JPH10512745A - Ｄｎａ塩基配列決定およびｄｎａ同定の方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）法および装置は、多数試料を個別的に多数プローブ分析するために細区分されたフィルタを用いるもので、ＤＮＡ同定およびＤＮＡ配列決定に用いることができる。区画化されたフィルタを調製する。この区画化されたフイルタのセグメントに試料を添え、またハイブリダイゼーションの判定を行うために各扇形を単一のプローブまたは多重プローブを用いて調べる。相補性、ＳＢＨによる部分的シークエンシング、またはＳＢＨによる完全なシークエンシングについて、ハイブリダイゼーションデータを分析する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ塩基配列決定およびＤＮＡ同定の方法および装置 発明の分野 本発明は、核酸分析に関し、特にＤＮＡ塩基配列決定の方法および装置に関する 。 背景技術 ＤＮＡ試料に含まれる４種類のヌクレオチド配列を決定する速度は、分子生物 学、医学、及びバイオテクノロジーの進歩にとって重要な技術的課題である。ゲ ル上でＤＮＡ分子の分離を必要とする核酸配列決定法は１９７８年から利用され ている。核酸の配列を決定する定評のある方法としては、ハイブリダイゼーショ ン法による塩基配列決定法（ＳＢＨ）が唯一の方法である。 ＳＢＨの配列（array）にもとづいたアプローチは、ＤＮＡ分子の分離、分解 、合成、およびイメージングに際して単一塩基の分析を必要としない。この方法 でもっとも一般的に議論される変形例では、長さがＫ塩基である短いオリゴヌク レオチドの不適合（mismatch）弁別（discriminative）ハイブリダイゼーション を用いて構成Ｋ量体（k-mer）オリゴヌクレオチドのリストをターゲットＤＮＡ について決定することができよう。このシークエンス（sequence）は、判定され た（scored）オリゴヌクレオチドが独特に重なり合ってアセンブルされている。 ＳＢＨシークエンスのアセンブリでは、分析したＤＮＡフラグメントで偶然に 、または生物学的理由により繰り返して生ずるＫ−１オリゴヌクレオチドに対し て特に検討する必要があるかもしれない。もし追加の情報がないとするならば、 すべての塩基対（bp）が数回読み取られることからＤＮＡの相対的に小さなフラ グメントを完全に組み合わせてもよい。相対的に長めのフラグメントからなる組 み合わせでは、Ｋ−１ヌクレオチドが繰 り返して生ずることから曖昧さが生ずる。この問題は、変異を起こした、あるい は類似のシークエンスを決定すなければならない場合には起こらない。一つのシ ークエンスについての知識は、同様のシークエンスを正確に組み立てるテンプレ ートとして用いられる。 ハイブリダイゼーション法による塩基配列決定法にはいくつかのアプローチの 仕方がある。ＳＢＨフォーマット１では、ＤＮＡ試料を配列し、該ＤＮＡ試料に 標識プローブをハイブリダイズさせる。試料ＤＮＡの同一セットを保持するレプ リカ膜を用いて、いくつかのプローブを平行して判定（スコアリング）する際に 利用してもよく、さらに（あるいは）プローブを増やしてもよい。ナイロン膜上 にＤＮＡ試料を配列し、かつハイブリダイズさせることについては、開発が十分 進んでいる。各配列の再利用を数多く行うこともできよう。フォーマット１は、 大量の試料をバッチ処理する上で特に有効である。 ＳＢＨフォーマット２では、プローブを配列し、さらに標識ＤＮＡ試料フラグ メントをこの配列されたプローブにハイブリダイズさせる。この場合、一フラグ メントの完全なシークエンスが、並んだプローブとの同時ハイブリダイゼーショ ン反応によって決定される。他のＤＮＡの塩基配列を決定する場合、同じオリゴ ヌクレオチド配列を再利用してもよい。このような配列をフォーマット２のスポ ッティングまたはin situ変形（variant）によって産生してもよい。ＤＮＡアン カーを配列し、リゲーションを利用して合成されるオリゴ配列を決定する。特異 的なハイブリダイゼーションが公開されている。フォーマット２の変形では、リ ゲーションを利用してＤＮＡアンカーを配列し、ターゲットＤＮＡ末端に存在す るオリゴ配列を決定する。 フォーマット３では、２セットのプローブを利用する。一つのセットは並んだ かたちにあり、また他の標識されたセットは多穴プレートに保存される。この場 合、ターゲットＤＮＡを標識する必要はない。ターゲットＤＮＡおよび一つの標 識プローブをプローブの配列されたセットに加える。もし一つの結合したプロー ブと一つの標識プローブが共にターゲットＤＮ Ａ上で隣接するようにしてハイブリダイズするならば、共有結合のかたちでリゲ ートし、スコアされるものよりも２倍長い配列が作られる。このような方法は、 長いＤＮＡフラグメント、例えば完全な細菌ゲノムを、より小さな断片のかたち でＤＮＡサブクローニングすることなくシークエンシングするのを可能とさせる 。 本発明では、ＳＢＨを用いて短時間で１つ以上のＤＮＡ試料を効率よく同定し 、かつ塩基配列決定を行う。この方法は、ＤＮＡ診断、法医学、およびゲノム・ マッピングの数多くの用途に適用されるものである。また、生物学的多様性の評 価を行ったり、ＤＮＡ配列に応じた異なるタイプのデータを数多く作成するため に、遺伝子疾患または他の形質に関する突然変異を同定するのに用いることがで きよう。 発明の要約 上記したように、フォーマット１ＳＢＨは大きな一つのセットとなった試料を 同時に分析するのに好適である。何千もの試料を大きな配列上で平行して判定す る方法を一つまたはわずかな試料に対して適用すると、膜の小さな断片を用いて 個別にハイブリダイゼーション反応を数千回行うことになる。ＤＮＡの同定は１ 〜２０のプローブを必要とするものであり、突然変異体の同定はいくつかの場合 では各試料に対して特別に選択され、かつ設計された１，０００以上のプローブ を必要とする。変異ＤＮＡフラグメントの特性を同定するために、ハイブリダイ ゼーションの第１ラウンドで検出された各変異体に対して特異的なプローブを合 成または選択してもよい。 本発明によれば、複数のＤＮＡ試料は複数の小さな配列として調製される。こ れらの小配列は適当なスペーサで分離され、また多穴プレートに保持されたオリ ゴヌクレオチドの一セットから選択されるプローブによって同時に試験される。 小さな配列は、一つ以上の試料からなる。各小配列内のＤＮＡ試料は突然変異体 またはあるシークエンスの個々の試料からなる。 大きな配列を形成する連続した複数の小さな配列は、同一配列の複製または異な るＤＮＡフラグメントの試料のいずれかを表現する。プローブの普遍的セットは 、所定の精度、例えば各塩基対を読み取ることの冗長性についての精度を持って 任意のＤＮＡフラグメントを分析するのに十分なプローブからなる。これらのセ ットは、ある特定のフラグメントに対して必要以上の数であり、一方で異なるシ ークエンスの数千のＤＮＡ試料を試験するのに必要とされる数以下のプローブを 含むものであってもよい。 ＤＮＡまたは形質の同定および診断用の塩基配列決定プロセスは、 １）複数の小さな配列の各々に対してハイブリダイズする専用のセット、典型的 セット、あるいは普遍的セットからプローブのサブセットを選択するステップと 、 ２）平行して分析される配列の各々の上の各サブ配列に第一のプローブを添加す るステップと、 ３）ハイブリダイゼーションを実施し、該ハイブリダイゼーションの結果を判定 するステップと、 ４）先に使用したプローブを取り除き、判定に使用される他の残りのプローブを 繰り返すステップと、 ５）最終分析を得るために、またはハイブリダイゼーションされる追加のプロー ブを決定するために、得られた結果を処理するステップと、 ６）一定のサブ配列に関してさらにハイブリダイゼーションを行うステップと、 ７）データの完全なセットを処理し、最終分析を得る計算を行うステップとを有 する。 本発明は、一つのタイプの僅かな数の核酸試料の同定および配列決定をすばや く行う上での問題点、およびサブ配列のかたちにある支持体に付着した試料と処 理しやすい大きさのプローブの前もって合成されたセットを使うことによって行 われる平行分析での問題点を解決する。ＤＮＡの同一性の判断、ＤＮＡ診断、お よび突然変異体の同定のための効率的で、かつ汎用的なプロセスを作るために、 ２つのアプローチを組み合わせた。既知 のシークエンスを同定するために、短いプローブの小さなセットを、長い独特の プローブの代わりに用いることができる。この場合、より一層多くのプローブを 判定する。しかし、プローブの普遍的セットを合成して、どのようなタイプのシ ークエンスでもカバーできるようにする。例えば、６量体または７量体の完全セ ットは、それぞれ４，０９６および１６，３８４プローブである。 ＤＮＡフラグメントの完全な塩基配列決定は２つの段階を含む。第１の段階は 、少なくとも１回はすべての塩基をカバーするプローブの十分なセットのハイブ リダイゼーションである。この目的のために、標準試料に対してプローブの特定 セットを合成する。このハイブリダイゼーションデータは、非標準試料で変異（ 違い）が生じたかどうか、またどこに生じたかを明らかにする。変化の同一性を 判断するために、追加の特異的プローブを試料にハイブリダイズする。他の実施 態様では、普遍的セットのすべてのプローブを判定する。 プローブの普遍的セットは、許容できない時間の浪費をすることなく２ステッ ププロセスでもって、試料あたり相対的に少ない数のプローブの判定を可能とす る。ハイブリダイゼーションプロセスは最初にハイブリダイズするプローブの最 適セットをコンピュータ処理する第１ステップと、得られた結果にもとづいて、 存在する普遍的セットのプローブから判定する追加のプローブを定める第２のス テップとにおける連続的なプロービングを含む。 試料配列の一配列を使うことで、単一試料上の、あるいは試料の小さなセット 上の多くのオリゴヌクレオチドを連続的に判定することが回避される。このこと は、一つの物理的対象物のみを操作することによって平行して多くのプローブの 判定が可能となる。プローブの普遍的セットによって形成されたサブ配列の利用 と４段階ハイブリダイゼーションプロセスとの組み合わせによって、長さが１０ ００塩基対のＤＮＡ試料の塩基配列決定が相対的に短時間で行える。もし試料が 一つの配列に対して５０のサブ配列でスポットされるならば、配列は１０回再分 析されて、５００プローブ が判定される。このプローブ数はかなり満足できるものである。突然変異の発生 に関するスクリーニングでは、各塩基を３回カバーするのに約３３５プローブが 使用される。もし突然変異が存在しているならば、いくつかのカバーしているプ ローブが影響を及ぼされるであろう。それらのネガティブなプローブは２塩基精 度で突然変異をマッピングする。この精度でマッピングされた単一塩基突然変異 を解決するために、さらに１５プローブを追加で使用する。これらのプローブは 、２つの疑わしい位置（欠失および挿入は含まれないと仮定する）に対する任意 の塩基組み合わせをカバーする。これらのプローブは、１回のサイクルで与えら れた試料が含まれる５０のサブ配列上で判定される。多重標識カラー・スキーム （多重化）を実施する際、異なる蛍光色素によって標識された２ないし６のプロ ーブがプールとして使用され、それによってハイブリダイゼーション・サイクル 数を少なくし、また配列決定プロセスを短くする。 より一層複雑なケースでは、２つの近接した突然変異または挿入が存在する。 例えば、３塩基挿入は６４プローブで解明される。もっとも複雑なケースは、数 段階のハイブリダイゼーションによって取り組まれるもので、先のハイブリダイ ゼーションの結果にもとづいてプローブの新しいセットを選択する。 サブ配列が一つのタイプの数十または数百の試料からなる場合、それらのうち のいくつかには、１つの以上の変化（突然変異、挿入、または欠失）が含まれよ う。変異が生ずる各セグメントについて、プローブの特定のセットが判定される 。試料のタイプについて判定されるプローブの全数は、数百程度である。平行に 複製配列を判定することによって、相対的に少ないサイクル数で数百のプローブ を判定することが可能となる。さらに、互換性のあるプローブをプールしてもよ い。ポジティブなハイブリダイゼーションを、特定のＤＮＡセグメントをチェッ クするために選択されたプローブに割り当てる。なぜなら、これらのセグメント は構成塩基の７５％が通常は異なる。 長いプローブの大きなセットを用いることによって、長いターゲットを うまい具合に分析できる。それらのターゲットは、エクソン・クローン等の短い フラグメントのプールを表す。 必要なプローブの数を少なくする多段階アプローチでは、倍数染色体の組から シークエンスされるゲノムのセグメントにおけるヘテロ接合体の存在を規定する 特定のハイブリダイゼーション判定法が用いられる。２つの可能性がある。すな わち、 ｉ）１つの染色体由来のシークエンスは塩基のタイプを表し、また他方の染色体 由来のシークエンスは新しい変異を表す、あるいはｉｉ）両方の染色体とも新し い、しかし異なる変異を含む。第一のケースでは、マッピングを変えるように意 図された走査ステップによって、ヘテロ接合位置で２倍の最大シグナル差が与え られる。第２のケースでは、マスキングが無く、ハイブリダイゼーションの連続 するラウンドに対してプローブの選択をより完全なものとすることが要求される 。 第１のケースで必要とされる２倍シグナル差の判定は、対応シグナルを基本シ ークエンス型のみを含む対照群および他の分析された試料由来のシグナルと比較 することによって効率よく達成される。このアプローチによって、与えられた試 料の各特定のプローブに対するハイブリダイゼーションシグナルでの相対的減少 の決定が可能となる。このことは重要である。なぜなら、ハイブリダイゼーショ ン効率は、完全に一致するターゲットを持つ異なるＤＮＡフラグメントとハイブ リダイズした特定のプローブの２倍以上に変わる。さらに、ヘテロ接合部位は、 オリゴヌクレオチド・プローブの数に応じて一つ以上のプローブに対して影響を 及ぼす。２ないし４の連続プローブのシグナルが減少することによって、ヘテロ 接合部位のより一層顕著な同定がなされる。このことは、不適正含有二重鎖から 来るシグナルよりも平均して８倍強い１つまたは僅かのプローブが完全に一致す るシグナルを与えると考えられる選択されたプローブの小さなセットによってチ ェックされる。 仕切られた膜によって、任意のタイプを表し、かつ相対的に数の多い試料に対 応する実験、あるいは少数の試料によって表される数多くの異なる タイプに対応する実験を非常に柔軟に構成することが可能となる。４ないし２５ ６試料の範囲を個々に効率よく取り扱うことができる。この範囲の数のドットの 中にあるサブ配列は、オリゴヌクレオチドを保存し、かつ標識する標準的な多穴 プレートの構成および大きさに一致するように設計されている。サブ配列の大き さを異なる数の試料に適合するようにするか、もしくはいくつかの標準的な順配 列の大きさを用いることもできる。さらに、各サブ配列に対して複製の数を設定 することによって、同定または塩基配列決定のプロセスを完了するまでの時間が 変わる。 発明の詳細な説明 実施例１ プローブの普遍的セットの調製 ２種類のプローブの普遍的セット（universal set）を調製する。その第１の ものは、比較的短いプローブの完全なセット（あるいは、少なくとも非相補的サ ブセット）である。例えば、全４０９６（または、約２０００の非相補的）６量 体であるか、あるいは全１６，３８４（または、約８，０００の非相補的）７量 体である。８量体の完全な非相補的サブセットまたはそれより長いプローブは、 それらが３２，０００以上のプローブを含むので、あまり簡便ではない。 プローブのセットの第２の種類は、少なくとも１個のプローブを有するあらゆ るシークエンスの全ての塩基対（ｂｐ）を読みとるのにさらに十分なプローブの 小さなサブセットとして選ばれる。例えば、１６の２量体のうちの１２が充分で ある。二重鎖ＤＮＡの塩基配列決定を行うための７量体、８量体および９量体の 小さなサブセットは、それぞれ、約３０００、１０，０００および３０，０００ プローブである。 プローブは、標準的な化学を用いて、１〜３個の特定されていない（Ａ、Ｔ、 ＣおよびＧの混合）または普遍的（例えば、Ｍ塩基、イノシン）な塩 基を末端に用いて調製される。放射線標識化が用いられる場合には、プローブは、 放射線標識された亜リン酸基によってキナーゼ処理(kinasing)するために５′ −末端にＯＨ基を有していてもよい。あるいはまた、蛍光染料で標識されたプロ ーブを用いてもよい。さらに、ＰＮＡ（蛋白質核酸）等の他の種類のプローブ、 あるいは二本鎖の安定性(duplex stability)を変化させる修飾された塩基を含有 するプローブを使用してもよい。 プローブは、バーコードの付いた多穴プレートに保存される。少数のプローブ では、９６穴のプレートを用いてもよく、１０，０００以上のプローブでは、３ ８４穴または８６４穴のプレートに保存することが好ましい。５〜５０枚のプレ ートのスタックは、全てのプローブを保存するのに充分である。１つのＤＮＡ試 料とのハイブリッドには約５ｐｇのプローブで充分である。したがって、プロー ブ当たり約５０μｇという小さな合成から、１０００万の試料が分析可能となる 。各プローブが第３の試料毎に用いられる場合、および各試料が１０００ｂｐの 長さである場合には、３０００以上の塩基（１０ヒトゲノム）が１セットの５， ０００種のプローブにより配列決定される。 実施例２ ＤＮＡ試料の調製 ＤＮＡフラグメントは、Ｍ１３、プラスミドまたはラムダベクターにおけるク ローンのように調製してもよく、および／または、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ からＰＣＲまたは他の複製方法により直接調製してもよい。試料は、多穴プレー トに調製または分配(dispense)される。約１００〜１０００ｎｇのＤＮＡ試料は 、最終体積２〜５００μｌに調製される。 実施例３ ＤＮＡの配列(arrrays)の調製 配列は、ＤＮＡ試料をナイロン膜等の支持体上にスポットすることにより調製 される。スポッティングは、金属ピンの配列（その位置は、マイクロタイタープ レートの穴の配列に対応する）を用いて行い、約２０ｎｌのＤＮＡ溶液がナイロ ン膜への移動により繰り返されてもよい。オフセット印刷により、上記穴の密度 よりも高いドット密度が達成される。用いられる標識の種類に応じて、１ｍｍ² に１〜２５ドットが収容可能である。幾つかの予め選ばれた数の列行(rows and columns)へのスポットを回避するために、別のサブセット（サブ配列(subarrays )）を形成してもよい。１つのサブ配列中の試料は、異なる個体からの同一のＤ ＮＡのゲノムセグメント（または同一の遺伝子）であってもよく、あるいは異な る重複ゲノミッククローンであってもよい。