JPH10512959A - 多光子レーザ顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レーザ走査顕微鏡（１０）は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物（１４）における分子励起を生じさせ、それによって、内在的な３次元分解能をもたらす。短い（紫外線の又は可視の）波長領域における単一光子の吸収を有する蛍光体は、比較的長い（赤色の又は赤外線の）波長領域のレーザ光による、強く結像されたサブピコ秒のパルスのビーム（１６）により励起させられる。蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光画像を作成するために、レーザ波長の約３分の１，４分の１、若しくはそれより小さい分数でさえも吸収する。蛍光体からの蛍光放射は、励起強度とともに、３次的に、４次的に、若しくは、それより大きな冪乗の法則で増大し、その結果、レーザ光を結像させることにより、光漂白のみならず、蛍光が、焦点面の近傍に限定される。この特徴は、共焦点レーザ走査顕微鏡によりもたらされるものに匹敵する視野分解能の深度を与え、また、その上、光漂白及び光の有毒性を減少させる。

Description

【発明の詳細な説明】 多光子レーザ顕微鏡法発明の背景 本発明は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物における分子の 励起をもたらすレーザ顕微鏡検査技術に関する。本発明は、デンク（Ｄｅｎｋ） 等により米国特許第５，０３４，６１３号（以下、’６１３号特許という）に開 示された２光子レーザ顕微鏡における改良であり、また、この特許は、引用する ことにより、ここに組み込まれる。 上記’６１３号特許は、内在的な３次元分解能をもたらすべく、２光子の同時 吸収により目的物における分子の励起を生じさせるレーザ走査顕微鏡を開示して いる。短い（紫外線の又は可視の）波長帯域における単一光子吸収を有する蛍光 体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、強く結像されたサブピコ秒の比較的長い（ 赤色の又は赤外線の）波長帯域のレーザ光の流れにより励起させられる。上記蛍 光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光像をつくるために、約２分の １のレーザ波長を吸収する。上記蛍光体からの蛍光放射は、レーザ光を結像させ ることにより、蛍光及び光漂白が焦点面近傍に限定されるように、励起強度とと もに２次的に増える。この特徴は、共焦点のレーザ走査顕微鏡により生じさせら れたものに匹敵する視野分解能の深度を与え、その上、光漂白を減少させるもの である。レーザ走査顕微鏡によるレーザビームの走査は、レーザビームを結像さ せることにより、また、そのビームをパルス時間で圧縮することにより得られる 非常に高い励起強度についての必要条件を満たしながら、走査された対象物にお ける各ポイントからの２光子の励起による蛍光を集めることにより、像の形成を 可能とする。結像されたパルスは、また、かご閉じ込めエフェクタ分子（ｃａｇ ｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の光分解の放出（ｐｈｏｔｏｌ ｙｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ）において特に有用である、３次元空間的に解像され る光化学をもたらす。 上記’６１３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡検査技術についての欠点 は、その適用が、有用なレーザ技術に限定されることである。特に、２光子技術 は、その適用に従って、２光子のエネルギーレベルの合計が所望の蛍光放射を生 じるのに必要とされる特定のエネルギーレベルをもたらすように、特定の波長に おけるレーザの利用を要する。あいにく、幾らかのレーザ顕微鏡の適用は、現時 点では技術的に実現不可能である波長を有するレーザの利用を要するであろう。 例えば、アミノ酸及び核酸のような、非常に短い波長の吸収を有する発色団（ｃ ｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）の励起は、上記２光子技術を用いて、５４０ｎｍの波 長を有するレーザを要することとなるが、現時点では、かかるレーザは存在しな い。発明の概要 本発明は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に、また、マイクロ薬理学（ｍｉｃｒｏ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）についてのかご閉じ込め試薬の活性化、及び、光学 的な３次元情報保存についてのポリマー架橋のような空間的に解像される光化学 的な処理に、３つ又はそれ以上の光子の励起を適用することにより、前述した問 題に対する解決法をもたらすことができる。 ３光子に誘導される蛍光が、励起強度に対する三次的な依存性に従う一方、４ 光子による励起が、四次的な依存性に従うため、両方はレーザ走査顕微鏡におい て内在的な３次元分解能をもたらす。たとえ、かかる３次元分解能が、上記’６ １３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡に基づく非線形の顕微鏡検査技術に より既に実現されるものでも、３つの光子の励起が、通常では紫外帯域（２３０ 〜３５０ｎｍ）において励起可能である分子を近赤外光（７００〜１１００ｎｍ ）で励起させることは稀である。アミノ酸トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａ ｎ）及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、神経伝達物質であるセロトニン（ｓｅ ｒｏｔｏｎｉｎ）及び核酸のような興味あるバイオ分子は、約２６０〜２８０ｎ ｍにおける１光子吸収ピークを有しており、これらのバイオ分子では、３つ及び ４つの光子の励起により、蛍光が励起され得る。赤外光に近い長波長を用いる利 点は、生きた細胞への光によるダメージがおそらく少ないことや深い紫外線吸収 体について好都合に適用し得る固体状態のフェムト秒のレーザ源である。実際に は、３光子レーザ走査顕微鏡の構成は、既存する２光子システムと同様である。 しかし ながら、３光子及び２光子の吸収スペクトルは、全体として、まったく異なるの で、２光子及び３光子が励起される蛍光顕微鏡検査法の組み合わせは、２光子顕 微鏡において一般に採用されているレーザシステムの有効範囲を拡張する。 ３つ若しくはそれ以上の光子の励起の特に有効な適用は、２００ｎｍ程度の波 長の吸収を要するある適用について、エキシマレーザを取り替えることである。 よりずっと長い波長（つまり５５０〜９００ｎｍ）を発するレーザによる３つ及 び４つの光子の励起は、同様のエネルギー吸収をもたらし、その上、３次元空間 分解能をもたらすものである。エキシマレーザは、極めて高価であり、ユーザに 身近なものでないため、幾つかの光子の励起が、非常に望ましいかも知れない。 提案される３光子顕微鏡検査の実用性は、種々の蛍光体及びバイオ分子（ｂｉ ｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の３光子の蛍光励起断面積に極めて重大に依存する。しか しながら、３光子の吸収断面積が報告されたことはほとんどない。摂動論に基づ く簡単な計算は、３光子の励起が、匹敵する励起のレベルを実現するために、典 型的には、２光子励起技術で一般に用いられるピーク強度の＜１０倍を要するこ とをあらわしている。この必要とされる強度レベルが、モードロック式のＴｉ： サファイアレーザのようなフェムト秒のレーザ源により容易に手に入れることが できる。モデロック式のＴｉ：サファイアレーザを用いて、トリプトファン（ｔ ｒｙｐｔｏｐｈａｎ）及びセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）の３光子に導かれ る蛍光は、約８００と９００ｎｍとの間にある励起波長において観察される。測 定される蛍光は、期待された励起強度に対する３次的な法則の依存性に従う。カ ルシウム指示薬（ｉｎｄｃａｔｏｒ）の蛍光パワーの測定法は、期待された３光 子励起の最適条件よりもかなり下の励起波長（約９１１ｎｍ）でのフラ−２（Ｆ ｕｒａ−II）を着色し、満足な蛍光画像が、最適な励起波長（約７３０ｎｍ）で のフラ−２の２光子励起に必要とされるレーザパワーのわずか〜５倍で取得し得 るべきであることが示されている。