AT501101A1

AT501101A1 - Allergie-immuntherapie

Info

Publication number: AT501101A1
Application number: AT0202804A
Authority: AT
Original assignee: Biomay Prod & Handel
Priority date: 2004-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2006-06-15
Also published as: WO2006058359A2; ES2319218T3; EP1817330B1; CN101068830A; PL1817330T3; AU2005312324B2; US20080286311A1; AU2005312324A1; ATE417060T1; EP1817330A2; AT501101B1; WO2006058359A3; CN101068830B; DE602005011667D1; JP2008521837A; CA2589187A1

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Allergen-Wirkung von Wildtyp-Protein-Allergenen, neue Allergen-Derivate und Allergen-ImpfStrategien.

Eine Allergie ist die ererbte oder erworbene spezifische Veränderung der Reaktionsfähigkeit gegen fremde (d.h. nichteigene) Substanzen, die normalerweise harmlos sind („Allergene"). Eine Allergie ist mit entzündlichen Reaktionen in den betroffenen Organ-Systemen (Haut, Bindehaut, Nase, Rachen, Schleimhaut der Bronchien, Magen-Darm-Trakt), unmittelbaren Krankheitssymptomen, wie allergische Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis, anaphylaktischer Schock und Asthma, und chronischen Krankheitsmanifestationen, wie Reaktionen im Spätstadium bei Asthma und atopische Dermatitis, verbunden.

Die Typ-I-Allergie stellt eine genetisch bestimmte Überemp-findlichkeits-Erkrankung dar, die etwa 20% der Bevölkerung der industrialisierten Welt betrifft. Das pathophysiologische Merkmal der Typ-I-Allergie ist die Erzeugung von Immunglobulin E (IgE)-Antikörpern gegen ansonsten harmlose Antigene (Allergene).

Derzeit ist die einzige ursächliche Form der Allergiebehandlung eine Allergen-spezifische Immuntherapie, wobei dem Patienten zunehmende Allergen-Dosen verabreicht werden, um ein Allergen-spezifisches Nichtreagieren zu induzieren. Obwohl mehrere Untersuchungen eine klinische Wirksamkeit der Allergen-spezifischen Immuntherapie zeigten, versteht man die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht ganz.

Der größte Nachteil der Allergen-spezifischen Immuntherapie ist, dass man von der Verwendung natürlicher Allergen-Extrakte abhängig ist, die schwierig - wenn nicht unmöglich - zu standardisieren sind, zumindest in industriellem Maßstab. Solche natürliche Allergen-Extrakte bestehen aus verschiedenen allergenen und nicht-allergenen Verbindungen, und infolgedessen ist es möglich, dass bestimmte Allergene im verabreichten Extrakt nicht vorhanden sind oder - noch schlimmer - dass Patienten neue IgE-Spezifitäten gegen Komponenten im Laufe der Behandlung entwickeln können. Ein weiterer Nachteil der Therapie auf Extrakt-Basis ergibt sich aus der Tatsache, dass die Verabreichung biologisch aktiver Allergen-Präparate anaphylaktische Nebenwirkungen induzieren kann.

Die Anwendung von Techniken der Molekularbiologie auf dem Gebiet der Allergen-Charakterisierung hat es ermöglicht, die_

I NACHGEREICHT 2 ·· ♦···

• ······ ··♦ ♦·♦ ·· ·· ·· ··♦ • · · ·

cDNAs, die für alle relevanten Umwelt-Allergene codieren, zu isolieren, und die Produktion rekombinanter Allergene ermöglicht. Die Verwendung solcher rekombinanter Allergene hat es möglich gemacht, das Reaktivitäts-Profil des einzelnen Patienten entweder durch diagnostische Verfahren in vitro (d.h., Detektion Allergen-spezifischer IgE-Antikörper im Serum) oder durch Testen in vivo zu bestimmen. Auf der Grundlage dieser Technologie schien die Entwicklung neuer ImpfStrategien, insbesondere gegen die Typ I-Allergie, auf Komponenten-Basis, welche für das Sensibilisierungsprofil des Patienten maßgeschneidert sind, im Bereich der Möglichkeit zu liegen. Infolge der Ähnlichkeit der rekombinanten Allergene mit ihren natürlichen Gegenstücken weisen aber auch rekombinante Allergene eine beträchtliche allergene Aktivität auf. Da die rekombinanten Allergene die allergene Aktivität der Wildtyp-Allergene sehr stark nachahmen, liegen alle mit dieser allergenen Aktivität verbundenen Nachteile der natürliche Allergene anwendenden Immuntherapie auch für rekombinante Allergene vor. Um die Immuntherapie zu verbessern, muss die allergene Aktivität der rekombinanten Allergene reduziert werden, so dass die Dosis der verabreichten Allergene - mit einem nur geringen Risiko anaphylaktischer Nebenwirkungen - erhöht werden kann.

Es wurde vorgeschlagen, ausschließlich die Aktivität von Allergen-spezifischen T-Zellen zu beeinflussen, indem Peptide verabreicht werden, die nur die T-Zellen-Epitope enthalten. Die T-Zellen-Epitope stellen kleine Peptide dar, die sich aus dem proteolytischen Verdau intakter Allergene durch Antigenpräsentierende Zellen ergeben. Solche T-Zellen-Epitope können als synthetische Peptide erzeugt werden. Bisher mit T-Zellen-Epitopen durchgeführte Tests zeigten jedoch nur schwache Ergebnisse und eine geringe Effizienz. Für die geringe Effizienz der Immuntherapie auf T-Zellen-Peptid-Basis wurden mehrere Erklärungen erwogen: erstens kann es schwierig sein, die optimale Dosis zu verabreichen, um eine T-Zellen-Toleranz statt einer Aktivierung zu erreichen. Zweitens haben kleine T-Zellen-Epitop-Peptide im Körper eine kurze Halbwertszeit. Drittens gibt es beträchtliche Beweise, dass die IgE-Produktion bei atopischen Individuen eine Gedächtnis-Immun-Reaktion darstellt, die keine De-novo-Klassenumschaltung („de novo dass switching") erfordert und somit nicht durch von T-Zellen abstammende Gytelcine kon--

NACHGEREICHT 3 trolliert werden kann. Therapie-Formen, die ausschließlich auf der Verabreichung von T-Zellen-Epitopen basieren, könnten daher die Aktivität Allergen-spezifischer T-Zellen modulieren, könnten aber nur einen geringen Einfluss auf die Erzeugung von Allergenspezifischen IgE-Antikörpern durch bereits umgeschaltete Ge-dächtnis-B-Zellen haben.

Weiters wurde vorgeschlagen, hypoallergene Allergen-Derivate oder Fragmente durch rekombinante DNA-Technologie oder Peptid-Synthese zu erzeugen. Solche Derivate oder Fragmente tragen T-Zellen-Epitope und können IgG-Antikörper induzieren, die mit der IgE-Erkennung des nativen Allergens konkurrieren. Es wurde vor mehr als 20 Jahren nachgewiesen, dass der proteolytische Verdau von Allergenen kleine Allergen-Fragmente ergab, die zum Teil ihre IgE-Bindungsfähigkeit beibehielten, aber keine Reaktionen vom unmittelbaren Typ hervorriefen. Während die Proteolyse von Allergenen schwer zu steuern und zu standardisieren ist, eröff-nete die Molekularbiologie neue Wege für die Erzeugung von IgE-bindenden Haptenen. Es wurde vorgeschlagen, dass solche IgE-bindenden Haptene für eine aktive Immunisierung mit geringeren Risiken anaphylaktischer Wirkungen und für eine passive Therapie zur Sättigung des Effektor-Zellen-gebundenen IgE vor dem Allergen-Kontakt und somit zur Blockierung der Allergen-induzierten Mediator-Freisetzung nützlich sein könnten.

Ein weiterer Vorschlag war, hypoallergene Allergen-Versionen durch Genmanipulation herzustellen, auf Grund der Beobachtung, dass Allergene von Natur aus als Isoformen, die sich nur in wenigen Aminosäure-Resten unterscheiden und/oder in Konforma-tionen mit geringer IgE-Bindungsfähigkeit auftreten können. Beispielsweise ergab die Oligomerisation des Birken-Pollen-Hauptallergens, Bet v 1, durch Genmanipulation ein rekombinantes Trimer mit stark reduzierter .allergener Aktivität. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass die Einführung von Punkt-Mutationen entweder zu Konformationsänderungen in der Allergen-Struktur führt und somit diskontinuierliche IgE-Epitope aufbricht oder die IgE-Bindungsfähigkeit direkt beeinflusst (Valenta et al.,

Biol. Chem. 380 (1999), -815-824).

Es wurde auch gezeigt, dass die Fragmentierung des Allergens in einige wenige Teile (z.B. in zwei Teile) zu einem beinahe vollständigen Verlust der IgE-Bindungsfähigkeit und allergenen Aktivität des Allergens führt, infolge eines Verlusts ihrer na-

NACHGEREICHT 4 tiv-artigen Faltungen (Vrtala et al. (J. Clin. Invest. 99 (1997), 1673-1681) für Bet v 1, Twardosz et al. (BBRC 239 (1997) , 197-204) für Bet v 4, Hayek et al. (J. Immunol. 161 (1998) , 7031-7039) für Aln g 4, Zeiler et al. (J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1997), 721-727) für Rinder-Hautschuppen-Allergen, Elfman (Int. Arch. Allergy Immunol. 117 (1998), 167-173) für Lep d2), Westritschnig (J. Immunol. 172 (2004), 5684-5692) für Phlp 7), ...). Die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuierliche/konformationelle IgE-Epitope enthalten, führt zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungsfähigkeit des Allergens. Auf Grund dieses Wissens wurde im Stand der Technik untersucht, ob solche hypoallergene Allergen-Fragmente in vivo schützende Immunantworten induzieren können (Westritschnig et al., (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003), 495-500) .

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren für eine verbesserte Allergie-Immuntherapie auf Basis des oben erwähnten Wissens vorzusehen. Solche Verfahren und Mittel sollten wirksam, mit einem geringen Risiko eines anaphylaktischen Schocks verbunden, leicht anwendbar und an die Bedürfnisse eines einzelnen Patienten angepasst und leicht auf industriellen Maßstab transformierbar sein.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen mit verringerter allergener Aktivität vor, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

Vorsehen eines Wildtyp-Protein-Allergens mit einer all-ergenen Aktivität,

Spleißen des Wildtyp-Protein-Allergens in zwei Teile, wobei die beiden Teile keine oder eine verringerte allergene Aktivität aufweisen, und

Wiederverbinden der beiden Fragmente in umgekehrter Orientierung.

NACHGEREICHT

Das vorliegende Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuierli-che/konformationelle IgE-Epitope enthalten, zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungskapazität des Allergens führt. Fragmente bestimmter Allergene waren jedoch zu wenig immunogen, um eine schützende Antikörper-Antwort zu induzieren (Westritschnig et al., (2004)). 5

Mit dem vorliegenden Verfahren werden neue und bestimmte Protein-Allergen-Derivate vorgesehen, welche die Vorteile der Ansätze auf Basis der T-Zellen- und B-Zellen-Epitope vereinigen. Gleichzeitig sind die Nachteile einer Impfung nur mit Fragmenten oder mit ausgeklügelten („sophisticated") Anordnungen von Fragmenten (wie IgE-bindende Haptene und das Mischen („shuffling") mit drei oder mehr Fragmenten) bei den Allergen-Derivaten der vorliegenden Erfindung nicht vorhanden.

Tatsächlich konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass die besten Ergebnisse mit jener Struktur erhalten werden können, die - hinsichtlich der Vollständigkeit der Strukturelemente - dem Wildtyp-Allergen am ähnlichsten ist (d.h., mit allen Aminosäuren des Wildtyp-Allergens), jedoch ohne dessen allergener Aktivität (oder mit einer genügend reduzierten aller-genen Aktivität). Natürlich sind, wenn im Laufe der Erzeugung der Allergen-Derivate nur ein paar Aminosäure-Reste verloren (deletiert) oder hinzugefügt (insertiert) werden, oder wenn die Teile durch einen Linker verbunden werden anstatt einer direkten Kombination, die Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung noch immer vorhanden. Diese Reduktion oder Ausschaltung der allerge-nen Aktivität wird mit dem bekannten und allgemeinen Prinzip der Teilung des Allergens in definierte Fragmente erreicht. Zusätzlich zu diesem allgemeinen Prinzip verbindet die vorliegende Erfindung die beiden erhaltenen Teile des Allergens wiederum, in umgekehrter Orientierung, was zu Allergen-Derivaten führt, die im Wesentlichen die gesamte relevante Struktur-Information des Allergens enthalten (weil die Aminosäure-Sequenz vollständig oder beinahe vollständig in den Allergen-Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist), jedoch im Vergleich zum Wildtyp-Allergen mit nur geringer (oder keiner) verbleibenden allergenen Aktivität.

Diese „Kopf-an-Schwanz"-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine geeignete, individuelle und effiziente Immuntherapie für Allergie-Patienten, die mit Routine-Schritten leicht auf größeren Maßstab umsetzbar ist. Die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung induzieren schützende IgG-Antikörper, die die Bindung von IgE des Patienten an Wildtyp-Allergene blockieren und eine Allergen-induzierte Basophilen-Degranulation inhibieren kann.

Das vorliegende Verfahren ist besonders für rekombinante

j NACHGEREICHT - 6 - ·♦ ♦ ··· ·· ··♦ • · · · • · · · · DNA-Technologie geeignet. Sobald das Derivat durch Genmanipulation erzeugt ist, kann es leicht in großen Mengen durch trans-gene Expression in geeigneten Wirten in industriellem Maßstab erhalten werden. Die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise in einem Wirt mit großer Expressionskapazität erzeugt werden.

Zu den bevorzugten, durch die vorliegende Erfindung zu modifizierenden Allergenen zählen alle wesentlichen Protein-Allergene, die z.B. unter www.alleraen.org/List.htm verfügbar sind. Zu den speziell bevorzugten Gruppen von Allergenen gemäß der vorliegenden Erfindung zählen Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p 2, Vorratsmilben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergene, insbesondere Phi p 7, und die in Tabelle A aufgezählten Allergene.

Tabelle A: bevorzugte, durch Mischen („shuffling") gemäß der vorliegenden Erfindung zu modifizierende Allergene (einschließlich Bezugs-Beispiele)

NACHQEREICHT

ALLERGENE

Spezies-Name

Allergen-Name Biochem.ID od. MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs- Ambrosia artemisiifolia Beifußblättrige Ambrosie („short ragweed“) Amb a 1 Antigen E 38 C 8,20 Amb a 2 Antigen K 38 C 8,21 Amba3 Ra3 11 C 22 Amb a 5 Ra5 5 C 11,23 Amb a 6 Ra6 10 C 24,25 Amb a 7 Ra7 12 P 26 Ambrosia triflda Dreilappige Ambrosie („giant ragweed“) Ambt 5 Ra5G 4.4 C 9,10,27 Artemisia vulgaris Beifuß („mugwort“) Art v 1 27-29 C 28 Artv2 35 P 28A Art v 3 Lipid-Transfer-Protein 12 P 53 •· ···· •· ···· ·· ··· • · · · • · t · · - 7 - 14 C 29 34 29A 15,7 C Y15210 14-15 c Y13271 veed“), 17 c AY049012,29B 14 c AY082337 10 c AY082338 43 P 29C c AY335187 15 c vgl. Liste der Isoallergene c vgl. Liste der Isoallergene c vgl. Liste der Isoallergene 15 29D 32 c 30, S83343 c 31, X91256 14 c 31a, Y08390 9 c AF517686 Daten anhängig 9 c AF517685 P. 21 P anhängig

Art v 4 Profilm

Helianthus annuus Sonnenblume Heia 1

Hel a 2 Profilin

Mercurialis annua

Mer a 1 Profilin

Caryophyllales Chenopodium album Weißer Gänsefuß („lamb's-quarters“,„p Chea 1

Weißer Gänsefuß („white goosefoot“)

Che a 2 Profilin

Che a 3 Polcalcin

Salsola kali

Kali-Salzkraut („Russian-thistle“)

Salkl

Rosales

Humulus japonicus Japanischer Hopfen („Japanese hop“) Humj 4w Parietaria judaica

Par j 1 Lipid-Transfer-Protein 1 Par j 2 Lipid-Transfer-Protein 2 Par j 3 Profilin

Parietaria officinalis

Par ο 1 Lipid-Transfer-Protein B. Gräser Poales

Cynodon dactylon Bermudagrass („Bermuda grass“)

Cynd 1 Cynd7

Cyn d 12 Profilin

Cynd 15

Cyn d 22w Enolase

Cyn d 23 Cyn d 14

Cyn d 24 Pathogenese-verwandi Dactylis glomerata

NACHGEREICHT 8 Knäuelgras („orchard grass“) Dac g 1 AgDgl 32 P 32 Dacg2 11 C 33, S45354 Dacg3 c 33A, U25343 Dacg5 31 P 34 Festuca pratensis Wiesenschwingel („meadow fescue“) Fes p 4w 60 Holcus lanatus Wolliges Honiggras („velvet grass „) Hol 11 c Z27084 Lolium perenne Ausdauerndes Weidelgras („iye grass“) Lol p 1 Gruppe 1 27 c 35,36 Lolp2 Gruppe II 11 P 37,37A, X73363 Lol p 3 Gruppe ΠΙ 11 P 38 Lolp5 Lol p IX, Lol p Ib 31/35 c 34,39 Lol p 11 hom: Trypsin-Inhibitor 16 39A Phalaris aquatica Wasserglanzgras („canary grass“) Phaa 1 c 40, S80654 Phleum pratense Wiesenlieschgras („timothy“) Phlpl 27 c X78813 Phlp2 c X75925,41 Phlp4 P 41A Phlp 5 Ag25 32 c 42 Phlp6 c Z27082,43 Phi p 11 Trypsin-Inhibitor-hom. 20 c AF521563,43A Phlp 12 Profilin c X77583,44 Phlp 13 Polygalacturonase 55-60 c AJ238848 Poa pratensis Wiesen-Rispengras („Kentucky blue grass“) Poa p 1 Gruppe I 33 P 46 Poap 5 31/34 c 34,47 Sorghum halepense Aleppohirse (.Johnson grass“) Sorh 1 c 48 C. Bäume Arecales Phoenix dactylifera I NACHGEREICHT | j. j. ·· • · • · • ·

Dattelpalme

Phod2 Profilin 14.3 C ·· »ft ···· • · · · ft» ··· · • ft · · · • · · ft ft · 9 -

Asturias p.c.

Fagales

Ainus glutinosa Erle

Alng 1 17 C Betula verrucosa Birke Bet v 1 17 C Bet v 2 Profilin 15 c Bet v 3 c Bet v4 8 c Bet v 6 h: Isoflavon-Reduktase 33.5 c Betv7 Cyclophilin 18 P Carpinus betulus Hainbuche („hombeam „) Car b 1 17 c Castanea sativa Ess-Kastanie („chestnut“) Cas s 1 22 P Cas s 5 Chitinase Cas s 8 Lipid-Transfer-Protein 9.7 P Corylus avellana Hasel Cor a 1 17 c Cora2 Profilin 14 c Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein 9 c Cor a 9 11S Globulin-art. Protein 40/? c Cor a 10 Luminal-bindend. Prot. 70 c Cor a 11 7S Vicilin-art. Prot. 48 c Quercus alba Weißeiche („white oak“) Quea 1 17 P S50892 vgl. Liste der Isoallergene M65179 X79267 X87153, S54819 vgl. Liste der Isoallergene P81531 vgl. Liste der Isoallergene 52 53 vgl. Liste der Isoallergene

Beyer p.c. AJ295617 AF441864 54

Lamiales Oleaceae Fraxinus excelsior Esche Fra e 1 20 P 58A, AF526295 Ligustrum vulgare Liguster („privet“) Lig v 1 20 P 58A Olea europea Olive Oie e 1 16 C 59,60 fnachgereicht

01ee2 Profilin 15-18 C 60A 01ee3 9.2 60B 01ee4 32 P P80741 Oie e 5 Superoxid-dismutase 16 P P80740 01ee6 10 c 60C, U86342 01ee7 9 P 60D, P81430 Oie e 8 Ca2+-bind. Protein 21 c 60E, AF078679 01ee9 beta-l,3-Glucanase 46 c AF249675 Oie e 10 Glycosyl-Hydrolase-hom. 11 c 60F, AY082335 Syringa vulgaris Flieder Syr v 1 20 P 58A Plantaginaceae Plantago lanceolata Spitzwegerich („English plantain“) Plal 1 18 P P842242 Pinales Cryptomeria japonica Sugi Cryj 1 41-45 c 55, 56 Cryj 2 c 57, D29772 Cupressus arizonica Zypresse Cup a 1 43 c A1243570 Cupressus sempervirens Gemeine Zypresse („common cypress“ ) Cups 1 43 c vgl. Liste der Isoallergene Cup s 3w 34 c Ref. anhängig Juniperus ashei Berg-Zeder („mountain cedar “) Juna 1 43 P P81294 Juna2 c 57A, AJ404653 Juna 3 30 P 57B, P81295 Juniperus oxycedrus Stechwacholder („prickly juniper“) Jun o 4 hom: Calmodulin 29 c 57C, AF031471 Juniperus sabinoides Bergzeder („mountain cedar“) Jun s 1 50 P 58 Juniperus virginiana Virginische Rotzeder („eastem red cedar“ Jun v 1 43 P P81825,58B I nachgereicht - 11 ·· · • · ·· ··· · • · t · • · · · ··· ·· ·

Platanaceae Platanus acerifolia

Gewöhnliche Platane („London plane tree“)

NACHGEREICHT

Plaa 1 18 P P82817 Plaa2 43 P P82967 Pia a 3 Lipid-Transfer-Protein 10 P Iris p.c. D. Milben Acarus siro Arthropode Milbe Aca s 13 Fettsäure-bind. Prot 14* C AJ006774 Blomia tropicalis Milbe Bio 11 Cystein-Protease 39 C AF277840 Blot3 Trypsin 24* C Cheong p.c. Bio 14 alpha-Amylase 56 C Cheongp.c. Blot 5 C U59102 Bio 16 Chymotrypsin 25 C Cheongp.c. Bio 110 Tropomyosin 33 C 61 Blot 11 Paramyosin 110 C AF525465,61A Blot 12 Btlla C U27479 Bio 113 Bt6, Fettsäure-bind. Prot. C U58106 Bio 119 anti-mikrobiel. Pep. -hom 7.2 C Cheong p.c. Dermatophagoides farinae Amerikanische Hausstaubmilbe (.American house dust mite“) Der f 1 Cystein-Protease 25 C 69 Der f 2 14 C 70,70A, vgl. Liste der Isoallergene Der f 3 Trypsin 30 c 63 Der f7 24-31 c SW:Q26456,71 Der f 10 Tropomyosin c 72 Der f 11 Paramyosin 98 c 72A Der f 14 mag3, Apolipophorin c D17686 Der f 15 98k Chitinase 98 c AF178772 Der f 16 Gelsolin/Villin 53 c 71A Der f 17 Ca-bind. EF-Protein 53 c 71A Der f 18w 60k Chitinase 60 c Weber p.c. Dermatophagoides microceras Hausstaubmilbe („house dust mite“) Derm 1 Cystein-Protease 25 P 68 E>ermatophagoides pteronyssinus Europäische Hausstaubmilbe („European house dust mite“) Der p 1 Antigen PI. Cystein-Protease 25 c 62, vgl. Liste der Isoallergene Derp2 14 c 62A-C, vgl. Liste der Isoallergene Derp 3 Trypsin 28/30 c 63 ·· ····

Der p 4 Amylase 60 - 12 -P ·· ··· ··· · 64 Derp5 14 c 65 Derp 6 Chymotrypsin 25 P 66 Derp 7 22/28 c 67 Derp 8 Glutathion-Transferase c 67A Der p 9 kollagenolytische Serin-pro. P 67B Der p 10 Tropomyosin 36 c Y14906 Der p 14 Apolipophorin-art. Prot. c Epton p.c. Euroglyphus maynei Milbe Eur m 2 c vgl. Liste der Isoallergene Eurm 14 Apolipophorin 177 c AF149827 Glycyphagus domesticus Vorratsmilbe („storage mite“) Glyd2 c 72B, vgl. Isoallergen-Liste Lepidoglyphus destructor Vorratsmilbe („storage mite“) Lep d 2 Lep d 1 15 c 73,74,74A, vgl. Isoallergen-Liste Lep d 5 c 75, AJ250278 Lepd7 c 75, AJ271058 Lep d 10 Tropomyosin c 75A, AJ250096 Lep d 13 c 75, AJ250279 Tyrophagus putrescentiae Vorratsmilbe (,storage mite“) Tyr p 2 c 75B, Y12690 E. Tiere Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“ Bosd2 Ag3, Lipocalin 20 c 76, vgl. Isoallergen-Liste (vgl. auch Nahrungsmittel) Bos d 3 Ca-bind. SlOO-hom. 11 c L39834 Bosd4 alpha-Lactalbumin 14.2 c Ml8780 Bos d 5 beta-Lactoglobulin 18.3 c X14712 Bos d 6 Serumalbumin 67 c M73993 Bosd7 Immunglobulin 160 77 Bosd8 Caseine 20-30 77 Canis familiaris (Canis domesticus) Canf 1 25 c 78,79 Hund Can f 2 27 c 78,79 Canf3 Albumin c S72946 Canf 4 18 P A59491

NACHGEREICHT

Equus caballus Hauspferd („domestic horse“)

Equ c 1 Lipocalin 25 C Equ c 2 Lipocalin 18.5 P Equ c 3 Ag3 - Albumin 67 c Equc4 17 P Equc5 AgX 17 P Felis domesticus Katze (Speichel) Fel d 1 cat-1 38 c Fel d 2 Albumin c Fel d 3 Cystatin 11 c Fel d 4 Lipocalin 22 c Fel d 5w Immunglobulin A 400 Fel d 6w Imunglobulin M 800-1000 Fel d 7w Immunglobulin G 150 Cavia porcellus Meerschweinchen Cav p 1 Lipocalin-Homolog 20 P Cavp2 17 P Mus musculus Maus (Ham) Mus m 1 MUP 19 c Rattus norvegius Ratte (Ham) Ratn 1 17 c

U70823 79A, 79B 79C, X74045 79D

Goubran Botros p.c. 15 79E, X84842 79F, AF238996 AY497902 Adedoyin p.c. Adedoyin p.c. Adedoyin p.c. SW:P83507, 80 SW:P83508 81,81A 82,83 F. Fungi (Schimmelpilze) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Altemaria altemata

Altai 28 C Alt a2 25 C Alt a 3 Hitzeschock-Prot. 70 C Alt a 4 prot. Disulfid-Isomerase 57 C Alt a 6 saures ribosomal. Prot. P2 11 C Alt a 7 YCP4 Protein 22 C Alt a 10 Aldehyd-Dehydrogenase 53 C Alt a 11 Enolase 45 C Alt a 12 saures ribosomal. Prot. PI 11 C Cladosporium herbarum Clahl 13 U82633 83A, U62442 U87807, U87808 X84217 X78222, U87806 X78225 X78227, P42041 U82437 X84216 83B, 83C ;_

I NACHGEKEiCHT I

Clah2 23 - 14 - • · 83B, 83C Clah3 Aldehyd-Dehydrogenase 53 C X78228 Cla h 4 saures ribosomal. Prot. P2 11 C X78223 Clah5 YCP4 Protein 22 c X78224 Clah6 Enolase 46 c X78226 Cla h 12 saures ribosomal. Prot. PI 11 c X85180 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus Asp fl 13 alkalische Serinprotease 34 84 Aspergillus fumigatus Asp fl 18 c M83781, S39330 Aspf2 37 c U56938 Aspf3 peroxisomales Protein 19 c U20722 Aspf4 30 c AJ001732 Aspf5 Metallprotease 40 c Z30424 Asp f 6 Mn-Superoxid-dismut. 26.5 c U53561 Aspf7 12 c AJ223315 Asp f 8 ribosomal. Prot. P2 11 c AJ224333 Aspf9 34 c AJ223327 Asp f 10 Asparagin-Protease 34 c X85092 Asp f 11 Peptidyl-Prolyl-Isomerase 24 84A Asp f 12 Hitzeschock-Prot. P90 90 c 85 Asp f 13 alkalische Serin-Protease 34 84B Asp f 15 16 c AJ002026 Asp f 16 43 c g3643813 Asp f 17 c AJ224865 Asp f 18 vakuoläre Serin-Protease 34 84C Asp f 22w Enolase 46 c AF284645 Asp f 23 L3 ribosomal. Protein 44 c 85 A, AF464911 Aspergillus niger Asp n 14 beta-Xylosidase 105 c AF108944 Asp n 18 vakuoläre Serin-Protease 34 c 84B Asp n 25 3-Phytase B 66-100 c 85B, P34754 Aspn? 85 c Z84377 Aspergillus oiyzae Asp o 13 alkalische Serin-Protease 34 c X17561 Asp o 21 TAKA-Amylase A 53 c D00434, M33218 Penicillium brevicompactum Pen b 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Penicillium chiysogenum (vormals P. notatum) Pen ch 13 alkalische Serin-Protease 34 87 [nachgereicht • · ··

Pen ch 18 vakuoläre Serin-Protease 32 - 15 - 87 Pen ch 20 N-Acetyl-glucosaminidase 68 87A Penicillium citrinum Penc3 peroxisomal. Mem.-Prot. 18 86B Pen c 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Pen c 19 Hitzeschock-Prot. P70 70 C U64207 Pen c 22w Enolase 46 C AF254643 Pen c 24 Elongations-Faktor 1 beta c AY363911 Penicillium oxalicum Pen o 18 vakuoläre Serin-Protease 34 87B 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum Fus c 1 ribosomales Prot. P2 11* c AY077706 Fus c 2 Thioredoxin-art. Prot. 13* c AY077707 1.4 Onygenales Trichophyton rubrum Trir2 c 88 Tri r 4 Serin-Protease c 88 Trichophyton tonsurans Tritl 30 P 88A Tri 14 Serin-Protease 83 c 88 l.S Saccharomycetales Candida albicans Canda 1 40 c 89 Cand a 3 peroxisomales Protein 29 c AY136739 Candida boidinii Cand b 2 20 c J04984,J04985 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis Psic 1 Psi c 2 Cyclophilin 16 Coprinus comatus Schopftintling („shaggy cap“) 89A Cop c 1 Leucin-Zipper-Protein 11 C AJ132235 Copc2 AJ242791 Copc3 AJ242792 CopcS AJ242793 Inachgereicnt 16 ·· ·· ···· ·· ·· ··· · ♦ · · · · • · · · · # ·· ·· ··

Copc7 AJ242794 2.2 Urediniomycetes Rhodotomla mucilaginosa Rho m 1 Enolase 47 C 89B Rho m 2 vakuoläre Serin-Protease 31 C AY547285 2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur Mala f 2 MF1, peroxisomales 21 C AB011804,90 Membran-Protein Mala f 3 MF2, peroxisomales 20 C AB011805,90 Membran-Protein Mala f 4 Mitochondrien-Malat-Dehydrogenase 35 C AF084828,90A Malassezia sympodialis Malas 1 C X96486,91 Mala s 5 18* C AJ011955 Mala s 6 17* C AJ011956 Malas 7 C AJ011957,91A Malas 8 19* C AJ011958,91A Malas 9 37* C AJ011959,91A Mala s 10 Hitzeschock-Prot. 70 86 C AJ428052 Mala s 11 Mn-Superoxid-Dismut. 23 C AJ548421 3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (vormals E. nigrum) Epi p 1 Serin-Protease 30 P SW:P83340,911 G. Insekten Aedes aegyptii Stechmücke Aed a 1 Apyrase 68 C L12389 Aeda2 37 C M33157 Apis mellifera Honigbiene Api m 1 Phospholipase A2 16 C 92 Api m 2 Hyaluronidase 44 C 93 Api m 4 Melittin 3 C 94 Apim6 7-8 P Kettner p.c. Api m 7 CUB Serin-Protease 39 C AY127579 nachgereicht

Bombus pennsylvanicus Hummel („bumble bee“) Bom p 1 Phospholipase 16 P 95 Born p 4 Protease P 95 Blattelia germanica Deutsche Schabe Bla gl Bd90k C Blag2 Asparagin-Protease 36 C 96 Blag4 Calycin 21 C 97 Bla g 5 Glutathion-Transferase 22 C 98 Blag6 TroponinC 27 C 98 Periplaneta americana Amerikanische Schabe Peral Cr-PII C Per a 3 Cr-PI 72-78 C 98A Per a 7 Tropomyosin 37 c Y14854 Chironomus kiiensis Mücke Chi k 10 Tropomyosin 32.5* c AJ012184 Chironomus thummi thummi Mücke Chi 11-9 Hämoglobin 16 c 99 Chi 11.01 Komponente III 16 c P02229 Chi 11.02 Komponente IV 16 c P02230 Chi 12.0101 Komponente I 16 c P02221 Chi 12.0102 Komponente LA 16 c P02221 Chi 13 Komponente II-beta 16 c P02222 Chi 14 Komponente ΠΙΑ 16 c P02231 Chi 15 Komponente VI 16 c P02224 Chi 16.01 Komponente VIIA 16 c P02226 Chi 16.02 Komponente IX 16 c P02223 Chit7 Komponente VIIB 16 c P02225 Chi 18 Komponente VIII 16 c P02227 Chi 19 Komponente X 16 c P02228 Ctenocephalides felis felis Katzenfloh Ctefl Ctef2 Mlb 27 c AF231352 Cte f 3 25 c Thaumetopoea pityocampa Pinienprozessionsspinner („pine processionary moth' 0 Thap 1 15 P PIR:A593i

Lepisma saccharina Silberfischchen I nachgereicht ·· ····

Lep s 1 Tropomyosin 36 - 18 -C AJ309202 Dolichovespula maculata Langkopfwespe („white face homet“) Dol m 1 Phospholipase Al 35 C 100 Dol m 2 Hyaluronidase 44 c 101 Dol m 5 Antigen S 23 c 102, 103 Dolichovespula arenaria Gelbwespe („yellow homet“) DolaS Antigen 5 23 c 104 Polistes annularies Wespe („wasp“) Pol a 1 Phospholipase Al 35 P 105 Pol a 2 Hyaluronidase 44 P 105 Pol a 5 Antigen 5 23 c 104 Polistes dominulus Mittelmeer-Papierwespe („Mediterranean paper wasp“) Pol dl Pol d 4 Serin-Protease 32-34 c Hoffman p.i Hoffman p.< Pol d 5 Polistes exclamans Wespe („wasp“) Pol e 1 Phospholipase Al 34 P P81656 107 Pol e 5 Antigen 5 23 c 104 Polistes fuscatus Wespe („wasp“) Pol f 5 Antigen 5 23 c 106 Polistes gallicus Wespe („wasp“) Pol g 5 Antigen 5 24 c P83377 Polistes metricus Wespe („wasp“) Polm5 Antigen 5 23 c 106 Vespa crabo Europäische Hornisse („European homet“) Vesp c 1 Phospholipase 34 P 107 Vesp c 5 Antigen 5 23 c 106 Vespa mandarina Asiatische Riesenhomisse („giant asian homet“) Vespm 1 Vesp m 5 Vespula flavopilosa Wespe („yellowjacket“ )Ves f 5 Antigen 5 23 c Hoffman p. P81657 106 Γ nachgereicht - 19 - 19 ·· ·· • ·· ·· ··· ·· · · · • ·* ··· * • · · · #

• · · · I I ··· ·· ·· ··

Wespe („yellowjacket“) Ves g 5 Antigen 5 Vespula maculifirons Wespe („yellowjacket“) 23 C 106 Ves m 1 Phospholipase Al 33.5 C 108 Ves m 2 Hyaluronidase 44 P 109 Ves m 5 Antigen 5 23 C 104 Vespula pennsylvanica Wespe („yellowjacket“) Vesp5 Antigen 5 23 C 106 Vespula squamosa Wespe („yellowjacket“) Vess5 Antigen 5 23 C 106 Vespula vidua Wespe („wasp“) Ves vi 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula vulgaris Wespe („yellowjacket“) Ves v 1 Phospholipase Al 35 C 105A Vesv2 Hyaluronidase 44 P 105A Vesv5 Antigen 5 23 C 104 Myrmecia pilosula Australische ,jumper ant“ Myrp 1 C X70256 Myrp2 C S81785 Solenopsis geminata tropische Feuerameise („tropical fire ant“) Solg2 Hoffman p.c. Solg4 Hoffman p.c. Solenopsis invicta Feuerameise („fire ant“) Soli 2 13 C 110, 111 Soli 3 24 C 110 Soli 4 13 C 110 Solenopsis saevissima Brasilianische Feuerameise („Brazilian fire ant“) Sols 2 Hoffman p.c. Triatoma protracta Raubwanze („California kissing bug“) Tria p 1 Procalin 20 C AF179004,111A.

- 20 - • · ·· ·· ···· H. Nahrungsmittel Gadus callarias Dorsch („cod“)

Gad c 1 Allergen M 12 C 112, 113 Salmo salar Atlantischer Lachs Sal s 1 Parvalbumin 12 C X97824 Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“) Bosd4 alpha-Lactalbumin 14.2 C Ml 8780 (Milch) BosdS beta-Lactoglobulin vgl. auch Tiere 18.3 C X14712 Bosd6 Serum-Albumin 67 C M73993 Bosd7 Immunglobulin 160 77 Bosd8 Caseine 20-30 77 Gallus domesticus Huhn Gal d 1 Ovomucoid 28 C 114, 115 Gald2 Ovalbumin 44 C 114,115 Gald3 Ag22, Conalbumin 78 C 114,115 Gald4 Lysozym 14 C 114, 115 Gal d 5 Serum-Albumin 69 C X60688 Metapenaeus ensis Garnele Met e 1 Tropomyosin Penaeus aztecus C U08008 Garnele Pen a 1 Tropomyosin Penaeus indicus 36 P 116 Garnele Pen i 1 Tropomyosin 34 C 116A Penaeus monodon Black Tiger-Garnele Pen m 1 Tropomyosin 38 C Pen m 2 Arginin-Kinase 40 C AF479772,117 Todarodes pacificus Kalmar („squid“) Tod p 1 Tropomyosin Helix aspersa 38 P 117A Braune Gartenschnecke („brown garden snail“) Hel as 1 Tropomyosin 36 C Y14855,117B Haliotis midae Seeohr („abalone“) Halm 1 49 117C Rana esculenta essbarer Frosch Ran e 1 Parvalbumin-alpha 11.9* C AJ315959 j. nachgereicht ·· ····

Rane2 Parvalbumin-beta 11.7* - 21 -C AJ414730 Brassica juncea Sareptasenf („oriental mustard“) Bra j 1 2S Albumin 14 c 118 Brassica napus Rapssamen („rapeseed“) Bra η 1 2S Albumin 15 P 118A, P80208 Brassica rapa Rübe („tumip“) Bra r 2 hom: Prohevein 25 P81729 Hordeum vulgare Gerste Hot v 15 BMAI-1 15 c 119 Hör v 16 alpha-Amylase Hör v 17 beta-Amylase Hör v 21 gamma-3 Hordein 34 c 119A, SW:P80198 Secale cereale Roggen Sec c 20 Secalin Triticum aestivum Weizen Tri a 18 Agglutinin Tri a 19 omega-5-Gliadin 65 P vgl. Isoall.-Liste PIR:A59156 Zea mays Mais, („maize, com“) Zea m 14 Lipid-Transfer-Prot. 9 P P19656 Oiyza sativa Reis Ory s 1 c 119B, U31771 Apium graveolens Sellerie Api g 1 hom: Bet v 1 16* c Z48967 Apig4 Profilin Api g 5 55/58 P AF129423 P81943 Daucus carota Karotte Dau c 1 hom: Bet v 1 16 c 117D, vgl. Isoallergen-Liste Dauc4 Profilin c AF456482 Coiylus avellana Haselnuss Cor a 1.04 hom: Bet v 1 17 c vgl. Liste der Isoallergene Cora2 Profilin 14 c AF327622 Cora8 Lipid-Transfer-Protein 9 c AF329829 Malus domestica Apfel Mal d 1 hom: Bet v 1 c vgl. Liste der Isoalleigene Mal d 2 hom: Thaumatin c AJ243427 [ nachgereicht

Mal d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 Maid4 Profilin 14.4* Pyrus communis Birne Pyrcl hom:Betvl 18 Pyr c 4 Profilin 14 Pyr c 5 hom: Isoflavon-Reduktase 33.5 Persea americana Avocado Pers a 1 Endochitinase 32 Prunus armeniaca Aprikose Pru ar 1 hom: Bet v 1 Pruar 3 Lipid-Transfer-Protein 9 Prunus avium ·· · - 22 - • · ·· • · · • · · • · · ·· ··· C C Pastorello p.c. vgl. Liste der Isoallergene C AF05730 C AF129424 c AF071477 c Z78202 c U93165 P ·* • · · ·· Mf • · · · • · · t I ·· tt ·· •· ···· ·· Süßkirsche Pru av 1 hom: Bet v 1 C U66076 Pru av 2 hom: Thaumatin C U32440 Pru av 3 Lipid-Transfer-Protein 10 C AF221501 Pru av 4 Profilin Prunus domestica Europäische Pflaume („European plinn“) 15 C AF129425 Pru d 3 Lipid-Transfer-Protein Prunus persica 9 P 119C Pfirsich Prup3 Lipid-Transfer-Protein 10 P P81402 Prup4 Profilin Asparagus officinalis Spargel 14 C vgl. Isoallergen-Liste Aspa ο 1 Lipid-Transfer-Protein Crocus sativus 9 P 119D Safian („saffron crocus“) Cro s 1 Lactuca sativa 21 Varasteh A-R p.c. Salat Lac s 1 Lipid-Transfer-Protein Vitis vinifera 9 Vieths p.c. Traube Vit v 1 Lipid-Transfer-Protein Musa x paradisiaca 9 P P80274 Banane Mus xp 1 Profilin Ananas comosus Ananas („pineapple“) 15 C AF377948 Ana c 1 Profilin 15 C AF377949 Anac2 Bromelain Citrus limon 22.8* C 119E-G, D14059 Zitrone Cit 13 Lipid-Transfer-Protein Citrus sinensis 9 P Torrejon p.c. Orange („sweet orange“) | nachgereicht ·· ····

Cit s 1 Germin-artiges Protein 23 - 23 -P ·· ··· Torrejon p.c. Cit s 2 Profilm 14 P Torrejonp.c. Cit s 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Torrejon p.c. Litchi chinensis Litchi Lit c 1 Profilm 15 c AY049013 Sinapis alba gelber Senf („yellow mustard“) Sin a 1 2S albumin 14 c 120 Glycine max Sojabohne Glyml HPS 7 P 120A Glym2 8 P A57106 Gly m 3 Profilin 14 c vgl. Liste der Isoallergene Glym4 (SAM22) PR-10 Prot. 17 c X60043, 120B Vigna radiata Mungbohne Vig r 1 PR-10 Protein 15 c AY792956 Arachis hypogaea Erdnuss Ara h 1 Vicilin 63.5 c L34402 Arah2 Conglutin 17 c L77197 Arah 3 Glycinin 60 c AF093541 Arah4 Glycinin 37 c AF086821 Arah5 Profilin 15 c AF059616 Ara h 6 hom: Conglutin 15 c AF092846 Ara h 7 hom: Conglutin 15 c AF091737 Arah 8 PR-10 Protein 17 c AY328088 Lens culinaris Linse Len c 1 Vicilin 47 c vgl. Liste der Isoallergene Len c 2 Samen biotinyliert. Prot. 66 P 120C Pisum savitum Erbse Pis s 1 Vicilin 44 c vgl. Liste der Isoallergene Pis s 2 Convicilin 63 c anhängig Actinidia chinensis Kiwi Act c 1 Cystein-Protease 30 P P00785 Actc2 Thaumatin-art. Protein 24 P SW:P81370,121 Capsicum annuum Paprika („bell pepper“) Cap a lw Osmotin-artiges Protein 23 c AJ297410 Capa2 Profilin 14 c AJ417552 Lycopersicon esculentum Tomate Lyc e 1 Profilin 14 c AJ417553 Lyce2 b-Fructofuranosidase 50 c vgl. Isoallergen-Liste

·*· ·· ·*·· • · • » ·· ··· · • · • · · • · • « · · ·· ·· M - 24 - • · ·· • · · • · ♦ • · · ·« ·♦·

Lyce3 Lipid-Transfer-Prot. Solanum tuberosum Kartoffel 6 C U81996 Sola 11 Patatin 43 P P15476 Sola 12 Cathepsin-D-Inhibitor 21 P P16348 Sola 13 Cystein-Protease-Inhibitor 21 P P20347 Sola 14 Aparagin-Protease-Inhibitor 16+4 Bertholletia excelsa Paranuss („Brazil nut“) P P30941 Ber e 1 2S Albumin Bere2 11S Globulin 9 C P04403, M17146 Samen-Speicherprotein Juglans nigra Schwarznuss („black walnut“) 29 C AY221641 Jug η 1 2S Albumin 19* C AY102930 Jug n 2 Vicilin-art. Prot. Juglans regia Echte Walnuss („English walnut“) 56* C AY102931 Jug r 1 2S Albumin C U66866 Jug r 2 Vicilin 44 C AF066055 Jug r 3 Lipid-Transfer-Protein Anacardium occidentale Cashew-Nuss 9 P Pastorello Ana ο 1 Vicilin-artiges Protein 50 C vgl. Isoallergen-Liste Ana o 2 Legumin-artiges Protein 55 C AF453947 Ana o 3 2S Albumin Ricinus communis Rizinussamen („Castor bean“) 14 C AY081853 Ric c 1 2S albumin Sesamum indicum C P01089 Sesam Ses i 1 2S Albumin 9 C 121A, AF240005 Ses i 2 2S Albumin 7 C AF091841 Ses i 3 7S Vicilin-art. Globulin 45 C AF240006 Ses i 4 Oleosin 17 C AAG23840 Ses i 3 Oleosin Cucumis melo Kantaloupmelone („muskmelon“) 15 c AAD42942 Cuc m 1 Serin-Protease 66 c D32206 Cuc m 2 Profilin 14 c AY271295

Cuc m 3 Pathogenese-verw. P. PR-1 16* P P83834 I. Andere I nachgereicht - 25 - ·· ·+· Anisakis simplex Nematode Anis 1 24 P 121B, A59069 Anis2 Paramyosin 97 C AF173004 Anis3 Tropomyosin 41 c 121C, Y19221 Anis4 9 P P83885 Argas reflexus Taubenzecke („pigeon tick“) Argr 1 17 c AJ697694 Ascaris suum Wurm Asc s 1 10 P 122 Carica papaya Papaya Carp3w Papain 23.4* c 122A, Ml 5203 Dendronephthya nipponica Weichkoralle („soft coral“) Denn 1 53 P 122B Hevea brasiliensis Gummi (Latex) Hev b 1 Elongations-Faktor 58 P 123,124 Hev b 2 1,3-Glucanase 34/36 c 125 Hevb3 24 P 126,127 Hevb4 Komponente von Microhelix-Komplex 100- 115 P 128 Hevb 5 16 c U42640 Hev b 6.01 Hevein-Präkursor 20 c M36986, p02877 Hev b 6.02 Hevein 5 c M36986,p02877 Hev b 6.03 C-terminales Fragment 14 c M36986, p02877 Hev b 7.01 hom: Patatin aus B-Serum 42 c U80598 Hev b 7.02 hom: Patatin aus C-Serum 44 c AJ223038 Hev b 8 Profilin 14 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 9 Enolase 51 c AJ132580 Hev b 10 Mn-Superoxid-Dismut. 26 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 11 Klasse 1-Chitinase c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 12 Lipid-Transfer-Protein 9.3 c AY057860 Hev b 13 Esterase 42 P P83269 Homo sapiens Human-Autoallergene Horns 1 73* c Y14314 Horns 2 10.3* c X80909 Horns 3 20.1* c X89985 Horns 4 36* c Y17711 Horns 5 42.6* c P02538

NACHGEREICHT 26

Triplochiton scleroxylon Abachi („obeche“)

Kespohl p.c.

Trip s 1 Klasse 1-Chitinase 38.5 P *MW=Molekulargewicht

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NACHGEREICHT 42

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φφ φφφ · ·♦ φφ φφ#φ • ·· φ

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Mit vorliegendem Spleißen/Kopf-an-Schwanz-Modifizieren kann eine signifikante Verringerung der allergenen Aktivität erhalten werden. Je nach dem Verfahren kann diese Aktivität aus demWild-typ-Protein-Allergen großteils ausgelöscht werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der Inhibition der IgE-Bindungskapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen gemessen. Ein bevorzugtes Verfahren ist im Beispiel-Abschnitt unten gezeigt.

Bei einem alternativen, aber ebenfalls bevorzugten Weg zur Definition der Verringerung der allergenen Aktivität verwendet man die Messung der IgE-Bindung. Das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern von mit Allergen sensibilisierten Patienten-Seren an einen „dot blot" des Derivats wird als Beweis für eine sehr wesentliche Verringerung angesehen. Auch dieses Verfahren ist unten im Beispiel-Abschnitt gezeigt.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Derivate können leicht mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten kombiniert und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.

Vorzugsweise werden die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans kombiniert und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung mit weiteren Allergenen zu

NACHGE einem Kombinations-Vakzin kombiniert. Solche Allergene sind vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon. Solche Mischungen können speziell für die Bedürfnisse (Allergen-Profil) eines bestimmten Patienten hergestellt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches pharmazeutisches Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Allergen-Derivat eines Wildtyp-Protein-Allergens vorgesehen, wobei das Wildtyp-Protein-Ällergen eine Aminosäure-Sequenz von 1 bis Z aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nebeneinander - in N-Terminus zu C-Terminus-Orientierung - die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente X bis Z und 1 bis X enthält, wobei die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt.

Vorzugsweise ist das Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X mindestens 30 Aminosäure-Reste lang, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäure-Reste lang, insbesondere mindestens 60 Aminosäure-Reste lang sind.

Es ist sogar noch mehr bevorzugt, wenn X bis Z und 1 bis X sich längenmäßig um 50% oder weniger, vorzugsweise um 30% oder weniger, insbesondere um 20% oder weniger, voneinander unterscheiden.

Besonders bevorzugte Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt aus Typ I-Allergen, vorzugsweise aus einem Allergen der Tabelle A, mehr bevorzugt von Wiesenlieschgras(Phleum pratense)-Pollen, insbesondere Phi p 12,

Birken(Betula verrucosa)-Pollen, insbesondere Bet v 2 und Bet v 4, Gift der gemeinen Wespe (Vespula vulgaris), Gift der Papierwespe („paper wasp", Polistes annularis), Parietaria ju-daica-Pollen, Weidelgras-Pollen usw..

Vorzugsweise sind die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung als Allergen-Zusammensetzung vorgesehen, wobei nicht nur ein Allergen vorhanden ist, sondern zwei oder mehr. Die vorliegenden Derivate können auch mit Allergen-Extrakten gemischt sein, die durch die Derivate der vorliegenden Erfindung ergänzt sind, um das Fehlen genügender Mengen spezifischer Allergene in den natürlichen Extrakten zu substituieren. Mischungen von Al--^—-

I NACHGEREICHT 45 45 • · ··

• · ♦♦ ·♦·· lergenen sind besonders bei Patienten notwendig, die allergene Reaktionen auf nicht nur ein Allergen aufweisen. Es ist daher bevorzugt, die vorliegenden Derivate in Kombination mit weiteren (anderen) Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin vorzusehen.

Die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können daher vorzugsweise mit Wildtyp-Allergen zu einer Allergen-Zusammensetzung kombiniert sein, insbesondere einer Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon (jeweils vom gleichen und/oder einem anderen Allergen und/oder Isoformen oder Mutanten davon; solange eine Gesamt-Reduktion der allergenen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Protein oder rekombinanten Allergen im Präparat als Ganzes gegeben ist).

Vorzugsweise enthält das vorliegende Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.

Das Allergen oder die Allergen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments .

Vorzugsweise enthält das Medikament weiters andere geeignete Ingredienzien, wie Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, usw..

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg, des rekombinanten Allergen-Derivats pro Applikationsdosis. Bevorzugte Wege der Verabreichung umfassen alle Standard-Verabreichungssysteme, die zur Impfung im Allgemeinen und für die Allergie-Immunthera-pie im Besonderen beschrieben und vorgeschlagen wurden (oral, transdermal, intravenös, intranasal, über die Schleimhaut usw.). Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Behandlung und Prävention von Allergie durch Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Allergen-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung, welches durch die folgenden kennzeichnet ist:

Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung codiert,

Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.

Vorzugsweise ist der Wirt ein Wirt mit einer großen Expressionskapazität .

Natürlich können die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit irgendeinem anderen geeigneten Verfahren, insbesondere mittels chemischer Synthese oder halbchemischer Synthese, hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung ist weiters durch die folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren beschrieben, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der primären Struktur von MP12 (einem umstrukturierten („reshuffled")

Phi p 12-Allergen gemäß der vorliegenden Erfindung) im Vergleich zu Phi p 12-Wildtyp;

Fig. 2 zeigt CD-Spektren von Phi p 12-Wildtyp und MP12. Die mittlere Rest-Elliptizität [Θ] (y-Achse) von Phi p 12 und dem Derivat MP12 ist für einen Bereich von Wellenlängen gezeigt (x-Achse);

Fig. 3 zeigt die Coomassie-Färbung von 14% SDS PAGE, beladen mit Fraktionen von rekombinantem MP12, das einer Polyprolin-Säule ausgesetzt war. Bahn M stellt den Molekulargewichtsmarker dar, Bahn 1 stellt die Durchfluss-Fraktion dar, die Bahnen 2-4 Wasch-Fraktionen, die Bahnen 5-6 Elutions-Fraktionen. Molekulargewichte (kDa) sind am linken Rand angegeben;

Fig. 4 zeigt die IgE-Reaktivität von Nitrozellulose-aufge-punktetem („dotted") Phi p 12 und MP12. Die aufgepunkteten Proteine sowie humanes Serumalbumin (HSA) für Zwecke der Negativkontrolle wurden Seren von 24 gegen Phi p 12 allergischen Patienten ausgesetzt (Bahnen 1-24). Bahn N stellt Serum von einem nicht-allergischen Kontroll-Probanden dar. Gebundene IgE-Anti-körper wurden mit anti-humanen IgE-Antikörpern detektiert;

Fig. 5 zeigt die Induktion einer Basophilen-Histamin-Frei-setzung bei zwei Phi p 12-allergischen Patienten. Die Granulocy-ten der Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen (x-Achse) von Phi p 12 (Quadrate) und MP12 {κυρίβρϊ inkubiert. Der nachgereicht

Prozentsatz des gesamten Histamins, das in den Überstand freigesetzt wurde, ist auf der y-Achse gezeigt;

Fig. 6 zeigt die Reaktivität von Kaninchen-Antiseren mit Profilinen aus Wiesenlieschgras-, Birken- und Beifuß-Pollen. Kaninchen-Antiseren, die gegen Phi p 12 (Karos) und M12 (Quadrate) gezogen worden waren, wurden auf ihre Reaktivität gegen Phi p 12- (A) , Bet v 2- (B) und Beifuß-Profilin (C) mittels ELISA getestet. Die Verdünnungen der Seren sind auf der x-Achse gezeigt, die entsprechenden OD-Werte auf der y-Achse. Die entsprechenden Präimmun-Seren zeigten keine Reaktivität;

Fig. 7 zeigt die Inhibition von rPhl p 12-induzierter Baso-philen-Degranulation durch mit anti-rPhl p 12 (P12) und anti-MP12 induziertes IgG. Ratten-Basophile waren mit Phi p 12-spezi-fischem Maus-IgE beladen worden;

Fig. 8 zeigt eine schematische Darstellung der primären Struktur und Erzeugung von Der p 2-Hybride (ein umstrukturiertes Der p 2-Allergen gemäß der vorliegenden Erfindung) im Vergleich mit Der p 2-Wildtyp;

Fig. 9 zeigt, dass rDer p 2-Hybriden eine reduzierte IgE-Bindungskapazität im Vergleich zu rDer p 2-Wildtyp in einem Dot-Blot-Test haben.

BEISPIELE

In den Beispielen 1 bis 5 sind die Prinzipien der vorliegenden Erfindung durch ein Profilin-Allergen, das Wiesen-lieschgras-Pollen-Profilin Phi p 12, beispielhaft gezeigt. Die Beispiele 6 bis 8 beziehen sich auf das Haupt-Milben(Dermato-phagoides pteronyssinus)-Allergen, Der p 2.

Beispiel 1: Charakterisierung eines hypoallergenen Derivats aus Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin a) Erzeugung, Expression und Reinigung einer hypoallergenen Variante aus Wiesenlieschgras-Pollen-Prof ilin, Phi p 12

Die Überlappungs-PCR-Technik wurde zur Herstellung eines umstrukturierten Phi p 12-Derivats verwendet. Die PCR-Matrize war die cDNA- die für das Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin,

Phi p 12, codiert, subkloniert in petl7b-Expressionsvektor. Die folgenden Primer wurden verwendet, um zwei PCR-Fragmente zu erzeugen, die überlappende Sequenzen sowie die Ndel- und EcoRI-Restriktions-Stellen und eine für einen C-terminalen 6x Histidin-Rest für Protein-Reinigung enthielten. Für das Fragment 1 wurden der Primer MDE-1: 51CATATGAGGCCCGGCGCGGTCJffOO1 und dor-

NACHGEREICHT • ·· ·· · i • ♦· ♦ · « ··· ·· ·· ···· • · • · • ♦ * · · I ·· ·« • · ·♦ - 48 -

Primer MDE-2: 5'GTACGTCTGCCACGCCATCÄTGCCTTGTTCAAC3· verwendet, für das Fragment 2 wurden der Primer MABC-1: 5'GTTGAACAAGGCAT-GATGTCGTG-GCAGACG3' und der Primer MABC-2: 5'GAATTCTTAATGGT-GATGGTGATGGTGACCCT-GGATGACCATGTA3' verwendet. Im nächsten Schritt wurden beide wie beschrieben erhaltenen PCR-Produkte als Matrizen für die Überlappungs-PCR-Reaktion verwendet, wobei Primer MDE-1 und MABC-2 verwendet wurde, um die DNA zu erzeugen, die für das Phi p 12-Derivat (d.h., MP12) codierte (schematisch in Fig. 1 dargestellt). Die für MP-12 codierende DNA wurde in pBluescript-Vektor-System (Stratagene) kloniert, und die DNA-Se-quenz wurde mittels Doppelstrang-Sequenzierung (MWG Biotech, Deutschland) bestätigt.

Zur Protein-Reinigung musste MP12-codierende cDNA in ein petl7b-Expressions-Vektor-System unter Verwendung von Ndel- und EcoRI-Restriktionsenzymen subkloniert werden, und die DNA-Se-quenz wurde wiederum mittels Doppelstrang-Sequenzierung (MWG Biotech) bestätigt.

Zur Protein-Reinigung wurde MP-12 in Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene, East Kew, Australien) in Flüssigkultur exprimiert. E.coli wurde zu einer OD600 von 0,4 in LB-Medium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt, gezüchtet. Die Expression rekombi-nanter Proteine wurde durch Zugeben von Isopropyl-b-thiogalacto-pyranosid bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert und weiteres Züchten für zusätzliche 4 Stunden bei 37°C. E.coli-Zellen aus einer 500 ml-Kultur wurden durch Zentrifugieren geerntet, in Puffer A (lOOmM NaH2P04, lOmM Tris, 8M Harnstoff, pH 7,5) resuspendiert. Nach dem Zentrifugieren bei 20.000 U/min, 30 min, wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule (Quiagen, Hilden, Deutschland) transferiert, und die Elution des 6x His-tagged MP12-Proteins wurde unter Verwendung von Puffer A mit abnehmenden pH-Werten durchgeführt. Das Protein eluierte bei einem pH-Wert von 4,9 und wurde danach durch stufenweise Dialyse gegen Puffer A, pH 7,5, enthaltend 6-0 M Harnstoff, wieder gefaltet. Der endgültige Dialyse-Schritt erfolgte gegen mit Phosphat ge^ pufferte Kochsalzlösung (PBS) , wo MP12 löslich war, wie durch Zentrifugier-Experimente gezeigt. nachgereicht

Die Protein-Reinheit wurde mittels SDS-PAGE bestätigt, und die Quantifizierung wurde unter Verwendung eines Micro BCA-Kit (Pierce, Rockford, IL) durchgeführt, b) Sekundär-Struktur-Analyse 49 • e • e · • · • · • · e · · ··· it« ··

Zirkular-Dichroismus(CD)-Messungen erfolgten auf einem Jasco J-715-Spektropolarimeter unter Verwendung einer Zelle mit einer Weglänge von 0,1 cm, äquilibriert bei 20°C. Die Spektren wurden mit 0,5 nm Auflösung bei einer Scan-Geschwindigkeit von 100 nm/min aufgezeichnet und ergaben sich aus dem Durchschnitt von 3 Scans. Die endgültigen Spektren wurden durch Subtrahieren der korrespondierenden MilliQ-Spektren, die unter identischen Bedingungen erhalten wurden, Basislinien-korrigiert. Die Ergebnisse wurden mit dem Sekundär-Struktur-Bewertungs-Programm J-700 angepasst.

Die Ergebnisse weisen auf eine beträchtliche Menge an Sekundärstruktur des Derivats hin. Das Spektrum von Phi p 12 ist mit einem Minimum bei 218nm und einem starken Maximum unter 200nm gekennzeichnet, wogegen das Minimum des Derivats zu einer kleineren Wellenlänge verschoben ist und die Null-Überquerung der Kurve unter 200nm ist (Fig. 2). Diese Ergebnisse weisen auf einen steigenden Anteil einer beliebig-gewundenen Sekundärstruktur innerhalb des Derivats hin. c) Dem hypoallergenen Derivat Phi p 12 fehlt die Affinität für Polyprolin

Die Affinität zu Polyprolin ist ein Merkmal, das Profilinen aus verschiedenen Organismen gemeinsam ist. Es wurde gezeigt, dass das hypoallergene Phi p 12-Derivat, MP12, Polyprolin nicht bindet und somit veränderte biochemische Eigenschaften aufweist.

Etwa 5 pg gereinigtes rekombinantes MP12 in PBS wurde einer mit Polyprolin beladenen, CnBr-aktivierten Agarose-Säule (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden), die mit PBS äquilibriert war, unterzogen. Nach dem Sammeln des Durchflusses wurde die Säule mit 3 Volumina (PBS) gewaschen, und die Elution wurde mit 5x 1 ml PBS, die 2 bzw. 6M Harnstoff enthielt, durchgeführt. Zehn μΐ Aliquots des Durchflusses, die Waschfraktionen und Elutionsfraktionen wurden einer 14% Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) unterzogen, und die Proteine wurden mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (Fig. 3). Die Ergebnisse weisen auf einen Verlust der Polyprolin-Bindungs-stelle infolge der Reorganisation der primären Struktur von Phi p 12 hin.

Beispiel 2: Verringerung der IgE-Bindungskapazität von MP 12 a) MP12 zeigt eine stark verringerte IgE-Bindungskapazität

Die IgE-Bindungskapazität von rekombinantem MP12 wurde mit

INACHGEREICKT

J jener von rekombinantem Phi p 12-Wildtyp mittels Dot-Blot-Analy-se unter Verwendung von Seren von 24 mit Profilin sensibilisierten Patienten verglichen (Fig. 4). Phi p 12 und MP12 sowie humanes Serumalbumin (HSA) für Kontrollzwecke wurden auf Nitrozellulose punktweise aufgetragen und mit Seren von 24 mit Profilin sensibilisierten Patienten untersucht. Gebundene IgE-Antikörper wurden unter Verwendung von mit 125I markierten anti-Human-IgE-Antikörpern nachgewiesen. Alle Patienten wiesen eine IgE-Reaktivität mit Phi p 12-wildtyp auf, wogegen keiner der 24 Patienten mit MP12 oder mit dem Kontroll-Protein HSA reagierte (Fig. 4).

Um die Verringerung der IgE-Bindungskapazität von MP12 zu quantifizieren, wurden Flüssigphasen-Inhibitionen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde Serum von sechs mit Profilin sensibilisierten Patienten mit je 10 pg von Phi p 12 und MP12 vorinkubiert und danach mit ELISA-Platten-gebundenem Phi p 12 (5 pg/ml) inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem mit alkalischer Phosphatase markiertem anti-Human-IgE-Antikörper (Pharmingen) detektiert. Die Inhibition der IgE-Bindung wurde mit der folgenden Formel berechnet: Inhibition%= ΙΟΟχ[(A-B)/A]; wobei A OD-Werte darstellt, die nach der Inkubation von Serum mit BSA erhalten wurden, B OD-Werte nach Inkubation von Serum mit Phi p 12 bzw. MP12 darstellt.

Die Fähigkeit von MP12, die Bindung von IgE an Phi p 12 zu inhibieren, ist als Prozentsatz Inhibition in Tabelle 2 gezeigt, welcher im Bereich von 20-40% liegt, mit einer mittleren Inhibition von 31,2% für MP12, wogegen die mit Phi p 12 erreichte Inhibition im Bereich von 76-91% lag (Mittel: 86%).

Tabelle 2: Inhibition der Antikörper-Bindung an immobilisiertes Phi 12 unter Verwendung von Phi p 12 und MP12. Die IgE-Antikörper-Bindung wurde durch Vorinkubation von Seren von 6 mit Profilin sensibilisierten Patienten mit Phi p 12 Wildtyp oder MP12 inhibiert. Die mittlere Inhibition der Antikörperbindung wurde berechnet und ist dargestellt. | nachgereicht - 51

* »· V ·· ···»

Μ f·· tl

Protein name Aminosäuresequenz Anzahl der Aminosäuren berechneter Pi MW (kDa) strukturelle Integrität Phi p 12 MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQS ADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYM VIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALWGIYDEPM TPGQCNMVVEPLGDYLVEQGM 131 4.92 14.1 + MP 12 MEPGAVIRGKKGAGGITiKKTGQALVGlYDEPMTPGQ CNMWERLGDYLVEQGMMSWQTYVDEHLMCEIEGH 137 5.68 15 + HLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEIT GIMKDFD EPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGHHHHHH b) MP 12 weist eine verringerte allergene Aktivität auf

Danach wurde umstrukturiertes Phi p 12 mit Phi p 12-Wildtyp im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Histamin-Freisetzung aus Basophilen von auf Profilin allergischen Patienten zu induzieren, verglichen.

Granulozyten wurden aus heparinisierten Blutproben von gegen Wiesenlieschgras-Pollen allergischen Patienten mittels Dextran-Sedimentation isoliert. Nach der Isolierung wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Phi p 12, MP12 oder - für Kontrollzwecke - mit einem monoklonalen anti-Human-IgE-Antikör-per (Immunotech, Marseille, Frankreich) inkubiert. Die Histamin-Freisetzung in den Überstand wurde mittels Radioimmunoassay (Immunotech) gemessen. Das Gesamt-Histamin wurde nach Gefrieren/

Auftauen von Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte von Duplikat-Bestimmungen ausgedrückt und stellen den Prozentsatz des gesamten Histamins dar.

Wie in Fig. 5 beispielhaft angegeben, induzierte Phi p 12 stark und Dosis-abhängig die Histamin-Freisetzung in Basophilen von beiden Patienten, wobei sich eine maximale Histamin-Freisetzung bei Konzentrationen zwischen 10“5 - IO-4 pg/ml ergab, wogegen keine Histamin-Freisetzung bei MP12 bei Konzentrationen bis zu 10~2 pg/ml beobachtet wurde, was eine mehr als 1000-fache Verringerung der allergenen Aktivität anzeigt. Außerdem war die maximale Histamin-Freisetzung aus Basophilen nach der Zugabe von MP12 beträchtlich niedriger als jene, die mit Phi p 12-Wildtyp erreicht wurde.

Beispiel 3: Immunisierung mit MP12 Induziert IgG-Antikörper, die Phi p 12-Wildtyp sowie Profiline von anderen Pollen erkennen

Um zu testen, ob die Immunisierung mit umstrukturiertem Phi p 12 IgG-Antikörper induziert, die mit Phi p 12-Wildtyp und >> mit Profilinen aus anderen Pollen reagieren, wurden Kaninchen NACHGEREICHf 52

> ♦· ·· · • ·· • ·

dreimal mit Phi p 12 oder MP12 unter Verwendung von Freundschen kompletten und unvollständigen Adjuvantien (200 pg/Injektion) (Charles River, Kisslegg, Deutschland) immunisiert. Serum-Proben wurden in vierwöchigen Intervallen erhalten. Die Seren wurden bei -20°C bis zur Analyse gelagert.

Die Reaktivität von mit MP12 und Phi p 12 induzierten IgG-Antikörpern wurde mittels ELISA untersucht (Fig. 6). Phi p 12 sowie Profiline aus Birke (Bet v 2) und Beifuß wurden auf ELISA-Platten beschichtet (5 pg/ml) und mit seriellen Verdünnungen von Kaninchen-Antiseren (1:2000-1:64000) inkubiert. Gebundene Kaninchen-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünntem, Peroxidasemarkiertem Esel-anti-Kaninchen-Antiserum (Amersham Pharmacia Biotech) detektiert. MP12 induzierte eine IgG anti-Phl p 12-Antikörper-Antwort, die mit jener, die mit Phi p 12-Wildtyp induziert war, vergleichbar war (Fig. 6A). Außerdem führten sowohl mit Phi p 12-als auch mit MP12-induzierte IgG-Antikörper zu einer Kreuzreaktion mit Profilinen aus Birke und Beifuß (Fig. 6B, C).

Beispiel 4: Anti-MP 12-Antikörper inhibieren die Bindung von Serum-IgE von gegen Gras-Pollen allergischen Patienten an vollständigen Phi p 12

Die Fähigkeit von mit MP 12 induziertem Kaninchen-IgG, die Bindung des IgE allergischer Patienten an Phi p 12 zu inhibieren, wurde mittels ELISA-Konkurrenz-Test untersucht. ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Rosklide, Dänemark) wurden mit Phi p 12 (1 pg/ml) beschichtet und entweder mit einer 1:250 Verdünnung von jeweils dem anti-MP12-Antiserum oder dem Phi p 12-Antiserum vorinkubiert und - für Kontrollzwecke - mit dem korrespondierenden Präimmun-Seren. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von sieben mit Phi p 12 sensibilisierten, gegen Gras-Pollen allergischen Patienten inkubiert, und die gebundenen IgE-Antikörper wurden mit einem monoklonalen Ratten-anti-Human-IgE-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA) nachgewiesen, 1:1000 verdünnt, gefolgt von einem 1:2000 verdünnten HRP-gekoppelten Schaf-anti-Ratten-Ig-Antiserum (Amersham). Der Prozentsatz der Inhibition der IgE-Bindung, der durch Vorinkubation mit den Anti-Peptid- oder Anti-Mutanten-Antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: % Inhibition der IgE-Bindung = lOO-OD^ODpXlOO. ODi und ODP repräsentieren die Absorptionen nach Vorinkubation mit den Im-

NACHGEREICHT - 53 ·· • · ♦ • · • · · ·· ···

• ·· ·· ···· ·· · • • · • ·· ··· · • · • • · · • · # • · · · ··· ·· ·· M munseren der Kaninchen bzw. den korrespondierenden Präimmunseren.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, lag die Inhibition der Patienten-IgE-Bindung an Phi p 12, die mit anti-Phl p 12-Antikörpern erreicht wurde, zwischen 30,2-66,7% (49,8% mittlere Inhibition). Ebenso wurde eine beträchtliche Verringerung der anti-Phl p 12-IgE-Re-aktivität beobachtet, die im Bereich von 10,8-27,6% (20,8% mittlere Inhibition) bei Antikörpern, die gegen MP12 gezogen worden waren, lag (Tabelle 3).