上記サブ配列の各々は、同一の試料 のレプリカ・スポッティングを示す。１つの実施例において、１つの遺伝子セグ メントは、６４人の患者から増幅される。各患者に対して、増幅された遺伝子セ グメントは、１枚の９６穴プレート（９６穴の全部が同一の試料を含有する）で あってもよい。６４人の患者の各々に対して１枚のプレートを調製する。９６ピ ンの装置を用いることにより、全ての試料は、１枚の８×１２ｃｍの膜上にスポ ットされる。サブ配列は、６４の試料（すなわち、各患者から１試料）を含む。 ９６のサブ配列が同一である場合、ドットのスパンは１ｍｍ²であり、サブ配列 間には１ｍｍの間隔があいている。 もう１つのアプローチは、物理的スペーサー（例えば、膜全面にわたって成形 されているプラスチック製グリッドであり、該グリッドは、多穴プレートの底部 に適用される膜の種類と類似している）あるいは疎水性のストリップで区切られ ていてもよい膜またはプレート（ＮＵＮＣ社(Ｎaperville,Illinois)より入手可 能）を用いることである。固定された物理的スペーサーは、平坦な蛍光体−保存 スクリーン(phosphor-storage screen)またはＸ線フィルムに露光することによ る画像形成には好ましくない。 実施例４ プローブの選択およびラベリング サブ配列の１つの配列が得られたら、各サブ配列に対する各ハイブリダイゼー ション・サイクルでハイブリッドすべきプローブのセットを決定する。実施例３ の試料では、普遍的セットから３８４プローブの１セットが選ばれ、９６のプロ ーブ化がそれぞれ４サイクルで行われる。１つのサイクルにおいてハイブリダイ ズするのに選ばれるプローブは、同様のＧ＋Ｃ含量を有する。 各サイクルに対して選ばれたプローブは、９６穴プレートへ移され、次いで、 それらが標識されていない場合には、保存する前に、キナーゼ処理(kinasing)ま たは他の標識化操作により（例えば安定な蛍光染料で）標識する。 第１ラウンドのハイブリダイゼーションに基づいて、さらなるサイクルのため のサブ配列の各々に対して新たな１セットのプローブが決定される。配列の幾つ かは、サイクルのどれかにおいて用いなくてもよい。例えば、６４人の患者試料 のうち、わずか８人だけ突然変異を示し、かつ各突然変異に対して８つのプロー ブが最初に判定される(scored)場合には、全６４のプローブが１つのサイクルで 判定され、かつ３２のサブ配列は使用されない。これらのサブ配列は、次いでハ イブリダイゼーション用用緩衝液で処理されて、フィルタの乾燥を防止する。 プローブは、あらゆる簡便なアプローチにより保存プレートから回収され、そ のようなアプローチとしては、シングルチャンネル・ピペッティング装置、また は Ｂeckman Ｂiomek 1000(Ｂeckman Instruments社、Ｆullerton,Ｃalifornia) やＭega Ｔwo robot(Ｍegamation社、Lawrenceville,Ｎew Ｙork)ロボット・ステ ーションが挙げられる。ロボット・ステーションには、データ解析プログラムお よびプローブ管理プログラムをセットみ込んでもよい。これらのプログラムの出 力は、１つ以上のロボット・ステーションでの入力であってもよい。 プローブは、１つずつ回収され、ハイブリダイゼーション・用緩衝液に より覆われるサブ配列に添加される。回収したプローブは、新たなプレートに入 れて、標識するか、あるいはハイブリダイゼーション・用緩衝液と混合すること が好ましい。回収の好ましい方法は、保存したプレートを１枚ずつアクセスして 、各選択したプローブの充分量を各プレートから中間プレートの特定の穴へピペ ッティングすること（または、金属ピンにより移すこと）によるものである。個 別にアドレッシング可能なピペットまたはピンの配列を用いて、回収ステップを スピードアップしてもよい。 実施例５ ハイブリダイゼーションおよび判定方法 標識化したプローブは、ハイブリダイゼーション・用緩衝液と混合し、優先的 にマルチチャンネル・ピペットによりサブ配列へ移す。（膜に刷り込まれた疎水 性ストリップまたは物理的バリアが全く存在しない場合に）サブ配列間でのプロ ーブの混合を防止するために、対応するプラスチック、金属またはセラミック製 のグリッドを膜にしっかりと押し圧してもよい。さらに、用緩衝液の体積は、ｍ ｍ²当たり約１μｌ以下に低減してもよい。用いられるプローブの濃度およびハ イブリダイゼーションの条件は、洗浄用緩衝液をサブ配列の配列に素早く注いで プローブを速く希釈させて、著しいクロス・ハイブリダイゼーションを防止する 以外は、先述したとおりでよい。同じ理由により、プローブの最小濃度が用いら れ、ハイブリダイゼーションの時間が最大の実用レベルまで延長される。ＤＮＡ 検出および塩基配列決定では、「正常なシークエンス」を知っていることは、連 続的な積み重ね相互作用現象(continuous stacking interaction phenomenon)を 用いてシグナルを増加させることを可能にする。標識されたプローブに加えて、 ラベルされたものと背中合わせにハイブリッドする追加の標識されていないプロ ーブを、ハイブリダイゼーション反応に添加する。ハイブリッドの量は数回増加 させてもよい。プローブはライゲーションにより連結する。このアプローチは、 「圧縮(compressions)」を形成するＤＮＡ領 域を分解(resolving)するのに重要である。 放射線標識したプローブの場合、 フィルタのイメージは、好ましくは蛍リン光体保存技術(phosphorstorage techn ology)により得られる。蛍光標識は、ＣＣＤカメラ、共焦顕微鏡法等により判定 される。未処理のシグナルは、各ドットにおけるターゲットの量に基づいて、適 切な尺度および異なるハイブリダイゼーション実験からの積分データへと標準化 される。ドット当たりのターゲットＤＮＡの量の差は、各プローブの個々のシグ ナルに対して、１個のドットについて判定される全てのプローブに対する平均シ グナルにより補正される。また、標準化されたシグナルを測定して（通常は１〜 １００）、別の実験からのデータと比較する。また、各サブ配列においては、幾 つかのコントロールＤＮＡを用いて、完全適合ターゲット(full match target) を含有しない試料における平均的バックグラウンド・シグナルを求めてもよい。 さらに、２倍体（倍数体）の判定(score)から得られる試料では、ホモ接合体の 調節を用いて、試料中のヘテロ接合体の認識を可能にしてもよい。 実施例６ 特徴−判定結果のわかっている突然変異 または完全遺伝子の塩基配列再決定 単純な場合とは、幾つかの公知の突然変異がＤＮＡセグメント内で起こるか否 かを発見することである。１２未満のプローブがこの目的を満足させ、例えば、 １つの対立遺伝子に対して正である５つのプローブ、もう一方に対して正である ５つ、および両方に対して負である２つが挙げられる。試料当たり少数のプロー ブが判定されるので、多数の試料が並行して分析される。例えば、３つのハイブ リダイゼーション・サイクルにおいて１２プローブを用いて、６４人の患者から の９６の異なるゲノム遺伝子座または遺伝子セグメントが、１２×２４のサブ配 列（それぞれが、６４人の患者からの同一のＤＮＡセグメントを示す６４のドッ トを有する）を含有する１枚の６×９インチの膜の上で分析される。この例にお いて、試料は、 ６４枚の９６穴プレートで調製される。各プレートは１人の患者を示し、各穴は 、分析すべきＤＮＡセグメントの１つを示す。６４人の患者からの試料は、同一 の膜の４分の４として４つのレプリカでスポットされる。 １セットの１２プローブは、シングル・チャンネル・ピペッティングまたはシ ングル・ピン移動装置（あるいは、個別に調節されたピペットまたはピンの配列 ）により、９６セグメントの各々に対して選択され、１２枚の９６穴プレートに 再度並べられる。プローブは、保存される前に予め標識されていない場合には、 標識化され、４枚のプレートからのプローブはハイブリダイゼーション・用緩衝 液と混合し、好ましくは９６チャンネル・ピペッティング装置によりサブ配列に 添加する。１つのハイブリダイゼーション・サイクルの後で、３７℃〜５５℃で 、かつ好ましくは蒸留されていないハイブリダイゼーション・用緩衝液または洗 浄緩衝液中で膜をインキュベートすることにより、前に用いられたプローブを除 去することが可能である。 １つの対立遺伝子に対して正であるプローブが正であり、他方の対立遺伝子に 対して正であるプローブが負である可能性を用いて、その２つの対立遺伝子のど ちらが存在するかを決定する。この冗長な判定方法では、各プローブのハイブリ ダイゼーションにおける或るレベル（約１０％）のエラーが許容される。 殆どの対立遺伝子を判定するために、特に同様の冗長性(redundancy)が十分で ある場合、プローブの不完全なセットを用い、例えば、試料中に２つの対立遺伝 子の一方が存在するか存在しないかを明らかにする１つまたは２つのプローブが 挙げられる。例えば、４０００の８量体の１セットを用いた場合、ランダムに選 ばれた座の２つの対立遺伝子の一方に対する少なくとも１つの正のプローブを見 つける可能性が９１％ある。プローブの不完全なセットは、分析される試料にお けるＧ＋Ｃ含量および他の偏り(biases)を反映するように最適化される。 完全な遺伝子シークエンスでは、遺伝子は、適当数のセグメントに増幅される 。各セグメントに対して、１セットのプローブ（２〜４塩基当たり 約１プローブ）を選択してハイブリッドする。これらのプローブは、分析される セグメントのどこかに突然変異があるか否かを同定する。１つ以上の突然変異部 位が検出されるセグメント（すなわち、これらのセグメントを含有するサブ配列 ）は、別のプローブとハイブリッドして、突然変異の起こっている部位における 正確な配列を見つける。ＤＮＡ試料が第２の６量体毎に試験され、かつ突然変異 が、正にハイブリッドされたプローブであるＴＧＣＡＡＡおよびＴＡＴＴＣＣに より包囲され、３つの負のプローブであるＣＡＡＡＡＣ、ＡＡＡＣＴＡおよびＡ ＣＴＡＴＴにより被覆されている場所に局在する場合には、突然変異が起こって いるヌクレオチドは、単一の塩基の突然変異により、あるいは１つまたは２つの ヌクレオチド欠損および／または塩基ＡＡ、ＡＣまたはＣＴの間での挿入により 改変(change)されていなければならない。 １つのアプローチは、１つのプローブに対して正にハイブリッドされたプロー ブであるＴＧＣＡＡＡを右へ延長し、かつ１つのヌクレオチドのプローブＴＡＴ ＴＣＣを左へ延長するプローブを選択することである。これらの８つのプローブ （ＧＣＡＡＡＡ、ＧＣＡＡＡＴ、ＧＣＡＡＡＣ、ＧＣＡＡＡＧおよびＡＴＡＴＴ Ｃ、ＴＴＡＴＴＣ、ＣＴＡＴＴＣ、ＧＴＡＴＴＣ）を用いて、２つの問題となる ヌクレオチドが決定される。 突然変異について最も可能性のある仮定を決定する。例えば、ＡはＧへ突然片 影することがわかっている。これらの結果を満足する解答が２つある。ＡをＧで 置き換えることが唯一の改変であるか、あるいは、その改変に加えて、さらに、 新たに決定されたＧと次のＣとの間に数個の塩基が挿入されることである。橋か けプローブ(bridging probes)を用いた結果が負である場合、これらの選択肢は 、まず最初に、突然変異が起こっている位置（ＡＡＧＣＴＡ）を含有し、かつ、 さらに８つのプローブ（ＣＡＡＡＧＡ、ＣＡＡＡＧＴ、ＣＡＡＡＧＣ、ＣＡＡＡ ＧＧおよびＡＣＴＡＴＴ、ＴＣＴＡＴＴ、ＣＣＴＡＴＴ、ＧＣＴＡＴＴ）を有す る少なくとも１つの橋かけプローブによりチェックされる。突然変異を解明する プローブを選択する方法は、他にも多くある。 二倍体の場合、試験試料およびホモ接合体の調節の判定の特定の比較を行って 、ヘテロ接合体の同定を行う（上記参照）。幾つかの連続したプローブは、これ らのプローブにより被覆されたセグメントが２つの染色体の一方の上で突然変異 を起こしている場合には、およそ２倍の類似したシグナルを有することが予期さ れる。 実施例７ 遺伝子疾患または他の形質に関係する遺伝子（突然変異体）の同定 ここに開示される塩基配列決定のプロセスは、塩基あたりのコストが大変低く い。また、長いプローブ（８量体または９量体）のより大きな普遍的セットを用 いることによって、５〜２０ｋｂほどの長さのＤＮＡフラグメントをサブクロー ン化することなくシークエンスする。さらに、再びシークエンスする際の速度は 、約１０００万塩基／日／ハイブリダイゼーション機器である。このような特性 によって、科学的または医学的に興味ある個体から繰り返してヒト遺伝子または ヒト・ゲノムの大きな分画を再シークエンスすることが可能となる。ヒト遺伝子 の５０％再シークエンスするために、約１０００万塩基対を調べる。このことは 手頃な価格で、かつ相対的に短い時間で行うことができる。 この際、極めて優れた再シークエンシング能を、突然変異の同定、および（ま たは）疾患または任意の形質をコード化する遺伝子の同定を行う幾通りかの方法 で使用することができる。基本的には、所定の疾患を持つ患者の所定組織由来の ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡに変換してもよい）またはゲノムＤＮＡを出発材料として用 いる。これら両方のＤＮＡ源から、適当な長さの分離遺伝子またはゲノム・フラ グメントをクローニング法またはin vitroでの増幅法（例えば、ＰＣＲによって 調製する。もし、クローニングを用いるならば、シークエンシングに先だって分 析すべき最小セットのクローンがライブラリから選択される。このことは、特に ５塩基を越える長さの少ない数のクローンがソートされる場合、少ない数のプロ ーブのハイブリ ダイゼーションによって効率よく行うことができる。クローニングは、ハイブリ ダイゼーションデータの量を約２倍にするが、幾万ものＰＣＲプライマーを要求 することはない。 方法の一変形例として、遺伝子またはゲノムフラグメントをＨｇＩ等の制限酵 素でもって切断することによって調製することもできる。ここでＨｇＩはＤＮＡ を以下のようにして切断する。すなわち、 ＧＡＣＧＣ（Ｎ５’）／ＧＴＧＣＧ （Ｎ１０’）。フラグメントが異なれば５塩基の突出した末端も異なる。一つの 酵素である数の遺伝子に関して適当なフラグメントが産生される。ｃＤＮＡまた はゲノムＤＮＡを別々の反応でもっていくつかの酵素で切断することによって、 目的とする各々の遺伝子を適切に切り取ることができる。一つのアプローチでは 、切断ＤＮＡを大きさによって分画する。この方法（および３’末端からヌクレ オチドを別々に除去し、該末端の長さおよび特異性を増加させるエクソヌクレア ーゼＩＩＩによって任意に処理すること）によって調製されたＤＮＡフラグメン トを試験管または多穴プレートに分ける。共通部分と適当な長さの可変突出末端 とを持つＤＮＡアダプタの相対的に小さなセットから、増幅を必要とする遺伝子 フラグメントごとに一対のアダプタを選択する。これらのアダプタをリゲーショ ンし、さらに普遍的なプライマーによってＰＣＲを実行する。１０００アダプタ から百万対が生じ、それによってアダプタの共通末端に対する相補性を有するプ ライマの普遍的対による同一条件下で百万の異なったフラグメントが特異的に増 幅される。 何人かの患者で繰り返してＤＮＡの違いが見つかり、さらにそのシークエンス の変化がナンセンス変異であるか、もしくは対応するタンパク質の機能を変える ことができるものであるならば、変異した遺伝子は疾患に関与するものであると 考えられる。任意の形質を持つ顕著な数の個体を分析することによって、特定の 遺伝子の機能的対立遺伝子変異が特定の形質によって対応づけられよう。 この方法は、広範囲にわたる系図上で非常に高価な遺伝子マッピングの必要性 を取り除き、さらにそのような遺伝子データまたは材料がない場合 は特別の価値を持つ。 実施例８ 遺伝子マッピングにおける単一核酸多型現象の判定 この出願に開示された技術は、単一核酸多型現象（ＳＮＵＰ）を持つ遺伝子フ ラグメントの効率的な同定にとって適当である。クローニングによって、あるい はin vitro 増幅によって増幅される多数の既知遺伝子フラグメント上において 上記シークエンシング方法を適用することによる１０個体中で、ＳＮＵＰを有す る十分な数のＤＮＡフラグメントが同定される。多型フラグメントをＳＮＵＰマ ーカーとしてさらに利用する。これらのマーカーを事前にマッピング（例えば、 マッピングされたＳＴＳを表す）するか、あるいは以下に記載したようなスクリ ーニング法によってマッピングする。 マーカーを増幅し、かつそれをサブ配列の配列として配置することによって、 ＳＮＵＰを関連した系統群または個体群由来の個々の個体で判定する。サブ配列 には、分析された個体から増幅された同一マーカーが含まれる。各マーカーにつ いて、既知の突然変異体を診断する場合のように、一つの形質に対してポジティ ブな６以下のプローブと他の形質に対してポジティブな６以下のプローブとのセ ットを選択して判定する。疾患によって一つまたは一群のマーカーが顕著に解離 することから、関与する遺伝子の染色体上の位置が決定される。高スループット および低コストであることから、数千もの個体対して数千ものマーカーが判定さ れる。 このデータ量によって、多遺伝子性の疾患に含まれる遺伝子の位置決めと同様 に、百万塩基対よりも少ない分析能で遺伝子の位置決めを行うことが可能となる 。位置決めされた遺伝子は、関連する正常個体および影響を受けた個体から特定 の領域をシークエンシングし、変異体を判定する。 ＰＣＲはゲノムＤＮＡからマーカーを増幅するのに好適である。各々のマーカ ーはプライマーの所定の対を必要とする。存在するマーカーはコン パーチブルであるか、もしくはＨｇＩ型制限酵素によってゲノムＤＮＡを切断す ることによって、また実施例７に記載した一対のアダプタとのリゲーションによ って調製される新しいマーカーを定めてもよい。 ＳＮＵＰマーカーを増幅したり、あるいはプールとしてスポッティングされる ことによって、独立した増幅反応の数を少なくする。この場合、一試料あたりよ り多くのプローブが判定される。４つのマーカーがプールされ、かつ１２枚の複 製膜上でスポッティングされる場合、４８プローブ（マーカーあたり１２）が４ サイクルで判定される。 実施例９ ＤＮＡフラグメントの同一性の検出および検証 制限酵素による切断、クローニング、またはin vitro 増幅（例として、ＰＣ Ｒ）で生じたＤＮＡフラグメントは、しばしば実験によって同定される。同定は 、ゲル電気泳動上で特定の大きさのＤＮＡバンドの存在を確認することによって 行われる。あるいは、特定のオリゴヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーシ ョン法によって問題となるＤＮＡ試料を確認する。ここで開発した方法によれば 、各フラグメントに対して特定のオリゴヌクレオチドを調製することなく大量の 試料を効率良く同定することが可能となる。