これらの予備結果から概算される３光子蛍光 励起断面積は、３光子レーザ走査顕微鏡検査法が、適度なレベルの励起パワーを 用いて行われることを示している。このアプローチがどれほど広く適用可能であ るかは、決定されなければならない。４光子励起は、約１０００ｎｍより上の水 （ｗａｔｅｒ）による強い１光子吸収のオンセット（ｏｎｓｅｔ）によって制限 され得る。 ３つ又はそれ以上の光子のプロセスによる蛍光の分子励起の研究は、その励起 断面積が相当小さいものであると予期されるので、稀である。その結果、励起の 有効なレートは、通常、非常に高い瞬間照明強度を要する。多光子断面積の簡単 な補外（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）としては、放射電磁界による分子励起に 関した双極子遷移確率の量子力学の摂動論の解における、マトリックス素子のパ ターンの積が考えられる。基本的には、多光子プロセスは、分子と相互作用する ために、（分子の断面領域、Ａ〜１０^-16ｃｍ²の範囲内で、また同時に、中間状 態の寿命により決定される時間間隔、δτ〜１０^-16ｓの範囲内で）３つ又はそ れ以上の光子を要する。この短い一致時間は、摂動論のエネルギー分母から導出 される大きなエネルギーの不確定性により制限される。 幾つかの光子による蛍光励起は、（与えられた蛍光体についての）長い方の励 起波長が、１光子ポイント拡張関数を複数の光子のプロセスに関するパワーｎに 引き上げることにより増大させられるのと同じ程度で、分解能を減少させるので 、レーザ顕微鏡検査法の分解能を著しく増大させることはない。それは、波長の 因子に関するものでなく、３光子励起の分解能における増大は、本質的には、２ 光子顕微鏡に対して理想的な共焦点空間フィルタを付加することにより招来され るものと同様のものであろう。 意外にも大きな３光子の断面積についての近年のリポートは、（過度に明るい 閃光から人間の視界を保護するための調節可能な遮光物を付与することを目的と した）光学的に制限のある吸収を向上させるための研究のうちに見い出される。 最近では、約１０^-75ｃｍ⁶ｓ²の光子吸収断面積が、テトラヒドロフラン（ｔｅ ｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）における２，５−ベンゾチアゾ（ｂｅｎｚｏｔｈ ｉａｚｏ）３，４−ジデシロキシ（ｄｉｄｅｃｙｌｏｘｙ）の吸収及び蛍光に関 して報告されている。近年のまた別の実験は、共役有機ポリマーからの蛍光の３ 光子励起を示している。しかしながら、このプロセスは、ほとんどの蛍光励起と は異なった２つの励起状態を含むようにみえる。これらの実験の条件は、レーザ 走査蛍光顕微鏡検査に若しくは大抵のマイクロ光化学にまったく適さないが、大 きな断面積は約束される。しかしながら、かかる大きな断面積は、３つ又はそれ 以上の光子の顕微鏡検査に不可欠ではないことに注意すべきである。 蛍光顕微鏡検査及びフォトマイクロ薬理学における生きた細胞への光によるダ メージのレートの励起波長の依存性は、広くには知られておらず、異なる適用に ついては大きく変化し得る。経験では、２光子励起が、匹敵する蛍光画像の認識 についての１光子励起よりもはるかに少ないダメージを導くことが分かっている 。励起に関して３つ又は４つの光子に増加することによって、改良が更に為され 得るかどうかは明らかでない。このような知識及び非線形吸収スペクトルの知識 の助けによって、将来、最良の励起モードが、個々のシステムについて決定され 、利用されることが可能である。特に魅力のある可能性は、３光子励起及びそれ に伴う蛍光信号の２光子励起による光化学を導き出すために、１つのレーザ波長 を用いることである。３光子励起は、それを元に戻しそうにないことを除いて、 まったく好ましいことに、既存の２光子励起技術を有効に向上させるように思わ れる。 代わりとして、極微的な光化学の活性，光切除及び光学的な手術（ｏｐｔｉｃ ａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ）に関し、光の励起は、アミノ酸及び核酸のような非常に 短い波長吸収体を有する内在的な発色団、若しくは同等の付加された発色団の多 光子励起により、好適に実現され得る。