結合剤が、被検体に特異的な結合部位を有する抗体であることを特徴 とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 ６．前記結合剤が特異的である前記被検体の周辺濃度が大きく乱されないよう に、各々の結合剤の少量が用いられることを特徴とする先の請求項のいずれか一 に記載の方法。 ７．前記結合剤の少量が0.1 Ｖ／Ｋモル未満であり、ここでＶは、前記サンプ ルの容量であり、Ｋは、前記被検体が前記結合剤に結合することについての有効 アフィニティー定数であることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８．各々の捕獲剤が、実質的に全ての供された結合剤に結合するために、過剰 に用いられることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 ９．前記捕獲剤が、分離された位置で支持体上に固定化されることを特徴とす る先の請求項のいずれか一に記載の方法。 10．前記分離された位置がミクロスポット（microspots）であることを特徴と する請求項９に記載の方法。 11．供された被検体の濃度の一連の測定が同時に行われ得るように、供された 捕獲剤が、複数の位置において前記支持体上に固定化されることを特徴とする先 の請求項のいずれか一に記載の方法。 12．前記被検体により占有される結合部位のフラクションを表す値が、競合及 び／又は非競合法において発現剤を用いて決定され、前記発現剤がマーカーで標 識されることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 13．前記マーカーが蛍光又は化学発光マーカーであることを特徴とする請求項 12に記載の方法。 14．請求項１〜13のいずれか一に記載の方法において、液体サンプル中の１以 上の被検体の濃度を決定するためのキットであって、該キットが、 （ａ）固体支持体に付着され、供された結合剤に特異的に結合することができ る捕獲剤を複数の位置に有する前記固体支持体と、 （ｂ）１以上の結合剤であって、各々の結合剤が、被検体に特異的な結合部位 を有し、そして１以上の捕獲剤に結合するのに適合した尾部を有することを特徴 とする結合剤と、 （ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合した被検体又は未占有 の結合剤結合部位に結合することができるマーカーを有する１以上の発現剤と、 を含み前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブリ ッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴と するキット。 15．液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するためのアッセイ用のキ ットであって、該キットが、 （ａ）１以上の尾部であって、各々の尾部が結合剤への付着のためであること を特徴とする尾部と、 （ｂ）固体支持体に付着され、尾部に特異的に結合することができる１以上の 捕獲剤を複数の位置に有する前記固体支持体と、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブ リッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、前記アッ セイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることにより、請求項１〜13の いずれか一に記載の方法において、前記捕獲剤が付着された前記固体支持体と共 に用いられ得る結合剤を供することを特徴とするキット。 16．液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定することにおいて用いられ る固体支持体であって、前記支持体が、該支持体上に固定化された１以上の結合 剤を有し、各々の結合剤が、供された被検体に特異的な結合部位を有し、そして 尾部を有し、前記結合剤が、捕獲剤により前記支持体に特異的に付着され、前記 捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブリッド形成さ れる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする固体支持体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するための方法であって、 （ａ）固体支持体上に１以上の捕獲剤を固定化させるステップであって、各々 の捕獲剤が、供された結合剤に特異的に結合することができることを特徴とする ステップと、 （ｂ）１以上の結合剤に前記液体サンプルを接触させるステップであって、各 々の結合剤が、結合部位のフラクションが被検体により占有されるに至るような 供された前記被検体に特異的な結合部位と、対応する捕獲剤に結合するのに適合 した尾部と、を有することを特徴とするステップと、 （ｃ）前記ステップ（ｂ）と同時又は連続的のいずれかにおいて、前記結合剤 が該結合剤各々の捕獲剤に結合するに至るように、前記固定化された捕獲剤に前 記液体サンプルを接触させるステップと、 （ｄ）被検体により占有された供された結合剤の前記結合部位の前記フラクシ ョンを表す値を決定することにより、前記液体サンプル中の被検体の濃度を決定 するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２．支持体上に１以上の結合剤を固定化する方法であって、各々の結合剤が、 供された被検体に特異的な結合部位と、捕獲剤に結合するのに適合した尾部と、 を有し、 （ａ）支持体上に１以上の捕獲剤を固定化させるステップであって、各々の捕 獲剤が、供された結合剤の前記尾部に結合することができることを特徴とするス テップと、 （ｂ）前記結合剤が該結合剤の尾部を通して該結合剤各々の捕獲 剤に特異的に結合するに至るように、前記支持体上に固定化された前記捕獲剤を 有する前記支持体に前記結合剤を接触させるステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ３．前記方法が、前記支持体上に固定化された前記捕獲剤に前記結合剤をさら す前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステップを更に含むことを特徴とする 請求項２に記載の方法。 ４．前記捕獲剤が、前記対応する結合剤の尾部における相補的配列にハイブリ ッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴と する請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。 ５．前記オリゴヌクレオチドが８〜30塩基長であることを特徴とする請求項４ に記載の方法。 ５．前記結合剤が、被検体に特異的な結合部位を有する抗体であることを特徴 とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 ６．前記結合剤が特異的である前記被検体の周辺濃度が大きく乱されないよう に、各々の結合剤の少量が用いられることを特徴とする先の請求項のいずれか一 に記載の方法。 ７．前記結合剤の少量が0.1 Ｖ／Ｋモル未満であり、ここでＶは、前記サンプ ルの容量であり、Ｋは、前記被検体が前記結合剤に結合することについての有効 アフィニティー定数であることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８．各々の捕獲剤が、実質的に全ての供された結合剤に結合するために、過剰 に用いられることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 ９．前記捕獲剤が、分離された位置で支持体上に固定化されることを特徴とす る先の請求項のいずれか一に記載の方法。 10．前記分離された位置がミクロスポット（microspots）であることを特徴と する請求項９に記載の方法。 11．供された被検体の濃度の一連の測定が同時に行われ得るように、供された 捕獲剤が、複数の位置において前記支持体上に固定化されることを特徴とする先 の請求項のいずれか一に記載の方法。 12．前記被検体により占有される結合部位のフラクションを表す値が、競合及 び／又は非競合法において発現剤を用いて決定され、前記発現剤がマーカーで標 識されることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。 13．前記マーカーが蛍光又は化学発光マーカーであることを特徴とする請求項 12に記載の方法。 14．請求項１〜13のいずれか一に記載の方法において、液体サンプル中の１以 上の被検体の濃度を決定するためのキットであって、該キットが、 （ａ）固体支持体に付着され、供された結合剤に特異的に結合することができ る捕獲剤を複数の位置に有する前記固体支持体と、 （ｂ）１以上の結合剤であって、各々の結合剤が、被検体に特異的な結合部位 と、１以上の捕獲剤に結合するのに適合した尾部と、 を有することを特徴とする結合剤と、 （ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合した被検体又は未占有 の結合剤結合部位に結合することができるマーカーを有する１以上の発現剤と、 を含むことを特徴とするキット。 14．液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するためのアッセイ用のキ ットであって、該キットが、 （ａ）１以上の尾部であって、各々の尾部が結合剤への付着のためであること を特徴とする尾部と、 （ｂ）固体支持体に付着され、尾部に特異的に結合することができる１以上の 捕獲剤を複数の位置に有する前記固体支持体と、 を含み、前記アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることにより 、請求項１〜13のいずれか一に記載の方法において、前記捕獲剤が付着された前 記固体支持体と共に用いられ得る結合剤を供することを特徴とするキット。