既知のシークエンスにもとづいて各 フラグメントに対する普遍的セットからポジティブおよびネガティブなプローブ のセットを選択する。ポジティブなものとして選択されたプローブは、通常は１ または僅かな重なり合った群を形成することができ、さらにネガティブなプロー ブは挿入全体に分散される。 この技術は、ＳＴＳをＹＡＣクローン上にマッピングするプロセスにおいてＳ ＴＳの同定を行うために使用される。ＳＴＳの各々を、約１００のＹＡＣクロー ン上で、あるいはＹＡＣクローンのプール上で試験する。これら１００の反応由 来のＤＮＡをできる限り一つのサブ配列にスポッティングする。異なるＳＴＳは 、連続したサブ配列を表す。いくつかのハイブ リダイゼーション・サイクルでは、各々のＤＮＡ試料に対してサインが生じる。 このサインによって必要な信頼度をもって任意のＹＡＣクローンにおける所定の ＳＴＳの存在が認められるか、もしくは認められない。 互いに独立したＰＣＲ 反応の数またはスポッティング用のそれぞれ独立した試料の数を減少させるため に、いくつかのＳＴＳを一つの反応で同時に増幅させか、もしくはＰＣＲ試料を それぞれ混合する。この場合、一つのドットあたり多くのプローブが判定されな ければならない。ＳＴＳのプーリングはＹＡＣのプーリングから独立したもので あり、単一ＹＡＣまたはＹＡＣのプール上で使用される。このスキームは、異な る色でいくつかのプローブが標識されている場合、特に関心がよせられる。 試料中にＤＮＡフラグメントが存在することを裏付けることに加えて、いくつ かの分離したプローブまたはプローブの１以上のプールのハイブリダイゼーショ ンの強度を用いることによってＤＮＡの量を評価する。既知のＤＮＡ量を持つ対 照群の試料に対する強度と得られた強度とを比較することによって、全てのスポ ッティングされた試料に含まれるＤＮＡ量を同時に決定する。わずかなプローブ のみがＤＮＡフラグメントの同定に必要であり、また長さがＮ塩基のＤＮＡに使 用されるＮ個の推定プローブが存在することから、この利用例では任意のＤＮＡ フラグメントの同定に十分な大量のプローブを必要としない。１，０００の８量 体から、平均して約３０の完全に一致したプローブが１００塩基対のフラグメン トに対して選択される。 実施例１０ 伝染病微生物およびその変異株の同定 患者の体内に宿うウイルス、細菌、真菌、および他の寄生微生物を検出するた めのＤＮＡにもとづく試験は、一般により信頼性が高く、かつ代用のものよりも コストが低い。ＤＮＡ試験の主に優れた点は、特定の下部および突然変異体を同 定することを可能にするという点であり、また最終的 にはより有効な治療を施すことを可能にするという点である。以下、２通りの利 用例を説明する。 細菌感染に存在する１２の既知の抗生物質耐性遺伝子を、該遺伝子の増幅によ って試験する。１２８人の患者から得た増幅産物を２つのサブ配列にスポッティ ングし、つづいて１２の遺伝子に対して２４のサブ配列を８ｘ１２ｃｍ膜上で四 回繰り返した。各遺伝子に対して、１２プローブをポジティブおよびネガティブ 判定用に選択する。３サイクルでハイブリダイゼーションを行う。これらの試験 に対して、実施例９の試験の場合のように、１，０００のポジティブ・プローブ から、平均して３０のプローブが１０００塩基対フラグメントでポジティブであ り、さらに１０のポジティブ・プローブが信頼性の高い同定に対して一般に足り うる。実施例９に記載したように、いくつかの遺伝子を増幅したり、および（ま たは）一緒にスポッティングし、さらに任意のＤＮＡの量を決定する。増幅され た遺伝子の量は、感染の度合いを示すインジケータとして用いることができる。 他の実施例には、ＨＩＶウイルスの一つの遺伝子あるいはゲノム全体を推定ス クリーニングことが含まれる。急激な多様化のため、ウィルスは最適な治療の選 択に対して数多くの困難性を与える。ＤＮＡフラグメントは、６４人までの患者 から単離されたあウィルスから増幅される。得られた配列にもとづいて、最適な 治療が選択される。もし一方が基本的なシークエンス（ヘテロ接合体の場合に類 似）である２種類のウィルス型の混合物が存在するならば、突然変異体はそれ自 身のハイブリダイゼーション判定を、他の試料、特に基本的なウイルス型のみを 含む対照群の判定と量的に比較することによって同定される。試料に含まれる２ 種類のウィルス型（上記を見よ）の一つで変異した部位をカバーする３ないし４ のプローブに対して二倍小さい判定が得られる。 実施例１１ 法医学および親の同定への応用 シークエンス多型現象は、個々のゲノムＤＮＡをユニークなものにする。この ことは、犯罪現場からの血液、または他の体液または組織を分析し、さらに犯罪 容疑者の試料とを比較することを可能とさせる。試料のユニークなサイン(signa ture)を作るために十分な数からなる多型部位が判定される。ＳＢＨは容易に単 一ヌクレオチド多様性を判定してそのようなサインを生産する。 ＤＮＡフラグメント（１０〜１０００）のセットは、試料および容疑者から増 幅される。１つのフラグメントを示す試料由来のＤＮＡおよび容疑者由来のＤＮ Ａを、一つまたはいくつかのサブ配列にスポッティングし、さらに各サブ配列を ４回複製する。３つのサイクルでは、１２のプローブによって、各ＤＮＡ遺伝子 座に対して、容疑者等の各試料にある形質ＡまたはＢの存在が決定される。試料 のパターンと容疑者のパターンとを一致させることは、犯罪に係わった容疑者の 発見につながる。 同様の方法が子供の親であるかの証明にも応用できる。ＤＮＡを調製し、子供 および成人から増幅させた多型性遺伝子座；ＡまたはＢ形質のパターンを各々に 対するハイブリダイゼーション法によって決定する。ポジティブおよびネガティ ブな対照群に沿って得られたパターンを比較することによって、家族関係の判断 に役立つ。この場合、同定のために形質の顕著な部分のみが一人の親に一致する 必要がある。多くの判定された遺伝子によって、方法における統計学的なエラー をさけたり、de novo突然変異の効果をマスクすることが可能となる。 実施例１２ 個体群または種の遺伝的多様性と生態学的ニッチの生物学的多様性の分析 有意な数の遺伝子座（例えば、いくつかの遺伝子またはミトコンドリアＤＮＡ 全体）上の対立遺伝子変異の頻度を測定することによって、遺伝子型に対する環 境の影響に関する結論、個体群の歴史および進化あるいは病 気や絶滅に対するその感受性などの異なるタイプの結論を発展させることが可能 となる。これらの評価は、既知の特定形質を試験することによって、あるいは申 し分ない変異あるいは環境における突然変異誘発要因の存在を示すde novo突然 変異を定めることが可能ないくつかの遺伝子座を完全に再シークエンスすること によって行われる。 さらに、微生物の世界での生物学的多様性は、進化的に保存されたＤＮＡシー クエンス、例えばリボゾームＲＮＡの遺伝子あるいは高度に保存されたタンパク 質の遺伝子を再シークエンスすることによって調べられる。ＤＮＡは環境および 保存されたシークエンスに対応するプライマーを用いて増幅された特定の遺伝子 から調製される。ＤＮＡフラグメントは優先的にプラスミド・ベクター内にクロ ーン化される（あるいは多穴プレートにおいて一穴あたり一分子の濃度に希釈し 、in vivoで増幅する）。このようにして調製したクローンをすでに述べたよう にして再シークエンスする。２種類の情報が得られる。第１は、異なる種のカタ ログを各種の個体の多様性と同様に定義することができる。別の種類の情報は生 態学的要因または生態系に対する汚染の影響を測定するのに使用することができ る。それは、いくつかの種は根絶されるかどうか、あるいは種間の存在比率は汚 染によって変わるかどうかを明らかにするかもしれない。また、方法は化石から のＤＮＡをシークエンスするのに利用できる。 実施例１３ ＤＮＡの塩基配列決定（シークエンシング） 複数のサブ配列のうちの一つの配列によって、複製されたサブ配列のかたちで 配列された試料の小セットの効率よいシークエンシングが可能となる。例えば、 ６４個の試料を８ｘ８サブ配列に配列し、１６ｘ２４サブ配列を５ｘ２３ｃｍの 膜上に複製する。この際、サブ配列間に１ｍｍ幅のスペーサが設けられている。 複製の膜をいくつか作る。例えば、３，０７２ の７量体の普遍的セットからのプローブを３２枚の９６穴プレートに分けて、キ ナーゼ処理によって標識する。ハイブリダイゼーション・サイクルの間、平行し て４枚の膜を処理する。各膜に対して、３８４のプローブを判定する。すべての プローブが２回のハイブリダイゼーション・サイクル中に判定される。ハイブリ ダイゼーション強度を判定し、以下のようにしてシークエンスが組み立てれられ る。 もし単一試料のサブ配列または複数のサブ配列がいくつかの未知なものを含む ならば、特に類似の試料が用いられる場合、前に判定されたプローブの結果にも とづいてインテリジェントに選択されるものならば少数のプローブで十分である 。例えば、もしプローブＡＡＡＡＡＡＡがポジティブではないならば、８個のオ ーバーラッピング・プローブのいずれかがポジティブである可能性は少ない。も しＡＡＡＡＡＡＡはポジティブならば、２つのプローブは通常ポジティブである 。この場合のシークエンシング・プロセスは、まずはじめに、ポジティブ・アン カーを定義し、つぎに連続してプローブを選択するために最小限にオーバーラッ プされたプローブのサブセットにハイブリダイズするもので、アンカーのオーダ とアンカー間のギャップの大きさおよびタイプとについてもっとも見込みのある 仮説の一つを立証する。これの第２のフェーズでは、２〜１０のプローブのプー ルを使用する。各プローブは一つのＤＮＡ試料においてポジティブとなるように 選択されるとともに、このＤＮＡ試料はプールの他のプローブによってポジティ ブであると予想される試料とは異なるものである。 サブ配列によるアプローチは、多岐にわたる問題点を解決するという点でプロ ーブの競合（オーバーラップしたプローブ）またはプローブの協同の効率的な実 施を可能とする。プローブの普遍的セットのハイブリダイゼーションの後に、シ ークエンス・アセンブリ・プログラムは候補となるシークエンスのサブフラグメ ント（ＳＦ）を決定する。ＳＦをさらにアセンブルするために、追加の情報が提 供されなければならない（ＤＮＡフラグメントのオーバーラップしたシークエン ス、類似のシークエンス、単一のパス・ゲル・シークエンスから、または他のハ イブリダイゼーションまた は制限マッピング・データから）。ＳＦアセンブリに対して競合的ハイブリダイ ゼーションおよび連続的な積み重ね相互作用が提案されている。これらのアプロ ーチは、均一な配列を用いた場合に付けられた試料に対して標識プローブが適用 されるＳＢＨによる大量の試料のシークエンシングについて実用的価値に限界が ある。幸運にも、複製サブ配列を用いる少数の試料の分析によって、両方のアプ ローチの効率的な実施が可能となる。複製サブ配列の各々において、一つの分岐 点は、同一サブ配列内にスポッティングされた異なる試料における変異したシー クエンスを解決するという点(前述)で類似するプローブのプールを用いた１また はそれ以上のＤＮＡ試料について試験する。 この実施例で述べた６４試料の各々において、約１００分岐点が存在し、さら にもし８試料が各サブ配列において平行に分析されるならば、少なくとも８００ サブ配列プロービングはすべての分岐を解決する。このことは、３０７２塩基プ ロービングに関して８００プロービング（２５％）が追加で用いられる。より好 ましくは、一つの分岐点に対して２つのプロービングが用いられる。サブ配列が よりいっそう小さいとするならば、追加して使用されるプローブはより少なくな る。例えば、もしサブ配列が１６個の試料からなるとすると、２００の追加プロ ーブが判定される（６％）。７量体のプローブ（Ｎ_1-2Ｂ₇Ｎ_1-2）と競合または 協同で分岐を解決するアプローチを使うことによって、約１０００塩基対フラグ メントのフラグメントは約４，０００プロービングとアセンブルされる。さらに 、８量体プローブ（ＮＢ₈Ｎ）を使うことで、４塩基対またはそれよりも長いフ ラグメントが１２，０００プロービングとアセンブルされる。ギャップが形成さ れたプローブ、例えばＮＢ₄ＮＢ₃ＮまたはＮＢ₄ＮＢ₄Ｎは分岐点の数を減らすの に使用される。 実施例１４ プローブのサブ配列に対する一時的付着および 標識プローブのリゲーションによるＤＮＡ分析 ４ないし４０塩基の有益な長さを持つオリゴヌクレオチド・プローブは標準的 な化学によって合成されて試験管または多穴プレートに格納される。１ないし１ ０，０００プローブ含まれるプローブの特定セットは、デポジッションまたはin situ合成によって分離支持体または大きな支持体の独立したセクション上に配 列される。最後の場合、セクションまたはサブ配列は物理的または疎水性の障壁 によって分離される。プローブの配列はin situ 合成によって調製される。適当 なサイズの試料ＤＮＡを一つまたはそれ以上の特定配列とハイブリダイズさせる 。多くの試料が、同一サブ配列でプールとしてあるいは一つの支持体にある異な るサブ配列によって独立して確認（interrogate）される。試料と同時に、ある いは続いて、単一標識プローブまたは標識プローブのプールをサブ配列の各々に 加える。もし付着し、かつ標識されたプローブが試料ＤＮＡの相補的ターゲット 上に背中合わせにハイブリダイズするならば、それらはリゲーションされる。リ ゲーションの発生はプローブから標識を検出することによって測定されよう。 この方法は、上記したＤＮＡ分析の一つの変形例であり、ＤＮＡ試料は支持体 に永久的に付着しているものではない。支持体に固定されたプローブによって一 時的付着が提供される。この場合、ターゲットＤＮＡを配列させるプロセスは必 要ではない。さらに、リゲーションは短い標識されたプローブを短い固定された プローブと結合させることによって長いオリゴヌクレオチド配列を検出すること を可能とさせる。 プロセスにはいくつかの独特な特徴を有する。基本的には、ターゲットの一時 的付着によって再利用が可能となる。リゲーションが起こった後、ターゲットは 解放され、さらに標識は支持体に対して共有結合してとどまる。この特徴によっ て、ターゲットの循環と少量の該ターゲットによって検出可能なシグナルの生産 とが可能となる。最適な条件下では、ターゲットを増幅させる必要はない。例え ば、ＤＮＡ試料の天然の源は診断およびシークエンシングの目的に直接利用され る。ターゲットは有効なハイブリ ダイゼーションと有効な２重鎖の効率的な溶解との間の温度を繰り返させること によって解放される。より好ましくは、繰り返しはない。構成要素の温度および 濃度は、遊離のターゲットとハイブリダイゼーションを開始したターゲットとの 平衡状態が５０：５０％の度合いになるように定める。この場合、リゲーション された産物の生産が連続する。目的に応じて平衡比を変えて最適化する。 電界を用いてターゲットの使用を強化させてもよい。最初に、各サブ配列にお いて水平方向の磁界パルスを用いてターゲットのソーティングを早める。このフ ェーズでは、平衡はハイブリダイゼーションのほうへ移動し、未標識のプローブ が使用される。ターゲットソーティング・フェーズの後、適当な洗浄（試料の動 きを制限する垂直方向の電界が役に立つ）を行う。数サイクルの選別的ハイブリ ッド溶解、ハイブリダイゼーションおよびリゲーションによるターゲットの回収 、および未使用のターゲットの除去を導入して特異性を高める。次のステップで は、標識プローブを添加し、垂直方向の電界パルスを印加する。温度を上昇させ ることによって、最適な遊離ターゲットとハイブリダイズしたターゲットとの最 適な比が達成される。垂直方向の電界は選別されたターゲットの拡散を防ぐ。 固定プローブのサブ配列および標識プローブのセット（特別に設計されるか、 もしくは普遍的なプローブ・セットから選択）を種々の方法で配列して効率的で 、かつ適応性のある塩基配列決定および診断プロセスを可能とする。例えば、も し細菌のゲノムの短いフラグメント（約１００〜５００塩基対）が部分的あるい は完全にシークエンスされるならば、既知のシークエンスにもとづいて設計され たプローブの小さな配列（５〜３０塩基の長さ）が使用される。もしサブ配列あ たり１０の標識プローブからなる異なるプールによって確認されるならば、各々 が１０個のプローブを有する１０種類のサブ配列のうちの一配列は２００塩基の チェックを可能とするので、リゲーションによって結合した２つの塩基のみが判 定されると推測される。ハイブリッド全体にわたって不整合が見分けられる条件 下で、プローブを一つ以上の塩基と置換して長いターゲットを同数のプローブで カバーする。長いプローブを用いることによって、ターゲットは試料中の残りの ＤＮＡから増幅または単離されることなく直接確認される。また、一試料でいく つかのターゲットを同時に分析（スクリーニング）してもよい。もし得られた結 果が突然変異（または病原体）の発生を示すものならば、プローブのプールを追 加して突然変異の種類あるいは病原体の亜型を検出する。このことは患者の一部 のみに感染または突然変異があると予期する予防診断上において費用対効果が高 いプロセスの所望の特徴である。 実施例に記載したプロセスでは、種々の検出方法が使用される。例えば、放射 線標識、蛍光標識、酵素または抗体（化学的発光）、光の散乱または干渉分析に よって検出可能な巨大分子または粒子である。 実施例１５ ＳＢＨに好適なオリゴヌクレオチド・プローブおよびターゲット （フラグメント-クローンの数）ｘ（プローブの数）行列として定義される実 験的シークエンス・データを得るために、プローブの数を使用するフラグメント の数に応じて少なくするか、あるいはその逆を行う。２種類の数の最適な比率は ハイブリダイゼーションプロセスによる特定の塩基配列決定における技術的要求 によって定まる。 プローブの長さを選択する上で影響を与える２つのパラメータがある。第１は 所望の選別度合いを示すハイブリダイゼーション結果を得る点で成果を納めるこ とである。第２は所望の数のプローブを合成する技術的実現性である。 実用的かつ有効な量のターゲット核酸によってハイブリダイゼーションを十分 に弁別することを要求することによって、プローブの長さが限定される。短いプ ローブでは十分な量のハイブリッドを得ることが困難であり、また長いプローブ との末端不整合を弁別することが困難である。従来は、文献によれば１１量体よ りも短いプローブを用いることは、非常に安定したプローブに限定されていた（ Ｅstivill et al.，Ｎucl．Ａcids Ｒes．15: 1415 (1987)）。一方、１５塩基よりも長いプローブは何とか末端不整合を弁別する（ Ｗood et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 82: 1585(1985)）。 不安定なプローブおよび末端不整合の弁別上の問題点を解決する一つの解決策 は、情報的な意味において単一の短いプローブを表す長いプローブの一群を使用 することである。