JPH1081655A - スフィンゴ脂質及びスフィンゴ脂質誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 スフィンゴ脂質又はリゾスフィンゴ脂質から
スフィンゴイドの長鎖脂肪酸が修飾又は置換したスフィ
ンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法、あ
るいは該方法により得られる当該物質を提供する。 【解決手段】 スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪
酸との酸アミド結合を特異的に加水分解する酵素、又は
該酵素の生産能を有する微生物を用いて、スフィンゴ脂
質又はリゾスフィンゴ脂質と、標識を有し、又は有しな
い脂肪族カルボン酸との反応で、酸交換又は酸アミド化
を行うか、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体同
志の酸交換を行うスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘
導体の製造方法。該方法により得られたスフィンゴ脂質
又はスフィンゴ脂質誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、糖質工学及
び細胞工学等に有用なスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂
質誘導体の製造方法、並びに該製造方法により得られた
スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体に関する。

【０００２】スフィンゴ脂質はスフィンゴ糖脂質、スフ
ィンゴリン脂質、セラミド、を含む長鎖塩基スフィンゴ
イドを持つ脂質の総称であり、下等動物から高等動物に
まで広く分布している。これらスフィンゴ脂質は近年、
細胞の増殖、分化誘導、アポトーシス等のような生物活
性において重要な役割に関与していることが明らかにさ
れつつある。また、細胞表層の構成成分であることから
化粧料等への添加物としても使用されつつある。スフィ
ンゴ脂質は、共通構造としてスフィンゴイドのアミノ基
に不均一な鎖長の長鎖脂肪酸を酸アミド結合したセラミ
ド構造を有している。スフィンゴ脂質の長鎖脂肪酸を修
飾あるいは置換したスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質
誘導体の製造法は、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドの
アミノ基に酸アミド結合した脂肪酸を欠くリゾスフィン
ゴ脂質を出発原料として、化学的、酵素的に合成する方
法が知られている。化学的方法としては、リゾ体のアミ
ノ基に以下の様な方法で脂肪酸あるいは脂肪酸誘導体を
縮合させる方法がある。例えば、脂肪酸のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル等の脂肪酸活性エステルを用
いる方法、脂肪酸とカルボニルジイミダゾールやジシク
ロヘキシルカルボジイミドなどのカップリング試薬を用
いる方法、脂肪酸の無水物を用いる方法、脂肪酸塩化物
を用いる方法などが知られている。酸性糖脂質のリゾ体
としてリゾガングリオシドを用いる方法は、メソッズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology)、第
１３８巻、第３１９〜３４１頁（１９８７）、特開平２
−２００６９７号及び特開平７−３０９８８８号各公報
に報告されている。また、スフィンゴリン脂質のリゾ体
としてスフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフィン
ゴミエリン）を用いる方法が、ジャーナルオブ リピッ
ド リサーチ（Journal of Lipid Research)、第２８
巻、第７１０〜７１８頁（１９８７）に記載されてい
る。これらの方法によるとＯ−アシル化等の副反応が起
こる場合があり選択的にＮ−アシル化された物を得るた
めには保護基の使用、精製等に煩雑な操作が必要であ
る。また、スフィンゴホスホノリピドの一種セラミドシ
リアチンやアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂質を化学的に
脱アシル化して得られるデ−Ｎ−アセチルリゾガングリ
オシドのようにスフィンゴイドのアミノ基以外にアミノ
基をもつスフィンゴ脂質のスフィンゴイドのアミノ基だ
けを選択的にアシル化したいときには保護基の導入、部
分的アシル化、アシル化後の部分的脱アシル化といった
操作、あるいはデ−Ｎ−アセチルリゾガングリオシドを
リポソームに取り込ませた後、選択的にＮ−アシル化す
る等の煩雑な操作が必要であり困難を伴う。一方、酵素
的合成方法は、国際公開番号ＷＯ９４／２６９１９号公
報に記載されている。この方法は、有機溶媒中でリパー
ゼにより縮合を行う方法であり、実質的に無水の有機溶
媒が必要であり、基質の溶解性により基質が限定され
る。国際公開番号ＷＯ９４／２６９１９号公報には、セ
ラミド及びハイブリッドセラミドの酵素的合成方法が記
載されているが、反応も特異的なものではなくＯ−アシ
ル化物の生成が見出されており、また化学的合成法と同
様に複数のアミノ基をもつ場合、スフィンゴイドのアミ
ノ基だけに特異的に作用させることは困難である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、従来
の化学的あるいは酵素的にスフィンゴ脂質の長鎖脂肪酸
を修飾あるいは置換しスフィンゴ脂質あるいはスフィン
ゴ脂質誘導体を合成する方法は、望ましくない副生成物
ができたり、基質が限定されたりするものである。ま
た、従来の方法は、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドの
２位に酸アミド結合する脂肪酸を欠くリゾスフィンゴ脂
質を出発原料として用いる方法であり、目的のスフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を合成するためには、
その合成をする前に、まずリゾスフィンゴ脂質を調製す
る必要があった。したがって、本発明の目的は、リゾス
フィンゴ脂質のみならずスフィンゴ脂質からスフィンゴ
イドに結合する長鎖脂肪酸の修飾あるいは置換したスフ
ィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を特異的に合
成する製造方法を提供することにある。本発明の他の目
的は、該製造方法により得られたスフィンゴ脂質又はス
フィンゴ脂質誘導体を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂
質誘導体の製造方法に関する発明であって、スフィンゴ
脂質と、標識を有し、又は有しない脂肪族カルボン酸と
を、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪酸との酸ア
ミド結合を特異的に加水分解する酵素を用いて酵素的に
反応させ、脂肪酸鎖の異なるスフィンゴ脂質あるいはス
フィンゴ脂質誘導体を得ることを特徴とする。本発明の
第２の発明は、他のスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質
誘導体の製造方法に関する発明であって、リゾスフィン
ゴ脂質と、標識を有し、又は有しない脂肪族カルボン酸
とを、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪酸との酸
アミド結合を特異的に加水分解する酵素を用いて酵素的
に反応させ、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘
導体を得ることを特徴とする。本発明の第３の発明は、
更に他のスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の製
造方法に関する発明であって、少なくとも異なる２種の
スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を、スフィン
ゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特
異的に加水分解する酵素を用いて酵素的に反応させ、脂
肪酸鎖の交換されたスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ
脂質誘導体を得ることを特徴とする。本発明の第４の発
明は、同じくスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体
の製造方法に関する発明であって、前記した本発明の第
１〜第３の発明における酵素の代りに、該酵素の生産能
を有する微生物を用いて、それと反応原料とを接触させ
て目的物を得ることを特徴とする。本発明の第５の発明
は、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体に関する
発明であって、前記本発明の第１〜第４の発明のいずれ
かの製造方法により得られたものであることを特徴とす
る。

【０００５】本発明者らは、任意のスフィンゴ脂質ある
いはスフィンゴ脂質誘導体の合成法について検討を行っ
た結果、リゾスフィンゴ脂質のスフィンゴイドのアミノ
基への脂肪酸の再結合、あるいはスフィンゴ脂質のスフ
ィンゴイドに酸アミド結合する脂肪酸と別の脂肪酸との
置換が、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドの酸アミド結
合に作用しリゾスフィンゴ脂質と脂肪酸に加水分解する
酵素によって、任意のスフィンゴ脂質あるいはスフィン
ゴ脂質誘導体を合成できることを見出し、本発明に到達
した。従来、酵素による逆反応あるいは転移反応は、同
時に起こる加水分解反応を抑える必要から受容体に対し
て供与体を大過剰に添加したり、有機溶媒系で反応を行
わなければならなかった。しかしながら、本発明者ら
は、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪酸との酸ア
ミド結合を特異的に加水分解する酵素を用いることによ
り、水溶液中の緩和な条件において、受容体に対して供
与体を大過剰添加することなくスフィンゴ脂質あるいは
スフィンゴ脂質誘導体を合成できることを見出し、本発
明を完成した。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本明細書において、スフィンゴ脂質とは、スフィン
ゴ糖脂質、スフィンゴリン脂質、セラミド、を含む長鎖
塩基スフィンゴイドを有する天然物あるいは合成物を単
体、あるいはそれらの混合物等が挙げられる。また、本
明細書において、リゾスフィンゴ脂質とは、スフィンゴ
イドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪酸を欠くスフィ
ンゴ脂質のＮ−脱アシル体を示す。

【０００７】本明細書において、脂肪族カルボン酸に
は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸はもちろんのこと、それ
ら脂肪酸の炭化水素鎖が、ハロゲン、置換若しくは非置
換のアミノ基、オキソ基、水酸基等の官能性基で置換さ
れている酸、あるいは当該炭化水素鎖中に酸素、硫黄、
アミノ基を有する酸等の脂肪族性をもつカルボン酸がす
べて含まれる。

【０００８】更に、本明細書において、スフィンゴリピ
ドセラミドデアシラーゼとは、スフィンゴ脂質のスフィ
ンゴイドのアミド結合に作用しリゾスフィンゴ脂質と脂
肪酸とに特異的に加水分解する酵素を意味する。すなわ
ち、特異的にはスフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪
酸との酸アミド結合のみを加水分解することを意味す
る。その例としては、スフィンゴ糖脂質（ガングリオシ
ド、中性糖脂質）、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミ
エリン）を含むスフィンゴ脂質に幅広く作用する酵素と
してシュードモナス属に属する微生物の生産するスフィ
ンゴリピドセラミドデアシラーゼ〔ＳＣＤａｓｅ、ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journa
l of Biological Chemistry)、第２７０巻、第２４３７
０〜２４３７４頁（１９９５）、特開平８−８４５８７
号公報〕、ガングリオシドのみに作用する酵素としてノ
カルディア（Nocardia) 属に属する微生物の生産するガ
ングリオシド セラミダーゼ〔ジャーナル オブ バイ
オケミストリー（Journal of Biochemistry)、第１０３
巻、第１〜４頁（１９８８）、特開昭６４−６０３７９
号公報〕、ロドコッカス（Rhodococcus)属に属する微生
物の生産する中性糖脂質のみに作用しリゾ体を生ずる酵
素（特開平６−７８７８２号公報）、スフィンゴ糖脂質
に作用する酵素としてストレプトミセス（Streptmyces)
属に属する微生物の生産するグリコスフィンゴリピドセ
ラミドデアシラーゼ〔バイオサイエンス，バイオテクノ
ロジー，アンド バイオケミストリー（Bioscience, Bi
otechnology, and Biochemistry)、第５９巻、第２０２
８〜２０３２頁（１９９５）、特開平７−１０７９８８
号公報〕、あるいはセラミドに作用するセラミダーゼ
（アシルスフィンゴシンデアシラーゼ、ＥＣ３．５．
１．２３、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー、第２４１巻、第３７３１〜３７３７頁（１９６
６）、バイオケミストリー（Biochemistry) 、第８巻、
第１６９２〜１６９８頁（１９６９）、バイオキミカ
エ バイオフィジカ アクタ（Biochimica Biophysica
Acta) 、第１７６巻、第３３９〜３４７頁（１９６
９）、サイエンス（Science)、第１７８巻、第１１００
〜１１０２頁（１９７２）〕等が挙げられるが、これに
限定されるものではない。また、これら酵素をコードす
る遺伝子を用いて得られた組換体の酵素、更に、これら
酵素をコードする遺伝子が欠失、付加、挿入若しくは置
換された遺伝子を用いて得られる組換体の酵素であって
も、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪酸との酸ア
ミド結合を特異的に加水分解する酵素であれば、本明細
書で言うスフィンゴリピドセラミドデアシラーゼに含ま
れる。また、該酵素の使用に際しては、該酵素の精製
品、該酵素を含む培養液又は粗抽出液を用いることがで
きる。