多光子励起は、長波長でのサブピコ秒の パルス、及び、光の励起が望まれる極微的な焦点体積への長波長光の伝達をもた らす、より有用なレーザの選択を可能とする。図面の簡単な説明 本発明の前述した付加的な特徴及び利点は、添付図面とともに、以下の好適な 形態の詳細な説明から明らかになるであろう 図１は、本発明の好適な実施態様に従って、レーザ走査顕微鏡の模式的な図解 である。 図２及び３は、それぞれ、Ｆｕｒａ−２及びＩｎｄｏ−１の３光子励起を用い て得られ適用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強度のグラフで ある。発明を実施するための最適なモード さて、本発明の好適な実施の形態の詳細な説明については、図１は、３通りの 検出方式を有する従来の走査顕微鏡を模式的に示している。サブピコ秒のパルス 化されたレーザ源１２は、可動式ステージ又は他の適切な支持部材１５上に置か れた試料又は目的物の必然的な励起をもたらすものである。上記レーザ１２は、 例えば、約８０ＭＨｚの繰り返し率で、１００ｆｓｅｃより短い持続期間を有す るパルスとともに、約６３０ｎｍの、スペクトルの赤領域における波長を有する 光のパルスを生じ得る、コライディング・パルス（ｃｏｌｌｉｄｉｎｇ ｐｕｌ ｓｅ）の、モード・ロック式の色素レーザ若しくは固体レーザであってよい。他 の明るいパルスレーザもまた、例えば、その合計が試料における蛍光に必要とさ れる適切な吸収エネルギー帯域に匹敵するであろう必然的な励起の光子エネルギ ーを生じるように、赤外線の、若しくは赤色の領域における比較的長い異なる波 長の光をもたらすために使用されてもよい。単一光子励起技術において、これら は３つ又は４つの光子励起について、それぞれ、入射光の波長の約３分の１、若 しくは４分の１の波長を有するスペクトル領域における単一光子の吸収により励 起されることになる。その結果、例えば、９４５ｎｍでの可視の赤色領域におけ る３つの光子が、通常３１５ｎｍでの紫外線領域における光を吸収する蛍光を励 起させるように協力する一方、１０７０ｎｍでの３つの光子が、可視光領域にお いて、３５７ｎｍで吸収する分子を励起させることになる。 本発明の改良された態様では、単一波長レーザ１２が、入射光ビームが、高い 瞬間パワーの、また、異なる波長の、２つ又はそれ以上の重ね合わせパルス光ビ ームからなるように、２つ又はそれ以上の異なる長波長のレーザ源に交換され得 る。入射ビームの波長は、 １／λ_abs＝１／λ₁＋１／λ₂＋１／λ₃ と表記され得る短い波長で吸収性のある蛍光を励起させるように選択される。こ こで、λ_absは吸収体の短い波長であり、λ₁，λ₂及びλ₃は、３つの波長のケー スに場合についての、レーザの入射ビームの波長である。 上記レーザ１２は、１組みの発振ミラーを有するＸ−Ｙスキャナ１８により走 査され、その後、接眼レンズ２０及び２２並びに対物レンズ２４により、焦点つ まり焦点体積１９で試料１４上に結像される、パルス化された出力ビーム１６を 生じる。対物レンズの背面口径（ｂａｃｋ ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、走査される ビームについてのピボットポイントであり、その結果、収差を無視し、ラスター パターンにおける全ての点は、同等の画像形成条件を経験する。上記スキャナ１ ８は、試料１４を通じて、焦点つまり焦点体積１９の走査を行い、それによって 、焦点つまり焦点体積１９での若しくはその近傍における試料１４の蛍光励起を もたらす。 上記出力ビーム１６は、上記Ｘ−Ｙスキャナ１８に指向させられる前に、分散 補正及びパルス診断器の両方にかけられる。フェムト秒のパルス化された照明の 問題の１つは分散である。短いパルスは、光学材料を通過する場合に、パルス化 された帯域幅の互いに異なる周波数成分が、材料内で異なる速さで進むため、広 がる傾向にある。光学材料についての分散補正は、約１２０ｆｓｅｃよりも大き いパルスにとって不可欠でない。なぜなら、これらのパルスが小さな周波数帯域 幅（約４ｎｍ）を有し、その結果、広がりがほとんどないからである。しかしな がら、７００ｎｍで、７０ｆｓｅｃのパルスは、良好な対物レンズにより約１． ５倍に、ビーム変調及びシャッタに用いられ得る標準的な音響光学変調器により それ以上に広げられることが分かっている。パルスの広がりは、観察される蛍光 の均整を減少させる。顕微鏡１０では、光学材料についての分散補正が、より高 い（全体としてより遅い）周波数がより少ないガラスを通過して、その結果、固 有の位相遅れに戻されるように、光を指向させる一対のガラスプリズム２６及び ２８を二重に通過することにより達せられる。上記プリズム２６及び２８を通過 してリターンさせるためには、全反射ミラー３０が用いられる。 量的な測定のために、励起ビームの波長及びパルス持続時間を知る必要があり 、そのため、パルス化された出力ビーム１６を分析すべく、種々の態様のパルス 診断器３２が提供される。波長及び持続時間の両方の大まかなモニタのためには 、波長の測定値をもたらす、標準的な形態にある単一のモノクロメータが十分で ある。もし、出力のスリットが取り除かれ、その結果得られるスペクトルが、ス ク リーン又は１次元検出器へ送られれば、パルス波長帯域がモニタされ得る。より 正確なパルス分析のために、上記パルス診断器３２は、直接的で詳細なパルス幅 の測定及びその位相干渉の輪郭の指示を可能とする自己相関器（ａｕｔｏｃｏｒ ｒｅｌａｔｏｒ）を有してもよい。 レーザ顕微鏡１０は、また、３つの検出方式の各々について、蛍光通路を分離 するために用いられる、第１，第２及び第３のダイクロックミラー３４，３６及 び３８を有している。これらの方式の第１のものは、分離スキャンされた（ｄｅ ｓｃａｎｎｅｄ）共焦点検出方式として知られている。共焦点検出では、蛍光ビ ームが、共焦点光電子増倍管（ＰＭＴ）４２の前に配置されたピンホール絞り４ ０で静止画像面を形成するように、分離スキャンされる。走査におけるすべての 位置で、標本において照射されるポイントは、検出器の面における開口部に対し て結像する、若しくは共焦である。上記ピンホール絞り４０と第１のダイクロッ クミラー３４との間には、検出された信号から望ましくない周波数を除去するた めに、帯域放射フィルタ４４が配置されている。 第２の検出技術は、対物レンズの背面口径が、分離スキャンなしに、レンズ４ ６及び帯域放射フィルタ４８を介して、フーリエＰＭＴ５０上に結像されるフー リエ面検出方式として知られている。上記背面口径が走査においてピボットポイ ントであるため、蛍光のパターンは、光電陰極において定常である。 最後に、第３の検出技術は、試料１４における完全な焦点面が、上記帯域放射 フィルタ５２及び結像レンズ５４を通じて、その認識速度がフレームの走査時間 に同調させられるＣＣＤカメラのような画像形成検出器５６上に結像される、走 査された画像形成検出方式として知られている。 検出方法の最初の選択は、既存の顕微鏡の構成により、若しくは設計された特 定の実験に必要な顕微鏡検査方法により決められる。各検出方式の概要は、それ 自身特有の長所及び短所を呈している。これら全ての検出方式の概要では、集光 された蛍光が、適切に被覆されたダイクロックミラーにより抽出される。典型的 には、励起波長と放射波長との間の差がストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈ ｉｆｔ）よりもずっと大きいため、２色性の被覆が、反射透過帯域間の通常のシ ャ ープなカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）を有する必要はない。放射フィルタ４４，４ ８及び５２は、多光子励起波長での特有の阻止のために点検される必要があるが 、通常、標準的である。蛍光パワーに対する平均励起パワーの比は、線形顕微鏡 検査における場合よりも多光子レーザ顕微鏡検査における場合の方が高いため、 より高い阻止の比が得られる。それ故、赤色に鈍感な光電子エミッタについての 光電子増倍管の選択は、有益である。 ２光子より多い多光子の励起について、例えば、Ｎ個の光子では、１蛍光体に つき１パルス当たりに吸収される光子の数は、一般に、 と表記される。ここで、前に肩付けされた文字Ｎは、前述したＮ＝２である２光 子励起の場合の類推（ａｎａｌｏｇｙ）において同時に吸収される光子の数をあ らわしている。多光子吸収プロセスに関した連続的な比である比^Nｎ_a／^(N-1)ｎ_a は、 の形の有用な比較パラメータを提供する。 