例えば、１６個の１０量体からなる群を単一８量体のかわりに 使用する。この群の各メンバーは共通のコア８量体と外側の位置に３通りの可能 性のあるバリエーションのうちの一つと各末端に２通りのパリエーションを有す る。このプローブは、５’（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）Ｂ₈（Ａ，Ｔ ，Ｃ，Ｇ）３’として表すことができる。この種のプローブによって、内側の８ 量体が読み取られるだけなので非情報的末端塩基（２つの５’末端にあり、一つ は３’末端にある）を弁別する必要がなくなる。この解決策では、ハイブリダイ ゼーション反応においてよりいっそう質量の大きいプローブと標識とが用いられ る。 これらの不都合な点は６量体ほど短いオリゴマー・プローブに対する弁別ハイ ブリダイゼーション条件のわずかな組み合わせを用いることによって排除される 。ハイブリダイゼーション反応の数は、不一致な標識プローブの数に依存する。 したがって、オリゴヌクレオチド数よりも少ない数のフラグメントクローンを用 いて短い核酸の塩基配列決定を行う場合、オリゴマーをターゲットとして用い、 かつ核酸フラグメントをプローブとして用いることが望ましい。不確定のシーク エンスを持つターゲット核酸は、異なる大きさのゲノム・フラグメントからなる 挿入を持つファージまたはプラスミド・ベクターにおいて、あるいはＰＣＲによ って調製されたプラスミドにおいて典型的なライブラリの混合物として作られる 。シークエンスされたフラグメントの並びにおける避けることができないギャッ プおよび不確実性は、複合ゲノムのノンランダムまたは繰り返しシークエンスの 構成や大腸菌（Ｅscherichia coli）の毒性シークエンスのクローニングの困難 さによって生ずる。これらの問題は任意の方法を用いて大きな複合分子をシーク エンシングする上で固有の問題である。そのような問題は、ライブラリおよびハ イブリダイゼーションに使用するサブクローンの数の選択 によって最小限にすることができる。あるいは、そのような困難さを増幅ターゲ ットシークエンス、例えばＰＣＲ増幅、リゲーション反応、リゲーション増幅反 応等を使うことによって克服することができよう。 核酸や、核酸の単離、クローニング、およびシークエンシングは当業者によく 知られていることである。例えば、Ａusubel et al.,Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology，Ｖol．1-2，Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons(1989)、およびＳamb rook et al.,Ｍolecular Ｃloning Ａlaboratory Ｍanual,2nd Ｅd.,Ｖols.1-3, Ｃold Ｓprings Ｈarbor Ｐress(1989)を参照せよ。これら両方の文献を本明細 書の一部として援用する。 ＳＢＨは十分に開発された技術であり、当業者に知られている方法のいくつか によって実施される。特に、以下の文献のハイブリダイゼーション法によるシー クエンシングに関連した技術を本明細書の一部として援用する。すなわち、Ｄrm anac らの米国特許第 5,202,231 号（本明細書の一部として援用）、１９９３年 ４月１３日発行、Ｄrmanac et al.,Ｇenomics,4,114-128(1989)、Ｄrmanac et a l.,Ｐroceedings of the Ｆirst Int'l．Ｃonf.Ｅlectrophoresis Ｓupercomput ing Ｈuman Ｇenome Ｃantor,ＤＲ＆Ｌm ＨＡeds,Ｗorld Ｓcientific Ｐub.Ｃo .,Ｓingapore,47-59(1991);Ｄrmanac et al.,Ｓcience，260，1649-1652(1993); Ｌehrach et al.，Ｇenome Ａnalysis:Ｇenetic and Ｐhysical Ｍapping，1， 39-81(1990)，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress; Ｄrmanac et al.， Ｎuci．Ａcids Res.，4691(1986);Ｓtevanovic et al.,Ｇene,79,139(1989);Ｐa nusku et al.,Ｍol.Ｂiol.Ｅvol.,1,607(1990); Ｎizetic et al.,Ｎuci.Ａcids Ｒes.,19，182(1991); Ｄrmanac et al.,Ｊ.Ｂiomol.Ｓtruct.Ｄyn.,5，1085(1 991);Ｈoheisel et al.,ＭoＬ Ｇen.,4, 125-132(1991);Ｓtrezoska et al.,Ｐr oc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ),88,10089(1991); Ｄrmanac et al.，Ｎuci．Ａ cids Ｒes.，19，5839(1991); およびＤrmanac et al.,in:.Ｊ.Ｇenome Ｒes.， 1，59-79(1992)。 実施例１６ ハイブリダイゼーションデータから決定されるシークエンス シークエンス・アセンブリは、任意のオーバーラッピング（Ｎ−１）量体が２ 回以上複製される場合は必ず中断される。最後のヌクレオチドが異なる２つのＮ 量体を用いてシークエンスを延長する。この分岐点はシークエンスの不明瞭では ないアセンブリに制限を加える。 ターゲット核酸の完全なシークエンスを作るためにターゲット核酸にハイブリ ダイズする既知のオリゴヌクレオチドのシークエンスの再アセンブリはいくつか のケースでは達成されない。このことは、ハイブリダイゼーションに用いられる オリゴヌクレオチドの大きさに関係した適当な大きさのフラグメントのなかにタ ーゲット核酸がない場合に何らかの情報が失われるからである。損失情報量はシ ークエンスされているターゲットの長さに比例する。しかし、もし十分に短いタ ーゲットが使用されるならば、シークエンスは不明瞭なことなく決定される。 ある長さのＤＮＡに沿って分布するシークエンス・アセンブリと干渉する複製 シークエンスの予想頻度を計算する。この導出にはシークエンスの構成と関わり あるパラメータの定義を導入することを要求される。すなわち、シークエンス・ サブフラグメント（ＳＦ）。シークエンス・フラグメントは、ターゲット核酸の シークエンスの任意の部分が、ターゲットシークエンス内で２回以上繰り返した （Ｎ−１）量体によって開始および終了する場合、シークエンス・サブフラグメ ントが結果として生ずる。したがって、サブフラグメントは本発明の方法におい てシークエンスをアセンブリするプロセスでの分岐の２つの点間に生ずる。すべ てのサブフラグメントの合計は、短い末端が重なり合うので実際のターゲット核 酸よりも長い。一般に、サブフラグメントは追加の情報なしに直線状には集合す るものではない。なぜなら、開始および終了部分で（Ｎ−１）量体を共有するか らである。繰り返し（Ｎ−１）量体の数に応じて各核酸ターゲットに対して異な る数のサブフラグメントが得られる。数はＮ−１の値とターゲットの長さとに依 存する。 確率計算によって、２つのファクタの相互関係を評価することができる。 もしポジティブなＮ−量体のオーダリングが長さＮー１Ｐで、あるいは平均距離 Ａ。でオーバーラップしているシークエンスを用いることによって達成されると するならば、Ｌｆ塩基の長さのフラグメントのＮ−１は以下の式で表される。 式中、Ｋは２以上、またＰ（Ｋ、Ｌ_f）は長さがＬ_f塩基のフラグメント上でＮ量 体がＫ回生ずる確立を表す。また、任意に与えられたシークエンスに対するＮ量 体の内容からサブフラグメントを形成することが可能なコンピュータ・プログラ ムを下記の実施例８に示す。 サブフラグメントの数は、所定の長さのプローブに対するフラグメントの長さ の増加に伴って増加する。得られたサブフラグメントは、それら自身の間で一意 的にオーダーされることはない。完全ではないが、この情報は比較によるシーク エンスの分析および機能的シークエンス特性の認識にたいへん有用である。この タイプの情報は部分シークエンスと呼ばれる。部分シークエンスを得る別の方法 は、所定の長さのオリゴヌクレオチド・プローブのサブセットのみを使うことで ある。 理論にもとづいて予測されたシークエンスとランダムＤＮＡ配列についてのコ ンピュータ・シミュレーションとの間に相対的に良好な一致が認められる。 例えば、Ｎ−１＝７，［５’（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）Ｂ₈（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）３’］ 型の８量体または１６の１０量体からなる群を用いる］について、２００塩基の ターゲット核酸は平均した３つのサブフラグメントを持つであろう。しかし、平 均値まわりの分散のため、ターゲット核酸のライブラリは５００塩基対の挿入を 有するものでなければならず、それによって２０００ターゲットの１未満が３を 上回る数のサブフラグメントを有する。したがって、ランダム・シークエンスの 長い核酸のシークエンス決定の理想的なケースでは、ターゲット核酸の十分に短 い挿入を有する典型的なライブラリ を使用する。そのような挿入によって、本発明の方法により個々のターゲットを 再構築することが可能である。 大きい核酸のシークエンス全体が、所定の個々の挿入の重ね合わせによって得 られる。 非常に短いフラグメント、例えば８量体プローブの５０塩基に対する必要性を 少なくするために、クローニング、またはランダムＰＣＲのような各ランダムＤ ＮＡフラグメンテーション・プロセスに存在するオーバーラップしたフラグメン トに含まれる情報を使用する。また、短い物理的核酸フラグメントのプールを使 用することが可能である。１メガ塩基をシークエンスするための５’（Ａ，Ｔ， Ｃ，Ｇ）Ｎ₈（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）３’様の８量体または１１量体を使うことによ って、２０，０００５０塩基対フラグメントを必要とするかわりに、たった２， １００の試料で十分である。この数は、７００個のランダム７ｋｂクローン（基 本ライブラリ）、５００塩基対（サブフラグメント・オーダリング・ライブラリ ）の２０クローンからなる１２５０プール、およびジャンピング（または類似の ）ライブラリの１５０クローンから構成される。開発されたアルゴリズム（実施 例１８参照）は上記試料のハイブリダイゼーション・データを用いるシークエン スを再生する。 実施例１７ オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション オリゴヌクレオチドをＧｅｎｏｓｙｓ社（Ｈouston,Ｔexas）から購入、また はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザによっ て合成した。使用したプローブのほとんどは、ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動によ って精製した。例えば、プローブはインタフェロンの単一の完全な相補的ターゲ ット、Ｍ１３クローン含有９２１ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ II ヒトＢ１−イン タフェロン・フラグメント（Ｏhno and Ｔangiuchi,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.74 : 4370-4374(1981)、およびＭ１３ベ クターそれ自身に末端塩基不整合を持つ少なくとも一つのターゲットを有するよ うに設計された。 オリゴヌクレオチドの末端標識を記載[Ｍaniatis et al.，Ｍolecular Ｃloni ng: Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｃold Ｓpr ing Ｈarbor，Ｎew Ｙork(1982)]に従って、Ｔ４−ポリヌクレオチド・キナーゼ （５単位 Ａmersham 社）、γ^32p−ＡＴＰ（３．３ｐＭ、１０μＣｉ Ａmersham 社、３０００Ｃｉ／ｍＭ）、およびオリゴヌクレオチド（４ｐＭ、１０ｎｇ）を 含有する１０μｌで行った。プローブの特異的活性は２．５〜５ ｘ １０９ｃ ｐｍ／ｎＭであった。 一本鎖ＤＮＡ（０．５ＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌに２ないし４μｌ）を同一 溶液で湿潤し、０．０５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ６．５で中和し、８０℃、６０ 分間オーブンでベーキングし、さらに１分間紫外線照射したジーン・スクリーン ・メンブラン上にスポットした。つぎに、フィルタをハイブリダイゼーション溶 液（０．５Ｍ Ｎａ₂ＰＯ₄ ｐＨ７．２、７％ラウロイル・サルコシン・ナトリ ウム）に室温で５分間インキュベートし、プラスチック製ペトリ皿の表面に置い た。４ｎＭ濃度の³²Ｐ末端標識オリゴマー・プローブを含むハイブリダイゼーシ ョン溶液（１０ Ｏｌ、０．５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７．２， ７％ラウロイ ル・サルコシン・ナトリウム）の一滴を、フィルタあたり１〜６ドットにわたっ て置き、一枚の矩形状になったポリエチレン（約１ｘ１ｃｍ）を重ねて置き、さ らに指示された温度で３時間にわたりモイスト・チャンバーでインキュベートし た。ハイブリダイゼーションの停止は、フィルタを６ｘＳＳＣ洗浄用液に３ｘ５ 分間、０℃で置くことによってハイブリダイズしていないプローブを除去した。 フィルタを乾燥させるか、あるいはさらに指示された時間および温度でもって洗 浄し、オートラジオグラフィにかけた。選別測定のために、オートラジオグラフ ィ［フォスフォイメージャー（Ｍolecular Ｄynamics,Ｓunnyvale，Ｃalifornia ）後に乾燥フィルタからドットを切り取って液体シンチレーション・カクテルに 入れてカウントを行った。ＩＦおよびＭ１３ドットに対するｃｐｍの未補正比を Ｄとする。 ここに報告した条件で、たいへん短いオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼ ーションが可能となるが、ターゲット核酸に相補的であり、かつ結合する整合し たオリゴヌクレオチドと不整合したオリゴヌクレオチドとの間の確実な弁別がな される。完全に相補的なターゲットとハイブリッドに単一の不整合がある不完全 に相補的なターゲットとの間の弁別度（Ｄ）を定める。実験的な試験では、２つ のＭ１３クローンまたはメンブラン・フィルタに結合したモデル・オリゴヌクレ オチドに対して、長さが６ないし８ヌクレオチドの２８個のプローブのドット・ ブロット・ハイブリダイゼーションが達成された。実験手法を導く原理を以下に 説明する。 プローブ過剰の条件でプローブよりも長い核酸がわずかであるフィルタに結合 したターゲット核酸に対するオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションは、 ターゲット濃度に関して擬１次反応である。この反応は以下のように定義される 。 式中、Ｓ_tおよびＳ_oは、それぞれ時間ｔおよび時間ｔ_oでのターゲット・シー クエンス濃度である。（ＯＰ）はプローブ濃度であり、またｔは温度である。ハ イブリッド形成の速度定数ｋｈは０℃から３０℃の範囲でわずかながら増加する （Ｐorschke and Ｅigen,Ｊ.Ｍol.Ｂiol．62:361(1971);Ｃraig et al.,Ｊ．Ｍo l.Ｂiol.62:383(1971)]。ハイブリッド融解はハイブリッド濃度に関して１次反 応である（ここで、フィルタ結合状態に応じて質量に置き換える）。 この等式では、Ｈ_tおよびＨ_oは、それぞれ時間ｔおよび時間ｔ_oでのハイブリ ッド濃度である。ｋ_mは温度および塩濃度に依存したハイブリッド融 解の速度定数である［Ikuta et al.,Ｎucl．Ａcids Ｒes．15: 797(1987);Ｐors clike and Ｅigen,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.62:361(1971);Ｃraig et al.,Ｊ.Ｍol.Ｂiol. 62: 303(1971)]。鎖連結プロセス、戻し、融解、または鎖解離であるハイブリダ イゼーション中、反応が同様に起こる。したがって、時間内に形成されたハイブ リッドの量はフォワード反応およびバック反応の結果である。平衡状態は、プロ ーブ濃度を増加し、さらに（または）温度を減少されることによってハイブリッ ド形成に動く。しかし、大容量の用緩衝液内での洗浄サイクル中、融解反応が優 勢となり、プローブが存在しないのでバック反応ハイブリダイゼーションは取る に足らない。この分析は、プローブ濃度または温度で変動する実行可能な短オリ ゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション（ＳＯＨ）条件を示す。 Ｄまたは弁別は４番目の式によって定義される。すなわち、 Ｈ_p（ｔ_w）およびＨｉ（ｔ_w）は、それぞれ完全および不完全に相補的な二重 鎖の同一量に対する洗浄時間ｔｗ後に残存するハイブリッドの量である。所定の 温度で、弁別Ｄは洗浄時間の１０で変化し、式５であるＨ_i＝Ｂのときに最大値 に達する。 バックグラウンドＢはシステムが検出することが可能な最も低いハイブリダイ ゼーション・シグナルを表す。Ｈ_iのさらなる減少は何等試験されていないので 、洗浄を続けることによってＤが減少する。ｔ_w時間洗浄を続けるとＢに対して Ｈ_pが減少する。不完全なハイブリッドに対する最適な洗浄時間ｔ_wは、式３およ び式５から、 Ｈ_pは式を結合して同一ｔｗで洗浄されるので、最適弁別関数が得られる。す なわち、 Ｔの関数としてのＤの変化が重要である。なぜなら、最適な洗浄時間が選択され るからである。それは以下のアレニウスの式： を先の等式に代入して最終的に以下の等式にする。すなわち、 式中、ＢはＨ_i（ｔ_o）よりも小さい。 完全なハイブリッドの活性エネルギーＥ_α、pおよび不完全なハイブリッドの活 性エネルギーＥ_α、iを共に等しく、あるいはＥ_α、pよりもＥ_α、iを少なくするこ とができるもので、Ｄは温度に無関係であり、あるいは温度の上昇にともなって 減少する。この結果は、ＳＯＨにおける良好な弁別にとって厳しい温度条件を探 すことは不当であることを暗に示している。