JPH09110857A

JPH09110857A - 新規イソフラボン誘導体及びヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤

Info

Publication number: JPH09110857A
Application number: JP26716895A
Authority: JP
Inventors: Emiko Kinoshita; 恵美子木下; Yoshinori Ozawa; 善徳小澤; Tetsuro Aijima; 鐵郎相島
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1995-10-16
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 1997-04-28

Abstract

(57)【要約】【解決手段】下記の一般式：【化１】（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨ）で表される新規イソフラ
ボン誘導体、及び当該イソフラボン誘導体を有効成分と
して含有するヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤。【効果】本発明の新規イソフラボン誘導体は、潰瘍、
アレルギー疾患等の炎症疾患の原因となるヒスタミンの
生合成に関与するヒスチジン脱炭酸酵素に対し優れた活
性阻害作用を示し、副作用もない。本物質は、医薬品、
機能性食品等として大変有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒスチジン脱炭酸
酵素阻害活性を有する新規イソフラボン誘導体及び該イ
ソフラボン誘導体を有効成分として含有するヒスチジン
脱炭酸酵素阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の潰瘍、喘息性
気管支炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患は、生
体内の過剰なヒスタミンの生成により起こる炎症疾患で
ある。ヒスタミンは、ヒスチジンの脱炭酸反応により生
成する。この反応を触媒する酵素がヒスチジン脱炭酸酵
素（以下、「ＨＤＣ」という）である。

【０００３】上記の炎症疾患の治療薬としては、ヒスタ
ミンの生合成を阻害するもの、すなわちＨＤＣ阻害剤が
知られている。このような薬剤としては、（＋）−カテ
キン、ヒスチジン誘導体、シアニダノール、トリトクア
リン等を挙げることができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規物質を
有効成分として含有する優れたＨＤＣ阻害剤を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下式で表される新
規イソフラボン誘導体が、優れたＨＤＣ阻害活性を有す
ることを見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発
明は、下記の一般式：

【０００６】

【化２】

【０００７】（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨ）で表される
新規イソフラボン誘導体である。本発明はまた、上記の
イソフラボン誘導体を有効成分として含有するヒスチジ
ン脱炭酸酵素阻害剤である。以下、本発明を詳細に説明
する。

【０００８】

【本発明の実施の形態】本発明のイソフラボン誘導体
（以下「本発明物質」という）を得るための出発材料
は、本発明物質又はその前駆体を含有するものであれば
いかなるものでもよい。本発明物質は、例えば、本発明
物質の生産能を有する微生物を培地に培養し、その培養
物から本発明物質を採取することによって得られる。

【０００９】本発明で用いられる微生物は、本発明物質
の生産能を有するものであればいかなる菌株でもよい
が、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生
物、具体的にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ
（ＩＦＯ４２０６）等を挙げることができる。又、本発
明で用いられる微生物は、上記の菌株のみならず、人工
的又は自然に得られる変異株であってもよい。上記の菌
株の変異株を人工的に作成する方法としては、例えば、
ラジオアイソトープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を
用いて原株に突然変異を起こさせる方法を用いることが
できる。

【００１０】本発明で用いられる培地は、微生物を培養
する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、そ
の他の栄養素を適切な割合で含有し、且つ本発明物質の
前駆体となり得る物質を含有するものであれば、合成培
地又は天然培地のいずれでも使用できる。そのような培
地としては、例えば、蒸煮大豆及び炒熬後に粉砕した小
麦の混合物を挙げることができる。

【００１１】微生物の培養は、２５〜３５℃、好ましく
は３０℃前後で３０〜８０時間、好ましくは４０〜４５
時間行えばよい。以上の操作により、培養物中に本発明
物質が生成蓄積する。培養終了後、培養物より本発明物
質を精製するためには、溶媒抽出及び蒸留法を含む通常
の方法を用いることができる。本発明物質は、例えば、
下記の方法を用いて精製することができる。

【００１２】先ず、培養物に蒸留水を加えた後、３５〜
４５℃で一晩静置し、培養物より本発明物質を抽出す
る。次いで、培養物のガーゼ濾過及び遠心分離を行い、
得られた遠心上清をフィルター濾過する。上記の遠心上
清に、有機溶媒、例えば酢酸エチル、１−プロパノール
等を加えて、振盪した後、上層と下層とに分ける。この
上層について、上記と同様の有機溶媒処理を２回行い、
下層を得る。得られた全ての下層を合わせ、塩酸でｐＨ
２．０前後に調整した後、有機溶媒を加えて、振盪し、
上層と下層とに分ける。この上層をロータリーエバポレ
ーター（東京理化社製）にて濃縮し、濃縮液を得る。