Tabelle 3: Inhibition der IgE-Bindung allergischer Patienten an rPhl p 12 durch Kaninchen-Antikörper. Der Prozentsatz der Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 12, der durch Vorinkubation mit Kaninchen-Antiseren (Kaninchen-anti-Phl p 12, anti-MP12) bei sieben gegen Phi p 12 allergischen Patienten erreicht wurde, und die errechnete mittlere Inhibition sind gezeigt.

Patient anti-Phl 1 66,7 2 53,8 3 46,0 4 43,2 5 45,7 6 30,2 7 63,0 Mittel 49,8

Anti-MPl2-Antiserum inhibiert

Beispiel 5: % Inhibition pl2 anti-MP12 27,6 18,8 16,2 18,9 27.0 10,8 26.1 20,8 die Basophilen-De- granulation

Die biologische Relevanz und mögliche Schutzwirkung der Peptid· induzierten IgG-Antikörper wurde in eines definierten Zell-Modell- System unter Verwendung von Ratten-Basophilen-Leukämie (RBL) -Zellen, die mit Allergen-spezifischem IgE beladen waren, untersucht. RBL-2H3-Zellen wurden in Gewebe-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (4xl04 Zellen/Vertiefung) ausplattiert, 24 h lang bei 37°C unter Verwendung von 7% C02 inkubiert. Die passive Sensibilisierung wurde 2 h lang mit Maus-Seren, die Profilin-re-aktives IgE in einer endgültigen Verdünnung von 1:30 enthielten, vorgenommen. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimaliges

NACHGEREICHT - 54 - ·· • · • · • · • · ♦ · ·· ·· ♦ · · ·· ··· • · · « • · · · ♦ · ·· ·· ♦ · ····

Waschen der Zellschicht in Tyrode-Puffer (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 0,5mM MgCl2, l,8mM CaCl2, 0,4mM NaH2P04, 5,6mM D-Glucose, 12mM NaHC03, lOmM HEPES und 0,1% Gew./Vol. BSA, pH 7,2) entfernt. RBL-Zellen, die mit Phi p 12-spezifischem Maus-IgE vorbeladen worden waren, wurden rPhl p 12 (0,005 pg/ml) ausgesetzt. Phi p 12 wurde in Tyrode-Puffer mit 0, 2, 5, 7,5 oder 10% V/V Kaninchen-Antiserum aus einem mit Phi p 12-immunisierten Kaninchen, einem mit MP12 immunisierten Kaninchen oder den entsprechenden Präimmun-Seren 2h lang bei 37°C vorinkubiert.

Vorinkubiertes Phi p 12 wurde zu den RBL-Zellen 30 min lang in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C zugesetzt, und ihre Überstände wurden auf ß-Hexosaminidase-Aktivität durch einstün-dige Inkubation mit 80 μΜ 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-ß-D-glu-cosamid (Sigma-Aldrich, Wien, Österreich) in Citrat-Puffer (0,1M, pH 4,5) bei 37°C analysiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μΐ Glycin-Puffer (0,2M Glycin, 0,2M NaCl, pH 10,7) gestoppt, und die Fluoreszenz wurde bei λβΧ: 360/λβ,η: 465 nm unter Verwendung einer Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesevorrichtung (Spectrafluor, Tecan, Österreich) gemessen. Die Ergebnisse sind als Fluoreszenz-Einheiten und Prozentsatz der gesamten ß-Hexosa-minidase, die nach Lyse der Zellen mit 1% Triton X-100 freigesetzt wurde, berichtet.

Wie in Fig. 7 beispielhaft angeführt, führte sowohl die Vorinkubation von Phi p 12 mit steigenden Konzentrationen (2-10% V/V) von Kaninchen-anti-MP12-Antikörpern als auch mit Kaninchen-anti-Phl p 12-Antikörpern zu einer Dosis-abhängigen Inhibition der rPhl p 12-induzierten Mediator-Freisetzung aus RBLs, die mit Phi p 12-spezifischen Maus-IgE vorbeladen worden waren. Es wurde keine Inhibition der Basophilen-Degranulation beobachtet, wenn das Allergen mit denselben Konzentrationen von Präimmun-Ig vorinkubiert worden war.

Beispiel 6: Charakterisierung eines hypoallergenen Derivats des Dermatophagoides pteronyssinus-Allergens Der p 2 (Der p 2-Hybride)

Zwei rekombinante Fragmente von Der p 2, umfassend die Aminosäuren (AS) 1-53 und AS 54-129, wurden mittels PCR-Amplifika-tion, wie in Beispiel 1 dargestellt, konstruiert (vgl. Fig. 8). Ein Der p 2-Hybride-Molekül wurde in umgekehrter Anordnung (AS 54-129 + 1-53) mittels auf PCR basierender Gene-SOEing (Linhart et al., FASEB J.16 (2002), 1301-1303) erzeugt.

NACHGEREterfF - 55 ·· • · • · • · • · ·· ♦ ·· ·· • · · ·· ··· • · · • · · ·· f· ···· ·' · • · · ··

Beispiel 7: Rekombinante Der p 2-Hybride (rDer p 2-Hybride) zeigt stark verringerte IgE-Bindungskapazität

Wie in Beispiel 2 angegeben, wurden gereinigtes rDer p 2 und seine Derivate auf Nitrozellulose punktförmig aufgetragen und mit Humanseren inkubiert (Bahn 1-18: gegen Milben allergische Patienten; Bahn 19: nicht-allergische Person; Bahn 20: Puffer-Kontrolle) . Gebundenes IgE wurde mit mit 1251 markierten anti-Human-IgE-Antikörpern detektiert und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt. Die Der p 2-Hybride zeigt eine signifikant verringerte IgE-Bindungskapazität .

Beispiel 8: Anti-Der p 2-Hybride-Antikörper inhibieren die Bindung von Serum-IgE von gegen Milben allergischen Patienten an komplettes Der p 2

Gemäß der allgemeinen Vorgangsweise von Beispiel 4 wurden Mikrotiter-Platten mit rDer p2 beschichtet, vorinkubiert mit Maus-Antiseren, die mit rDer p 2, rDer p 2-Derivaten oder mit einem Präimmun-Serum als Kontrolle induziert worden waren, und mit Seren von gegen Milben allergischen Patienten inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit mit POX markierten anti-Human-IgE-Antikörpern nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. Die Inhibition der Serum-IgE-Bindung ist in % gezeigt.

Tabelle 4:

Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mittel Der p2 (AS 1-53) 48 66 53 50 54 Der p2 (AS 54-129) 39 50 52 24 41 Der p2-Hybride 59 76 64 47 62 Der p2 61 87 77 73 75

Anti-rDer p 2- und anti-rDer p 2-Derivat-Antikörper, die durch Immunisierung von Mäusen induziert worden waren, inhibieren die IgE-Bindung allergischer Patienten an rDer p 2, wie in einem ELISA-Inhibitions-Test gezeigt.

Die Der p 2-Hybride induziert blockierende Antikörper im vorliegenden Maus-Modell; die Immunogenität wird durch Umstrukturierung der Fragmente signifikant erhöht. "nachgereicht

Claims

- 56 ··

·· ·· ·· • 9 # ·« ··· • · · · • · · · · ·· ···« 999 ·· »· 99 Patentansprüche; 1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Wildtyp-Prote-in-Allergenen mit verringerter allergener Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Vorsehen eines Wildtyp-Protein-Allergens mit einer all-ergenen Aktivität, Spleißen des Wildtyp-Protein-Allergens in zwei Teile, wobei die beiden Teile keine oder eine verringerte allergene Aktivität aufweisen, und Wiederverbinden der beiden Fragmente in umgekehrter Orientierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat als rekombinantes Protein in einem Wirt, insbesondere in einem Wirt mit großer Expressionskapazität, erzeugt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe der Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p2, Vorrats-milben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-All-ergene, insbesondere Phi p 7.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der Inhibition der IgE-Bindungskapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, im Verlgeich zum Wildtyp-Allergen, gemessen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dg die Verringerung der allergenen Aktivität durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern aus mit Allergen sensibilisierten Patienten-Seren an einen Dot-Blot des Derivats gemessen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, dass die Derivate mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten kombiniert und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden. ____ NACHGEREICHT φ 57 ·· • · • · • · • * ·· ·· ··· ·· ·· ··· • · ♦ ·· ·«· • + · • · · ·· Ι· ·· ··*· • · Φ #·
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans kombiniert und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit weiteren Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin kombiniert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ein Wildtyp-Allergen ist, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
11. Allergen-Derivat eines Wildtyp-Protein-Allergens, wobei das Wildtyp-Protein-Allergen eine Aminosäure-Sequenz von 1 bis Z aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nebeneinander - in N-Terminus zu C-Terminus-Orientierung - die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente X bis Z und 1 bis X enthält, wobei die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt.
12. Allergen-Derivat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X mindestens 30 Aminosäure-Reste lang, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäure-Reste lang, insbesondere mindestens 60 Aminosäure-Reste lang sind.
13. Allergen-Derivat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X sich längenmäßig um 50% oder weniger, vorzugsweise um 30% oder weniger, insbesondere um 20% oder weniger, voneinander unterscheiden.
14. Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-Allergen ausgewählt ist aus Typ I-Allergen, vorzugsweise aus Tabelle A, mehr bevorzugt

nachgereicht einem Allergen von Wiesenlieschgras(Phleum pratense)-Pollen, insbesondere Phi p 12, Birken(Betula verrucosa)-Pollen, insbesondere Bet v 4, Gift der Gemeinen Wespe (Vespula vulgaris), Gift der Papierwespe („paper wasp", Polistes annularis), Pa-rietaria judaica-Pollen, Weidelgras-Pollen, oder Mischungen davon.
15. Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 14 und weitere Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergenen, Derivate von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
16. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
17. Allergen-Zusammensetzung nach den Ansprüchen 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten enthält.
18. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zu-sammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 17 zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des rekombinanten Allergen-Derivats aufweist.
21. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 11 bis 17, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 17 codiert, Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und NACHGEREICHT 59 ·· ♦ ··

Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt ein Wirt mit einer großen Expressionskapazität ist.
23. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es durch chemische Synthese erzeugt wird. NACHGEREICHT