より低い温度で洗浄することによっ て、等しいあるいは良好な弁別が得られる。しかし、温度が減少するとそれにと もなって指数関数的に洗浄時間が長くなる。Ｈ_p（ｔ_o）に比較してＨ_i（ｔ_o）が 増加すると、弁別はＴによってよりいっそう強く減少する。 より低い温度でＤは、Ｈ_p(ｔ_o)／Ｈ_i（ｔ_o）比よりもＨ_p(ｔ_o)／Ｂ比が高い率 であることに依存する。この結果は、このステップで達成される弁別に関わりな くハイブリダイゼーションにおけるＨ_pの十分な量を得ることが望ましいことを 示している。良好な弁別は洗浄によって得られる。なぜならよりいっそう量の多 い完全なハイブリッドによって効果を示すまでの特異な融解のための時間をより 多くかけることが可能となる。同様に、 よりいっそう多くの標的核酸を用いることによって、たとえＫ_m,pとＫ_m,iとの間 がわずかな差であったとしても必要な弁別が達成される。 この単純なモデルでカバーされるよりもより一層複雑な状況を考えると、所定 の核酸ターゲット内の数多くの末端不整合を有するプローブのハイブリダイゼー ションの場合に弁別を得る上で、低い温度で洗浄することはよりいっそう重要で あることを結果が示している。 上記理論的原理を実験のガイドとして用いることによって、信頼性のあるハイ ブリダイゼーションが長さ６ないし８ヌクレオチドのプローブによって得られる 。すべての実験は、フィルタ上のハイブリダイゼーション溶液の膜を提供する浮 遊するプラスチック製のシートを用いて実施した。この手法によれば、プローブ の量を最大限少なくし、それによってドット・ブロット・ハイブリダイゼーショ ンにおける標識のコストも減少させる。ラウロイル硫酸ナトリウムの代わりに高 濃度のラウロイル・サルコシン・ナトリウムを含むハイブリダイゼーション用燐 酸用緩衝液によって室温から１２℃に反応温度を落とすことが可能となる。同様 に、４〜６ＸＳＳＣ、２０％ラウロイル・サルコシン・ナトリウムによって２℃ ほどの低温でのハイブリダイゼーションが可能となる。このような用緩衝液に含 まれる界面活性剤は、標識プローブの濃度が４０ｎＭまで許容できるバックグラ ウンドを得るためのものである。短いオリゴヌクレオチド・ハイブリッドの耐熱 性に関する予備的な特徴を、Ｇ＋Ｃ含量が５０％のプロトタイプのオクタマー、 すなわちシークエンスＴＧＣＴＧＡＴＧのプローブ上で決定した。理論的に予想 できることは、このプローブが安定性が低いオクトタマーの一つであるというこ とである。その遷移エントロピーはよりいっそう安定なヘプタマー、あるい長さ が６ヌクレオチドの場合と同じである(Ｂresslauer et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcd. Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.83: 3746(1986))。パラメータＴ_d、ハイブリッドの５０％が一分 の単位時間内で融解する温度は１８℃である。結果によれば、Ｔ_dは１１塩基対 二重鎖よりも８塩基対ハイブリッドの方が１５℃低い［Ｗallance et al.，Ｎuc leic Ａcids Ｒes.6: 3543(1979)］。 モデル・オリゴヌクレオチドによる実験に加えて、短いオリゴヌクレオチド・ ハイブリダイゼーションの実質的なデモンストレーションを行うために、システ ムとしてＭ１３ベクタが選択される。主な目的は、本発明の方法の種々の用途で 使用されるものに類似の標的によって実用的な末端不整合の弁別を示すことであ る。Ｍ１３モデルのオリゴヌクレオチド・プローブは、Ｍ１３ベクタ自身が末端 が不整合した塩基を含むように選択される。ベクターＩＦ、９２１塩基対ヒト・ インターフェロン遺伝子挿入を含むＭ１３組換え体は、単一の完全に整合したタ ーゲットを運ぶ。したがって、ＩＦはＭ１３ベクタそれ自体と比較して同数の、 あるいはより多くの不整合したターゲットを有する。 低温度条件およびドット・ブロットを用いることで、完全および不整合したタ ーゲットを含むタイ・ドット（tie dot）と不整合したターゲットのみを含むド ットとの間でハイブリダイゼーション・シグナルにおける十分な差が得られる。 このことは、６量体オリゴヌクレオチドにとって真実であり、また核酸の大きな ＩＦ−Ｍ１３対にハイブリダイズした７量体および８量体オリゴヌクレオチドに とっても真実である。 ハイブリダイゼーションのシグナルは、プローブとの反応のためのフイルタ上 で有効なターゲットの量に依存する。必要な対照群は、サイン強度の違いは２つ のドットにおける核酸の量の変化を反映するものではないことを示すためのもの である。数が同じで、かつ同様のターゲットをＩＦおよびＭ１３の両方に持つプ ローブとのハイブリダイゼーションは、ドット中に等しい量のＤＮＡが存在する ことを示す。ハイブリッド形成の効率はハイブリッドの長さによって増加するこ とから、６つのヌクレオチドを持つ二重鎖に対するシグナルは、フィルタに結合 した大量のオリゴヌクレオチド・ターゲットによって最適に検出された。分子量 が低いことから、ターゲットを兼ねる核酸の巨大分子と比較した場合に大量のオ リゴヌクレオチド・ターゲット分子が所定の表面領域に結合することができる。 未精製ＤＮＡを用いた検出の感度を測定するために、様々な量のファージ上澄 みを前記フィルター上にスポットし、³²Ｐで標識したオクタマー でハイブリダイズした。０．５ｎｇ以上のＤＮＡを含む最少５億個の未精製ファ ージにより、前記短オリゴヌクレオチド雑種形成法の感度が十分であることを示 す検出可能なシグナルが得られた。反応時間は短かく、実用性に加味される。 前記理論の節で述べたように、ハイブリッドの平衡収量はオイル・プローブ濃 度および／または反応温度に依存している。例えば、１３℃で４ｎＭのオクタマ ーを含む同量の標的におけるシグナルレベルは、プローブ濃度が４０ｎＭの標的 より３倍も低く、ハイブリダイゼーション温度を２５℃に上げることにより４． ５倍低下する。 最大弁別（maximal discrimination）を実現するために低温度洗浄の使用を実 施する。現象を明瞭に視覚化するために、ベクトル固有プローブによるハイブリ ダイゼーションを用いる前記ＩＦドットに添加するより５０倍ものＤＮＡを前記 Ｍ１３ドットに添加した。このようにして、活性プローブを用いたハイブリダイ ゼーション・ステップの後のシグナルを、前記適合したケースにおけるシグナル に不適合な場合において、増強した。Ｈ_p：Ｈ_i比は１：４であった。７℃での長 い洗浄の後のシグナル強度の反転は、完全ハイブリッドの大きな損失なしに実現 され、その結果、比は２：１になった。これに対して、２５℃でなんらかの識別 を実現することは不可能である。というのは、適合標的シグナルは２分間の洗浄 により既にバックグランドレベルに低下しており、同時に、不適合ハイブリッド からのシグナルは未だに検出可能であるからである。 ７℃に比較した場合の１ ３℃における識別損失は、それほど大きくないが、はっきりと視認できる。前記 不適合ハイブリッドシグナルがバックグランドレベル近くにあり、それぞれの条 件に対して最少の洗浄時間を示している、７℃での９０分時と１３℃での１５分 時とを考察すると、１３℃における場合より７℃における場合の方が量的に数倍 大きいことが明らかである。このことをさらに説明すると、前記二つの温度で開 始ハイブリッドの同量を洗浄して、その変化を識別する時間行程をたどると、前 記低温度でより高い最大値Ｄが示される。この結果により、前記洗浄ステップの 開始時における温度と二つの タイプのハイブリッドの量比率とによって、Ｄが変化しやすいことが、確かめら れた。 短オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション条件の一般的使用を示すため に、我々は、我々のＭ１３単一システムにおける長さ１２核酸までの４ヘプタマ ー、１０オクタマーおよび他の１４プローブ類のハイブリダイゼーションを、参 照した。これらは、二つのＧＣ含量過剰物を示しているノナマーＧＴＴＴＴＴＴ ＡＡとオクタマーＧＧＣＡＧＧＣＧを、含んでいる。ＧＣ含量およびシークエン スは短ハイブリッドの安定性に影響を与えるものと考えられているが［Ｂressla uer et al.,Ｐroc.Ｎati．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.83: 3746(1986)］、低温度、 短オリゴヌクレオチド条件は、充分な識別を実現するすべてのテスト済みのプロ ーブに適用可能であった。１３核酸長さのプローブを用いて得られた最適識別値 は２０であったので、シークエンス変化に応じて数倍の滴下数が容易に許容され る。 前記Ｍ１３システムは、複雑な標的ＤＮＡの作用を前記識別レベルについて表 す利点を有する。０または５つの不適合標的のいずれかとを有し、一つのＧＣ対 だけが異なっている二つのオクタマーについて、測定された識別値は、それぞれ １８．３および１．７であった。 この方法の使用を示すために、ブルースクリプト・ベクトル（Ｂluescript ve ctor）のライブラリーから調製した５１プラスミドＤＮＡドットの集合について 、８核酸長さの３つのプローブがテストされた。一つのプローブはブルースクリ プト・ベクトルに存在し、固有であったが、Ｍ１３には存在せず、他の２つのプ ローブは周知のシークエンスの挿入体である標的を有していた。このシステムに よれば、ハイブリダイゼーションのネガティブまたはポジティブ制御ＤＮＡの使 用を各プローブを用いて可能にすることができる。また、このプローブ・シーク エンス（ＣＴＣＣＣＴＴＴ）は、前記インターフェロン挿入体に補足標的を有し ていた。前記Ｍ１３ドットは、Ｍ１３またはブルースクリプトのいずれか内の前 記インターフェロン挿入体がポジティブである間、ネガティブであるので、その ハイブリダイゼーションはシークエンス固有である。同様に、前記標的を検出す るプロ ーブは、５１挿入体の一つだけの中に、すなわち前記試験した挿入体のいずれで もない挿入体中に、該クローン中に前記好適な標的が存在する場合にハイブリダ イゼーションが生じることを確認するコントロールに沿って、配列している。 熱安定性は、６〜８の核酸長さであり、少なくとも、１１〜１２の核酸長さの ハイブリッドにおけるより低い１５℃で、大変短いオリゴヌクレオチド・ハイブ リッドにおいて、カーブする［図１およびＷallace et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒ es. 6: 3543-3557(1979)］。しかしながら、低温度で、大変実用的な０．４〜４ ０ｎＭ濃度のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、ハイブリダイゼーション を行うことにより、周知の、または未知の核酸における補足シークエンスの検出 が可能になる。未知の核酸シークエンスを完全に決定するには、６５５３５の８ 量体プローブを含む全セットを用いることができる。この目的のために充分量の 核酸は、数マイクロリットルのＭ１３培地、１０ｍｌのバクテリア培地またはバ クテリアの単一コロニーから調製したプラスミド、または１μｌ未満の標準ＰＣ Ｒ反応物などの入手容易な生物学的試料中に存在する。 ６〜１０の核酸長さの短いオリゴヌクレオチドにより、優れた識別が行える。 不適合な単一末端を有するハイブリッドの安定性における相対的減少は、より 長いプローブにおけるより、大きい。前記オクタマーＴＧＣＴＣＡＴＧで得られ た結果は、この考察を支持している。前記試験において、Ｇ／Ｔ不適合末端を有 する標的、この不適合タイプの標的へのハイブリダイゼーションが、他のタイプ のオリゴヌクレオチドを抜いて、最も安定したものである。実施したこの識別は 、１９対の二重鎖の内部Ｇ／Ｔより大きい１９塩基対の内部不適合Ｇ／Ｔと、同 じか、または大きい[Ikuta et al.,Ｎucl.Ａcids Ｒes.15:797(1987)]。短オリ ゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションにおける前述のハイブリダイゼーショ ン条件を用いるこれらの識別特性を利用することにより、オリゴヌクレオチド標 的の大変正確な測定が可能になる。 完全および不完全ハイブリッド間の識別検出の容易性を比較すると、大 変短いオリゴヌクレオチドを用いることに伴う問題があり、それはハイブリッド の充分量を調製することにある。実際、Ｈ_pとＨ_iとを識別する必要性は、前記ド ットおよび／またはプローブ濃度におけるＤＮＡ量の増加によって、あるいは、 前記ハイブリダイゼーション温度の低下によって、促進される。しかし、高いプ ローブ濃度は通常バックグランドを増加する。さらに、実際に使用する標的核酸 の量には、限界がある。この問題は、４ｎＭで効果的なバックグランドを与える 高濃度な界面活性剤そによって、解決された。濾過するプローブの非固有結合の ため、競争剤(competitors)を用いることによって、または、ハイブリダイゼー ション支持物質を替えることによって、さらなる改善が実現される。さらに、４ ５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のＥαを有するプローブにおいて（例えば、多くのヘプ タマーおよび多数のヘキサマーにおいて）、修飾オリゴヌクレオチドは、その非 修飾複製より安定なハイブリッド［Ａsseline,et al.,Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci .81:3297(1984)］を与える。低温度を用いる短オリゴヌクレオチド・ハイブリダ イゼーションの本発明で説明したハイブリダイゼーション条件により、すべての シークエンスおよび二重鎖ハイブリッド投入に対して、より良い識別が得られる 。異なったシークエンスのハイブリダイゼーション条件において均一性が達成さ れることに支払われるたった一つの対価は、シークエンスに依存して、洗浄時間 が数分から２４時間にまで増加することである。さらに、この洗浄時間は、前記 塩濃度の低減によって、より減少可能である。 ある不適合ハイブリッドに対する一つの適合ハイブリッドの識別は優れたもの であるが、短オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションでは、不適合ハイブ リッドからのシグナルが、不適合末端から得られた多数の不適合ハイブリッドと ともに、存在する。このことにより、所定長さのプローブによって効率的に試験 される挿入サイズが、限定される。 識別におけるシークエンスの複雑性の影響は、無視できない。しかしながら、 複雑性の影響は、固有の、非ランダムなシークエンス用の短オリゴヌクレオチド ・ハイブリダイゼーションによりシークエンス情報を決定す る時に、より顕著であり、標的長さ比が好適なプローブを用いろことにより、克 服することができる。前記長さ比は、識別をなくすか、間違って逆の識別をし得 る多数の末端−不整合物を有する固有なシークエンスが生じる蓋然性がなくなる ように、統計的基盤に基づいて、選択される。結果は、それぞれ、０.６，２.５ ，および１０ｋｂより短い標的核酸投入物について６，７，および８ヌクレオチ ド長さのオリゴヌクレオチドの使用を示唆している。 実施例１８ 八量体および九量体を用いるターゲットの配列決定 この実施例では、用いられたハイブリダイゼーション条件を、実施例１７より 詳しく説明する。八量体および九量体オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ ョンにより得られるデータは、ハイブリダイゼーションによる配列決定が極めて 高度な正確さを付与することがわかる。この実験において、既知のシークエンス を、一連の連続の重複する成分の八量体および九量体オリゴヌクレオチドを推測 するのに用いた。 完全に適合するオリゴヌクレオチドに加えて、不適合オリゴヌクレオチドを調 べた。この不適合オリゴヌクレオチドとは、内部および末端の不適合がオリゴヌ クレオチドおよびターゲットによって形成された二重鎖に生じることである。こ れらの分析において、最も低い実際温度を、ハイブリダイゼーションの形成を最 大にするのに用いた。洗浄は、同温またはより低い温度でなされ、オリゴヌクレ オチド／ターゲットのハイブリダイゼーションの適合に対する不適合のより大き な解離比を利用して、最大の識別を確かにした。これらの条件は、全てのシーク エンスに適用できるとわかっているが、絶対的なハイブリダイゼーションの収量 は、シークエンスに依存すると示している。 仮定することのできる不安定にすることの最も少ない不適合は、簡単な末端不 適合であり、そのため、ハイブリダイゼーションによる配列決定の テストは、末端不適合のオリゴヌクレオチド／ターゲットの二重鎖から完全な適 合のオリゴヌクレオチド／ターゲットの二重鎖を識別する能力である。 ドットブロットフォーマット（dot blot format）における１０５のハイブ リッドするオリゴヌクレオチドのうち１０２という識別値は、シークエンスの高 度に正確な発生を許す２より大きかった。このシステムは、ハイブリダイゼーシ ョン形成およびハイブリダイゼーションの不安定性の影響の分析も可能にする。 ＰＣＲによって調製されたヒトβ−インターフェロン遺伝子の既知の部分の１ ００塩基対、つまり１００ｂｐターゲットシークエンスを、ターゲット核酸への 既知のシークエンスの１０５オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーシ ョンから得られるデータを用いて発生した。用いられたオリゴヌクレオチドプロ ーブが完全にターゲットに相補的である７２の八量体および２１の九量体を含ん だ。９３プローブの組は、一つまたは二つの塩基によって置換されたターゲット シークエンスの連続的な重複フレームを提供した。 不適合の効果を評価するため、ハイブリダイゼーションを、１００ｂｐテスト ターゲットシークエンスにハイブリッドした際に少なくともひとつの末端不適合 を含んだ１２の追加のプローブに対して調べた。１２のオリゴヌクレオチドが４ つの抑制ＤＮＡと完全に適合した二重鎖ハイブリッドを形成するように選ばれた ４つの他の抑制核酸に末端不適合なターゲットを有する、１２のプローブのハイ ブリダイゼーションも試験した。次に、オリゴヌクレオチドとターゲットの内部 不適合、末端不適合、および完全な適合の二重鎖対のハイブリダイゼーションは 、それぞれ実験に用いられたオリゴヌクレオチドに対して評価された。