【００１３】該濃縮液を、逆相カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（以下「逆相ＨＰＬＣ」という）に
供する。逆相カラムとしては、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５
Ｃ１８ＨＧ（和光純薬社製）、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−
１２０Ｔ（東ソー社製）等が挙げられる。吸着画分は、
トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配によ
り溶出させることができる。溶出液を分画した後、各画
分のＨＤＣ阻害活性を後記の測定法に従って測定する。
ＨＤＣ阻害活性を有する画分を、ロータリーエバポレー
ターにより濃縮し、濃縮液を得る。該濃縮液を蒸留
水、エタノール等に溶解した後、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを行ない、ＨＤＣ阻害活性を有する画分を集め
る。ゲル濾過支持体としては、バイオゲルＰ−２樹脂
（バイオラド社製）、トヨパールＣＷ−３５（東ソー社
製）等が挙げられる。

【００１４】以上の操作により、高度に精製された本発
明物質を得ることができる。本発明物質は優れたＨＤＣ
阻害活性及び高い安全性を示し、医薬品や機能性食品と
して有用である。本発明物質を炎症疾患の治療薬として
用いる場合、単独で投与することもできるが、通常は、
賦形剤、潤沢剤、希釈剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、甘味
剤、芳香剤、乳化散剤等を用いて錠剤、粉剤、水和剤、
乳剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、座剤等の形に製剤
化し、経口的又は非経口的に投与することができる。上
記賦形剤としては、水、ゼラチン、澱粉、結晶セルロー
ス、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、アラビア
ゴム、植物油等が挙げられる。

【００１５】本発明物質の投与量は、投与方法と症状の
程度、患者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人
一日当たりの有効成分として０．０１〜２０ｇ、好まし
くは０．５〜１０ｇの範囲で選ばれる。又、本発明物質
を、他の医薬品等と適宜混合して使用することも可能で
ある。本発明物質を機能性食品として用いる場合、その
ままで、又は他の食品に添加して使用することができ
る。本発明物質を他の食品に添加する場合、食品中に混
合する方法、食品表面に塗布する方法等が例示される。
その場合は、食品１ｋｇ当たり０．０１ｇ以上、好まし
くは、０．５〜１０ｇ程度添加すればよい。

【００１６】適用できる食品としては、醤油、味噌、つ
ゆ等の調味料、カマボコ、チクワ等の水産練り製品、ハ
ム、ソーセージ等の畜肉加工品、日本酒、洋酒、果実酒
等の酒類、清涼飲料、果実飲料等の飲料類、ケーキ、プ
リン、饅頭等の菓子類が例示される。更に、本発明物質
を、果実、野菜類、缶詰類、惣菜食品等に添加して用い
ることも可能である。

【００１７】本発明物質は、他の食品添加物等と適宜混
合して使用することも可能である。本発明物質のＨＤＣ
阻害活性の測定法を以下に示す。（１）試薬酵素溶液ＨＤＣを、マウス肥満腫瘍細胞Ｐ−８１５（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１３３，１７２
−１７８（１９９２）参照）から、Ｏｈｍｏｒｉらの方
法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，８３４−８３９
（１９９０）参照）により部分精製したもの。

【００１８】基質溶液リン酸緩衝液１００ｍＭヒスチジン５μｇ／ｍｌピリドキサールリン酸５μｇ／ｍｌの酵素溶液２０μｌ／ｍｌ検体溶液本発明物質の各精製工程において得られた画分

【００１９】（２）反応条件基質溶液０．１ｍｌに、検体溶液１０μｌを添加し、３
７℃で１２時間反応させる。

【００２０】（３）反応生成物ヒスタミンの定量生成したヒスタミンは、ジメチルアミノアゾベンゼンイ
ソチオシアネート誘導体としてＨＰＬＣを用いて定量す
る。ＨＰＬＣの条件は以下の通り。カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＳＬ（ナカライテス
ク社製）溶出液：クロロホルム／ジメチルホルムアミド／水
／酢酸＝２１０／８０／４／１（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）検出波長：４３５ｎｍ