【０００９】更に、既述のように、前記した酵素の代り
に、該酵素の生産能を有する微生物を用いてもよい。本
明細書において、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂
肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解する酵素の生
産能を有する微生物とは、上記のスフィンゴリピドセラ
ミドデアシラーゼを生産することができる微生物であれ
ば、特に限定されるものではなく、細菌類、酵母類、放
線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物、更
には、植物、昆虫、動物等の生体由来の細胞も含まれ
る。また、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドの酸アミド
結合に作用しリゾスフィンゴ脂質と脂肪酸とに加水分解
する酵素、あるいはその酵素の生産能を有する菌体は、
従来周知であるような固体担体上に固定されても良い
し、リポソームや逆ミセルに取り込まれても良い。高分
子物質により修飾された酵素を用いることもできる。

【００１０】本発明の反応は通常、原料となるスフィン
ゴ脂質又はリゾスフィンゴ脂質、標識を有し、又は有し
ない脂肪族カルボン酸、精製酵素、粗抽出液、培養液、
微生物のいずれかを含む緩衝液中で進行する。また、微
生物の場合、その微生物の培養液中に、原料となるスフ
ィンゴ脂質又はリゾスフィンゴ脂質、当該脂肪族カルボ
ン酸を加えてもよい。また、これら原料の使用量は特に
限定されず、その飽和量まで使用できる。通常、当該脂
肪族カルボン酸が過剰に存在する状態が望ましいが、本
発明においてはスフィンゴ脂質又はリゾスフィンゴ脂質
と、脂肪族カルボン酸とのモル比は１：１でも進行し、
スフィンゴ脂質又はリゾスフィンゴ脂質が過剰に存在し
ても良い。更に、酵素あるいは酵素を生産する微生物の
使用量は特に限定されるものではなく、広い範囲から適
宜選択でき、例えば出発溶液１ｍｌ当り、通常０．１ｍ
Ｕ以上、より好ましくは３ｍＵ〜１０Ｕ程度使用すれば
よい。緩衝液としては、ｐＨが５〜９程度の好適な緩衝
液を用いれば良く、通常ｐＨ６〜７付近の緩衝液中で行
うことが望ましい。また、緩衝液中には通常、酵素の活
性化あるいは基質の溶解のために界面活性剤を添加する
のが好ましい。界面活性剤として胆汁酸系界面活性剤あ
るいは非イオン性界面活性剤等が使用できる。界面活性
剤の添加量は、その酵素の活性化、基質の溶解のため、
あるいは生成物が効率よく得られる量で使用すればよ
く、特に限定されるものではないが、好適には０．０１
％〜２％の範囲内で添加することが好ましい。また更
に、これらの反応液に有機溶媒を添加しても良く、この
時の有機溶媒は水溶性有機溶媒でも良く、また不溶性有
機溶媒との２相系で反応を行っても良い。有機溶媒添加
量は酵素が失活せず生成物が効率よく得られる量であれ
ば良く、特に限定されるものではない。このようにして
生成したスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体は、
薄層クロマトグラフィーによって確認できる。本発明に
よって得られたスフィンゴ脂質は有機化合物の一般的に
用いられるクロマトグラフィーによって単離精製でき
る。

【００１１】このように本発明により、スフィンゴ脂質
の共通部分であるセラミド部分の長鎖脂肪酸の修飾、置
換を行いスフィンゴ脂質誘導体の製造方法が提供され
る。また当該製造方法を用いて任意のスフィンゴ脂質又
はスフィンゴ脂質誘導体を工業的に有利に製造すること
が可能となる。天然スフィンゴ脂質は一般に長鎖脂肪酸
鎖長に多様性があり、均一な長鎖脂肪酸鎖長のスフィン
ゴ脂質を得ることが困難であった。しかしながら、本発
明の長鎖脂肪酸の置換によって、長鎖脂肪酸が均一化さ
れたスフィンゴ脂質を得ることができる。また、スフィ
ンゴ脂質の脂肪酸部分に、発色団を形成する物質、蛍光
物質、ビオチン、放射性同位元素等を導入して、標識ス
フィンゴ脂質を作製することも可能となり、スフィンゴ
脂質の細胞内代謝や輸送経路の解明等への応用が可能と
なる。更に、スフィンゴ脂質のセラミド部分の変換、例
えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエ
ン酸（ＤＨＡ）等の機能性高度不飽和脂肪酸を導入する
ことによって、細胞への浸透性、細胞での代謝、あるい
は生物活性を改変した新しいスフィンゴ脂質誘導体を作
出でき、医薬、化粧料、細胞工学等への応用ができる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００１３】実施例１ ガラクトシルスフィンゴシン（シグマ社製）５ｎｍｏ
ｌ、［１−¹⁴Ｃ］ステアリン酸（アマシャム社製）５ｎ
ｍｏｌ、０．８％トリトン（Triton）Ｘ−１００、シュ
ードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ［ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第２４３７
０〜２４３７４頁（１９９５）、特開平８−８４５８７
号公報］１５０μＵを含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）５０μｌを３７℃で一晩反応させた。反応液を
薄層クロマトグラフィーにより展開し（展開溶媒 クロ
ロホルム：メタノール：０．２５％塩化マグネシウム水
溶液＝６５：２５：４）、イメージングプレートに露光
しＢＡＳ１０００イメージングアナライザー（富士フィ
ルム社製）でクロマトグラムを得た。この時［１−
¹⁴Ｃ］ステアリン酸と新たに生成したガラクトシルセラ
ミドのバンドだけが検出された。薄層プレートからガラ
クトシルセラミドに対応する部分をかき取りクロロホル
ム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）で抽出した。抽出液
を乾固した後、β−ガラクトシダーゼ［ジャック ビー
ン（Jack bean）由来］１６ｍＵ 、０．４％タウロデオ
キシコール酸を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
１０μｌに溶解し３７℃で一晩、酵素消化を行った。反
応液を再び薄層クロマトグラフィーにより展開し（展開
溶媒 クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝９
０：１０：１）、ＢＡＳ１０００イメージングアナライ
ザー（富士フィルム社製）で解析した結果、セラミドと
同じＲｆ値を与えるバンドが検出された。また非標識ス
テアリン酸を用い前述と同様の反応、薄層クロマトグラ
フィー、抽出操作によって得られた生成物をファースト
アトム ボンバードメント−マススペクトル（ＦＡＢ
−ＭＳ）分析した結果、ガラクトシルセラミドの親イオ
ンピークに一致するｍ／ｚ＝４６２のピーク及びセラミ
ドの分子イオンピークに一致するフラグメントイオンピ
ークｍ／ｚ＝５４８が検出された。以上の結果により、
逆反応によりスフィンゴシン部分のアミノ基に脂肪酸が
転移されていることが明らかとなった。

【００１４】実施例２ スフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフィンゴミエ
リン、シグマ社製）５０ｎｍｏｌ、［１−¹⁴Ｃ］ステア
リン酸５ｎｍｏｌ、０．８％トリトンＸ−１００、シュ
ードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ１５０μＵを含む５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌを３７℃で一晩反
応させた。反応液を薄層クロマトグラフィーにより展開
し（展開溶媒 クロロホルム：メタノール：０．０２％
塩化カルシウム水溶液＝５：４：１）、ＢＡＳ１０００
イメージングアナライザー（富士フィルム社製）で解析
した。この時［１−¹⁴Ｃ］ステアリン酸と新たに生成し
たスフィンゴミエリンのバンドだけが検出された。薄層
プレートからスフィンゴミエリンに対応する部分をかき
取り抽出した後、乾固し逆反応生成物を得た。生成物を
スタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aur
eus） 由来スフィンゴミエリナーゼ（シグマ社製）３
５．７μＵを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０μｌに溶解し、３７℃で一晩、酵素消化を行った。
反応液を再び薄層クロマトグラフィーにより展開し（展
開溶媒 クロロホルム／メタノール／アンモニア水＝９
０：１０：１）、ＢＡＳ１０００イメージングアナライ
ザーで解析した結果、セラミドと同じＲｆ値を与えるバ
ンドが検出された。このことから逆反応によりスフィン
ゴシン部分のアミノ基に脂肪酸が転移されていることが
明らかとなった。

【００１５】実施例３ ＳＣＤａｓｅによる各種アクセ
プターに対する逆反応１ ［１−¹⁴Ｃ］ステアリン酸１ｎｍｏｌ、リゾスフィンゴ
脂質１ｎｍｏｌ、０．８％トリトンＸ−１００、シュー
ドモナス属由来ＳＣＤａｓｅ３０μＵを含む５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０μｌを３７℃で一晩反応さ
せた。得られた反応液を薄層クロマトグラフィーで展開
し、イメージングプレートに露光しＢＡＳ１０００イメ
ージングアナライザー（富士フィルム社製）で反応生成
物の定量を行った。その結果を表１に示す。表１に示し
たように各種リゾスフィンゴ糖脂質に幅広く作用するの
みならずリゾスフィンゴリン脂質、スフィンゴシンをも
受容体とし作用することができる。

【００１６】

【表１】 表 １ ───────────────────────────── リゾスフィンゴ脂質 相対活性（％） ───────────────────────────── ガラクトシルスフィンゴシン １００．０ リゾスルファチド ５９．６ リゾラクトシルセラミド ３７．２ リゾグロボシド ３４．１ リゾガングリオシドＧＭｌａ １５．４ リゾスフィンゴミエリン ５．７ スフィンゴシン １１．５ ─────────────────────────────

【００１７】実施例４ ＳＣＤａｓｅによる各種アクセ
プターに対する逆反応２ Ｎ−トリフルオロアセチル化アミノドデカン酸６６．６
ｎｍｏｌ、リゾスフィンゴ脂質３３．３ｎｍｏｌ、０．
３％トリトンＸ−１００、シュードモナス属由来ＳＣＤ
ａｓｅ１４８μＵを含む２５ｍＭグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１１）４１．６μｌを３７℃、４８
時間反応させた。得られた反応液を薄層クロマトグラフ
ィーで展開し、スフィンゴ糖脂質はオルシノール硫酸に
より発色させ、その他のスフィンゴ脂質はクマシーブリ
リアントブルーにより発色させた後、イメージングデン
シトメーター（バイオラッド社製）で反応生成物の定量
を行った。その結果を表２に示す。実施例３と同様に、
表２に示したように各種リゾスフィンゴ脂質に幅広く作
用するのみならず、スフィンゴシンをも受容体とし作用
することができる。

【００１８】

【表２】 表 ２ ──────────────────────────── リゾスフィンゴ脂質 反応効率（％） ──────────────────────────── スフィンゴシン ６９ リゾガングリオシドＧＭ３ ２４ リゾガングリオシドＧＤ３ １３ リゾガングリオシドＧＭ１ａ ２９ リゾガングリオシドＧＤ１ａ ３２ ────────────────────────────

【００１９】実施例５ ＳＣＤａｓｅの逆反応の脂肪酸
分子種に対する特異性 ガラクトシルスフィンゴシン（シグマ社製）５ｎｍｏ
ｌ、各種非標識脂肪酸５ｎｍｏｌ、０．８％トリトンＸ
−１００、シュードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ１５０μ
Ｕを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌを
３７℃で一晩反応させた。得られた反応液を薄層クロマ
トグラフィーで展開後、オルシノール硫酸により発色し
クロマトスキャナーＣＳ９０００（島津製作所社製）で
定量した。その結果を図１に示す。すなわち、図１はＳ
ＣＤａｓｅの逆反応の脂肪酸分子種に対する特異性を示
す図であり、縦軸に脂肪酸、横軸に収率（％）を示す。

【００２０】実施例６ ＳＣＤａｓｅによる逆反応の至
適ｐＨ ガラクトシルスフィンゴシン１ｎｍｏｌ、［１−¹⁴Ｃ］
ステアリン酸１ｎｍｏｌ、０．８％トリトンＸ−１０
０、シュードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ３０μＵを含む
１０μｌの各種緩衝液を３７℃で３時間反応させた。こ
の結果を図２に示す。すなわち、図２は逆反応の至適ｐ
Ｈを示す図であり、縦軸に分解率（％）、横軸にｐＨを
示す。図中、白四角印は酢酸緩衝液、黒三角印はリン酸
緩衝液、黒丸印はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を示す。

【００２１】実施例７ ＳＣＤａｓｅによる各種アクセ
プターに対する脂肪酸交換反応 ［１−¹⁴Ｃ］ステアリン酸１ｎｍｏｌ、スフィンゴ脂質
１ｎｍｏｌ、０．８％トリトンＸ−１００、シュードモ
ナス属由来ＳＣＤａｓｅ３０μＵを含む５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ６．０）１０μｌを３７℃で一晩反応させ
た。得られた反応液を薄層クロマトグラフィーで展開
後、イメージングプレートに露光し、ＢＡＳ１０００イ
メージングアナライザー（富士フィルム社製）で反応生
成物の定量を行った。その結果を表３に示す。表３に示
したようにスフィンゴ脂質に対して幅広く脂肪酸交換反
応を行うことが可能である。

【００２２】

【表３】 表 ３ ──────────────────────────── スフィンゴ脂質 相対活性（％） ──────────────────────────── ガラクトシルセラミド １００．０ グルコシルセラミド １２９．０ スルファチド ３１．７ ラクトシルセラミド １１２．０ アシアロＧＭ１ １６４．０ グロボシド １４１．０ ガングリオシドＧＭ３ ５４．４ ガングリオシドＧＭ２ ５．５ ガングリオシドＧＭ１ａ ２．４ ガングリオシドＧＤ１ａ ６．２ ガングリオシドＧＤ１ｂ １．２ スフィンゴミエリン ２．９ セラミド ７７．５ ────────────────────────────

【００２３】実施例８ 反応条件の検討 加水分解反応、逆反応、脂肪酸交換反応の条件を検討す
るために、下記反応条件（Ａ）及び（Ｂ）を用い反応を
行った。 反応条件（Ａ）： シュードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ
１２０μＵ、０．８％トリトンＸ−１００を含む２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μｌに、基質とし
て、加水分解反応時には１００μＭ¹⁴Ｃ−ガラクトシル
セラミドを、逆反応時には１００μＭ［１−¹⁴Ｃ］ステ
アリン酸と１００μＭガラクトシルスフィンゴシンを、
脂肪酸交換反応時には１００μＭ［１−¹⁴Ｃ］ステアリ
ン酸と１００μＭガラクトシルセラミドをそれぞれ含
む。 反応条件（Ｂ）： シュードモナス属由来ＳＣＤａｓｅ
１２０μＵ、０．１％トリトンＸ−１００を含む２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌに、基質とし
て、加水分解反応時には１００μＭ¹⁴Ｃ−ガラクトシル
セラミドを、逆反応時には１００μＭ［１−¹⁴Ｃ］ステ
アリン酸と１００μＭガラクトシルスフィンゴシンを、
脂肪酸交換反応時には１００μＭ［１−¹⁴Ｃ］ステアリ
ン酸と１００μＭガラクトシルセラミドをそれぞれ含
む。上記反応条件において３７℃で反応させ、０．２
５、０．５、１、３、７、２１時間経過ごとに各反応液
からそれぞれ２０μｌずつを取り、１００℃、５分間加
熱し反応を止めた。得られた反応液を薄層クロマトグラ
フィーで展開し（展開溶媒 クロロホルム：メタノー
ル：０．０２％塩化カルシウム水溶液＝５：４：１）、
ＢＡＳ１０００イメージングアナライザー（富士フィル
ム社製）で反応生成物及び未反応物を定量し反応率を算
出した。その結果を図３に示す。すなわち、図３は上記
反応条件（Ａ）及び（Ｂ）でのＳＣＤａｓｅの加水分解
反応、逆反応、脂肪酸交換反応の反応率を示す図であ
り、縦軸に反応率（％）、横軸に反応時間（ｈ）を示
す。図中、白丸印は加水分解反応、白四角印は逆反応、
白三角印は脂肪酸交換反応の反応率を示す。この結果、
ＳＣＤａｓｅの加水分解反応は、反応液が酸性ｐＨで、
かつ、高濃度の界面活性剤存在下で優先的に進行し、ま
た、ＳＣＤａｓｅの逆反応及び脂肪酸交換反応は、反応
液が中性域で、かつ、界面活性剤の濃度が下がると優先
的に進行することが明らかとなった。

【００２４】実施例９ ¹⁴Ｃセラミドの合成 エタノールに溶解した［１−¹⁴Ｃ］パルミチン酸（アマ
シャム社製）１００ｎｍｏｌ（５．０μＣｉ）とスフィ
ンゴシン２００ｎｍｏｌを反応容器に入れ、窒素ガスに
より完全に乾固した。その容器に、０．６％トリトンＸ
−１００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．５ｍｌを加え、よくかくはんした後、超音波処理に
より均一化した。この均一化した溶液に、シュードモナ
ス由来ＳＣＤａｓｅ（１ｍＵ／ｍｌ）０．５ｍｌを加
え、３７℃、２０時間反応を行った。反応終了後、得ら
れた反応液を遠心濃縮機により乾固し、この乾固した反
応物をヘキサン：エーテル：酢酸＝５０：５０：１（ｖ
／ｖ）１ｍｌに溶解させ、同溶液にて平衡化したＳｅｐ
−Ｐａｋ（登録商標）シリカカートリッジに添加し、未
反応の［１−¹⁴Ｃ］パルミチン酸を１０ｍｌの同溶液で
洗い流した後、クロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ
／ｖ）１０ｍｌで¹⁴Ｃセラミドを溶出した。溶出液は、
窒素ガスにより乾固した後、蒸留水に懸濁し、更に超音
波処理により均一化した。この均一化した溶液をＳｅｐ
−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カートリッジに添加した。
このカートリッジを蒸留水２０ｍｌで洗浄し、メタノー
ル３ｍｌとクロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／
ｖ）１０ｍｌで¹⁴Ｃセラミドを溶出した。次に、得られ
た溶出液は窒素ガスにより乾固し、クロロホルム：メタ
ノール：蒸留水＝９０：１０：１（ｖ／ｖ）に溶解した
後、同溶液で平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ
Ｍカートリッジに添加することにより、未反応のスフィ
ンゴシンを吸着させた。この際、通過画分を窒素ガスに
より乾固し、混在脂肪酸及びスフィンゴシン１％以下の
精製¹⁴Ｃセラミド６６ｎｍｏｌ（３．３μＣｉ）を得
た。

【００２５】実施例１０ アミノセラミド及びその蛍光
誘導体の合成 Ｎ−トリフルオロアセチル化アミノドデカン酸６６．６
μｍｏｌ、スフィンゴシン（シグマ社製）３３．３μｍ
ｏｌ、０．３％トリトンＸ−１００、シュードモナス属
由来ＳＣＤａｓｅ１４８ｍＵを含む２５ｍＭグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）４１．６ｍｌを３
７℃、４８時間反応させた。反応終了後、反応液をＣ１
８逆相シリカカラムに負荷し、水でカラムを洗浄して脱
塩し、クロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）で
Ｎ−トリフルオロアセチル化アミノセラミドを溶出し
た。溶媒を留去後、クロロホルム：メタノール：水＝９
０：１０：１に溶かし、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ
Ｍカートリッジ（ウォ−ターズ社製）に負荷して未反応
のスフィンゴシンを吸着させ、Ｎ−トリフルオロアセチ
ル化アミノセラミドを含む非吸着画分を得た。この非吸
着画分をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）ＱＭＡカートリッ
ジ（ウォ−ターズ社製）に負荷して、未反応のＮ−トリ
フルオロアセチル化アミノドデカン酸を吸着させ、精製
されたＮ−トリフルオロアセチル化アミノセラミドを含
む非吸着画分を得た。得られたＮ−トリフルオロアセチ
ル化アミノセラミド、１％ナトリウムメトキシドを含む
クロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）２０ｍｌ
を室温で一晩反応させた。反応終了後、溶媒を留去し、
水に懸濁してＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カート
リッジ（ウォ−ターズ社製）に負荷し、水でカラムを洗
浄して脱塩し、クロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ
／ｖ）でアミノセラミドを溶出した。溶媒を留去後、ク
ロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：５に溶かし
てＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）ＣＭカートリッジに負荷
し、クロロホルム：メタノール：１Ｎ ＨＣｌ＝６０：
３０：５で溶出した後、乾固し、精製されたアミノセラ
ミド５．６μｍｏｌを得た。メタノールに溶かした１０
０ｎｍｏｌアミノセラミド７０μｌ、５０ｍＭフッ化Ｎ
ＢＤ（シグマ社製）エタノール溶液２０μｌ、トリエチ
ルアミン１０μｌを６０℃で１時間反応させた。反応終
了後、溶媒を留去し、ヘキサン：エーテル：酢酸＝５
０：５０：１に溶かしてＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）シ
リカカートリッジ（ウォーターズ社製）に負荷し、クロ
ロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）で溶出した
後、乾固し、精製されたＮＢＤセラミド３０ｎｍｏｌを
得た。

【００２６】実施例１１ 蛍光スフィンゴ脂質誘導体Ｎ
ＢＤセラミドを用いたカブトガニセラミダーゼのスクリ
ーニング カブトガニ血液を遠心分離して得られた血清１０μｌ
と、実施例１０で作製したＮＢＤセラミド１ｎｍｏｌ、
０．５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）１０μｌを３７℃、１８時間反応させ
た。反応終了後、反応液を薄層クロマトグラフィーによ
り展開し（展開溶媒 クロロホルム：メタノール：２５
％アンモニア水＝９０：２０：０．５）、紫外線ランプ
で検出した。このとき新たに生成したＮＢＤアミノドデ
カン酸が検出され、カブトガニの血清中にセラミダーゼ
活性が検出された。カブトガニの血清中で確認されたセ
ラミダーゼ活性が本当にセラミダーゼ由来の活性である
かどうか確認するため、このセラミダーゼを精製したと
ころ、ゲルろ過法により分子量約２０５ｋＤａ、至適ｐ
Ｈ４．５の酸性セラミダーゼであることが分かった。ま
た、このカブトガニセラミダーゼは、Ｎ−ステアロイル
スフィンゴシン（Ｃ１８：０、ｄ１８：１）を最もよく
分解し、長鎖塩基としてスフィンガニンやフィトスフィ
ンゴシンを含むセラミドに対しても活性を有しているこ
とが分かった。このように、これまで存在が知られてい
なかった無脊椎動物のセラミダーゼが、本発明の製造方
法で得た蛍光スフィンゴ脂質誘導体ＮＢＤセラミドを用
いることにより、その存在が初めて明らかとなり、蛍光
スフィンゴ脂質誘導体ＮＢＤセラミドがセラミダーゼ活
性測定用の基質として有用であることが分かった。

【００２７】実施例１２ 放射性同位体標識¹⁴Ｃセラミ
ド（Ｃ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒ）及び蛍光スフィンゴ脂質誘
導体ＮＢＤセラミド（Ｃ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒ）を基質
とするＢ１６細胞におけるセラミダーゼ活性測定 ６×１０⁶ 個のＢ１６細胞を１０ｍＭリン酸緩衝液２０
０μｌに懸濁し、細胞破砕液を調製した。タンパク量は
ＭｉｃｒｏＢＣＡ^TM ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒ
ｅａｇｅｎｔ（ピアス社製）により定量した。 反応条件１：細胞破砕液１０μｌ（タンパク量５０μｇ
に希釈）、基質として実施例１０で得たＣ１２−ＮＢＤ
−Ｃｅｒ２００ｐｍｏｌ又は実施例９で用いたパルミチ
ン酸の代りにラウリン酸を用いて得たＣ１２−¹⁴Ｃ−Ｃ
ｅｒ１００ｐｍｏｌ、０．５％トリトンＸ−１００を含
む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０μｌの酸性条
件下。 反応条件２：細胞破砕液１０μｌ（タンパク量５０μｇ
に希釈）、基質としてＣ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒ２００ｐ
ｍｏｌ又はＣ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒ１００ｐｍｏｌ、０．
５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１０μｌの中性条件下。 反応条件３：細胞破砕液１０μｌ（タンパク量５０μｇ
に希釈）、基質としてＣ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒ２００ｐ
ｍｏｌ又はＣ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒ１００ｐｍｏｌ、０．
５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）１０μｌの塩基性条件下。 上記反応条件で、それぞれ３７℃、３又は６時間反応を
行った。その後、反応液にクロロホルム：メタノール
（２：１）１００μｌを加え反応を止めた。得られた反
応液は乾固した後、クロロホルム：メタノール（２：
１）に溶解し試料とした。各試料は薄層クロマトグラフ
ィーで展開し（展開溶媒 クロロホルム：メタノール：
２５％アンモニア水＝９０：２０：０．５）、遊離した
¹⁴Ｃ脂肪酸はＢＡＳ１０００イメージングアナライザー
（富士フィルム社製）を用い定量し、反応率を算出し
た。また、遊離したＮＢＤ脂肪酸はクロマトスキャナー
ＣＳ９０００（島津製作所社製）を用い、それぞれ定量
し、反応率を算出した。その結果を図４に示す。すなわ
ち、図４はＢ１６細胞におけるセラミダーゼの活性測定
を比較する図であり、縦軸の上からＣ１２−ＮＢＤ−Ｃ
ｅｒを基質とし３時間（３ｈｒ）及び６時間（６ｈｒ）
反応を、Ｃ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒを基質とし３時間及び６
時間反応を示し、横軸に分解率（％）を示す。この結果
から、Ｂ１６細胞にはＣ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒによく作
用するがＣ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒにあまり作用しないアル
カリ性セラミダーゼと、Ｃ１２−¹⁴Ｃ−Ｃｅｒによく作
用するがＣ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒにあまり作用しない酸
性セラミダーゼが存在することが示唆された。

【００２８】

【発明の効果】本発明の製造方法により、任意のスフィ
ンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を効率よく安価に調
製することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＣＤａｓｅによる逆反応の脂肪酸分子種に対
する特異性を示す図である。

【図２】ＳＣＤａｓｅによる逆反応の至適ｐＨを示す図
である。

【図３】ＳＣＤａｓｅの加水分解反応、逆反応、脂肪酸
交換反応の反応率を示す図である。

【図４】Ｂ１６細胞におけるセラミダーゼの活性測定を
比較する図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｐ 19/44 (72)発明者 喜多 克洋 長崎県長崎市丸尾町３−19

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スフィンゴ脂質と、標識を有し、又は有
   しない脂肪族カルボン酸とを、スフィンゴ脂質のスフィ
   ンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解
   する酵素を用いて酵素的に反応させ、脂肪酸鎖の異なる
   スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を得るこ
   とを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導
   体の製造方法。
2. 【請求項２】 リゾスフィンゴ脂質と、標識を有し、又
   は有しない脂肪族カルボン酸とを、スフィンゴ脂質のス
   フィンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水
   分解する酵素を用いて酵素的に反応させ、スフィンゴ脂
   質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を得ることを特徴とす
   るスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の製造方
   法。
3. 【請求項３】 少なくとも異なる２種のスフィンゴ脂質
   又はスフィンゴ脂質誘導体を、スフィンゴ脂質のスフィ
   ンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解
   する酵素を用いて酵素的に反応させ、脂肪酸鎖の交換さ
   れたスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を得
   ることを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質
   誘導体の製造方法。
4. 【請求項４】 スフィンゴ脂質と、標識を有し、又は有
   しない脂肪族カルボン酸とを、スフィンゴ脂質のスフィ
   ンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解
   する酵素の生産能を有する微生物と接触させ、脂肪酸鎖
   の異なるスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体
   を得ることを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ
   脂質誘導体の製造方法。
5. 【請求項５】 リゾスフィンゴ脂質と、標識を有し、又
   は有しない脂肪族カルボン酸とを、スフィンゴ脂質のス
   フィンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水
   分解する酵素の生産能を有する微生物と接触させ、スフ
   ィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を得ることを
   特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
   製造方法。
6. 【請求項６】 少なくとも異なる２種のスフィンゴ脂質
   又はスフィンゴ脂質誘導体を、スフィンゴ脂質のスフィ
   ンゴイドと脂肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解
   する酵素の生産能を有する微生物と接触させ、脂肪酸鎖
   の交換されたスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘
   導体を得ることを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィ
   ンゴ脂質誘導体の製造方法。
7. 【請求項７】 スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂肪
   酸との酸アミド結合を特異的に加水分解する酵素が、ス
   フィンゴリピドセラミドデアシラーゼである請求項１〜
   ６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 酵素が、シュードモナス（Pseudomonas)
   属の細菌の生産する酵素である請求項７記載の製造方
   法。
9. 【請求項９】 スフィンゴ脂質と、標識を有し、又は有
   しない脂肪族カルボン酸を添加した培地中で微生物を培
   養することを特徴とする請求項４記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 リゾスフィンゴ脂質と、標識を有し、
    又は有しない脂肪族カルボン酸を添加した培地中で微生
    物を培養することを特徴とする請求項５記載の製造方
    法。
11. 【請求項１１】 少なくとも異なる２種のスフィンゴ脂
    質又はスフィンゴ脂質誘導体を添加した培地中で微生物
    を培養することを特徴とする請求項６記載の製造方法。
12. 【請求項１２】 微生物がシュードモナス属に属する細
    菌である請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方
    法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載
    の製造方法により得られたスフィンゴ脂質又はスフィン
    ゴ脂質誘導体。