テストの 八量体および九量体オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおける絶 対ＤＮＡターゲット濃度の効果を、同時増幅するプラスミドＤＮＡ内で単一の発 生ターゲットでない部位（single occurrence non- target site）に異なっ たオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することに よってターゲットＤＮＡ濃度を定義することによって決定した。 この実験結果より、ターゲットまたは抑制ＤＮＡへの完全に適合する相補的シ ークエンスを含む全てのオリゴヌクレオチドが、不適合を有するこれらのオリゴ ヌクレオチドよりも強くハイブリッドしているとわった。この結論に達するため に、我々はそれぞれのプローブに対してＨｐおよびＤを調べた。Ｈｐは、テスト ターゲットとオリゴヌクレオチドプローブの間に形成されたハイブリッド二重鎖 の量を定義する。１０５のプローブに対して得られたハイブリダイゼーション０ 〜１０の値のとき、１０５のプローブの６８．５％が２より大きいＨｐを有する ことは、明らかであった。 次の１)および２)の間のシグナル強度の比として定義される識別値(Ｄ)が得ら れた。ここで、１）はテストオリゴヌクレオチドと、ターゲットまたは抑制核酸 の間に形成された完全に適合する二重鎖を含むドットであり、２）は同じヌクレ オチドと、ターゲットまたは抑制核酸内の異なる部位の間に形成された不適合な 二重鎖を含むドットである。Ｄの値の変化は、１）または２）のどちらかから得 られ、ここで、１）はバックグランド上のシグナルの視覚化を可能にするハイブ リダイゼーション効果における摂動であり、２）はテストヌクレオチドおよびタ ーゲットの間にみられる不適合のタイプである。この実験で得られたＤ値は、調 べられた１０５のオリゴヌクレオチドプルーブの１０２に対して２〜４０であっ た。全体として１０２のオリゴヌクレオチドのグループに対するＤの計算より、 Ｄの平均値は１０．６であるとわかった。 オリゴヌクレオチド／ターゲットの二重鎖が末端適合を示すのは２０通りあっ た。これらのうちの５つにおて、Ｄは１０より大きかった。これらの場合での大 きなＤ値はおそらく、最も安定（Ｇ／ＴおよびＧ／Ａ）な末端不適合より他のも のよって生じるハイブリダイゼーションの不安定性によるようである。他の可能 性は、オリゴヌクレオチドかターゲットかのシークエンスにおける誤差があると いうことである。 低いＨｐを有するプローブに対するターゲットにおける誤差は、可能性として 除外された。その理由は、かかる誤差が、他の８個の重複するオリ ゴヌクレオチドのそれぞれのハイブリダイゼーションに影響を与えるからである 。ターゲットシークエンスが正確であることを表す他の重複するオリゴヌクレオ チドのシークエンス不適合のための明らかな不安定性はなかった。オリゴヌクレ オチドシークエンスにおける誤差は、７つの新たに合成されたオリゴヌクレオチ ドのハイブリダイゼーションを再試験した後の可能性として取り除かれた。７個 のオリゴヌクレオチドのうちただ一つが、よりよいＤ値を得た。低いハイブリッ ド形成値は、ハイブリッド不安定性またはハイブリッド二重鎖を形成するための 不可能性から得られる。ハイブリッド二重鎖の形成に対する不可能性は、１）選 ばれたプローブの自己相補性か、２）ターゲット／ターゲットの自己ハイブリダ イゼーションから得られる。プローブが自己相補的であるとき、オリゴヌクレオ チド／オリゴヌクレオチドの二重鎖形成は、オリゴヌクレオチド／ターゲットの 二重鎖形成より好ましい。同様に、ターゲット／ターゲット会合は、そのターゲ ットが自己相補的なら好ましく、内部パリンドロームを形成する。これらの可能 性を評価する際に、プローブ分析から、疑わしプローブはそれ自身とハイブリッ ドを形成しないことは明らかであった。さらに、ターゲット／ターゲットハイブ リダイゼーションの寄与を調べる際に、疑わしいオリゴヌクレオチドプルーブの 一つが、同じターゲットを含む２つの異なるＤＮＡと無効果にハイブリッドする ことを決定した。２つの異なるＤＮＡが同じターゲットシークエンスに対する自 己相補的領域を有するという低い可能性は、ターゲット／ターゲットハイブリダ イゼーションが低いハイブリダイゼーション形成に寄与しないという結果を導く 。従って、これらの結果は、ハイブリッドの形成の不可能性ではなく、ハイブリ ッドの不安定性が、特別なオリゴヌクレオチドに観測された低いハイブリッド形 成の原因になることを表している。この結果は、低いハイブリッド形成が特定の オリゴヌクレオチドの特別なシークエンスのためであるということを表している 。さらに、この結果は、八量体および九量体のオリゴヌクレオチドが用いられる のなら、確かな結果がシークエンスを発生するのに得られることを表している。 これらの結果より、特別なターゲット核酸の長いシークエンスの記載方法の使 用は、構成要素のオリゴヌクレオチドの最大、または独特の重複によって発生す るとわかる。かかる配列決定法は、その頻度および位置にかかわらず、個々の成 分のオリゴマーの内容量に依存する。 下に記載されたアルゴリズムを用いて発生されるシークエンスは、高い適合度 である。アルゴリズムは、４つのより確かでない値を含む１０５のハイブリダイ ゼーションの値から発生したシークエンスが正しいという事実から表されるとき 、ハイブリダイゼーションドットから誤認ポジティブシグナル（false positiv e signals）を容認する。ハイブリダイゼーションによる配列決定におけるこの 適合度は、短いオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの「全てまたは全く ない」動力学、および完全に適合した二重鎖および不適合の二重鎖の間に存在す る二重鎖の安定性の違いによる。適合および末端不適合の二重鎖の二重鎖安定性 の比は、二重鎖の長さが減少するにしたがって増加する。さらに、結合エネルギ ーは、より低いハイブリダイゼーション効果をまねく二重鎖の長さを減少させる ことによって減少する。しかしながら、得られた結果は、八量体ハイブリダイゼ ーションは、二重鎖の安定性および識別性に影響する要素の均衡を可能にし、ハ イブリダイゼーションによる高精度の配列決定法を提供することを示している。 他の実施例で得られた結果は、６、７、または８ヌクレオチドであるオリゴヌク レオチドが、（６量体に対して）０．５ｋｂ、（７量体に対して）２ｋｂ、およ び（８量体に対して）６ｋｂであるターゲットでの確かなシークエンスを生成す るのに、効果的に用いらることを示している。長いフラグメントのシークエンス は重複され、完全なゲノムシークエンスを発生する。 ハイブリダイゼーションによるシークエンスを決定するアルゴリズムを、実施 例１８に記載する。 実施例１９ アルゴリズム この実施例では、開始核酸シークエンスの別個にランダムに定義された最小数 のフラグメントにおいて、ｋ個の要素からなる語から４文字のアルファベットで 書かれた長い配列の発生に対するアルゴリズムを説明する。ここで、Ｋはオリゴ ヌクレオチドプローブの長さである。アルゴリズムは、ハイブリダイゼーション による配列決定（ＳＢＨ）方法の際に、主に用いるだろう。アルゴリズムは、サ ブフラグメント（ＳＦ）、情報フラグメント（informative fragments）（ＩＦ ）および情報フラグメントを定義するための物理的核シークエンスのプールを使 用する可能性に基づいている。 記載したように、フラグメントは、ターゲット核酸内のＫ−１オリゴマーシー クエンスの反復を結果として生じるアセンブリ方法において分枝ポイントに起因 する。サブフラグメントは、シークエンスに起こる長さＫ−１のあらゆる二つの 反復語の間にみられるシークエンスフラグメントである。Ｋ−１語の多発生は、 シークエンス発生の方法におけるＫ−語の重複を整理することを妨害する原因と なる。妨害によって、サブフラグメントの形状を保つシークエンスになる。次に 、その順番が独特に決定されない分枝点の間の明らかなセグメントは、シークエ ンスサブフラグメントと呼ばれる。 情報フラグメントは、重複した物理的シークエンスフラグメントの最も近い末 端によって決定されるシークエンスのフラグメントとして定義される。 特定数の物理的フラグメントを、情報フラグメントを定義する可能性を失うこ となくプールする。ランダムにプールされたフラグメントの全体の長さは、配列 決定方法に用いられるｋ個組（ｋ-tuples）の長さに依存する。 アルゴリズムは、二つの主なユニットからなる。第一部は、シークエンスに含 まれるｋ個組のセットからサブフラグメントの発生に対して用いる。サブフラグ メントは、特定サイズの物理的核酸シークエンスのコードする領域内、または長 い核酸シークエンス内で定義された情報フラグメント内で発生する。両タイプの フラグメントは、基本ライブラリー（basic library） の部分である。このアルゴリズムは、基本ライブラリーのｋ個組の情報フラグメ ントの構成の決定、すなわちシークエス発生方法に用いられるような情報フラグ メントの製造の工程を記載していない。 アルゴリズムの第二部分は、得られたサブフラグメントの一次配列を、基本ラ イブラリーの核酸フラグメントの完全なシークエンスを再生する目的で決定する 。この目的のため、第二のオーダリング・ライブラリ（ordering library）が用 いられ、開始シークエンスのランダムにプールされたフラグメントから作られる 。アルゴリズムは、基本フラグメントのシークエンスを組み合わせ、全体に大き な塩基を加えたシークエンスを再生する工程を含まない。これは、情報フラグメ ント発生の先行条件である塩基ライブラリーのフラグメントの結合を用いて達成 される。代わりの方法として、既存の一般的末端シークエンスを基に、これらの 重複の探索を用いるこのアルゴリズムを用いて基本ライブラリーのフラグメント のシークエンスを発生した後に達成される。 アルゴリズムは、基本およびオーダリングライブラリーの核酸シークエンス内 に付与されたｋ個組の外観の数の知識も必要としないし、ｋ個組の語がフラグメ ントの末端に存在するものの情報も必要としない。アルゴリズムは、種々の長さ のｋ個組の混合した構成要素で操作する。アルゴリズムの考え方によると、ｋ個 組の誤認ポジティブおよび誤認ネガティブを含むｋ個組で操作可能である。特別 な場合のみ、ｋ個組の誤認の内容は、主に、発生されたシークエンスの完全性お よび正確性に影響する。アルゴリズムは、模擬実験の際のパラメータの最適化に 用いられ、同様に、ゲノムＤＮＡシークエンスの発生などの実際のＳＢＨ実験に おけるシークエンス発生に対しても用いられる。パラメーターの最適化の際、実 際のフラグメントと便利なフラグメントのオリゴヌクレオチドプローブ（ｋ個組 ）の選択、および／または定義されたブローブに対するフラグメントの最適な長 さおよび数の選択が、本質的に重要になる。 アルゴリズムのこの部分は、ｋ個組の構成要素からシークエンスの発生方法に おいて中心的役割をする。これは最大の重複によってｋ個組の独特 の順番づけに基づく。シークエンス発生における主な障害は、特定の反復シーク エンスおよびｋ個組の誤認ポジティブおよび誤認ネガティブである。アルゴリズ ムのこの部分の目的は、正確なシークエンスと共に、最小数の最も長い可能なサ ブフラグメントを得ることである。アルゴリズムのこの部分は、ひとつの基本工 程といくつかの制御工程からなる。２工程方法は必要である。その理由は、特定 の情報は、全てのプライマリーサブフラグメントの発生のあとにのみ用いること ができるからである。 シークエンス発生の主な問題点は、定義によって特別なｋ個組の発生数におけ る情報を運ばない用語の内容から反復シークエンスを得ることである。全体的ア ルゴリズムの考え方は、この問題を解決するという基本に依存する。原則的に、 二つの反対のアプローチがある：１）反復シークエンスを、ｐＳＦの発生の方法 の際、初めに得てもよいし、２）反復シークエンスを、サブフラグメントの最終 的順番付けの方法の際位、後に得てもよい。第一の場合、ｐＳＦは過剰のシーク エンスを含み、第二の場合は、含まれるシークエンスは不足している。初めのア プローチは、過剰の発生したシークエンスの除外を必要とし、第二のアプローチ は、シークエンスの最終組立の工程において、いくつかのサブフラグメントの多 くの許容使用を必要とする。 二つのアプローチの違いは、ｋ個組の固有の重複の規則の厳密さの度合いにあ る。より厳格でない規則は、：ｋ個組のＸの最右端のｋ−１がｋ個組のＹの最左 端にのみ存在するときのみ、ｋ個組のＸが明らかにｋ個組のＹと最大限に重ねら れる。この規則は、反復シークエンスおよび余りのシークエンスの発生を可能に する。 第二のアプローチに用いられたより厳しい規則は、追加の警告を有する：もし ｋ個組のＸの最右端のＫ−１が、ｋ個のＹの最左端にのみ存在するなら、および ｋ個組のＹの最左端のＫ−１が、いかなる他のｋ個組の最右端に存在しないのな ら、ｋ個のＸはｋ個のＹと明らかに、最大限に重なる。このより厳密な規則に基 づいたアルゴリズムは、より簡単で、ここに記載されている。 付与されたサブフラグメントの延長方法は、含有される最後のｋ個組の右端の ｋ−１が、いかなるｋ個組の左端にも存在しないか、２こ以上のｋ個組に存在す るときに、停止する。ただ１つのｋ個組に存在するのなら、規則の第二部分をテ ストする。加えて、以前に含まれたものと異なるｋ個組があるのなら、付与され たサブフラグメントの組立を、第一の最も左の位置においてのみ終了する。この 追加のｋ個組が存在しないのなら、状態を独特のｋ−１の重複に対して適合し、 付与されたサブフラグメントは、１要素によって右に延長する。 基本的な規則に加えて、補足の規則を用いて、異なる長さのｋ個組の補充を可 能にする。最大限の重複は、重なっている組のより短いｋ個組のｋ−１の長さで ある。ｐＳＦの発生は、ファイルからの第一のｋ個組から始めるように実施し、 このファイル内のｋ個組は、核酸シークエンスの順番からランダム、および独立 に表される。次に、ファイルの初めのｋ個組は、シークエンスの開始にも、特定 のサブフラグメントの開始にも必要でない。サブフラグメント発生の方法を、独 特の重複によってｋ個組を順番づけることによって実行し、この独特の重複は記 載された方法で決定される。それぞれに用いられたｋ個組を、ファイルから消す 。含まれた最後のものと明らかに重複しているさらなるｋ個組はないというポイ ントで、サブフラグメントの蓄積が終わり、他のｐＳＦの蓄積を始める。大部分 のサブフラグメントの発生が実際の開始から始まらないので、形成されたｐＳＦ は、ｋ個組のファイルに加えられ、より長いｋとして考えられる。他の可能性は 、開始のｋ個組から両方向に進めてサブフラグメントを形成することである。こ の方法は、さらなる重なり、つまりサブフラグメントのいかなる延長が不可能な ときに終了する。 ｐＳＦは、３つのグループに分けられる：１）正確なｋ個組のセットの場合に おいて、最大の長さのフラグメントおよび正確なシークエンス；２）不完全なセ ットにおける最大で明らかな重複の規則の使用のために形成される短いサブフラ グメント、および／またはいくつかの誤認ポジティブのｋ個組を有するセット； および３）不正確なシークエンスのｐＳＦ。２） の組の不正確性は、ハイブリダイゼーション実験の誤認ネガティブの結果によっ て起こり、同様にｋの不正確な組を用いることによって起こる。これらを、ｋ個 組の誤認ポジティブおよび誤認ネガティブのため形成し、これらは、：ａ）誤っ て結合されたサブフラグメント；ｂ）間違った末端を有するサブフラグメント； およびｃ）誤認の最小サブフラグメントとしてあらわれるｋ個組の誤認ポジティ ブである。 ｋ個組の誤認ポジティブを考慮して、中央のどこかにひとつ以上の間違った塩 基を含むｋの存在を可能にするか、同様に末端に間違った塩基を有するｋ個組の 可能性である。短い、間違い、または間違って結合されたサブフラグメントは、 後半のｋ個組によって生じる。前者の二種類のｋ個組は、ｋ個組の長さに等しい 長さを有する間違ったｐＳＦを表す。 疑似ネガティブのｋの場合、ｐＳＦは、最大にまさなる可能性のため発生され る。その最も左および最も右端の間違った塩基を有する疑似ポジティブｋの存在 の場合に、ｐＳＦを明白な重なりの可能性のために生成する。一般のｋ−１シー クエンスを有する疑似ポジティブおよび疑似ネガティブのｋの両方が、ファイル に存在するとき、ｐＳＦはを発生し、これらのｐＳＦの一つは、適切な待ったｔ ｎで間違ったｋを含む。 シークエンスにおける失敗を有するサブフラグメントを直す方法、および明白 に接続されたｐＳＦの結合は、サブフラグメントの発生の後、およびサブフラグ メントを順番にする方法において実行される。接続されないｐＳＦを切断し、ｐ ＳＦの明白な接続によって最終サブフラグメントを得るこをからなる第一工程を 、下に記載する。 誤って連結されたサブフラグメントの形成のアプローチは２つある。第１にお いて、誤ったｋ個組がｋ−１長の反復シークエンスのアセンブリの点上に出現し た場合、誤りが発生する。第２では、反復シークエンスはｋ−１よりも短い。こ れらの状況は、それぞれ２つの変異体において発生する。第１の変異体では、反 復シークエンスの１つがフラグメントの末端を示す。第２の変異体では、反復シ ークエンスが、フラグメントのあらゆる位置で生ずる。第１の可能性(possibili ty)では、連結の誤り(misconnection) を生ずるために、幾つかのｋ個組がファイル（誤認ネガティブ）から存在しない ことが必要とされる。第２の可能性は、ファイル中に誤認ネガティブと誤認ポジ ティブの両方のｋ個組が存在することを必要とする。ｋ−１シークエンスの反復 を考慮すると、末端のいずれか一方が内部的に繰り返されている場合には、唯一 １個のみのｋ個組の欠如で十分である。厳密に内部的な反復には、２つの欠如が 必要とされる。この理由は、シークエンスの末端が情報科学的には誤認ネガティ ブｋ個組の終わりのない直鎖状の配列であると考えられることによる。「ｋ−１ 個の場合より短い」ということから２つまたは３つの特異的で間違ったｋ個組を 必要とするｋ−２個の長さの反復シークエンスのみが考えられる。これらが実際 の実験において検出される唯一の場合であることは非常にありそうなことであり 、それ以外はほとんど稀である。 反復シークエンスがフラグメントの末端に現れない場合には、誤って連結され たサブフラグメントの認識はさらに厳密に定義される。この状況において、さら に２つのサブフラグメントを検出でき、そのうちの一方はその最も左に、かつ他 方はその最も右に、末端ｋ−２個のシークエンスを含有し、このシークエンスも 、上記の誤って連結されたサブフラグメントに存在する。反復シークエンスがフ ラグメントの末端にある場合、ｋ−２シークエンスを含有する１つのみのサブフ ラグメントがあり、その最左端または最右端でサブフラグメント形成における誤 りを生ずる。 誤って連結されたサブフラグメントの切断(cutting)による除去は、通常の規 則に従って行われる。あらゆるサブフラグメントのｋ−２の長さの最左端または 最右端シークエンスが他のサブフラグメントに存在する場合、そのサブフラグメ ントは、２つのサブフラグメントに切断されるべきであり、それらの各々はｋ− ２シークエンスを含有する。この規則は、反復ｋ−１シークエンスの点上に１つ 以上の誤認のネガティブｋ個組がある場合、反復末端の稀有な状況を包含しない 。この種の誤って連結されたサブフラグメントは、オーバーラップしたフラグメ ント、または基本的およびオーダー(ordering)ライブラリーの情報フラグメント からの情報を用いて認識 可能である。さらに、２つ以上の誤認のネガティブｋ個組が、同一のｋ−１シー クエンスを含有する両方の位置で生ずる場合、この誤って連結されたサブフラグ メントは残留する。これは、非常に稀な状況である。その理由は、それが、少な くとも４つの特異的な誤認のｋ個組を必要とするからである。特定のシークエン スが、１つのサブフラグメントの末端および出発からｋ−２以下の短さの配列の 組み合わせにより得られる場合には、もうひとつの規則を導入して、長さｋのシ ークエンス上のこれらのサブフラグメントを切断することが可能である。 記載した規則を厳密に適用することにより、幾つかの完全性が失われて、出力 の精度が確実になる。上記サブフラグメントの幾つかは、誤って連結されていな いにもかかわらず、切断されるであろう。その理由は、それらが、誤って連結さ れたサブフラグメントのパターンに適合するからである。この種の幾つかの状況 がある。例えば、フラグメントは、少なくとも２つの同一のｋ−１シークエンス に加えて、ｋ−１からのあらゆるｋ−２シークエンスを含有するか、あるいは、 少なくとも２回繰り返されるｋ−２シークエンスと、特定のｋ−２シークエンス をその中心等に含有する少なくとも１つの誤認のネガティブｋ個組を含有する。 アルゴリズムのこの部分の目的は、ｐＳＦの数を、補正シークエンスを有する 長いサブフラグメントの最小数まで低減することである。独特に長いサブフラグ メントまたは完全なシークエンスの生成は、２つの状況において可能である。第 １の状況は、反復ｋ−１語の特定の順番に関係する。最大に延長されたｐＳＦ（ ｐＳＦの最初のグループ）の幾つか、または全てを特有に並べることが可能な場 合がある。例えば、フラグメントＳ−Ｒ１−ａ−Ｒ２−ｂ−Ｒ１−ｃ−Ｒ２−Ｅ （そこにおいて、ＳおよびＥはフラグメントの開始および末端であり、ａ、ｂお よびｃは各サブフラグメントに特異的な異なるシークエンスであり、Ｒ１および Ｒ２は縦一列に繰り返された２つのｋ−１シークエンスである）において、５つ のフラグメントが生ずる（Ｓ−Ｒ１、Ｒ１−ａ−Ｒ２、Ｒ２−ｂ−Ｒ１、Ｒ１− ｃ−Ｒ２およびＲ−Ｅ）。それらは、２つの方法で並べられる。すなわち、上記 のオリジナルのシークエンスまたはＳ−Ｒ１−ｃ−Ｒ−ｂ−Ｒ１−ａ−Ｒ−Ｅで ある。一方、同じ数および種類の反復シークエンスを有するが異なって並べられ たフラグメント（すなわち、Ｓ−Ｒ１−ａ−Ｒ１−ｂ−Ｒ−ｃ−Ｒ−Ｅ）では、 全てのサブフラグメントを含有する他のシークエンスはない。この種類の例は、 ｐＳＦの生成のプロセスの後でのみ、認識可能である。それらは、ｐＳＦ生成の 方法における２つの工程の必要性を示す。ファイルが誤認のネガティブおよび／ またはポジティブなｋ個組を含有する場合、非反復ｋ−１シークエンスの位置で の誤認の短いサブフラグメント生成の第２の状況はさらに重要である。 両方のｐＳＦ群の溶液(solution)は、２つの部分を含有する。第１に、存在し ない最小のサブフラグメントとして現れる誤認のポジティブなｋ個組が取り除か れる。いずれか一方の末端に（一方の末端にｋ−ａより長い長さの、かつ他方に ｋ−ｂより長い長さの）オーバーラップを有さない長さｋの全てのｋ個組のサブ フラグメントは除かれて、最大数の連結の形成を可能にする。我々の実験におい て、ａおよびｂの値がそれぞれ２および３であることが、十分な数の誤認のポジ ティブｋ個組を除くのに適当であることがわかる。 独自に連結可能なサブフラグメントの併合は、第２の工程で達成される。連結 の規則は以下のとおりである。つまり、２つのサブフラグメントの関連する末端 または開始におけるオーバーラップ・シークエンスが、他のサブフラグメントの 開始および／または末端に存在しない場合、およびそのような場合にのみ、２つ のサブフラグメントははっきりと連結される。 例外は、考慮される対からの１つのサブフラグメントが同一の始まりおよび末 端を有する場合である。そのような場合、例え、ファイルに存在する末端と同一 の末端を有するもう１つのサブフラグメントがあったとしても、連結は可能にな る。ここにおける主な問題は、オーバーラップ・シークエンスの正確な定義であ る。唯一１対のサブフラグメントに特有のオーバーラップ・シークエンスがｋ− ２よりも短い場合、あるいは、ｋ−２以上であるが、ｋ−４より長い長さのオー バーラップ・シークエンスを有す る別のサブフラグメントが存在する場合、連結は可能にはならない。さらに、ｐ ＳＦの規範的な末端と１つ（また数個）の最後の塩基を除いた後の末端の両方も 、オーバーラップ・シークエンスと考えられる。 この工程の後、幾つかの誤認のポジティブｋ個組（最小のサブフラグメント） および正しくない末端を有する幾つかのサブフラグメントは生き残る。さらに、 特定の数の或る特異的誤認ｋ個組が同時に存在する種々の稀有な状況において、 誤った連結が起こる。これらの場合は検出され、サブフラグメントオーダープロ セス、および切断されない「ミクロ連結された」サブフラグメントの取り扱いと 共にもう１つの調節工程において解決される。 得られる短いサブフラグメントは、２種類である。通常の場合において、これ らのサブフラグメントは、反復ｋ−１シークエンスの分布により、それらの中で はっきりと(unambiguously)連結される。これは、ｐＳＦ生成のプロセスの後で 行われ、ｐＳＦ生成のプロセスにおいて２つの工程が必要とされる良い例である 。誤認のポジティブおよび／または誤認のネガティブなｋ個組を含有するファイ ルを用いる場合、短いｐＳＦが、非反復ｋ−１シークエンスの部位に得られる。 誤認のポジティブなｋ個組を考慮すると、ｋ個組は、１つ以上の正しくない塩基 を含有し（あるいは、中心のどこかに１つの正しくない塩基を含有し）、さらに 末端にｋ個組を含有する。短く誤った（誤って連結された）サブフラグメントの 生成は、後者のｋ個組により起こる。前者の種類のｋ個組は、ｋ個組の長さと等 しい長さを有する間違ったｐＳＦを示す。 アルゴリズムのｐＳＦ部の併合の目的は、正しいシークエンスを有するｐＳＦ の数を長いサブフラグメントの最小数で低減することである。一方の末端におけ る長さがｋ−ａよりも長く、かつ、他方の末端における長さがｋ−ｂよりも長く 、いずれの末端にもオーバーラップを有さない全てのｋ個組のサブフラグメント は、取り除いて、最大数の連結を可能にする。このようにして、誤認のポジティ ブｋ個組の大部分が捨てられる。連結の規則は、次のとおりである。すなわち、 ２つのサブフラグメントの関連す る末端または開始のオーバーラップ・シークエンスがあらゆる他のサブフラグメ ントの開始および／または末端に存在しない場合、かつそのような場合にのみ、 ２つのサブフラグメントは、はっきりと連結可能である。例外は、同一の開始お よび末端を有するサブフラグメントである。その場合、連結は可能になるが、た だし、ファイルに存在するのと同一の末端を有するもう１つのサブフラグメント がある。ここにおける主な問題は、オーバーラップ・シークエンスの正確な定義 である。少なくとも２つの特異的な誤認のネガティブｋ個組がｋ−１またはｋ− ２シークエンスの反復の点に存在すること、さらには誤認のポジティブおよび誤 認のネガティブｋ個組を組み合わせることは、幾つかのオーバーラップ・シーク エンスを破壊または「マスク」して、明白な、しかし誤ったｐＳＦの連結を生ず る可能性がある。これを防止するために、完全性が正確さを犠牲にしなければな らない。連結は、ｋ−２より短い末端シークエンスにおいて、および、ｋ−４よ り長い特別な(extra)オーバーラップ・シークエンスの存在下では可能ではない 。オーバーラップ・シークエンスは、ｐＳＦの末端から決定されるか、あるいは 最後の塩基の１つまたは数個を削除する。 非常に稀有な状況において、特定の数の或る特異的な誤認ポジティブおよび誤 認ネガティブｋ個組が存在する場合、誤った末端を有する幾つかのサブフラグメ ントは製造可能であり、幾つかの誤認のポジティブなｋ個組（最小のサブフラグ メントとして）は残存するか、あるいは、誤った連結が起こる。これらのケース は検出され、サブフラグメントオーダープロセスにおいて、かつ別の調節工程に おいて切断されない誤って連結されたサブフラグメントと共に、解明される。 サブフラグメントのオーダーのプロセスは、それらの生成のプロセスと同じで ある。サブフラグメントを長いｋ個組と考える場合、オーダー(ordering)は、そ れらの曖昧でない連結により、オーバーラップ末端により行われる。曖昧でない 連結の情報の根拠は、基本ライブラリーのフラグメントにおいて生成されるサブ フラグメントを、それらのフラグメントのセグメントを示すグループへ分割する ことである。この方法は、関連の連結 シークエンスを有する長いオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション に基づく、この問題の生化学的解決と類似する。連結シークエンスは、基本的ラ イブラリーのフラグメントの関連のセグメントのｋ個組のセットを用いて、サブ フラグメントとして生成される。関連のフラグメントは、基本的ライブラリーの それぞれのフラグメントとオーバーラップするオーダーライブラリー(ordering library)のフラグメントにより定義される。最も短いセグメントは、オーダーラ イブラリーの情報フラグメントである。長いものは、幾つかの隣接する情報フラ グメントまたはオーダーおよび基本的ライブラリーに対応するフラグメントの全 オーバーラップ部分である。別の試料の数を低減するために、オーダーライブラ リーのフラグメントは、ランダムにプールされ、特有のｋ個組含量が求められる 。 オーダーライブラリーにおける多数のフラグメントを用いることにより、非常 に短いセグメントが生成され、したがって、サブフラグメントの生成の理由であ るｋ−１シークエンスの多重の外観の可能性が低下する。さらに、基本的ライブ ラリーの特定のフラグメントの種々の領域から構成される長いセグメントは、幾 つかの反復ｋ−１シークエンスを含有しない。あらゆるセグメントにおいて、連 結シークエンス（連結サブフラグメント）は、特定のフラグメントからの特定の 対のサブフラグメントに対して生ずる。オーダーのプロセスは、３つの工程から なる。すなわち、（１）各セグメントのｋ個組の含量(contents)の生成、（２） 各セグメントにおけるサブフラグメントの生成、および（３）サブセグメントの サブフラグメントの連結である。第１のセグメントは、基本的ライブラリーの特 定にフラグメントのｋ個組の含量とオーダーライブラリーのプールのｋ個組の含 量との有意の交差点(intersections)および差(differences)として定義される。 第２の（短い方の）セグメントは、第１のセグメントのｋ個組の含量の交差点お よび差として定義される。 誤認のポジティブおよびネガティブ両方のｋ個組を差および交差点の両方に蓄 積することの問題がある。出発シークエンスからの誤認のネガティブなｋ個組は 、交差点（オーバーラップ部）に蓄積し、同様に、誤認のポ ジティブｋ個組は両方のシークエンスにランダムに生じ、関連するオーバーラッ プ領域に生じるのではない。一方、出発シークエンスのいずれか一方からの誤認 のポジティブの大部分は、交差点に吸収(taken up)されない。これは、それらと オーバーラップするフラグメントからの情報を用いることによる、各フラグメン トからの実験エラーの低減の例である。誤認のｋ個組は、別の理由からその差に 蓄積する。最初のシークエンスからの誤認のネガティブのセットは、誤認のポジ ティブに対して拡大され、誤認のポジティブのセットは、エラーによって交差点 に含まれない（つまり、交差点において誤認のネガティブである）ｋ個組に対し て拡大される。出発シークエンスが１０％の誤認のネガティブなデータを含む場 合、第１および第２の交差点はそれぞれ１９％および２８％の誤認のネガティブ なｋ個組を含有する。一方、基本的フラグメントおよびプールがそれぞれ５００ ｂｐおよび１０，０００ｂｐを有する場合には、７７という誤認のポジティブの 数学的予想が予期される。しかし、「失われた」ｋ個組の大部分を回収する可能 性および誤認のポジティブのｋ個組の大部分を除去する可能性がある。 第１に、特定の対のｋ個組の含量の交差点として特定のセグメントに対するｋ 個組の塩基含有量を決定しなければならない。これに続いて、交差点における出 発ｋ個組含量の全てのｋ個組を包含し、これは、一方の末端にｋ−１を含有し、 他方の末端に基本的セット２つのｋ個組の末端に生ずるｋ−＋シークエンスを含 有する。これは、差が生ずる前に行われ、したがって、そのプロセスにおける誤 認のポジティブの蓄積を防止する。それに続いて、ｋ個組のセットの同じ種類の 拡大(enlargement)が、借り入れ(borrowing)が交差点からである差異(distincti on)との差に適用される。全ての借用されたｋ個組は、誤認の交差点から誤認の ポジティブとして削除される。 交差（すなわち、１セットの通常のｋ個組）は、各対に対して（基本的フラグ メント）×（オーダーライブラリーのプール）で定義される。セットにおけるｋ 個組の数が著しい場合、記載の規則に従って、誤認のネガテ ィブで延長される。第１の差のセットは、特定の基本的フラグメントから得られ た交差点のセットを差し引くことにより得られる。誤認にネガティブなｋ個組は 、記載の規則に従って、交差点のセットから借りることにより差のセットに追加 され、同時に、誤認にポジティブｋ個組として交差点のセットから除去される。 基本的フラグメントがプールされたフラグメントよりも長い場合、この差は、さ らなる工程においてその有用性が幾分か低下した２つの別々のセグメントを示す 。第１のセグメントは、相当数のｋ個組を含有する対（基本的フラグメント）× （オーダーライブラリーのプール）の全ての生じた交差点および差である。第２ のフラグメントのｋ個組のセットは、第１のセグメントの全ての可能な対のｋ個 組のセットの比較により得られる。この２つの差は、相当数のｋ個組で交差点を 生ずる各対から定義される。オーバーラップしたフラグメントの入手可能な情報 の大部分は、この工程において回収されて、交差点および差を形成する第３ラウ ンドから得られるべきものがほとんどないようにする。 （２）セグメントのサブフラグメントの生成は、基本的ライブラリーのフラグ メントについて記載されたものと同様に行われる。 （３）サブフラグメントの連結方法は、特定の基本的ライブラリー・フラグメ ントからのサブフラグメント（幾つかのオーバーラップした末端を有する）の中 でサブフラグメントの正しく連結された対を連続的に決定する工程とから構成さ れる。４つの関連するサブフラグメント（その２つは同一の開始を含有し、２つ は、同一の末端を有する）の場合、連結可能なサブフラグメントの４つの異なる 対がある。通常、２つは正しく、２つは誤っている。正しいものを見つけるため に、特定の基本的フラグメントに対する全ての第１および第２のセグメントから 生ずるサブフラグメントにおいて、各対の連結シークエンス(connectiong seque nce)の存在が試験される。連結シークエンスの長さおよび位置は、偶然に生ずる シークエンスの妨害を回避するように選ばれる。それらはｋ＋２またはそれ以上 であり、特定の対の両方のサブフラグメントにおいて、オーバーラップシークエ ンス以外に、少なくとも１つの要素２を含有する。連結は、２つの連結シー クエンスが見いだされ、かつ残留する２つが存在しない場合にのみ可能である。 ２つの連結したサブフラグメントは、ファイル中で前者のサブフラグメントを置 き換え、このプロセスは周期的に繰り返される。 このステップにおいて反復シークエンスを生じる。これは、いくつかのサブフ ラグメントが１回以上架橋されたサブフラグメントに含まれることを意味する。 上記サブフラグメントは、関連した結合するシークエンスを発見することによっ て認識されるであろう。そのシークエンスは一つのサブフラグメントを二つの異 なるサブフラグメントに組み合わせるものである。 ｐＳＦｓ構築方法およびｐＳＦｓをより長いサブフラグメントに合体させる方 法の実施中において生じる誤認結合したサブフラグメントについての認識は、既 知の基本的なフラグメントに由来するサブフラグメントのシークエンスがフラグ メントに関するセグメント中に生じるサブフラグメントのシークエンス中に存在 するか否かについての試験に基づいている。誤った結合位置からのスークエンス は誤認結合したサブフラグメントを示すものとしては発見されないであろう。 サブフラグメントの順番における上記三つのステップの他に、いくつかの付加 的なコントロールステップまたは特定のシークエンスに適用可能なステップは、 誤りなしに、より完全なシークエンスを生じさせるために必要であろう。 どのセグメントに属するサブフラグメントであるかの決定はセグメントおよび サブフラグメントにおけるｋ個組の含有量を比較することにより実行される。ｋ 個組含有量におけるエラーのために（プール中の初期エラーおよびｋ個組の発生 頻度による統計的なエラー）、サブフラグメントの正確な分割は不可能である。 このように、「全部の分割または全くなしの分割」に代えて、既知のセグメント （Ｐ（ｓｆ，ｓ））からのチャンスがサブフラグメント毎に決められる。この可 能性は、ｋ個組の長さ、サブフラグメントの長さ、順番ライブラリーのフラグメ ントの長さ、プールの大きさおよびファイル中の間違ったｋ個組のパーセントの 関数である。 ここで、Ｌｓｆはサブフラグメントの長さであり、Ｃｋは既知のサブフラグメ ントとセグメントとの対に共通するｋ個組の数であり、およびＦはｋ個組の長さ 、基本的なライブラリーのフラグメント、プールの大きさおよびエラーのパーセ ント間の関係を含むパラメータである。 特別のセグメントによるものとされるサブフラグメントは余分な短ｐＳＦｓと して処理され、明白な結合プロセスに供される。明白な結合の定義は、このケー スにおいてはやや異なる。というのは、重複する末端を有するサブフラグメント が考慮されたセグメントに属するという確率に基づいているからである。なお、 明白な結合の正確性は、他のセグメントにおけるこれらのサブフラグメントの結 合に続けてコントロールされる。異なるセグメントにおける結合後、得られたサ ブフラグメントの全ては共に合体され、より長いサブフラグメント内に含まれる より短いサブフラグメントは排除され、残りのサブフラグメントは通常の結合プ ロセスに供される。シークエンスが完全に再生されない場合には、サブフラグメ ントの分割および結合のプロセスは、特別なセグメントに属する確率基準と同一 かそれ以下の厳格性で反復され、その後、明白な結合がなされる。 明白な重複を定義するための厳格な基準を用いて、いくつかの情報は用いられ ない。完全なシークエンスに代えて、既知のフラグメントに関する確率の数を定 義するいくつかのサブフラグメントが得られる。厳格でない基準を用いると正確 で完全なシークエンスが生じる。例えば誤認結合などのいくつかの状況において 、完全で、しかし不正確なシークエンスを生じる可能があり、あるいはサブフラ グメント間に結合がない「モンスター」サブフラグメントを生じる。このように 、基本的なライブラリのサブフラグメント毎に、ａ）一つが正確であるいくつか の可能な溶液、およびｂ）ほとんど良さそうな正確な溶液を得る。また、非常に 小さい数字のケースでは、サブフラグメント生成プロセスにおける誤りのため、 あるいは属す る確率の特定の割合いのために、明白な溶液は生じず、すなわち一つの最も予想 される溶液である。これらのケースは不完全シークエンスとして残る。すなわち 、明白な溶液は基本的なライブラリの他の重複フラグメントとの間でデータを比 較することによって得られる。 上述のアルゴリズムは不規則的に生じた５０ｋｂシークエンス上で試験された 。そのシークエンスはヒトゲノムのＧＣ含有量をシミュレートしたＧＣを４０％ 含む。このシークエンスの中間部には、約４ｋｂの全長を有し、種々の全体およ びいくつかの他の反復シークエンスが挿入された。試験管内におけるＳＢＨ実験 をシミュレートするために、続く操作を実行し適切なデータを準備した。 ５ｋｂ重複する６０個の「クローン」の位置は、基本的なライブラリの標本を シミュレートするために、不規則的に定義された： ５００ｂｐの「クローン」の１０００分の１の位置は順番のライブラリの製造 をシミュレートするための不規則的に決められた。これらのフラグメントは上記 セグメントから抽出された。２０のフラグメントの不規則プールを作製し、プー ルのｋ個組セットを決め、ハードディスク上に記憶させた。これらのデータはサ ブフラグメントの順番の段階で用いられている：同一密度のクローンに関し、基 本的なライブラリにおける４００万のクローンおよび順番ライブラリにおける３ ００万のクローンは全ヒトゲノムに用いられる。７００万のクローンの総数は、 ゲノムＤＮＡのほとんど全部の不規則的なクローニングおよびゲル一塩基化法（ ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）により配列する長さの数ｋｂのクローン数 よりも少ない数で折り畳まれている。 ５ｋｂのフラグメントの開始部分および末端部分のデータから、１１７個の「 情報フラグメント」はその配列が決定された。これに続き、単体の「情報フラグ メント」が構成する重複ｋ個組のセットが決定された。所定のリストに整合する ｋ個組のサブセットのみを用いた。上記リストは６５％の８量体（８−ｍｅｒｓ ）、３０％の９量体（９−ｍｅｒｓ）および５％の１０〜１２量体（１０−１２ −ｍｅｒｓ）を含む。生成のプロセス およびサブフラグメントの順番はこれらのデータに基づいて実行された。 アルゴリズムの試験は、二つの実験においてシミュレートしたデータ上で実行 された。５０個の「情報フラグメント」のシークエンスは、１００％正確なデー タセット（２０，０００ｂｐ以上）と、１０％の誤ったｋ個組（５％のポジティ ブフラグメントおよび５％のネガティブフラグメント）を有する２６個の「情報 フラグメント」とで再生した。 最初の実験では、全てのサブフラグメントは正確であり、５０個の「情報フラ グメント」のうち一つだけ、シークエンスが完全に再生しておらず、５個がサブ フラグメントの形態で残っていた。順番ライブラリの重複フラグメントの位置の 分析では、５個のサブフラグメントの独特の順番に関する情報を欠いていること を示した。サブフラグメントは、１−２−３−４−５と １−４−３−２−５の重複する末端に基づく二つの方法で結合され得る。相違は サブフラグメント２と４の位置が交換されていろ点だけである。サブフラグメン ト２、３および４は相対的に短い（約１００ｂｐのトータル）ので、この場合、 サブフラグメント３の領域においては順番ライブラリのフラグメントは開始も終 了もしないという相対的に大きなチャンスが存在し、発生する。 実際のシークエンスをシミュレートするために、いくつかの誤り（ハイブリダ イゼーション）データを多くの実験中に入力データとして含めた。オリゴマーハ イブリダイゼーション実験では、所定の条件下で、信頼できないデータを出した ケースは末端不整合ハイブリダイゼーションと全整合ハイブリダイゼーションと の関係だけである。従って、シミュレートする場合、本物とはどちらかの末端上 の単独のエレメントを異にするｋ個組のみはポジティブな誤りであると考えられ た。これらの誤りのセットは次のように生成される。「情報フラグメント」のｋ 個組のオリジナルセット上には、５％のポジティブな誤りのｋ個組のサブセット が加えられている。ポジティブな誤りのｋ個組は、上記セットからｋ個組を不規 則的にピックアップし、それを複製し、始まり部分、終了部分上のヌクレオチド を変え ることによって作製される。これに続いて、不規則的に選択した５％のｋ個組の サブセットを差し引く。この方法では、最も複雑化されたケースの統計的に期待 された数は、正確なｋ個組が末端で誤った塩基を有するｋ個組に置換されたとき に得られる。 上述のように、ｋ個組のセットの生成は１０％の誤ったデータまで導く。この 値は、複製され、変えられ、消去されるべきｋ個組の不規則的な選択のために、 ケースによって変わる。にもかかわらず、このパーセンテージは、実際のハイブ リダイゼーション実験における信頼できないデータ量の３〜４倍を越える。導入 された１０％のエラーは、基本的なライブラリ（基本的なライブラリ情報フラグ メント）のフラグメントとセグメントにおけるサブフラグメント数で増加する二 つ折りに導く。約１１０％の最終的なサブフラグメントは、ポジティブな誤り（ サブフラグメントの主生成参照）を含むｋ個組に関し期待されているように誤っ た塩基を末端に有している。サブフラグメントの誤った結合のケースも誤ったシ ークエンスを有するサブフラグメントも観察されなかった。完全なシークエンス を順番プロセスにおいて実験した２６個のうち四つの情報フラグメントは再生さ れなかった。上記四つの消す全てにおいて、シークエンスは同一のセグメントに 含まれた、いくつかの、より長いサブフラグメントと、いくつかの、より短いサ ブフラグメントの形態で得られた。この結果はアルゴリズム原理が誤ったデータ を大きなパーセンテージで機能させたことを示す。 ｋ個組含有量からシークエンスの生成の成功は完全性および正確性という言語 で記述され得る。生成プロセスでは、二つの特別な状況が定義され得る。一つは 情報の一部が生成されたシークエンス中で欠けているが、曖昧であり、欠けてい る部分がどのタイプに属しているかを知っている状況である。二つ目は得られた 再生シークエンスが生成されたｋ個組含有量からのシークエンスと整合していな いが、失敗が検出されている状況である。アルゴリズムがその理論的限界に発展 していると仮定すると、正確なｋ個組の使用において最初の状況のみが起こり得 る。不完全さの結果は、明白に命令できない確かな数のサブフラグメントにおい て出ており、単純なシ ークエンスの正確な長さ、すなわち完全なタンデムの繰り返し数を決定する問題 にも出ている。 誤認のｋ個組を用いると、正しくないシークエンスが生成される。誤りの理由 は、アルゴリズムの欠点にあるのではなく、ｋ個組の特定の含量が、最初のもの と異なるシークエンスをはっきりと示す、という事実にある。ファイル中に存在 する誤認のｋ個組の種類に応じて、エラーの３つのクラスが定義できる。誤認の ネガティブなｋ個組（誤認のポジティブを伴わない）は「欠失」を生じる。誤認 のポジティブなｋ個組は「延長（等しくない乗換えまたは交叉）」を生じている 。誤認のネガティブを伴う誤認のポジティブは、「挿入」が単独で、あるいは「 欠失」を伴って生じる理由である。この「欠失」は、サブフラグメントの２つの 可能な開始の間のｋ個組の全て（またはその大部分）が誤認のネガティブである 場合に生じる。シークエンスにおける全ての位置がｋ個組により定義されるので 、通常の場合における欠失の発生は、ｋ個の連続的な誤認ネガティブを必要とす る。（誤認のネガティブが１０％であり、かつｋ＝８である場合、この状況は、 １０８要素毎に起こる。）この状況は、１０のゲノム当量(genome equivalents) を含有するランダムなライブラリーを用いた哺乳動物のゲノムの塩基配列決定に おいてさえも、極めて稀である。 誤認のポジティブなｋ個組により引き起こされるシークエンスの末端の延長は 、「挿入」の特別な場合である。その理由は、シークエンスの末端が、誤認のポ ジティブなｋ個組の無限に繰り返される直鎖状の配列として考えることが可能で あるからである。１つのｋ個組よりも長いサブフラグメントを生ずる誤認のポジ ティブなｋ個組の群を考えてもよい。この種の状況は、サブフラグメントが、オ ーダーライブラリーのランダムな物理的フラグメントのように、オーバーラップ ・フラグメントに生ずる場合に検出される。挿入、または欠失の代わりの挿入は 、誤認のポジティブおよび誤認のネガティブなｋ個組の特異的な結合の結果とし て起こりうる。第１の場合において、連続的な誤認のネガティブの数は、ｋより も小さい。両方の場合は、幾つかのオーバーラップしている誤認のポジティブな ｋ個組 を必要とする。挿入および欠失は、かなり大きな実施上の反動のない、ほとんど 理論上の可能性である。その理由は、誤認のｋ個組の数および特異性における要 件が単純に高すぎるからである。 誤認のポジティブおよびネガティブの最小数および種類の理論上の要件に全く 合致しない全ての他の状況において、ｋ個組の含量における誤りにより、生じる シークエンスの低い完全性のみを生ずる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ハイブリダイゼーション法によって核酸を分析する方法であって、 基質の第１のセクタ上に第１の複数の核酸セグメントを配列する配列ステップ と、 前記基質の第２のセクタ上に第２の複数の核酸セグメントを配置する配置ステ ップと、 完全な相補性と一塩基の不整合とを弁別する条件下で、第１の複数の核酸セグ メントを、前記第１のセクタにあり、かつ前記第１の複数の核酸セグメントの一 つよりも短い第１のハイブリダイゼーションプローブに作用させる作用ステップ と、 完全な相補性と一塩基の不整合とを弁別する条件下で、前記第２のセクタにあ り、また前記第２の複数の核酸セグメントの一つのセグメントよりも短く、かつ 前記第１のハイブリッド・プローブとは異なる配列を持つ第２のハイブリダイゼ ーションプローブをインキュベートするインキュベーション・ステップと、 核酸セグメントに対するハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼー ションを検出する検出ステップと、 結果を分析する分析ステップとを有することを特徴とする核酸分析方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、 さらに、前記配置ステップに先だって、核酸の移動に対する障壁を導入する導 入ステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 ３．請求項１に記載の方法であって、 前記配列ステップおよび前記配置ステップの後であり、また前記インキュベー ション・ステップに先だって、核酸の移動に対する障壁を導入する導入ステップ を有することを特徴とする核酸分析方法。 ４．請求項３に記載の方法であって、 前記導入ステップは、前記基質に対して物理的障壁を押しつけることを特徴と する核酸分析方法。 ５．請求項２に記載の方法であって、 前記導入ステップは、前記セクタ間のプローブの混合を防ぐために前記支持体 に対して垂直な方向切り換え電界を印加することを特徴とする核酸分析方法。 ６．請求項３に記載の方法であって、 前記導入ステップは、前記セクタ間のプローブの混合を防ぐために前記支持体 に対して垂直な方向切り換え電界を印加することを特徴とする核酸分析方法。 ７．請求項１に記載の方法であって、 前記配列ステップは、ピン配列の手段によって核酸試料をスポッティングする スポッティングステップを含むことを特徴とする核酸分析方法。 ８．請求項１に記載の方法であって、 前記配列ステップは、管の配列によって核酸を分配する分配ステップを含むこ とを特徴とする核酸分析方法。 ９．請求項１に記載の方法であって、 核酸試料をジェット印刷する印刷ステップを含むことを特徴とする核酸分析方 法。 １０．請求項１に記載の方法であって、 前記作用ステップは、複数の連続的にハイブリダイズするプローブを適 用する適用ステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 １１．請求項１に記載の方法であって、 前記インキュベーション・ステップは、複数の連続的にハイブリダイズするプ ローブを適用するステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 １２．請求項１０に記載の方法であって、 少なくとも２つの前記連続的にハイブリダイズするプローブをリゲートするリ ゲーションステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 １３．請求項１１に記載の方法であって、 少なくとも２つの前記連続的にハイブリダイズするプローブをリゲートするリ ゲーションステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 １４．請求項１に記載の方法であって、 前記作用ステップは、重なり合った核酸配列を持つ複数の拮抗的にハイブリダ イズするプローブを適用するステップを有することを特徴とする核酸分析方法。 １５．請求項１に記載の方法であって、 前記インキュベーション・ステップは、重なり合った核酸配列を持つ複数の拮 抗的にハイブリダイズするプローブを適用するステップを有することを特徴とす る核酸分析方法。 １６．請求項１に記載の方法であって、 少なくとも２つの前記第１の複数の核酸セグメントは混合物として配列される ことを特徴とする核酸分析方法。 １７．請求項１に記載の方法であって、 少なくとも２つの前記第２の複数の核酸セグメントは混合物として配列される ことを特徴とする核酸分析方法。 １８．請求項１に記載の方法であって、 ＨｇＩ型制限酵素による消化によって試料を調製し、得られた制限フラグメン トにアンカーをリゲーションするステップをさらに有することを特徴とする核酸 分析方法。 １９．請求項１に記載の方法であって、 所定の長さのプローブの普遍的セットからプローブを選択するステップをさら に有することを特徴とする核酸分析方法。 ２０．請求項１に記載の方法であって、 所定の長さのプローブの普遍的セットからプローブを選択するステップをさら に有することを特徴とする核酸分析方法。 ２１．請求項１に記載の方法であって、 デオキシリボヌクレオチド・プローブを選択するステップをさらに有すること を特徴とする核酸分析方法。 ２２．請求項１に記載の方法であって、 リボヌクレオチド・プローブを選択するステップをさらに有することを特徴と する核酸分析方法。 ２３．請求項１に記載の方法であって、 タンパク質核酸プローブと塩基類似体含有プローブとからなる群から選択され る核酸類自体を選択するステップをさらに有することを特徴とする核酸分析方法 。 ２４．請求項１に記載の方法であって、 プローブを多重標識するステップをさらに有することを特徴とする核酸分析方 法。 ２５．請求項１に記載の方法であって、 ハイブリダイゼーションしていないプローブ上の標識を劣化させるステップを 含むことを特徴とする核酸分析方法。 ２６．請求項１９に記載の方法であって、 前記作用ステップまたは前記インキュベーション・ステップは、普遍的プロー ブを長さが６，７，８，９，または１０塩基であるセットに集合させるステップ を含むことを特徴とする核酸分析方法。 ２７．請求項１９に記載の方法であって、 前記作用ステップまたは前記インキュベーション・ステップは、遍的プローブ のセットを長さが６，７，８，９，または１０塩基に集合させるステップを含む ことを特徴とする核酸分析方法。 ２８．請求項２０に記載の方法であって、 前記作用ステップまたは前記インキュベーション・ステップは、プローブのセ ットを長さが５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６ ，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８ ，２９，または３０塩基に集合させるステップを含むことを特徴とする核酸分析 方法。 ２９．ハイブリダイゼーションによって核酸を分析する装置であって、 核酸フラグメントを付着する点を持つ基質を備え、該基質は疎水性領域によっ てセグメント化されることを特徴とする核酸分析装置。 ３０．請求項２０に記載の方法であって、 前記配置ステップは、プローブのセットを長さが５，６，７，８，９，１０， １１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２， ２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０塩基に集合させるステ ップを含むことを特徴とする核酸分析方法。 ３１．請求項１に記載の方法であって、 前記少なくとも２つの塩基を含む重なり合った核酸シークエンスを有する２つ 以上のプローブのハイブリダイゼーションを検知することによって、セグメント の少なくとも２つの塩基の相対的順序を確認するステップをさらに有することを 特徴とする核酸分析方法。 ３２．核酸の配列を分析する方法であって、 プローブの配列に試料を導入するステップと、 試料分子の主な部分が所定の時間でリゲーションしたプローブによって解離す る温度に設定するステップと、 混合物に標識されたプローブを添加するステップと、 混合物をリガーゼとインキュベーションするステップと、 遊離のプローブを除去するステップと、 リゲーション産物を検出するステップとを有することを特徴とする核酸配列分 析方法。 ３３．請求項１に記載の方法であって、所望の結果を改善するために追加のプロ ーブを定めるステップと、前記作用ステップ、前記インキュベーション・ステッ プ、前記検知および分析ステップを繰り返すステップとをさらに有することを特 徴とする核酸配列分析方法。 ３４．請求項１に記載の方法であって、前記複数の核酸配列を再利用するために プローブから基質を取り除くステップをさらに有することを特徴と する核酸配列分析方法。