JPH1059956A

JPH1059956A - 新規イソフラボン誘導体及びその製造法

Info

Publication number: JPH1059956A
Application number: JP23863696A
Authority: JP
Inventors: Emiko Kinoshita; 恵美子木下; Yoshinori Ozawa; 善徳小澤; Tetsuro Aijima; 鐵郎相島
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1996-08-22
Publication date: 1998-03-03

Abstract

(57)【要約】【解決手段】次式のイソフラボン誘導体またはその塩【化１】【効果】本発明のイソフラボン誘導体は、潰瘍、アレ
ルギー疾患等の炎症疾患の原因となるヒスタミンの生合
成に関与するヒスチジン脱炭酸酵素に対し優れた活性阻
害作用を示し、副作用もない。また、本物質は、優れた
抗酸化活性をも有している。本物質は、医薬、抗酸化
剤、機能性食品等として大変有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒスチジン脱炭酸
酵素阻害活性等の薬効及び抗酸化活性を有する新規イソ
フラボン誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の潰瘍、喘息性
気管支炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患は、生
体内の過剰なヒスタミンの生成により起こる炎症疾患で
ある。ヒスタミンは、ヒスチジンの脱炭酸反応により生
成する。この反応を触媒する酵素がヒスチジン脱炭酸酵
素（以下、「ＨＤＣ」という）である。

【０００３】上記の炎症疾患の治療薬としては、ヒスタ
ミンの生合成を阻害するもの、すなわちＨＤＣ阻害剤が
知られている。このような薬剤としては、（＋）−カテ
キン、ヒスチジン誘導体、シアニダノール、トリトクア
リン等を挙げることができる。一方、抗酸化剤は、各種
工業製品及びその製造原料に添加して用いる添加剤とし
て、また、その抗酸化活性を利用する医薬・機能性食品
・化粧料等として広く用いられている。このため、優れ
た抗酸化剤の開発が、強く求められている。なお、本発
明でいう抗酸化剤とは、（１）食品、医薬、化粧料、化学薬品等の各種工業製品
及びその製造原料に添加され、それらの酸化を防止し、
安定性や保存性等を向上させるために用いられる添加
物。（２）生体内において抗酸化活性（例えば、フリーラジ
カル消去作用、脂質の過酸化防止作用、抗腫瘍作用等）
を示す医薬あるいは機能性食品として、種々の疾患或い
は皮膚障害等の予防・治療に用いられるもの。（３）皮膚、粘膜、毛髪等の酸化を抑制するために用い
る化粧料或いは皮膚外用剤。等として用いることのできる薬剤を意味する。なお、本
発明でいう医薬とは、薬事法上の医薬品及び医薬部外品
を意味する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規イソフ
ラボン誘導体を有効成分として含有する優れた医薬を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下式で表される新
規イソフラボン誘導体が、優れたＨＤＣ阻害活性及び抗
酸化活性を有することを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の一般式：

【０００６】

【化２】

【０００７】で表される新規イソフラボン誘導体または
その塩である。本発明のイソフラボン誘導体の塩とは、
薬学的に許容されるものであればどのようなものでもよ
く、そのような塩としては、例えば、ナトリウム、カリ
ウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウ
ム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム、モノエ
タノールアミン等のアミン類との塩が挙げられる。さら
には、該イソフラボン誘導体と、無機酸もしくは有機酸
とを反応させることにより得られる塩を挙げることがで
きる。ここでいう無機酸としては、例えば、塩酸、リン
酸、硝酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢
酸、コハク酸、マレイン酸等が挙げられる。本発明のイ
ソフラボン誘導体の塩には、上述の塩の無水物及び水和
物も含まれる。また、本発明は、新規イソフラボン誘導
体またはその塩からなる医薬である。更に本発明は、本
発明のイソフラボン誘導体の生産能を有する微生物を培
地に培養し、得られる培養物から該イソフラボン誘導体
を採取することを特徴とするイソフラボン誘導体の製造
法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【本発明の実施の形態】本発明のイソフラボン誘導体
（以下「本物質」という）を得るための出発材料は、本
物質又はその前駆体を含有するものであればいかなるも
のでもよい。本物質は、例えば、本物質の生産能を有す
る微生物を培地に培養し、その培養物から本物質を採取
することによって得られる。

【０００９】本発明で用いられる微生物は、本物質の生
産能を有するものであればいかなる菌株でもよいが、例
えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生物、具体
的にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（ＩＦＯ
４２０６）等を挙げることができる。又、本発明で用い
られる微生物は、上記の菌株のみならず、人工的又は自
然に得られる変異株であってもよい。上記の菌株の変異
株を人工的に作成する方法としては、例えば、ラジオア
イソトープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を用いて原
株に突然変異を起こさせる方法を用いることができる。

【００１０】本発明で用いられる微生物を培養するため
の培地は、該微生物を培養する通常の培地、すなわち炭
素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で
含有し、且つ本物質の前駆体となり得る物質（以下「前
駆物質」という）を含有するものであれば、合成培地又
は天然培地のいずれでも使用できる。前駆物質として
は、例えば、ダイゼイン、ゲニステイン、ダイジン、ゲ
ニスチン、トランス−エポキシコハク酸等を挙げること
ができる。該前駆物質は、微生物の培養開始時または途
中で培地に添加することもできるし、あるいは、培養後
に得られる培養物に添加することもできる。なお、本発
明でいう培養物には、培養物を水または適当な溶媒（各
種緩衝液、有機溶媒等）で抽出して得た抽出物も含まれ
る。培地や培養物等に対する前駆物質の添加量は、特に
限定されないが、トランス−エポキシコハク酸の場合な
らば、培地等に対して１０〜１０⁴ｐｐｍ程度添加すれ
ばよい。本発明で用いられる培地としては、例えば、蒸
煮大豆及び炒熬後に粉砕した小麦の混合物、あるいは該
混合物にトランス−エポキシコハク酸を添加したものを
挙げることができる。該混合物を用いる場合、前駆物質
であるダイゼイン、ゲニステイン、ダイジン、ゲニスチ
ン等は、培地成分である大豆から供給される。微生物の
培養は、２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で３０〜
８０時間、好ましくは４０〜４５時間行えばよい。

【００１１】以上の操作により、培養物中に本物質が生
成蓄積する。なお、本物質の生成蓄積を促進するため、
上記の培地にて本物質の前駆体となり得る物質を添加し
てもよい。そのような物質としては、例えば、ダイゼイ
ン、ゲニステイン、ダイジン、ゲニスチン、トランス−
エポキシコハク酸等を挙げることができる。培養終了
後、培養物より本物質を精製するためには、溶媒抽出
法、蒸留法、各種クロマトグラフィー等を含む通常の方
法を用いることができる。本物質は、例えば、下記の方
法を用いて精製することができる。

【００１２】先ず、培養物に蒸留水を加えた後、３５〜
４５℃で一晩静置し、培養物より本物質を抽出する。次
いで、培養物のガーゼ濾過及び遠心分離を行い、得られ
た遠心上清をフィルター濾過する。上記の遠心上清に、
有機溶媒、例えば酢酸エチル、１−プロパノール等を加
えて、振盪した後、上層と下層とに分ける。この上層に
ついて、上記と同様の有機溶媒処理を２回行い、下層を
得る。得られた全ての下層を合わせ、塩酸でｐＨ２．０
前後に調整した後、有機溶媒を加えて、振盪し、上層と
下層とに分ける。この上層をロータリーエバポレーター
（東京理化社製）にて濃縮し、濃縮液を得る。

【００１３】該濃縮液を、逆相カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（以下「逆相ＨＰＬＣ」という）に
供する。逆相カラムとしては、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５
Ｃ１８ＨＧ（和光純薬社製）、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−
１２０Ｔ（東ソー社製）等が挙げられる。吸着画分は、
トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配によ
り溶出させることができる。溶出液を分画した後、各画
分のＨＤＣ阻害活性を後記の測定法に従って測定する。
ＨＤＣ阻害活性を有する画分を、ロータリーエバポレー
ターにより濃縮し、濃縮液を得る。該濃縮液を蒸留水、
エタノール等に溶解した後、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行ない、ＨＤＣ阻害活性を有する画分を集める。ゲ
ル濾過支持体としては、バイオゲルＰ−２樹脂（バイオ
ラド社製）、トヨパールＣＷ−３５（東ソー社製）等が
挙げられる。

【００１４】以上の操作により、高度に精製された本物
質を得ることができる。本物質は優れたＨＤＣ阻害活性
及び抗酸化活性を有し、且つ高い安全性を示すことか
ら、医薬、抗酸化剤、或いは機能性食品として有用であ
る。本物質を医薬、例えば炎症疾患の治療薬等として用
いる場合、単独で投与することもできるが、通常は、賦
形剤、潤沢剤、希釈剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、甘味剤、
芳香剤、乳化散剤等を用いて錠剤、粉剤、水和剤、乳
剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、座剤等の形に製剤化
し、経口的又は非経口的に投与することができる。上記
賦形剤としては、水、ゼラチン、澱粉、結晶セルロー
ス、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、アラビア
ゴム、植物油等が挙げられる。

【００１５】本物質の投与量は、投与方法と症状の程
度、患者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人一
日当たりの有効成分として０．０１〜２０ｇ、好ましく
は０．０５〜１０ｇの範囲で選ばれる。又、本物質を、
他の医薬品等と適宜混合して使用することも可能であ
る。本物質を機能性食品として用いる場合、そのまま
で、又は他の食品に添加して使用することができる。本
物質を他の食品に添加する場合、食品中に混合する方
法、食品表面に塗布する方法等が例示される。その場合
は、食品１ｋｇ当たり０．０１ｇ以上、好ましくは、
０．０５〜１０ｇ程度添加すればよい。

【００１６】適用できる食品としては、醤油、味噌、つ
ゆ等の調味料、カマボコ、チクワ等の水産練り製品、ハ
ム、ソーセージ等の畜肉加工品、日本酒、洋酒、果実酒
等の酒類、清涼飲料、果実飲料等の飲料類、ケーキ、プ
リン、饅頭等の菓子類が例示される。更に、本物質を、
果実、野菜類、缶詰類、惣菜食品等に添加して用いるこ
とも可能である。

【００１７】本物質は、他の食品添加物等と適宜混合し
て使用することも可能である。本物質のＨＤＣ阻害活性
の測定法及び抗酸化活性の測定法を以下に示す。１．ＨＤＣ阻害活性の測定法（１）試薬ａ．酵素溶液ＨＤＣを、マウス肥満腫瘍細胞Ｐ−８１５（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１３３，１７２
−１７８（１９９２）参照）から、Ｏｈｍｏｒｉらの方
法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，８３４−８３９
（１９９０）参照）により部分精製したもの。

【００１８】ｂ．基質溶液リン酸緩衝液１００ｍＭヒスチジン５μｇ／ｍｌピリドキサールリン酸５μｇ／ｍｌａの酵素溶液２０μｌ／ｍｌｃ．検体溶液本物質の各精製工程において得られた画分

【００１９】（２）反応条件基質溶液０．１ｍｌに、検体溶液１０μｌを添加し、３
７℃で１２時間反応させる。

【００２０】（３）反応生成物ヒスタミンの定量生成したヒスタミンは、ジメチルアミノアゾベンゼンイ
ソチオシアネート誘導体としてＨＰＬＣを用いて定量す
る。ＨＰＬＣの条件は以下の通り。ａ．カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＳＬ（ナカライテ
スク社製）ｂ．溶出液：クロロホルム／ジメチルホルムアミド／
水／酢酸＝２１０／８０／４／１（ｖｏｌ．／ｖｏ
ｌ．）ｃ．検出波長：４３５ｎｍ

【００２１】（４）ＨＤＣ阻害活性の算出ＨＤＣ阻害率の算出方法は、以下の通りである。阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００Ａ：基質溶液に、検体溶液を添加して反応させたときの
ヒスタミン生成量Ｂ：検体溶液の代わりに、メタノール１０μｌを添加
し、同様の条件で反応させたときのヒスタミン生成量２．抗酸化活性の測定方法：ＡＭＶＮ(2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitri
le)によるメチルリノレートの酸化反応系に本物質を添
加し、本物質が酸化反応に及ぼす影響を検討する。（１）反応溶液１００ｍＭメチルリノレートｎ−ヘキサン−イソプロパノール（７：３、ｖ／ｖ）１０ｍＭＡＭＶＮ本物質（０．１ｍＭ、０．５ｍＭ）（２）酸化反応上記の反応溶液を、３７℃の暗室中で振とうし、生成す
るメチルリノレートハイドロパーオキシド（ＭｅＬ−Ｏ
ＯＨ）を、ＨＰＬＣを用いて経時的に分析する。

【００２２】

【実施例】

〔実施例１〕 (1) 種菌の培養Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（ＩＦＯ４２０
６）を、ＭＡ培地（2.0%モルトエクストラクト、2.0%グ
ルコース、0.1%ペプトン、2.0%寒天）を用いて斜面培養
した。培養物１白金耳分を、水分含量８０％ｗ／ｖのフ
スマ５ｇに植菌し、３０℃で４日間培養し、得られた培
養物を種菌とした。

【００２３】(2) 本培養本培養に用いる培地は下記の方法により調製した。すな
わち、丸大豆３００ｇを１２時間水に浸漬した後、４時
間蒸煮した。得られた蒸煮大豆に、炒熬した後粉砕した
小麦３３５ｇを加えた。上記の培地に、種菌２ｇを加え
て混和し、３０℃で１週間静置培養した。得られた培養
物に蒸留水８００ｍｌを加えた後、４２℃で一晩静置
し、次いで培養物のガーゼ濾過及び遠心分離（７０００
ｒｐｍ）を行った。得られた遠心上清を０．８μｍのフ
ィルター（ミリポア社製）で濾過した後、０．４５μｍ
のボトルトップフィルター（ファルコン社製）で濾過し
た。

【００２４】(3) 本物質の精製上記の濾液５００ｍｌに、酢酸エチル（和光純薬社製）
２５０ｍｌを加えて、３分間振盪した後、上層と下層と
に分けた。この上層について上記と同様の酢酸エチル処
理を２回行い、下層を得た。得られた下層を合わせ、塩
酸でｐＨ２に調整した後、酢酸エチル２５０ｍｌを加え
て３分間振盪し、上層と下層とに分けた。得られた上層
に酢酸エチル（和光純薬社製）２５０ｍｌを加えて、３
分間振盪し、上層と下層とに分けた。得られた上層をロ
ータリーエバポレーター（東京理化社製）にて濃縮し、
濃縮液１０ｍＬを得た。

【００２５】該濃縮液を、プレカラム（カラム：Ｗａｋ
ｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ１０×５０ｍｍ和光純
薬社製）を配置した逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｓ
ｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ１０×３００ｍｍ和光純薬
社製）に供した。吸着画分は、０．０５％トリフルオロ
酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配により溶出させた
（図１）。溶出液を１５ｍＬづつ分画し、ＨＤＣ阻害を
有する画分を集めた。高いＨＤＣ活性阻害作用を有する
ピークＡについて、下記の方法を用いて更に精製した。
すなわち、ピークＡの画分をロータリーエバポレーター
にて濃縮し、濃縮液３ｍｌを得た。該濃縮液を、１Ｍの
酢酸で平衡化したバイオゲルＰ−２樹脂（バイオラド社
製）を充填したカラム（２０×３８０ｍｍ）に供してゲ
ル濾過を行った。溶出液を１５ｍＬづつ分画し、ＨＤＣ
阻害作用を有する区分を集めた。これをロータリーエバ
ポレーターにて濃縮後、ピークＡの精製標品約２．１ｍ
ｇを得た。

【００２６】(4) 構造解析ピークＡの物性を以下に示す。性状：淡黄色粉末融点（℃）：２０９〜２１２℃（分解）分子量及び分子式：４１８、Ｃ₁₉Ｈ₁₄Ｏ₁₁ マススペクトル：m/z ４１９〔Ｍ＋Ｈ〕⁺(FAB-MS、JM
X-LX2000、日本電子社製）ＩＲスペクトル：KBr錠法、JASCO FT/IR−7300（日本
分光社製） (cm-1)；3450, 1650, 1640, 1620, 1540, 1520, 1510,
1460, 1420,1220, 1100, 1050, 840 1H-NMRスペクトル：DMSO-d₆中、400MHz、JOEL JNM-LA4
00（日本電子社製） δ(ppm)；4.63(1H,d), 5.32(1H,d), 6.42(1H,s), 6.81
(2H,d),7.39(2H,d), 8.50(1H,s), 8.72(OH,br), 9.55(O
H,br),12.31(OH,br) 13C-NMRスペクトル：DMSO-d₆中、100MHz、JOEL JNM-LA
400（日本電子社製） δ(ppm)；71.1, 79.7, 98.1, 105.7, 115.0, 121.1, 12
2.1, 126.9,130.1, 145.1, 151.6, 152.8, 154.3, 157.
4, 168.6, 171.0, 180.8 ＵＶスペクトル：水溶液中２６５ｎｍに吸収