【００２１】（４）ＨＤＣ阻害活性の算出ＨＤＣ活性阻害率の算出方法は、以下の通りである。阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００Ａ：基質溶液に、検体溶液を添加して反応させたときの
ヒスタミン生成量Ｂ：検体溶液の代わりに、メタノール１０μｌを添加
し、同様の条件で反応させたときのヒスタミン生成量

【００２２】

【実施例】以下に実施例および試験例を示し、本発明を
より具体的に説明する。〔実施例〕本発明物質の取得 (1) 種菌の培養Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（ＩＦＯ４２０
６）を、ＭＡ培地（2.0%モルトエクストラクト、2.0%グ
ルコース、0.1%ペプトン、2.0%寒天）を用いて斜面培養
した。培養物１白金耳分を、水分含量８０％ｗ／ｖのフ
スマ５ｇに植菌し、３０℃で４日間培養し、得られた培
養物を種菌とした。

【００２３】(2) 本培養本培養に用いる培地は下記の方法により調製した。すな
わち、丸大豆３００ｇを１２時間水に浸漬した後、４時
間蒸煮した。得られた蒸煮大豆に、炒熬した後粉砕した
小麦３３５ｇを加えた。上記の培地に、種菌２ｇを加え
て混和し、３０℃で１週間静置培養した。得られた培養
物に蒸留水８００ｍｌを加えた後、４２℃で一晩静置
し、次いで培養物のガーゼ濾過及び遠心分離（７０００
ｒｐｍ）を行った。得られた遠心上清を０．８μｍのフ
ィルター（ミリポア社製）で濾過した後、０．４５μｍ
のボトルトップフィルター（ファルコン社製）で濾過し
た。

【００２４】(3) 本発明物質の精製上記の濾液５００ｍｌに、酢酸エチル（和光純薬社製）
２５０ｍｌを加えて、３分間振盪した後、上層と下層と
に分けた。この上層について上記と同様の酢酸エチル処
理を２回行い、下層を得た。得られた下層を合わせ、塩
酸でｐＨ２に調整した後、酢酸エチル２５０ｍｌを加え
て３分間振盪し、上層と下層とに分けた。得られた上層
に酢酸エチル（和光純薬社製）２５０ｍｌを加えて、３
分間振盪し、上層と下層とに分けた。得られた上層をロ
ータリーエバポレーター（東京理化社製）にて濃縮し、
濃縮液１０ｍＬを得た。

【００２５】該濃縮液を、プレカラム（カラム：Ｗａｋ
ｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ１０×５０ｍｍ和光純
薬社製）を配置した逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｓ
ｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ１０×３００ｍｍ和光純薬
社製）に供した。吸着画分は、０．０５％トリフルオロ
酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配により溶出させた
（図１）。溶出液を１５ｍＬづつ分画し、ＨＤＣ阻害作
用を有する画分を集めた。高いＨＤＣ活性阻害作用を有
する２つの画分、ピークＡ及びピークＢについて、下記
の方法を用いて更に精製した。すなわち、ピークＡの画
分をロータリーエバポレーターにて濃縮し、濃縮液３ｍ
ｌを得た。該濃縮液を、１Ｍの酢酸で平衡化したバイオ
ゲルＰ−２樹脂（バイオラド社製）を充填したカラム
（２０×３８０ｍｍ）に供してゲル濾過を行った。溶出
液を１５ｍＬづつ分画し、ＨＤＣ阻害作用を有する区分
を集めた。これをロータリーエバポレーターにて濃縮
後、ピークＡの精製標品約１７ｍｇを得た。ピークＢに
ついても同様の操作を行い、ピークＢの精製標品約１０
ｍｇを得た。

【００２６】(4) 構造解析ピークＡ及びＢの物性を以下に示す。ピークＡ性状；白色粉末融点（℃）；２１２〜２１８℃（分解）分子量及び分子式；３８６、C₁₉H₁₄O₉ マススペクトル；m/z 387（Ｍ＋Ｈ） [FABmass、KRATOS CONCEPT-IIH （島津クレイトス社
製)] ＩＲスペクトル；ＫＢｒ錠法、JASCO FT/IR-7300
（日本分光社製） (cm ^-1) : 3420，1630，1540，1520，1450，1250，120
0，1110，970，890，840，780

