JPH1084979A - ＡｖａＩを用いる好熱性鎖置換増幅 - Google Patents
ＡｖａＩを用いる好熱性鎖置換増幅Info
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- JPH1084979A JPH1084979A JP9191129A JP19112997A JPH1084979A JP H1084979 A JPH1084979 A JP H1084979A JP 9191129 A JP9191129 A JP 9191129A JP 19112997 A JP19112997 A JP 19112997A JP H1084979 A JPH1084979 A JP H1084979A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 増幅された標的核酸配列を、標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによ
って検出する方法。 【解決手段】 アナベナ属（Anabaena）およびアナベノ
プシス属（Anabaenopsis）に由来する好中温性制限エン
ドヌクレアーゼＡｖａＩおよびそのアイソシゾマーは、
好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）において標的核酸配列の
高性能の増幅を支持することが判った。観察された最大
増幅効率は、低下した酵素活性を生じると従来報告され
た温度でもたらされた。ＡｖａＩはＢｓｏＢＩ（ｔＳＤ
Ａで一般的に用いられる好熱性制限エンドヌクレアー
ゼ）のアイソシゾマーであるので、本発明は、ＢｓｏＢ
Ｉよりも容易に入手可能であり且つＢｓｏＢＩ系で用い
るために従来構築されたＳＤＡ増幅プライマーの再設計
を必要としない代わりの酵素を提供する。
ゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによ
って検出する方法。 【解決手段】 アナベナ属（Anabaena）およびアナベノ
プシス属（Anabaenopsis）に由来する好中温性制限エン
ドヌクレアーゼＡｖａＩおよびそのアイソシゾマーは、
好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）において標的核酸配列の
高性能の増幅を支持することが判った。観察された最大
増幅効率は、低下した酵素活性を生じると従来報告され
た温度でもたらされた。ＡｖａＩはＢｓｏＢＩ（ｔＳＤ
Ａで一般的に用いられる好熱性制限エンドヌクレアー
ゼ）のアイソシゾマーであるので、本発明は、ＢｓｏＢ
Ｉよりも容易に入手可能であり且つＢｓｏＢＩ系で用い
るために従来構築されたＳＤＡ増幅プライマーの再設計
を必要としない代わりの酵素を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列を増幅す
る方法に関する。
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】in vitro 核酸増幅技術は、少量の核酸
の検出および分析のための有力な手段を提供してきた。
このような方法の極度の感受性は、感染および遺伝病の
診断、分析用の遺伝子の単離、並びに法医学におけるよ
うな特異的核酸の検出のためにそれらを開発する試みを
もたらしてきた。鎖置換増幅（ＳＤＡ；G.T.ウォーカー
（Walker）ら，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-3
96；G.T.ウォーカーら，1992.Nuc.Acids.Res.20,1961-1
696；米国特許第5,455,166号；米国特許第5,270,184
号；欧州特許第0684315号）などの方法は、一定温度で
行われる等温反応である。
の検出および分析のための有力な手段を提供してきた。
このような方法の極度の感受性は、感染および遺伝病の
診断、分析用の遺伝子の単離、並びに法医学におけるよ
うな特異的核酸の検出のためにそれらを開発する試みを
もたらしてきた。鎖置換増幅（ＳＤＡ；G.T.ウォーカー
（Walker）ら，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-3
96；G.T.ウォーカーら，1992.Nuc.Acids.Res.20,1961-1
696；米国特許第5,455,166号；米国特許第5,270,184
号；欧州特許第0684315号）などの方法は、一定温度で
行われる等温反応である。
【０００３】初期に開発されたＳＤＡ反応（「従来のＳ
ＤＡ」）は、約３７℃〜４２℃の一定温度で行われたが
（米国特許第5,455,166号）、それは、そのＤＮＡポリ
メラーゼかまたは制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｈ
ｉｎｃＩＩ）、または両方が、この範囲より高い温度で
熱不安定性（温度感受性）である好中温性酵素であるた
めであった。したがって、増幅を作動させる酵素は、反
応温度が約４２℃を越えて増加するにつれて失活する。
後に、従来のＳＤＡよりも高い温度で行うことができる
ＳＤＡ法（約５０℃〜７０℃、「好熱性ＳＤＡ」）が開
発された。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、公開欧州特許
出願第0684315号で記載されており、（１）より高温で
半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位にニック
を入れる好熱性制限エンドヌクレアーゼおよび（２）そ
の制限エンドヌクレアーゼと同様の温度範囲でニックか
ら伸長し且つ下流鎖を置換する好熱性ポリメラーゼを用
いる。ｔＳＤＡの増加した温度において、その増幅反応
には、向上した特異性、向上した有効性および、しばし
ば向上した増幅生成物収率をもたらす減少した非特異的
バックグラウンド増幅がある。更に、二本鎖標的の最初
の熱変性後の分離工程において酵素を加える必要性は、
その変性温度で安定である酵素を用いる場合になくなり
うる。そのＳＤＡ反応での標的特異的アンプリコンのＵ
ＤＧ汚染除去もまた、非特異的バックグラウンドアンプ
リコンの量が減少する場合に一層有効である。
ＤＡ」）は、約３７℃〜４２℃の一定温度で行われたが
（米国特許第5,455,166号）、それは、そのＤＮＡポリ
メラーゼかまたは制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｈ
ｉｎｃＩＩ）、または両方が、この範囲より高い温度で
熱不安定性（温度感受性）である好中温性酵素であるた
めであった。したがって、増幅を作動させる酵素は、反
応温度が約４２℃を越えて増加するにつれて失活する。
後に、従来のＳＤＡよりも高い温度で行うことができる
ＳＤＡ法（約５０℃〜７０℃、「好熱性ＳＤＡ」）が開
発された。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、公開欧州特許
出願第0684315号で記載されており、（１）より高温で
半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位にニック
を入れる好熱性制限エンドヌクレアーゼおよび（２）そ
の制限エンドヌクレアーゼと同様の温度範囲でニックか
ら伸長し且つ下流鎖を置換する好熱性ポリメラーゼを用
いる。ｔＳＤＡの増加した温度において、その増幅反応
には、向上した特異性、向上した有効性および、しばし
ば向上した増幅生成物収率をもたらす減少した非特異的
バックグラウンド増幅がある。更に、二本鎖標的の最初
の熱変性後の分離工程において酵素を加える必要性は、
その変性温度で安定である酵素を用いる場合になくなり
うる。そのＳＤＡ反応での標的特異的アンプリコンのＵ
ＤＧ汚染除去もまた、非特異的バックグラウンドアンプ
リコンの量が減少する場合に一層有効である。
【０００４】ＳＤＡ反応は、米国特許第5,455,166号、
米国特許第5,270,184号および欧州特許第0684315号で記
載されている。ＳＤＡ反応の工程は、用いられる温度お
よび酵素に関係なく同様であり、そしてそれは、標的配
列をうまく増幅させるためにいくつかの特異的酵素活性
を必要とする。更に、ＳＤＡは、制限エンドヌクレアー
ゼによるニッキングおよびポリメラーゼによる重合／鎖
置換が、同じ温度範囲内で同時に起こることを必要とす
る。２種類の酵素は、同じＳＤＡ反応配合物中で両方が
効率よく機能するために、互いにおよびＳＤＡと適合し
うるこれらの活性のための温度および反応要件を有する
必要がある。ＳＤＡポリメラーゼは、（１）自然のまま
でかまたは失活によって５′−３′エキソヌクレアーゼ
活性を欠いている、（２）ＳＤＡで必要な誘導体ヌクレ
オチドを包含する（αチオ−ｄＮＴＰまたは他の修飾ｄ
ＮＴＰなどのヌクレオチド類似体）、（３）一本鎖ニッ
クで開始する二本鎖分子から下流の一本鎖を置換する、
そして好ましくは、（４）アンプリコン汚染除去を可能
にするようにｄＵＴＰを包含する必要がある。好熱性Ｓ
ＤＡの温度で適当な生物学的活性を有する好熱性ポリメ
ラーゼの例は、欧州特許第0684315号で記載されてい
る。
米国特許第5,270,184号および欧州特許第0684315号で記
載されている。ＳＤＡ反応の工程は、用いられる温度お
よび酵素に関係なく同様であり、そしてそれは、標的配
列をうまく増幅させるためにいくつかの特異的酵素活性
を必要とする。更に、ＳＤＡは、制限エンドヌクレアー
ゼによるニッキングおよびポリメラーゼによる重合／鎖
置換が、同じ温度範囲内で同時に起こることを必要とす
る。２種類の酵素は、同じＳＤＡ反応配合物中で両方が
効率よく機能するために、互いにおよびＳＤＡと適合し
うるこれらの活性のための温度および反応要件を有する
必要がある。ＳＤＡポリメラーゼは、（１）自然のまま
でかまたは失活によって５′−３′エキソヌクレアーゼ
活性を欠いている、（２）ＳＤＡで必要な誘導体ヌクレ
オチドを包含する（αチオ−ｄＮＴＰまたは他の修飾ｄ
ＮＴＰなどのヌクレオチド類似体）、（３）一本鎖ニッ
クで開始する二本鎖分子から下流の一本鎖を置換する、
そして好ましくは、（４）アンプリコン汚染除去を可能
にするようにｄＵＴＰを包含する必要がある。好熱性Ｓ
ＤＡの温度で適当な生物学的活性を有する好熱性ポリメ
ラーゼの例は、欧州特許第0684315号で記載されてい
る。
【０００５】ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼは、（１）
その認識／切断部位が半修飾される場合に、その二本鎖
認識／切断部位にニックを入れる（すなわち、その一本
鎖を切断する）、（２）その認識／切断部位から分離し
て、ポリメラーゼが標的を結合し且つ増幅することを可
能にする、そして好ましくは、（３）その認識／切断部
位に中に包含されたｄＵＴＰによって影響されない必要
がある。制限エンドヌクレアーゼは、ポリメラーゼの必
要な活性の発現に適合する温度および反応条件下におい
てこれらの活性を示す必要がある。
その認識／切断部位が半修飾される場合に、その二本鎖
認識／切断部位にニックを入れる（すなわち、その一本
鎖を切断する）、（２）その認識／切断部位から分離し
て、ポリメラーゼが標的を結合し且つ増幅することを可
能にする、そして好ましくは、（３）その認識／切断部
位に中に包含されたｄＵＴＰによって影響されない必要
がある。制限エンドヌクレアーゼは、ポリメラーゼの必
要な活性の発現に適合する温度および反応条件下におい
てこれらの活性を示す必要がある。
【０００６】ＳＤＡによる増幅に関する用語は、欧州特
許第0684315号で記載されている。
許第0684315号で記載されている。
【０００７】ＡｖａＩは、配列
【化１】 を認識し且つ切断する、アナベナ・バリアビリス（Anab
aena variabilis）に由来する制限エンドヌクレアーゼ
である。ＡｖａＩの多数のアイソシゾマーもまた知られ
ており、ＢｓｏＢＩ、ＡｑｕＩ、ＢｃｏＩ、Ｅｃｏ８８
Ｉ、ＮｓｐＩＩＩ、Ａｍａ８７Ｉ、ＡｃｒＩ、ＡｓｐＢ
Ｉ、ＡｓｐＣＩ、ＡｓｐＤＩ、ＡｖｒＩ、Ｂｓｅｌ５
Ｔ、Ｂｓｔ７ＱＩ、ＢｓｔＳＩ、ＢｓｔＺ４Ｉ、Ｅｃｏ
２７ｋＩ、ＥｓｐＨＫ２９Ｉ、Ｎｌｉ３８７／７Ｉ、Ｎ
ｌｉＩ、ＮｍｕＡＩ、ＮｓｐＤＩ、ＮｓｐＥＩ、Ｎｓｐ
ＩＩＩ、ＮｓｐＳＡＩ、Ｕｂａｌ２０５ＩＩ、Ｕｂａｌ
４６３Ｉ、Ｕｂａｌ４４０ＩおよびＵｍｉ５Ｉが含まれ
る。ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、Ａｍａ８７Ｉ、ＢｃｏＩお
よびＥｃｏ８８Ｉは商業的に入手可能である。ＢｓｏＢ
Ｉは、好熱性細菌バチルス・ステアロサーモフィルス
（Bacillus stearothermophilus）に由来し、好熱性Ｓ
ＤＡ反応において一般的に用いられる好熱性制限エンド
ヌクレアーゼの一つである。ＡｖａＩと同様に、Ａｓｐ
ＢＩ、ＡｓｐＣＩ、ＡｓｐＤＩおよびＡｖｒＩはアナベ
ナ属種に由来する。Ｂ．ステアロサーモフィルスとは対
照的に、アナベナ属は好中温性微生物であり、そしてＡ
ｖａＩ活性について当該技術分野で認識された温度範囲
もまた好中温である。ＡｖａＩは、この群において最も
よく特徴付けられたアナベナ属制限エンドヌクレアーゼ
である。ＡｖａＩの認識部位のその二本鎖切断に提示さ
れた温度は約３７℃であるが、ＡｖａＩの二本鎖切断活
性は４５℃で増加することが報告されている（ライフ・
テクノロジーズ（Life Technologies），ゲイサーズバ
ーグ，ＭＤ，1993-1994 Catalogue and Reference Guid
e,6-10頁；ストラタジーン（Stratagene），ラホヤ，Ｃ
Ａ，1995 Catalog,211頁）。更に、最大二本鎖切断活性
は約５０℃で見られ、６０℃を越えると急速に失活する
ことが報告されている（ポール（Pohl）ら，1982.Eur.
J.Biochem.123,141-152）。したがって、一般的には、
ＤＮＡのＡｖａＩ切断に有用な温度範囲は約５０℃を越
えないということが認められてきた（ポールら，上
記）。約５０℃を越えると、酵素は低下した活性を示
し、遂には失活すると予想されるであろう。従来、Ａｖ
ａＩは、従来のＳＤＡで有用である制限エンドヌクレア
ーゼとして確認されており（米国特許第5,455,166号お
よび米国特許第5,270,184号）、すなわち、それは、従
来のＳＤＡのより低い温度範囲でその半修飾された制限
エンドヌクレアーゼ認識部位にニックを入れる。本発明
より以前には、ＡｖａＩが従来のＳＤＡの温度より高い
温度でＳＤＡに必要な活性を示すか否かは知られていな
かったが、二本鎖切断のためのその認められた有用な温
度範囲に基づいて、一般的には、どの種類のＡｖａＩ活
性も、好熱性ＳＤＡの温度範囲で低下するかまたは存在
しないであろうと考えられる。ＡｖａＩは、近縁の属で
あるアナベノプシス属（アナベノプシス・サークラリス
（Anabaenopsis circularis））に由来し、それもまた
好中温性微生物である。
aena variabilis）に由来する制限エンドヌクレアーゼ
である。ＡｖａＩの多数のアイソシゾマーもまた知られ
ており、ＢｓｏＢＩ、ＡｑｕＩ、ＢｃｏＩ、Ｅｃｏ８８
Ｉ、ＮｓｐＩＩＩ、Ａｍａ８７Ｉ、ＡｃｒＩ、ＡｓｐＢ
Ｉ、ＡｓｐＣＩ、ＡｓｐＤＩ、ＡｖｒＩ、Ｂｓｅｌ５
Ｔ、Ｂｓｔ７ＱＩ、ＢｓｔＳＩ、ＢｓｔＺ４Ｉ、Ｅｃｏ
２７ｋＩ、ＥｓｐＨＫ２９Ｉ、Ｎｌｉ３８７／７Ｉ、Ｎ
ｌｉＩ、ＮｍｕＡＩ、ＮｓｐＤＩ、ＮｓｐＥＩ、Ｎｓｐ
ＩＩＩ、ＮｓｐＳＡＩ、Ｕｂａｌ２０５ＩＩ、Ｕｂａｌ
４６３Ｉ、Ｕｂａｌ４４０ＩおよびＵｍｉ５Ｉが含まれ
る。ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、Ａｍａ８７Ｉ、ＢｃｏＩお
よびＥｃｏ８８Ｉは商業的に入手可能である。ＢｓｏＢ
Ｉは、好熱性細菌バチルス・ステアロサーモフィルス
（Bacillus stearothermophilus）に由来し、好熱性Ｓ
ＤＡ反応において一般的に用いられる好熱性制限エンド
ヌクレアーゼの一つである。ＡｖａＩと同様に、Ａｓｐ
ＢＩ、ＡｓｐＣＩ、ＡｓｐＤＩおよびＡｖｒＩはアナベ
ナ属種に由来する。Ｂ．ステアロサーモフィルスとは対
照的に、アナベナ属は好中温性微生物であり、そしてＡ
ｖａＩ活性について当該技術分野で認識された温度範囲
もまた好中温である。ＡｖａＩは、この群において最も
よく特徴付けられたアナベナ属制限エンドヌクレアーゼ
である。ＡｖａＩの認識部位のその二本鎖切断に提示さ
れた温度は約３７℃であるが、ＡｖａＩの二本鎖切断活
性は４５℃で増加することが報告されている（ライフ・
テクノロジーズ（Life Technologies），ゲイサーズバ
ーグ，ＭＤ，1993-1994 Catalogue and Reference Guid
e,6-10頁；ストラタジーン（Stratagene），ラホヤ，Ｃ
Ａ，1995 Catalog,211頁）。更に、最大二本鎖切断活性
は約５０℃で見られ、６０℃を越えると急速に失活する
ことが報告されている（ポール（Pohl）ら，1982.Eur.
J.Biochem.123,141-152）。したがって、一般的には、
ＤＮＡのＡｖａＩ切断に有用な温度範囲は約５０℃を越
えないということが認められてきた（ポールら，上
記）。約５０℃を越えると、酵素は低下した活性を示
し、遂には失活すると予想されるであろう。従来、Ａｖ
ａＩは、従来のＳＤＡで有用である制限エンドヌクレア
ーゼとして確認されており（米国特許第5,455,166号お
よび米国特許第5,270,184号）、すなわち、それは、従
来のＳＤＡのより低い温度範囲でその半修飾された制限
エンドヌクレアーゼ認識部位にニックを入れる。本発明
より以前には、ＡｖａＩが従来のＳＤＡの温度より高い
温度でＳＤＡに必要な活性を示すか否かは知られていな
かったが、二本鎖切断のためのその認められた有用な温
度範囲に基づいて、一般的には、どの種類のＡｖａＩ活
性も、好熱性ＳＤＡの温度範囲で低下するかまたは存在
しないであろうと考えられる。ＡｖａＩは、近縁の属で
あるアナベノプシス属（アナベノプシス・サークラリス
（Anabaenopsis circularis））に由来し、それもまた
好中温性微生物である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ここで意外にも、アナ
ベナ属種またはアナベノプシス属種に由来するＡｖａＩ
およびそのアイソシゾマーは、好熱性ＳＤＡに適合する
温度で、ＳＤＡに必要な活性を示し且つ増幅効率を増大
させることが判った。これらの反応温度は、これらの酵
素に最適な従来認められた温度より高く且つ先行技術か
ら低下した酵素活性が予測される範囲である。ＳＤＡに
おいてＡｖａＩに最適な温度範囲は約４７〜５７℃であ
ることが判っており、最大増幅は約５０〜５５℃で起こ
る。
ベナ属種またはアナベノプシス属種に由来するＡｖａＩ
およびそのアイソシゾマーは、好熱性ＳＤＡに適合する
温度で、ＳＤＡに必要な活性を示し且つ増幅効率を増大
させることが判った。これらの反応温度は、これらの酵
素に最適な従来認められた温度より高く且つ先行技術か
ら低下した酵素活性が予測される範囲である。ＳＤＡに
おいてＡｖａＩに最適な温度範囲は約４７〜５７℃であ
ることが判っており、最大増幅は約５０〜５５℃で起こ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ＡｖａＩを、好熱性ＳＤ
Ａ（ｔＳＤＡ）で試験して、この制限エンドヌクレアー
ゼが、二本鎖切断に最適と認められた温度より高い温度
でニッキング活性を示すか否かを確認し且つｔＳＤＡ反
応におけるその有用性を評価した。ＡｖａＩは、従来、
この酵素に最適な当該技術分野で認められた温度に相当
する従来のＳＤＡのより低い温度で必要なニッキング活
性を示すことが示された。ＡｖａＩは約５０℃より高い
温度で急速に失活すると考えられたが、ＡｖａＩが制限
エンドヌクレアーゼである場合、意外にも、ＳＤＡ反応
の効率は約４７℃〜５７℃で増加することが判った。
Ａ（ｔＳＤＡ）で試験して、この制限エンドヌクレアー
ゼが、二本鎖切断に最適と認められた温度より高い温度
でニッキング活性を示すか否かを確認し且つｔＳＤＡ反
応におけるその有用性を評価した。ＡｖａＩは、従来、
この酵素に最適な当該技術分野で認められた温度に相当
する従来のＳＤＡのより低い温度で必要なニッキング活
性を示すことが示された。ＡｖａＩは約５０℃より高い
温度で急速に失活すると考えられたが、ＡｖａＩが制限
エンドヌクレアーゼである場合、意外にも、ＳＤＡ反応
の効率は約４７℃〜５７℃で増加することが判った。
【００１０】ｔＳＤＡ反応は、本質的には欧州特許第06
84315号で記載のように、ＡｖａＩを制限エンドヌクレ
アーゼとして置換えて行われた。従来のＳＤＡ反応は、
本質的には米国特許第5,455,166号および米国特許第5,2
70,184号で記載のように行われた。ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されたプライマーカセット
配列を含むｐＵＣ１９ベクターは、標的配列を提供し
た。プライマーカセットは、以下の増幅およびバンパー
プライマー：
84315号で記載のように、ＡｖａＩを制限エンドヌクレ
アーゼとして置換えて行われた。従来のＳＤＡ反応は、
本質的には米国特許第5,455,166号および米国特許第5,2
70,184号で記載のように行われた。ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されたプライマーカセット
配列を含むｐＵＣ１９ベクターは、標的配列を提供し
た。プライマーカセットは、以下の増幅およびバンパー
プライマー：
【化２】 のハイブリダイゼーションのための配列を含んでいた。
ｐＵＤ１９ベクター中のプライマー結合部位間の標的部
分の増幅は、７０塩基対アンプリコンを生じた。Ｅｃｏ
ＲＩで線状化されたベクターの標的配列（１０3分子／
反応）を、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５ｍＭリン酸
カリウム、１．４ｍＭ α−チオｄＣＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧ
ＴＰ、各０．５μＭ増幅プライマー、各０．０５μＭバ
ンパープライマー、１０％グリセロール、５ｍＭ酢酸マ
グネシウム、５００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ，１５０単位Ａ
ｖａＩおよび１８単位 exo-Ｂｓｔポリメラーゼまたは
５０単位 exo-クレノウ中で増幅させた。exo-クレノウ
は、より低温反応（３７℃および４０℃）で用いられた
ポリメラーゼであり且つＢｓｔはより高温（４５〜６０
℃）で用いられたポリメラーゼであった。対照反応は標
的ＤＮＡを含まなかった。酵素以外の全成分を含有する
反応を３分間沸騰させ、そして増幅に選択された温度
（３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５２．５℃、５５
℃または６０℃）で加熱ブロックに移し、そこでそれら
を４分間平衡させた。酵素を加え、そして増幅反応を３
０分間進行させた。反応を５分間沸騰させることによっ
て停止した。増幅生成物は、本質的にはウォーカーら
（1992.PNAS，上記）によって記載のように、32Ｐ標識
プローブの３７℃でのハイブリダイゼーションおよび伸
長による各反応の５μｌアリコート中で検出された。プ
ローブ伸長生成物は、８％変性ゲル上の電気泳動によっ
て可視化された。
ｐＵＤ１９ベクター中のプライマー結合部位間の標的部
分の増幅は、７０塩基対アンプリコンを生じた。Ｅｃｏ
ＲＩで線状化されたベクターの標的配列（１０3分子／
反応）を、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５ｍＭリン酸
カリウム、１．４ｍＭ α−チオｄＣＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧ
ＴＰ、各０．５μＭ増幅プライマー、各０．０５μＭバ
ンパープライマー、１０％グリセロール、５ｍＭ酢酸マ
グネシウム、５００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ，１５０単位Ａ
ｖａＩおよび１８単位 exo-Ｂｓｔポリメラーゼまたは
５０単位 exo-クレノウ中で増幅させた。exo-クレノウ
は、より低温反応（３７℃および４０℃）で用いられた
ポリメラーゼであり且つＢｓｔはより高温（４５〜６０