【００２８】上記機器分析の結果より、ピークＡは下記
の一般式で表される化合物であると結論した。

【００３０】

【化３】

【００３１】〔実施例２〕培地にトランス−エポキシコ
ハク酸を５ｇ添加した以外は、実施例１と同様の条件で
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（ＩＦＯ４２０
６）を培養し、本物質の精製標品約４．０ｍｇを得た。
本物質の前駆物質を培地に添加することにより、培養物
中への本物質の生成蓄積が促進されることが分かった。〔試験例１〕ＨＤＣ阻害活性試験ピークＡ、すなわち本物質の精製標品のＨＤＣ阻害活性
を、上述の方法により調べた。結果を表１に示す。な
お、対照として公知のＨＤＣ阻害物質である（＋）−カ
テキン〔Lorenz,W.,Kusche,J.,Barth,H.,and Mathias,
C.H.(1973) in Histamine (Maslinski,C.Z.ed.)pp.265-
269,Dowdew,Hutchinson and Ross,Stroudsburg,Pennsyl
vania〕を用いた。表中の「５０％阻害値」とは、ＨＤ
Ｃの活性を５０％とするために必要な本物質の量（μｇ
／ｍｌ）を表す。

【００３２】

【００３３】表１の結果より、本物質は、（＋）−カテ
キンよりも強いＨＤＣ阻害活性を示すことが明らかであ
る。

【００３４】〔試験例２〕抗酸化活性試験本物質の精製標品の抗酸化活性を、上述の方法により調
べた。結果を図２に示す。図２中、縦軸は、酸化反応に
より生成したＭｅＬ−ＯＯＨの、ＨＰＬＣによる溶出チ
ャート上でのピーク面積を示す。また、CONTOROLは、反
応系に抗酸化剤を加えない場合のデータを示し、sample
は、反応系に本物質を加えた場合のデータを示す。尚、
ポジティブコントロールとしては、公知の抗酸化剤であ
るビタミンＥ（vitamin E）を用いた。本物質は、０．
１ｍＭで抗酸化活性を示し、０．５ｍＭでは、０．１ｍ
ＭビタミンＥよりも強い抗酸化活性を示した。〔試験例３〕急性毒性試験急性毒性試験は、「改正医薬品毒性試験法ガイドライ
ンＧＬＰ基準」に従い行った。本物質の精製標品５０
ｍｇを、注射用蒸留水１ｍｌに溶解し、５匹のＣｒｊ：
ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス（５週齢、雄）に、体重２５
ｇ当たり１ｍｌ（投与量２．０ｇ／Ｋｇ）の割合で経
口投与し、１４日間観察した。

【００３５】試験終了後の本物質投与群は、剖検及び全
身各臓器の病理組織検査において何ら異常は観察されな
かった。試験の結果より、本物質のＬＤ₅₀価は２．０ｇ
／Ｋｇ（経口）以上であり、その毒性は極めて低いと判
断された。

【００３６】

【発明の効果】本発明の新規イソフラボン誘導体は、潰
瘍、アレルギー疾患等の炎症疾患の原因となるヒスタミ
ンの生合成に関与するヒスチジン脱炭酸酵素に対し優れ
た活性阻害作用を示し、副作用もない。また、本物質
は、優れた抗酸化活性をも有している。本物質は、医
薬、抗酸化剤、機能性食品等として大変有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本物質の逆相ＨＰＬＣによる溶出チャートを示
す。

【図２】本物質の抗酸化活性試験の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 31/35 ＡＥＤＡ６１Ｋ 31/35 ＡＥＤＣ０９Ｋ 15/06 Ｃ０９Ｋ 15/06 Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｐ 17/06 //(Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の一般式：【化１】で表される新規イソフラボン誘導体またはその塩。
【請求項２】請求項１記載のイソフラボン誘導体また
はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項３】請求項１記載のイソフラボン誘導体また
はその塩を有効成分として含有するヒスチジン脱炭酸酵
素阻害剤。
【請求項４】請求項１記載のイソフラボン誘導体また
はその塩を有効成分として含有する抗酸化剤。
【請求項５】請求項１記載のイソフラボン誘導体の生
産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物か
ら該イソフラボン誘導体を採取することを特徴とするイ
ソフラボン誘導体の製造法。
【請求項６】請求項１記載のイソフラボン誘導体の生
産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物か
ら該イソフラボン誘導体を採取するにあたり、培地また
は培養物に、ダイゼイン、ゲニステイン、ダイジン、ゲ
ニスチン、トランス−エポキシコハク酸より選ばれる一
種以上の物質を添加することを特徴とするイソフラボン
誘導体の製造方法。
【請求項７】微生物が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏ
ｒｙｚａｅである請求項５または６記載のイソフラボン
誘導体の製造法。