予期される吸収断面積の好適な値を下の表に記す。 これら上記２光子励起について記述された多光子断面積及び計器パラメータの 典型的な値を用いた場合、約３Ｗレーザーパワーで、吸収の比は１（ｕｎｉｔｙ ）である。しかしながら、この等しい放射パワーは、特に、波長に依存する断面 積に従うものである。より高い比Ｎδ／^N-1δは、既知の好適な蛍光体について 存在し、それ以上のものは、この発明、また、他の多光子吸収の適用がきっかけ となる研究において見い出されるかもしれない。生物の細胞及び組織に対して適 用する場合、より高いオーダの多光子励起プロセスの選択及び励起波長の最適化 は、閉じ込められた化合物の蛍光顕微鏡検査及び極微的な活性化の間における、 生物の光によるダメージを最小限に抑制するのに適した状態を選択するための手 段を提供する。多光子レーザーパワー顕微鏡法又は光化学に関して、より高いオ ーダの多光子プロセスは、有効なレーザ一波長の選択を調節する。 Ｎ＞２である多光子励起を用いれば、分解能を規定する顕微鏡のポイント拡張 関数が、それ自身で、パワーＮに増えるため、画像形成分解能は、２光子の励起 に相対して改良される。その結果、３光子励起に関して、分解能は、波長が増大 するにつれて分解能を小さくする波長の因子を無視して、極微の共焦点アパーチ ャ の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）とほぼ同じ因子により更に改良される。 図２及び３は、それぞれ、１．０μｍでのＦｕｒａ−２及び１．０μｍでのＣ ａを備えたＩｎｄｏ−１の３光子励起に関する入射光子の光束密度の関数として の蛍光強度を示している。両方の場合において、試料における３光子の励起が明 らかにあらわされ、蛍光強度は、入射光子の光束密度の３乗に比例して増大する 。 ３つ又はそれ以上の光子による多光子励起の他の長所は、焦点励起外の依存性 が、増大する光子オーダＮの値とともに、強度のパワーＮが連続的に高くなるに つれて小さくなるので、２光子励起の好適な特性が、より高いオーダのプロセス において、更に高められることである。 本発明による３つ又はそれ以上の光子の励起は、可視又は赤外光による、単一 紫外線光子の励起に対応する励起エネルギーへのアクセスをもたらすので、全く 新しいクラスの蛍光体及び蛍光指示薬が、３次元的に解像されるレーザ走査顕微 鏡検査に受入れ可能となる。たとえ３つ又はそれ以上の光子の断面積は、多くの 化合物について未だ知られておらず、また、３つ又はそれ以上の光子の吸収には 、異なる選択則が適用されるが、分子の非対称性は、しばしば、同じ励起状態へ の奇数及び偶数の光子の遷移の両方を可能とする。励起状態の対称性の効果が、 奇数の光子及び偶数の光子の断面積ピークの相対値をシフトするようにあらわれ ることが分かっている。その結果、２光子吸収についての吸収ピークは、時折、 １光子プロセスについての優勢な吸収ピークの２倍よりも著しく短い波長であら われ、そして、３光子吸収の波長依存性は、１光子の場合の３倍に近い波長依存 性にたよることができる。多光子励起は、非干渉性の複数のステップの励起のケ ースにおいて特に強力であるかも知れない。この場合には、（例えば２光子の吸 収による）あるエネルギーの吸収が、それに伴う付加的な光子が蛍光又は光化学 的な活性が生じ得る状態に達するためのエネルギーをもたらす中間状態に到達す る。 さて、前述した蛍光体の全てが、２光子の励起で、生きた細胞において蛍光性 のラベル（ｌａｂｅｌ）分布をイメージ化するために、決まって用いられる。匹 敵する蛍光強度の３光子の励起は、Ｉｎｄｏ−１，ＦＵＲＡ−２，ＤＡＰＩ及び ダルニル（ｄａｒｎｙｌ）とともに得られるものである。３光子の吸収断面積は 、 約³δ〜２×１０^-82ｃｍ⁶（ｓ／光子）²である。セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉ ｎ），ノレピネフェリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ）及びトリプトファ ン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）における蛍光性のアミノ酸の３つ及び４つの光子の 励起は、３００ｎｍ以下で生じる１光子の吸収を用いた赤色光の励起で測定され る。有用なレーザによる３つ及び４つの光子の使用は、稀な神経伝達物質及びホ ルモンを極微的に検出しイメージ化する上で都合が良い。 本発明の他の適用は、組織又は組織の小器官の微視的な局部除去を、それらの 破壊若しくは外科的な切除のために行う方法としてのものである。これは、内在 的な発色団により、あるいは、外部から与えられた発色団により、３つ又はそれ 以上の光子の吸収の利用を通じて達せられる。上記発色団は、組織を分類し、サ ブピコ秒のレーザ光のパルス吸収のための第１の特性エネルギーをもたらすもの で、そのレーザ光のパルスが、例えば３分の１，４分の１等のほぼ整数分数であ る、若しくは第１の特性エネルギーよりも小さい第２の特性エネルギーをもたら すことになる。代わりとして、必要な蛍光をもたらす分子が、内在的な組織蛍光 体であってもよい。 本発明は、好適な実施の形態に関して開示されているが、以下の請求の範囲に 規定される発明の要旨を逸脱することなく、様々な改良や変更が可能であること は理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 特性エネルギーの光子により励起可能な分子を含む目的物の３つ又はそ れ以上の光子の励起技術による顕微鏡検査法であって、 ｎが上記目的物により吸収されるべき光子の数に等しく、３より大きい若しく はそれに等しい場合に、上記目的物に、上記特性エネルギーの約１／ｎのエネル ギーの光子を有するレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビームを照射し、 少なくとも３つの入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせるべく、十分 に高い照射強度をもたらすように、上記目的物の範囲内に照射光を結像させるス テップを有する方法。 ２． 上記目的物が、かご閉じ込めの生物学的に活性な分子を含み、上記照射 強度が、ｎ個の入射光子の同時吸収により、かご閉じ込めされた生物学的に活性 な化合物を解放するのに十分であり、各エネルギーが、上記特性エネルギーの約 １／ｎに等しい請求の範囲第１項の方法。 ３． 上記目的物が、蛍光性の分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子 ７の同時吸収により、上記目的物の蛍光を生じさせるのに十分であり、各エネル ギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求の範囲第１項の方法。 ４． 上記照射光を結像させるステップが、上記ｎ個の入射光子の同時吸収に より分子励起を生じさせるべく、上記焦点体積においてのみ十分に高い照射強度 をもたらすように、上記目的物の範囲内における小さな焦点体積へ照射光を結像 させることを有している請求の範囲第３項の方法。 ５． 上記目的物を通じて、上記焦点体積を走査すべく、上記ビームを走査し 、 上記目的物により生じさせられた蛍光を検出するステップを更に含む請求の範 囲第４項の方法。 ６． 上記目的物が組織であり、また、上記分子励起が、内在的な発色団，外 部から与えられた発色団、若しくは上記組織内の内在的な蛍光体による少なくと も３つの照射光子の同時吸収により発生する請求の範囲第１項の方法。 ７． 蛍光光子を生じさせるための特性エネルギーの光子による励起に応答す る蛍光成分を含む目的物のレーザ走査蛍光顕微鏡検査用の装置であって、 上記目的物を受合うためのステージ手段と、 ｎが３よりも大きい、あるいはそれに等しい場合に、上記特性エネルギーの１ ／ｎのエネルギーで構成されるサブピコ秒のコヒーレント光パルスの少なくとも １つの光源と、 上記目的物に少なくとも３つの光子を吸収させ、上記蛍光光子を生じさせるべ く、上記目的物上にコヒーレント光パルスを結像させる手段と、 上記蛍光光子を検出する検出手段と、 上記蛍光光子を検出手段に対して指向させる手段とを備えた装置。 ８． 上記目的物を通じて、上記光パルスを走査する走査手段を更に備えた請 求の範囲第７項の装置。 ９． 上記検出手段が、共焦点光電子増倍管を有する請求の範囲第７項の装置 。 １０． 上記検出手段が、フーリエ平面検出器を有する請求の範囲第７項の装 置。 １１． 上記検出手段が、画像形成検出器を有する請求の範囲第７項の装置。