【００２７】 ¹H-NMRスペクトル；DMSOーd₆中、200MH
z、JOEL JNMーFX200（日本電子社製） (ppm) : 4.48(1H,d)，5.13(1H,d)，6.8(2H,d)，7.09
(1H,dd) ，7.13(1H,dd)，7.39（2H,d)，8.02(1H,d)，8.
35(1H,s), 9.53(1H, br) ¹³C-NMRスペクトル ; DMSO ーd₆、50MHz、JOEL JNM
ーFX200（日本電子社製） δ(ppm) ：71.2，81.0，102.2，115.0，115.3，118.0，
122.4，123.7，127.0，130.0，153.1，157.1，162.4，1
69.0,171.9，174.8 ＵＶスペクトル；水溶液中、248nm、302nmに吸収

【００２８】ピークＢ性状；淡黄色粉末融点（℃）；１３９〜１４４℃（分解）分子量及び分子式；４０２、C₁₉H₁₄O₁₀ マススペクトル；m/z ４０３（Ｍ＋Ｈ） [FABmass、KRATOS CONCEPT-IIH （島津クレイトス社
製)] ＩＲスペクトル；ＫＢｒ錠法、JASCO FT/IR-7300
（日本分光社製） (cm^-1): 3450，1650，1620，1580，1520，1310，125
0，1180，1160，1070，840

【００２９】 ¹H-NMRスペクトル；DMSOーd₆中、200MH
z、JOEL JNMーFX200（日本電子社製） δ(ppm) ：4.51(1H,d)，5.15(1H,d)，6.37(1H,d)，6.62
(1H,d)，6.82(2H,d)，7.39(2H,d)，8.38(1H,s), 9.52(1
H,br),12.90(1H,s) ¹³C-NMRスペクトル；DMSOーd₆中、50MHz、JOEL JNM
ーFX200（日本電子社製） δ(ppm) ：70.9，79.3，93.4，98.8，105.7，115.0，12
0.9，122.5，130.0，154.3，157.2，157.4，161.6，16
3.5，168.4，171.5，180.3 ＵＶスペクトル；水溶液中、260ｎｍに吸収上記機器分析の結果より、ピークＡは下記の一般式（た
だしＲ＝Ｈ）で表される化合物であり、またピークＢは
下記の一般式（ただしＲ＝ＯＨ）で表される化合物であ
ると結論した。

【００３０】

【化３】

【００３１】〔試験例１〕ＨＤＣ阻害活性試験ピークＡおよびピークＢの精製標品のＨＤＣ阻害活性を
上述の方法により調べた。結果を表１に示す。なお、対
照として公知のＨＤＣ阻害物質である（＋）−カテキン
〔Lorenz,W.,Kusche,J.,Barth,H.,and Mathias,C.H.(19
73) in Histamine (Maslinski,C.Z.ed.)pp.265-269,Dow
dew,Hutchinson and Ross,Stroudsburg,Pennsylvania〕
を用いた。表中の「５０％阻害値」とは、ＨＤＣの活性
を５０％とするために必要な本発明物質の量（μｇ／ｍ
ｌ）を表す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１の結果より、ピークＡ及びＢの化合物
は共にＨＤＣ阻害活性を有し、とくにピークＢの化合物
は、（＋）−カテキンと同程度のＨＤＣ阻害活性を示す
ことが明らかである。

【００３４】〔試験例２〕急性毒性試験「改正医薬品毒性試験法ガイドラインＧＬＰ基準」実施例に記載のピークＡ及びピークＢの精製標品を、注
射用蒸留水１ｍｌ当たり５０ｍｇずつ溶解し、５匹のＣ
ｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス（５週齢、雄）に、体
重２５ｇ当たり１ｍｌ（投与量２．０ｇ／ｋｇ）の割
合で経口投与し、１４日間観察した。

【００３５】試験終了後のピークＡ投与群及びピークＢ
投与群は、剖検及び全身各臓器の病理組織検査において
何ら異常は観察されなかった。試験の結果より、ピーク
Ａ及びピークＢのＬＤ₅₀価は2.0 g/kg（経口）以上であ
り、両者の毒性は極めて低いと判断された。

【００３６】

【発明の効果】本発明の新規イソフラボン誘導体は、潰
瘍、アレルギー疾患等の炎症疾患の原因となるヒスタミ
ンの生合成に関与するヒスチジン脱炭酸酵素に対し優れ
た活性阻害作用を示し、副作用もない。本物質は、医薬
品、機能性食品等として大変有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明物質の逆相ＨＰＬＣによる溶出チャート
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の一般式：【化１】（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨ）で表される新規イソフラ
ボン誘導体。
【請求項２】請求項１記載のイソフラボン誘導体を有
効成分として含有するヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤。