JPH1066572A - 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 - Google Patents
高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法Info
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- JPH1066572A JPH1066572A JP8245470A JP24547096A JPH1066572A JP H1066572 A JPH1066572 A JP H1066572A JP 8245470 A JP8245470 A JP 8245470A JP 24547096 A JP24547096 A JP 24547096A JP H1066572 A JPH1066572 A JP H1066572A
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- soybean trypsin
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 大豆に特定の抽出方法を施し、次いで、該抽
出液から簡単に高純度の大豆トリプシンインヒビターを
得る方法を提供すること。 【解決手段】 大豆の抽出処理物に分離精製手段を施し
て大豆トリプシンインヒビターを得る大豆トリプシンイ
ンヒビターの製造方法において、抽出処理が水性溶媒
中、ｐＨ３．０〜６．０で行われることを特徴とする高
純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法。
出液から簡単に高純度の大豆トリプシンインヒビターを
得る方法を提供すること。 【解決手段】 大豆の抽出処理物に分離精製手段を施し
て大豆トリプシンインヒビターを得る大豆トリプシンイ
ンヒビターの製造方法において、抽出処理が水性溶媒
中、ｐＨ３．０〜６．０で行われることを特徴とする高
純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】大豆の抽出により大豆トリプ
シンインヒビターを製造する方法に関するものである
が、特に、大豆から特定の抽出方法により高純度の大豆
トリプシンインヒビターを簡単に製造する方法に関す
る。
シンインヒビターを製造する方法に関するものである
が、特に、大豆から特定の抽出方法により高純度の大豆
トリプシンインヒビターを簡単に製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】大豆トリプシンインヒビターは、大別し
てクニッツ型とボーマン・バーク型の２種が存在する。
前者は分子量２０，１００、等電点４．５でトリプシン
およびその類似酵素を阻害する。後者は分子量７，９７
５、等電点４．２でトリプシン、キモトリプシンの双方
を阻害する。両インヒビターは酵素阻害の特異性が異な
るため、生体内で異なる生理活性を示すことが知られて
いる。クニッツ型トリプシンインヒビターはトリプシ
ン、結漿カリクレイン、活性型第Ｘ因子等に抑制効果を
有することが知られており、炎症性浮腫亢進抑制剤（特
開平７ー１０７７２号公報）、癌性胸・腹水貯留抑制剤
（特公平６ー２３１１３号公報）として利用できること
が報告されている。また、ボーマン・バーク型トリプシ
ンインヒビターは肥満細胞脱顆粒抑制剤として有効であ
ることが報告されている（特公平５ー８６９３３号公
報）。
てクニッツ型とボーマン・バーク型の２種が存在する。
前者は分子量２０，１００、等電点４．５でトリプシン
およびその類似酵素を阻害する。後者は分子量７，９７
５、等電点４．２でトリプシン、キモトリプシンの双方
を阻害する。両インヒビターは酵素阻害の特異性が異な
るため、生体内で異なる生理活性を示すことが知られて
いる。クニッツ型トリプシンインヒビターはトリプシ
ン、結漿カリクレイン、活性型第Ｘ因子等に抑制効果を
有することが知られており、炎症性浮腫亢進抑制剤（特
開平７ー１０７７２号公報）、癌性胸・腹水貯留抑制剤
（特公平６ー２３１１３号公報）として利用できること
が報告されている。また、ボーマン・バーク型トリプシ
ンインヒビターは肥満細胞脱顆粒抑制剤として有効であ
ることが報告されている（特公平５ー８６９３３号公
報）。
【０００３】そこで、これらのインヒビターを工業的に
高純度で製造することが出来れば、医薬用原料として提
供することが可能となるが、特にクニッツ型トリプシン
インヒビターは酵素に対する特異性が高いことから、医
薬品原料としての提供が望まれている。
高純度で製造することが出来れば、医薬用原料として提
供することが可能となるが、特にクニッツ型トリプシン
インヒビターは酵素に対する特異性が高いことから、医
薬品原料としての提供が望まれている。
【０００４】トリプシンインヒビターを大豆から得る方
法は種々報告されているが、そのいずれも、中性から微
アルカリ性の水性溶媒、あるいは強酸による低ｐＨの水
性溶媒で、場合によっては食塩等の塩を添加して主要蛋
白画分を抽出し、得られるホエーからのインヒビターの
分離は、等電点沈殿、塩析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過等の組み合わせにより行われている。
法は種々報告されているが、そのいずれも、中性から微
アルカリ性の水性溶媒、あるいは強酸による低ｐＨの水
性溶媒で、場合によっては食塩等の塩を添加して主要蛋
白画分を抽出し、得られるホエーからのインヒビターの
分離は、等電点沈殿、塩析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過等の組み合わせにより行われている。
【０００５】大豆トリプシンインヒビターの製造方法と
しては、例えば、次のような方法が報告されている。
しては、例えば、次のような方法が報告されている。
【０００６】 丸大豆又は脱脂大豆を水又は温水で抽
出した豆乳から酸又は塩で蛋白質を凝固、沈殿させて得
られる大豆ホエーのｐＨを調節（５．０〜８．５）して
限外濾過膜で濃縮液を得、陰イオン交換体への吸着、塩
濃度勾配による溶出により大豆トリプシンインヒビター
を製造する方法（特開平６ー１４５１９８号公報）。
出した豆乳から酸又は塩で蛋白質を凝固、沈殿させて得
られる大豆ホエーのｐＨを調節（５．０〜８．５）して
限外濾過膜で濃縮液を得、陰イオン交換体への吸着、塩
濃度勾配による溶出により大豆トリプシンインヒビター
を製造する方法（特開平６ー１４５１９８号公報）。
【０００７】 脱脂大豆の弱アルカリ（ｐＨ７.５〜
８.０）抽出液を酸沈殿（ｐＨ３.５〜６.４）させたホ
エーを出発原料として、大豆トリプシンインヒビターを
製造する方法（Ｊ. Agric. Food Chem., 35,967-971(19
87)。
８.０）抽出液を酸沈殿（ｐＨ３.５〜６.４）させたホ
エーを出発原料として、大豆トリプシンインヒビターを
製造する方法（Ｊ. Agric. Food Chem., 35,967-971(19
87)。
【０００８】 脱脂大豆の０．２５Ｎ硫酸抽出液から
大豆トリプシンインヒビターを製造する方法（J. Bioch
em., 62,141-149(1967)。
大豆トリプシンインヒビターを製造する方法（J. Bioch
em., 62,141-149(1967)。
【０００９】上記の従来法又はの出発原料は、大豆
から水（ｐＨ無調整）又は弱アルカリ水（ｐＨ７．５〜
８．０）抽出により得られる豆乳である。次の段階の酸
処理は、不溶化する蛋白質を除くことが目的である。最
初の豆乳調製段階では、なるべく多くの蛋白質を抽出し
ており、大豆子葉細胞中の蛋白構造体であるプロテイン
ボデーは破壊されて、構成蛋白質は可溶化していると考
えられる。
から水（ｐＨ無調整）又は弱アルカリ水（ｐＨ７．５〜
８．０）抽出により得られる豆乳である。次の段階の酸
処理は、不溶化する蛋白質を除くことが目的である。最
初の豆乳調製段階では、なるべく多くの蛋白質を抽出し
ており、大豆子葉細胞中の蛋白構造体であるプロテイン
ボデーは破壊されて、構成蛋白質は可溶化していると考
えられる。
【００１０】また、上記の従来法では、大豆の硫酸
（０．２５Ｎ）抽出液から大豆トリプシンインヒビター
が得られているが、この硫酸溶液はｐＨ１．０前後と考
えられ、かなり強酸性の抽出条件であるから、上記の従
来法又はと同じように、プロテインボデーの破壊が
生起していると考えられる。
（０．２５Ｎ）抽出液から大豆トリプシンインヒビター
が得られているが、この硫酸溶液はｐＨ１．０前後と考
えられ、かなり強酸性の抽出条件であるから、上記の従
来法又はと同じように、プロテインボデーの破壊が
生起していると考えられる。
【００１１】このように、従来の方法は、いずれも大豆
のプロテインボディーを破壊して、蛋白質成分のほとん
どを可溶化した後に精製を行うことから、不純物が多
く、そのために多段階の操作が必要であったり、操作に
長時間を要するために微生物の繁殖が起こりやすい等の
問題点がある。また、不要な蛋白質が多いために起こる
と考えられる蛋白質成分の不安定化が操作を困難にし、
回収率の大幅な低下の原因となっている。工業的な方法
においては、十分な限外濾過濃縮を行うことで蛋白質の
不安定化を防ぐことができるとしているが、この操作は
長時間を要するために微生物の繁殖や、限外濾過濃縮時
のせん弾力による失活が問題となる。
のプロテインボディーを破壊して、蛋白質成分のほとん
どを可溶化した後に精製を行うことから、不純物が多
く、そのために多段階の操作が必要であったり、操作に
長時間を要するために微生物の繁殖が起こりやすい等の
問題点がある。また、不要な蛋白質が多いために起こる
と考えられる蛋白質成分の不安定化が操作を困難にし、
回収率の大幅な低下の原因となっている。工業的な方法
においては、十分な限外濾過濃縮を行うことで蛋白質の
不安定化を防ぐことができるとしているが、この操作は
長時間を要するために微生物の繁殖や、限外濾過濃縮時
のせん弾力による失活が問題となる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従来のものは、中性付
近から弱アルカリの条件又は強酸性の条件下で可溶化さ
せた蛋白質をｐＨ４．２付近の酸性条件で沈殿させて爽
雑蛋白質を分離した後、ホエー中に残る蛋白質から目的
とする大豆トリプシンインヒビターを得る方法である
が、このような方法では、蛋白質の抽出時のプロテイン
ボデーの破壊等により、ホエー中には目的とする大豆ト
リプシンインヒビターの他に、まだ多くの不純物が残存
するので、その後の精製には、特定の精製方法の組合せ
が必要となる等、ホエーからの大豆トリプシンインヒビ
ターの分離には困難が伴っていた。
近から弱アルカリの条件又は強酸性の条件下で可溶化さ
せた蛋白質をｐＨ４．２付近の酸性条件で沈殿させて爽
雑蛋白質を分離した後、ホエー中に残る蛋白質から目的
とする大豆トリプシンインヒビターを得る方法である
が、このような方法では、蛋白質の抽出時のプロテイン
ボデーの破壊等により、ホエー中には目的とする大豆ト
リプシンインヒビターの他に、まだ多くの不純物が残存
するので、その後の精製には、特定の精製方法の組合せ
が必要となる等、ホエーからの大豆トリプシンインヒビ
ターの分離には困難が伴っていた。
【００１３】そこで、本発明は、大豆に特定の抽出処理
を施し、次いで、該抽出液又はその抽出液から生成する
沈殿物を出発原料として、簡単に高純度の大豆トリプシ
ンインヒビターを得る方法を提供するものである。
を施し、次いで、該抽出液又はその抽出液から生成する
沈殿物を出発原料として、簡単に高純度の大豆トリプシ
ンインヒビターを得る方法を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】大豆蛋白質成分の等電点
はｐＨ４．０〜６．０の範囲のものが多く、その溶解性
はｐＨ４．０〜４．２で最も低くなるが、本発明者ら
は、大豆蛋白質成分の溶解度が低く、しかも、トリプシ
ンインヒビターそのものにとっても等電点付近に相当す
るｐＨ、すなわち、ｐＨ３．０〜６．０の条件下で抽出
した抽出物に、意外にも大豆トリプシンインヒビターが
多く含まれるとともに、除去困難な不純物が少ないこと
を知り、この抽出物を原料とすると、その後、高度な分
離精製手段を組み合わせることなく、実質的には単独の
分離精製手段を用いても高純度の大豆トリプシンインヒ
ビターが得られることを見い出し、本発明を完成した。
はｐＨ４．０〜６．０の範囲のものが多く、その溶解性
はｐＨ４．０〜４．２で最も低くなるが、本発明者ら
は、大豆蛋白質成分の溶解度が低く、しかも、トリプシ
ンインヒビターそのものにとっても等電点付近に相当す
るｐＨ、すなわち、ｐＨ３．０〜６．０の条件下で抽出
した抽出物に、意外にも大豆トリプシンインヒビターが
多く含まれるとともに、除去困難な不純物が少ないこと
を知り、この抽出物を原料とすると、その後、高度な分
離精製手段を組み合わせることなく、実質的には単独の
分離精製手段を用いても高純度の大豆トリプシンインヒ
ビターが得られることを見い出し、本発明を完成した。
【００１５】すなわち、本発明は、大豆に抽出処理を施
し、次いで、得られる抽出液又はその抽出液を低温下で
静置することにより生じる沈殿に分離精製手段を施して
大豆トリプシンインヒビターを得る大豆トリプシンイン
ヒビターの製造方法において、抽出処理が水性溶媒中、
ｐＨ３．０〜６．０で行われることを特徴とする高純度
の大豆トリプシンインヒビターの製造方法である。
し、次いで、得られる抽出液又はその抽出液を低温下で
静置することにより生じる沈殿に分離精製手段を施して
大豆トリプシンインヒビターを得る大豆トリプシンイン
ヒビターの製造方法において、抽出処理が水性溶媒中、
ｐＨ３．０〜６．０で行われることを特徴とする高純度
の大豆トリプシンインヒビターの製造方法である。
【００１６】本発明では、大豆の抽出時にプロテインボ
デーの破壊等が生起しないので、その分ホエー中の不純
物の量が少なくなる、その結果、ホエーから簡単な分離
手段により高純度の大豆トリプシンインヒビターを回収
できる点で非常に優れた方法である。
デーの破壊等が生起しないので、その分ホエー中の不純
物の量が少なくなる、その結果、ホエーから簡単な分離
手段により高純度の大豆トリプシンインヒビターを回収
できる点で非常に優れた方法である。
【００１７】大豆の抽出処理は、大豆に５〜２０倍容の
酸溶液を加え、更に必要に応じて酸を加える等して、ｐ
Ｈを３．０〜６．０、好ましくは４．０〜５．０に保ち
ながら、１０分から５時間、好ましくは３０分から２時
間で抽出することによって行う。この際、必要に応じて
３０〜６０℃に加熱する。
酸溶液を加え、更に必要に応じて酸を加える等して、ｐ
Ｈを３．０〜６．０、好ましくは４．０〜５．０に保ち
ながら、１０分から５時間、好ましくは３０分から２時
間で抽出することによって行う。この際、必要に応じて
３０〜６０℃に加熱する。
【００１８】抽出終了後、遠心分離又は加圧濾過等の手
段で抽出液をホエーとして回収する。ここで得られる抽
出液は、大豆主要蛋白質の含量が少ないためにその後の
精製負荷が小さく、しかも、目的とする生理活性を持つ
トリプシンインヒビター成分が等電点に近いにもかかわ
らず、トリプシンインヒビターは大豆中の４５〜７０％
がホエー中に溶出する。
段で抽出液をホエーとして回収する。ここで得られる抽
出液は、大豆主要蛋白質の含量が少ないためにその後の
精製負荷が小さく、しかも、目的とする生理活性を持つ
トリプシンインヒビター成分が等電点に近いにもかかわ
らず、トリプシンインヒビターは大豆中の４５〜７０％
がホエー中に溶出する。
【００１９】このホエーをそのまま、またはｐＨを中性
域に調整後生じた沈殿を除去して分離精製処理に供する
ことができる。この段階で限外濾過濃縮工程を組み入れ
ることも可能であるが、この工程は必ずしも必要ではな
い。また、分離精製処理の前に除粒子工程、例えば、孔
径０．１〜０．４５μｍの濾過膜処理等を行って、除菌
あるいは残存する粒子の除去を行うことができる。
域に調整後生じた沈殿を除去して分離精製処理に供する
ことができる。この段階で限外濾過濃縮工程を組み入れ
ることも可能であるが、この工程は必ずしも必要ではな
い。また、分離精製処理の前に除粒子工程、例えば、孔
径０．１〜０．４５μｍの濾過膜処理等を行って、除菌
あるいは残存する粒子の除去を行うことができる。
【００２０】さらに、先に得られたホエ−またはそれを
限外濾過膜で適宜濃縮した液を２〜１５℃、好ましくは
２〜１０℃にて２時間以上、好ましくは４〜２４時間静
置することで生じる沈殿を遠心分離等により回収し、ｐ
Ｈ６．０〜９．０の水性溶媒にて溶解、次いで、不溶物
を遠心分離や濾過等により除去して得られた溶液を分離
精製に供することもできる。溶解性を向上させるため
に、適当な濃度の塩類や、ドデシル硫酸ナトリウム、ト
リトンＸ−１００等の界面活性剤、２−メルカプトエタ
ノ−ル、ジチオスレイト−ル等の還元剤を添加すること
もできる。また、この際にも分離精製の前段階で上記と
同様の除菌あるいは残存粒子の除去操作を行うことがで
きる。
限外濾過膜で適宜濃縮した液を２〜１５℃、好ましくは
２〜１０℃にて２時間以上、好ましくは４〜２４時間静
置することで生じる沈殿を遠心分離等により回収し、ｐ
Ｈ６．０〜９．０の水性溶媒にて溶解、次いで、不溶物
を遠心分離や濾過等により除去して得られた溶液を分離
精製に供することもできる。溶解性を向上させるため
に、適当な濃度の塩類や、ドデシル硫酸ナトリウム、ト
リトンＸ−１００等の界面活性剤、２−メルカプトエタ
ノ−ル、ジチオスレイト−ル等の還元剤を添加すること
もできる。また、この際にも分離精製の前段階で上記と
同様の除菌あるいは残存粒子の除去操作を行うことがで
きる。
【００２１】分離精製処理は、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、限外濾過等の通常の分離精製手段単
独で行われるが、その場合、特にイオン交換クロマトグ
ラフィーを採用するのが好ましい。なお、イオン交換ク
ロマトグラフィーを採用した場合で展開剤の除去が必要
になるときに行う展開剤除去処理は、ここにいう分離精
製手段には入らないことは言うまでもない。通常は、単
独の分離精製手段の採用で十分その目的を達成すること
が出来るが、より高度の純度のものを得ようとする場合
には、他の分離精製手段を組み合わせることは勿論可能
である。
フィー、ゲル濾過、限外濾過等の通常の分離精製手段単
独で行われるが、その場合、特にイオン交換クロマトグ
ラフィーを採用するのが好ましい。なお、イオン交換ク
ロマトグラフィーを採用した場合で展開剤の除去が必要
になるときに行う展開剤除去処理は、ここにいう分離精
製手段には入らないことは言うまでもない。通常は、単
独の分離精製手段の採用で十分その目的を達成すること
が出来るが、より高度の純度のものを得ようとする場合
には、他の分離精製手段を組み合わせることは勿論可能
である。
【００２２】大豆材料としては、丸大豆や低温脱脂大豆
等を挙げることができるが、通常は植物油の製造工程で
発生する低温脱脂大豆が大量かつ安価に入手できるので
好ましい。
等を挙げることができるが、通常は植物油の製造工程で
発生する低温脱脂大豆が大量かつ安価に入手できるので
好ましい。
【００２３】水性溶媒としては、無機酸や有機酸の溶液
いずれも可能であるが、該酸は、特にリン酸や酢酸、ク
エン酸、乳酸等の弱電解質の酸が好ましい。
いずれも可能であるが、該酸は、特にリン酸や酢酸、ク
エン酸、乳酸等の弱電解質の酸が好ましい。
【００２４】本発明によれば、ホエーをそのままイオン
交換クロマトグラフィーに供することにより、トリプシ
ンインヒビターまたはクニッツ型トリプシンインヒビタ
ーを単独で分離精製することが可能であり、両者を安定
して純度９０％以上に精製することができる。
交換クロマトグラフィーに供することにより、トリプシ
ンインヒビターまたはクニッツ型トリプシンインヒビタ
ーを単独で分離精製することが可能であり、両者を安定
して純度９０％以上に精製することができる。
【００２５】大豆トリプシンインヒビターは、多くの大
豆蛋白質成分が含まれるプロテインボデーではなく、そ
の外の細胞質に局在するとされている（SMITH & CIRCLE
著「大豆タンパク質」建帛社（1974））が、プロテイ
ンボデーを破壊せずに細胞質のみから大豆トリプシンイ
ンヒビターを抽出することは行われていなかった。
豆蛋白質成分が含まれるプロテインボデーではなく、そ
の外の細胞質に局在するとされている（SMITH & CIRCLE
著「大豆タンパク質」建帛社（1974））が、プロテイ
ンボデーを破壊せずに細胞質のみから大豆トリプシンイ
ンヒビターを抽出することは行われていなかった。
【００２６】このように、プロテインボデーを破壊せず
に大豆の細胞質のみから大豆トリプシンインヒビターを
抽出することは本発明が初めてであり、また、大豆抽出
液中の分離困難な成分の存在等からみて、該抽出物から
簡単な分離精製手段により高純度の大豆トリプシンイン
ヒビターを得ることができることは予想外のことであ
り、このことは、本発明の特異性を窺わせる。
に大豆の細胞質のみから大豆トリプシンインヒビターを
抽出することは本発明が初めてであり、また、大豆抽出
液中の分離困難な成分の存在等からみて、該抽出物から
簡単な分離精製手段により高純度の大豆トリプシンイン
ヒビターを得ることができることは予想外のことであ
り、このことは、本発明の特異性を窺わせる。
【００２７】以上、本発明により、大豆に含まれる生理
活性を持つ大豆トリプシンインヒビター成分を工業的に
安定に高純度かつ安価に精製することが可能となり、大
豆トリプシンインヒビターを医薬品原料として利用する
ことが可能となった。
活性を持つ大豆トリプシンインヒビター成分を工業的に
安定に高純度かつ安価に精製することが可能となり、大
豆トリプシンインヒビターを医薬品原料として利用する
ことが可能となった。
【００２８】また、本発明の方法によれば、他のアルブ
ミン成分も容易に高純度で得ることができる点において
も、本発明は非常に価値がある。
ミン成分も容易に高純度で得ることができる点において
も、本発明は非常に価値がある。
【００２９】なお、大豆をリン酸処理（ｐＨ４．７、５
０℃）する技術としては、特開平２ー１５４６４６号公
報、特開平４ー１７３０５７号公報、特開平７ー１０７
９７４号公報等があるが、これらは、飼料用大豆（特開
平２ー１５４６４６号公報、特開平４ー１７３０５７号
公報）やβーアミラーゼ（特開平７ー１０７９７４号公
報）の製造に関するものであり、いずれも、トリプシン
インヒビターを得ることを目的とするものではないの
で、トリプシンインヒビターを得る方法についての記載
は全くないことからみて、これらは、本発明とは全く無
関係のものである。
０℃）する技術としては、特開平２ー１５４６４６号公
報、特開平４ー１７３０５７号公報、特開平７ー１０７
９７４号公報等があるが、これらは、飼料用大豆（特開
平２ー１５４６４６号公報、特開平４ー１７３０５７号
公報）やβーアミラーゼ（特開平７ー１０７９７４号公
報）の製造に関するものであり、いずれも、トリプシン
インヒビターを得ることを目的とするものではないの
で、トリプシンインヒビターを得る方法についての記載
は全くないことからみて、これらは、本発明とは全く無
関係のものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明の実施
の態様を説明する。
の態様を説明する。
【００３１】なお、活性測定はｐーtoluenesulfonyl-L-
arginine methyl ester (TAME)を基質に用いるHummelの
方法(Can. J. Biochem. Physiol., 37, 1393（1959））
に従ったトリプシンの活性測定法を用いて、１unitのト
リプシン活性を阻害する活性を１unitとした。
arginine methyl ester (TAME)を基質に用いるHummelの
方法(Can. J. Biochem. Physiol., 37, 1393（1959））
に従ったトリプシンの活性測定法を用いて、１unitのト
リプシン活性を阻害する活性を１unitとした。
【００３２】
【実施例１】低温脱脂大豆粉１００ｇに対して、０．２
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．７に且つ温度を５０℃に調整して、６０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．７に且つ温度を５０℃に調整して、６０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
【００３３】得られた大豆ホエー１００ｍｌをミリポア
社製メンブレン濾過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μ
ｍ）で除菌濾過し、イオン交換クロマトグラフィーに供
した。カラムはファルマシア製 DEAE-Sepharose FFを充
填し（φ１．６×１２ｃｍ）、０．０７５Ｍ食塩を含む
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衝化した後、
試料を供し、平衝化に用いた緩衝液で洗浄後、０．０７
５Ｍと０．２５Ｍの食塩をそれぞれ含む緩衝液で直線的
濃度勾配を作成して溶出し、溶出液を１０ｍｌずつ分画
した。得られた画分をＳＤＳ電気泳動に供し、クニッツ
型トリプシンインヒビター溶出画分を合わせて、ファル
マシア製ＰＤー１０カラムを用いて脱塩し、精製試料を
得た。得られた精製試料は、ＳＤＳ電気泳動でクニッツ
型トリプシンインヒビターの単独バンド（純度９８％以
上）となり、総活性７，０３０unitが得られた。
社製メンブレン濾過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μ
ｍ）で除菌濾過し、イオン交換クロマトグラフィーに供
した。カラムはファルマシア製 DEAE-Sepharose FFを充
填し（φ１．６×１２ｃｍ）、０．０７５Ｍ食塩を含む
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衝化した後、
試料を供し、平衝化に用いた緩衝液で洗浄後、０．０７
５Ｍと０．２５Ｍの食塩をそれぞれ含む緩衝液で直線的
濃度勾配を作成して溶出し、溶出液を１０ｍｌずつ分画
した。得られた画分をＳＤＳ電気泳動に供し、クニッツ
型トリプシンインヒビター溶出画分を合わせて、ファル
マシア製ＰＤー１０カラムを用いて脱塩し、精製試料を
得た。得られた精製試料は、ＳＤＳ電気泳動でクニッツ
型トリプシンインヒビターの単独バンド（純度９８％以
上）となり、総活性７，０３０unitが得られた。
【００３４】
【実施例２】低温脱脂大豆粉１００ｇに対して、０．２
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．７に且つ温度を５０℃に調整して、６０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．７に且つ温度を５０℃に調整して、６０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
【００３５】得られた大豆ホエー１００ｍｌを、６Ｎ水
酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整し、生じた沈殿
を遠心分離して除去した後、ミリポア社製メンブレン濾
過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μｍ）で除菌濾過し、
イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムはファ
ルマシア製 DEAE-Sepharose FFを充填し（φ１．６×１
２ｃｍ）、０．０７５Ｍ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衝化した後、試料を供し、平衝化
に用いた緩衝液で洗浄後、０．０７５Ｍと０．２５Ｍの
食塩をそれぞれ含む緩衝液で直線的濃度勾配を作成して
溶出し、溶出液を１０ｍｌずつ分画した。得られた画分
をＳＤＳ電気泳動に供し、クニッツ型トリプシンインヒ
ビター溶出画分を合わせて、ファルマシア製ＰＤー１０
カラムを用いて脱塩し、精製試料を得た。得られた精製
試料は、ＳＤＳ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒ
ビターの単独バンド（純度９８％以上）となり、総活性
９，５００unitが得られた。
酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整し、生じた沈殿
を遠心分離して除去した後、ミリポア社製メンブレン濾
過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μｍ）で除菌濾過し、
イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムはファ
ルマシア製 DEAE-Sepharose FFを充填し（φ１．６×１
２ｃｍ）、０．０７５Ｍ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衝化した後、試料を供し、平衝化
に用いた緩衝液で洗浄後、０．０７５Ｍと０．２５Ｍの
食塩をそれぞれ含む緩衝液で直線的濃度勾配を作成して
溶出し、溶出液を１０ｍｌずつ分画した。得られた画分
をＳＤＳ電気泳動に供し、クニッツ型トリプシンインヒ
ビター溶出画分を合わせて、ファルマシア製ＰＤー１０
カラムを用いて脱塩し、精製試料を得た。得られた精製
試料は、ＳＤＳ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒ
ビターの単独バンド（純度９８％以上）となり、総活性
９，５００unitが得られた。
【００３６】
【実施例３】低温脱脂大豆粉４００ｇに対して、０．４
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液４ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．０に且つ温度を５０℃に調整して、９０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液４ｌを添加して撹拌した
後、ｐＨを４．０に且つ温度を５０℃に調整して、９０
分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）し
て抽出液を回収した。
【００３７】得られた大豆ホエー３．５Ｌを６Ｎ水酸化
ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整し、生じた沈殿を遠
心分離して除去した。上清をミリポア社製メンブレン濾
過膜（タイプＧＶＬＰ；孔径０．２μｍ）で除菌濾過
し、イオン交換クロマトグラフィーに供した。ＴＳＫge
lＤＥＡＥートヨパール６５０Ｍを用い、φ８．９×１
５ｃｍのカラムを作成し、１０mＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衝化した後、試料を供し、０.０７５Ｍ、
０．２５Ｍ、０．５０Ｍの食塩をそれぞれ含む緩衝液で
段階的に溶出した。０．２５Ｍ食塩で溶出したトリプシ
ンインヒビターを、ファルマシア製 Ｓephadex Ｇー２
５を充填したカラムに供して脱塩した。
ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整し、生じた沈殿を遠
心分離して除去した。上清をミリポア社製メンブレン濾
過膜（タイプＧＶＬＰ；孔径０．２μｍ）で除菌濾過
し、イオン交換クロマトグラフィーに供した。ＴＳＫge
lＤＥＡＥートヨパール６５０Ｍを用い、φ８．９×１
５ｃｍのカラムを作成し、１０mＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衝化した後、試料を供し、０.０７５Ｍ、
０．２５Ｍ、０．５０Ｍの食塩をそれぞれ含む緩衝液で
段階的に溶出した。０．２５Ｍ食塩で溶出したトリプシ
ンインヒビターを、ファルマシア製 Ｓephadex Ｇー２
５を充填したカラムに供して脱塩した。
【００３８】得られたトリプシンインヒビターは、ＳＤ
Ｓ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒビターとボー
マン・バーク型トリプシンインヒビターの混合物であ
り、トリプシンインヒビターとしての純度９７％であっ
た。得られた総活性１，７３０，０００unitであった。
Ｓ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒビターとボー
マン・バーク型トリプシンインヒビターの混合物であ
り、トリプシンインヒビターとしての純度９７％であっ
た。得られた総活性１，７３０，０００unitであった。
【００３９】
【実施例４】低温脱脂大豆粉１００ｇに対して、０．２
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して攪拌しなが
ら、ｐＨを４．７、温度を５０℃に調整して９０分間抽
出し、遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）して抽出液
を回収した。得られた抽出液を５０℃に保持しながら限
外濾過膜（ＮＴＵ−３１５０；日東電工）を用いて１０
倍に濃縮し、濃縮液を４℃にて２４時間静置した。生じ
た沈殿を遠心分離して回収し、５０ｍｌの０．０１規定
水酸化ナトリウム溶液に分散し、十分に攪拌した後、可
溶画分を吸引濾過して回収した。得られた濾液をミリポ
ア社製メンブレン濾過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μ
ｍ）で除菌濾過した後、実施例２と同様の方法にてイオ
ン交換クロマトグラフィ−に供して精製クニッツ型トリ
プシンインヒビタ−を得た。得られた精製試料は、ＳＤ
Ｓ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒビタ−の単独
バンド（純度９８％以上）となり、７，９００unitが得
られた。
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１ｌを添加して攪拌しなが
ら、ｐＨを４．７、温度を５０℃に調整して９０分間抽
出し、遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）して抽出液
を回収した。得られた抽出液を５０℃に保持しながら限
外濾過膜（ＮＴＵ−３１５０；日東電工）を用いて１０
倍に濃縮し、濃縮液を４℃にて２４時間静置した。生じ
た沈殿を遠心分離して回収し、５０ｍｌの０．０１規定
水酸化ナトリウム溶液に分散し、十分に攪拌した後、可
溶画分を吸引濾過して回収した。得られた濾液をミリポ
ア社製メンブレン濾過膜（タイプＧＳ；孔径０．２２μ
ｍ）で除菌濾過した後、実施例２と同様の方法にてイオ
ン交換クロマトグラフィ−に供して精製クニッツ型トリ
プシンインヒビタ−を得た。得られた精製試料は、ＳＤ
Ｓ電気泳動でクニッツ型トリプシンインヒビタ−の単独
バンド（純度９８％以上）となり、７，９００unitが得
られた。
【００４０】
【実施例５】低温脱脂大豆粉１００ｇに対して、０．２
７％（ｖ／ｖ）リン酸水溶液をそれぞれ、０.２、０.
５、１.０、２.０、３.０ ｌ添加してｐＨを４．５に保
持しながら５０℃にて６０分間抽出した。遠心分離
（８，８００ｘｇ、１５分）にてそれぞれ抽出液を回収
し、４℃に２４時間保持した。生じた沈殿をデカンテ−
ションにより分取し、５０ｍｌの０．０１規定のＮaＯ
Ｈを加えて分散した後、０．１１規定の水酸化ナトリウ
ム溶液を用いてｐＨを８．０に調整し、可溶画分を遠心
分離にて回収した。得られた溶液のｐＨを０．１規定の
塩酸を用いて７．０に調整し、実施例２と同様に陰イオ
ン交換クロマトグラフィ−に供し、脱塩してクニッツ型
トリプシンインヒビタ−を得た。それぞれの抽出液から
得られた精製試料の純度は、同等であった。回収率は、
表に示したようにリン酸水溶液の添加量が１.０ ｌで最
も良好であった。添加量が０.５ ｌよりも少なくなる
と、溶解度の関係でトリプシンインヒビタ−が十分に抽
出されないものと考えられる。一方、添加量が２.０ ｌ
を越えると、その後の操作におけるロスが大きいばかり
でなく、処理量が多くなって操作が煩雑になるので実用
的ではない。 抽出時のリン酸溶液添加量（ｌ） 0.2 0.5 1.0 2.0 3.0 活性回収量（unit） 3200 6500 7200 7000 5300
７％（ｖ／ｖ）リン酸水溶液をそれぞれ、０.２、０.
５、１.０、２.０、３.０ ｌ添加してｐＨを４．５に保
持しながら５０℃にて６０分間抽出した。遠心分離
（８，８００ｘｇ、１５分）にてそれぞれ抽出液を回収
し、４℃に２４時間保持した。生じた沈殿をデカンテ−
ションにより分取し、５０ｍｌの０．０１規定のＮaＯ
Ｈを加えて分散した後、０．１１規定の水酸化ナトリウ
ム溶液を用いてｐＨを８．０に調整し、可溶画分を遠心
分離にて回収した。得られた溶液のｐＨを０．１規定の
塩酸を用いて７．０に調整し、実施例２と同様に陰イオ
ン交換クロマトグラフィ−に供し、脱塩してクニッツ型
トリプシンインヒビタ−を得た。それぞれの抽出液から
得られた精製試料の純度は、同等であった。回収率は、
表に示したようにリン酸水溶液の添加量が１.０ ｌで最
も良好であった。添加量が０.５ ｌよりも少なくなる
と、溶解度の関係でトリプシンインヒビタ−が十分に抽
出されないものと考えられる。一方、添加量が２.０ ｌ
を越えると、その後の操作におけるロスが大きいばかり
でなく、処理量が多くなって操作が煩雑になるので実用
的ではない。 抽出時のリン酸溶液添加量（ｌ） 0.2 0.5 1.0 2.0 3.0 活性回収量（unit） 3200 6500 7200 7000 5300
【比較例１】低温脱脂大豆１００ｇに１０倍量の蒸留水
を加えて、３０℃に保温して２時間抽出した。遠心分離
をして抽出液を得、３Ｎ塩酸でｐＨを４．５に調整して
生じた沈殿を再び遠心分離して除去した。得られたホエ
ーをｐＨ７．０に再度調整し、除菌濾過したのち実施例
２と同様に陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、脱
塩してトリプシンインヒビターを得た。得られたトリプ
シンインヒビターは、ＳＤＳ電気泳動の結果、クニッツ
型トリプシンインヒビターを含み、純度７３％であっ
た。
を加えて、３０℃に保温して２時間抽出した。遠心分離
をして抽出液を得、３Ｎ塩酸でｐＨを４．５に調整して
生じた沈殿を再び遠心分離して除去した。得られたホエ
ーをｐＨ７．０に再度調整し、除菌濾過したのち実施例
２と同様に陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、脱
塩してトリプシンインヒビターを得た。得られたトリプ
シンインヒビターは、ＳＤＳ電気泳動の結果、クニッツ
型トリプシンインヒビターを含み、純度７３％であっ
た。
【００４１】
【比較例２】低温脱脂大豆粉１００ｇに対して、１.１
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１.０ｌを添加して撹拌し
た後、ｐＨを２．０に調整して、撹拌しながら室温で９
０分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）
して回収した抽出液を、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを７．０に調整し、生じた沈殿を再び遠心分離して除
去した。得られたホエーを除菌濾過した後、実施例２と
同様に陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、脱塩し
てトリプシンインヒビターを得た。得られたトリプシン
インヒビターは、ＳＤＳ電気泳動の結果、クニッツ型ト
リプシンインヒビターを含み、純度７８％であった。
％（ｖ／ｖ）のリン酸水溶液１.０ｌを添加して撹拌し
た後、ｐＨを２．０に調整して、撹拌しながら室温で９
０分間抽出した。遠心分離（８，８００ｘｇ、１５分）
して回収した抽出液を、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを７．０に調整し、生じた沈殿を再び遠心分離して除
去した。得られたホエーを除菌濾過した後、実施例２と
同様に陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、脱塩し
てトリプシンインヒビターを得た。得られたトリプシン
インヒビターは、ＳＤＳ電気泳動の結果、クニッツ型ト
リプシンインヒビターを含み、純度７８％であった。
【００４２】
【発明の効果】従来のものは、中性付近から弱アルカリ
の条件又は強酸性の条件下で可溶化させた蛋白質をｐＨ
４．２付近の酸性条件で沈殿させてホエー中に残る少量
の蛋白質を分離した後、目的とする大豆トリプシンイン
ヒビターを得る方法であるが、このような方法では、蛋
白質の抽出時のプロテインボデーの破壊等により、ホエ
ー中には目的とする大豆トリプシンインヒビターの他
に、多くの不純物が残存するので、その後の精製には、
特定の精製方法の組合せが必要となる等、ホエーからの
大豆トリプシンインヒビターの分離には困難が伴ってい
た。
の条件又は強酸性の条件下で可溶化させた蛋白質をｐＨ
４．２付近の酸性条件で沈殿させてホエー中に残る少量
の蛋白質を分離した後、目的とする大豆トリプシンイン
ヒビターを得る方法であるが、このような方法では、蛋
白質の抽出時のプロテインボデーの破壊等により、ホエ
ー中には目的とする大豆トリプシンインヒビターの他
に、多くの不純物が残存するので、その後の精製には、
特定の精製方法の組合せが必要となる等、ホエーからの
大豆トリプシンインヒビターの分離には困難が伴ってい
た。
【００４３】これに対して、本発明では、大豆の抽出時
にプロテインボデーの破壊等が生起しないので、その
分、ホエー中の不純物の量が少なくなる結果、ホエーか
ら簡単な分離手段、すなわち、実質的に単独の分離精製
手段より高純度の大豆トリプシンインヒビターを回収で
きる点で、本発明は非常に優れた方法である。
にプロテインボデーの破壊等が生起しないので、その
分、ホエー中の不純物の量が少なくなる結果、ホエーか
ら簡単な分離手段、すなわち、実質的に単独の分離精製
手段より高純度の大豆トリプシンインヒビターを回収で
きる点で、本発明は非常に優れた方法である。
【００４４】また、このように本発明によれば、ホエー
をそのままイオン交換クロマトグラフィー等に供すると
いう簡単な操作により、トリプシンインヒビターまたは
クニッツ型トリプシンインヒビターを単独で安定して純
度９０％以上に分離精製することができるということ
は、取りも直さず、この両者が医薬の原料として価値が
高いだけに、本発明の技術に対し高い評価をしたとして
も当然である。
をそのままイオン交換クロマトグラフィー等に供すると
いう簡単な操作により、トリプシンインヒビターまたは
クニッツ型トリプシンインヒビターを単独で安定して純
度９０％以上に分離精製することができるということ
は、取りも直さず、この両者が医薬の原料として価値が
高いだけに、本発明の技術に対し高い評価をしたとして
も当然である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/81 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＤ
Claims (10)
- 【請求項１】 大豆の抽出処理物に分離精製手段を施し
て大豆トリプシンインヒビターを得る大豆トリプシンイ
ンヒビターの製造方法において、抽出処理が水性溶媒
中、ｐＨ３．０〜６．０で行われることを特徴とする高
純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法。 - 【請求項２】 大豆の抽出処理物が、抽出液である請求
項１記載の高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造
方法。 - 【請求項３】 大豆の抽出処理物が、抽出液から生成す
る沈殿物である請求項１記載の高純度の大豆トリプシン
インヒビターの製造方法。 - 【請求項４】 大豆の抽出処理に用いる水性溶媒の量
が、大豆の５〜２０倍量である請求項１乃至請求項３の
いずれか一つに記載の高純度の大豆トリプシンインヒビ
ターの製造方法。 - 【請求項５】 抽出処理が水性溶媒中、ｐＨ４．０〜
５．０で行われる請求項１乃至請求項４記載の高純度の
大豆トリプシンインヒビターの製造方法。 - 【請求項６】 抽出処理が施される大豆が、低温脱脂大
豆である請求項１乃至請求項５記載の高純度の大豆トリ
プシンインヒビターの製造方法。 - 【請求項７】 水性溶媒が、リン酸水溶液である請求項
１乃至請求項６のいずれか一つに記載の高純度の大豆ト
リプシンインヒビターの製造方法。 - 【請求項８】 大豆トリプシンインヒビターが、クニッ
ツ型トリプシンインヒビターである請求項１乃至請求項
７のいずれか一つに記載の高純度の大豆トリプシンイン
ヒビターの製造方法。 - 【請求項９】 分離精製手段が、単独の分離精製手段を
含むものである請求項１乃至請求項８のいずれか一つに
記載の高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方
法。 - 【請求項１０】 分離精製手段が、イオン交換クロマト
グラフィーで行われるものである請求項１乃至請求項９
のいずれか一つに記載の高純度の大豆トリプシンインヒ
ビターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8245470A JPH1066572A (ja) | 1996-08-29 | 1996-08-29 | 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8245470A JPH1066572A (ja) | 1996-08-29 | 1996-08-29 | 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066572A true JPH1066572A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=17134145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8245470A Pending JPH1066572A (ja) | 1996-08-29 | 1996-08-29 | 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1066572A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005082389A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Fuji Oil Company, Limited | 癌転移抑制組成物 |
| JP2006188439A (ja) * | 2004-12-28 | 2006-07-20 | Showa Sangyo Co Ltd | ピロリ菌付着抑制組成物、並びに飲食物 |
| JP2013516431A (ja) * | 2009-12-30 | 2013-05-13 | ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 大豆加工ストリームから単離される精製Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタータンパク質 |
| JP2019528242A (ja) * | 2016-06-17 | 2019-10-10 | ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第ｘａ因子誘導体の調製 |
-
1996
- 1996-08-29 JP JP8245470A patent/JPH1066572A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005082389A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Fuji Oil Company, Limited | 癌転移抑制組成物 |
| JP2006188439A (ja) * | 2004-12-28 | 2006-07-20 | Showa Sangyo Co Ltd | ピロリ菌付着抑制組成物、並びに飲食物 |
| JP2013516431A (ja) * | 2009-12-30 | 2013-05-13 | ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 大豆加工ストリームから単離される精製Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタータンパク質 |
| JP2013516429A (ja) * | 2009-12-30 | 2013-05-13 | ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー | ボーマン・バークインヒビタープロテインを大豆加工ストリームから回収する方法 |
| JP2013516432A (ja) * | 2009-12-30 | 2013-05-13 | ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 大豆加工ストリームからＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタータンパク質を回収する方法 |
| JP2019528242A (ja) * | 2016-06-17 | 2019-10-10 | ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第ｘａ因子誘導体の調製 |
| JP2022000477A (ja) * | 2016-06-17 | 2022-01-04 | ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第ｘａ因子誘導体の調製 |
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