℃）で用いられたポリメラーゼであった。対照反応は標
的ＤＮＡを含まなかった。酵素以外の全成分を含有する
反応を３分間沸騰させ、そして増幅に選択された温度
（３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５２．５℃、５５
℃または６０℃）で加熱ブロックに移し、そこでそれら
を４分間平衡させた。酵素を加え、そして増幅反応を３
０分間進行させた。反応を５分間沸騰させることによっ
て停止した。増幅生成物は、本質的にはウォーカーら
（1992.PNAS，上記）によって記載のように、32Ｐ標識
プローブの３７℃でのハイブリダイゼーションおよび伸
長による各反応の５μｌアリコート中で検出された。プ
ローブ伸長生成物は、８％変性ゲル上の電気泳動によっ
て可視化された。
【００１１】結果を下記の表で示し且つ図１においてグ
ラフで示す。
ラフで示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】増幅は、約４５℃〜６０℃で見られ、約５
０〜５５℃で最大効率であった。５５℃〜６０℃におい
て増幅効率の急速な低下があったが、しかしながら、こ
れらの結果は、高性能の増幅が５５℃より僅かに高い温
度まで（おそらくは約５７℃まで）および５０℃より僅
かに低い（おそらくは約４７℃程度に低い）温度まで広
がることを示唆する。したがって、ＡｖａＩを用いる増
幅に好ましい温度範囲は、約４７〜５７℃であると推定
される。
０〜５５℃で最大効率であった。５５℃〜６０℃におい
て増幅効率の急速な低下があったが、しかしながら、こ
れらの結果は、高性能の増幅が５５℃より僅かに高い温
度まで（おそらくは約５７℃まで）および５０℃より僅
かに低い（おそらくは約４７℃程度に低い）温度まで広
がることを示唆する。したがって、ＡｖａＩを用いる増
幅に好ましい温度範囲は、約４７〜５７℃であると推定
される。
【００１４】４０℃または３７℃で行われた増幅反応に
ついて、ゲル上で可視化された増幅生成物はなかった。
従来のＳＤＡのより低い温度で増幅ははるかに遅いの
で、これは、おそらくは３０分間の反応時間の結果であ
ると考えられる。従来のＳＤＡ反応は、典型的に、２時
間進行させる。従来のＳＤＡ温度での３０分間は、特
に、増幅反応の指数性を考えると、おそらくは、ゲル電
気泳動および短時間のオートラジオグラフィーによって
検出しうる量の増幅生成物を生じるのに不十分である。
ついて、ゲル上で可視化された増幅生成物はなかった。
従来のＳＤＡのより低い温度で増幅ははるかに遅いの
で、これは、おそらくは３０分間の反応時間の結果であ
ると考えられる。従来のＳＤＡ反応は、典型的に、２時
間進行させる。従来のＳＤＡ温度での３０分間は、特
に、増幅反応の指数性を考えると、おそらくは、ゲル電
気泳動および短時間のオートラジオグラフィーによって
検出しうる量の増幅生成物を生じるのに不十分である。
【００１５】本発明は、配列：
【化３】 を認識し且つ切断する好中温性制限エンドヌクレアーゼ
（アナベナ属種およびアナベノプシス属種に由来するＡ
ｖａＩおよびそのアイソシゾマー）が、それらの認めら
れた温度安定性ゆえに、これらの反応に典型的に選択さ
れる好熱性制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｏＢ
Ｉ）とほぼ同等の増幅効率であるならば、高性能ｔＳＤ
Ａを支持するという知見に基づいている。ＡｖａＩは、
ＢｓｏＢＩよりも容易に入手可能であり且つあまり高価
でないという利点を有し、そしてｔＳＤＡにおいてＢｓ
ｏＢＩの代わりにそれを代用することは、ＢｓｏＢＩ系
のために従来開発された増幅プライマーの再設計を必要
としない（すなわち、酵素認識部位は同じである）。こ
の制限エンドヌクレアーゼがｔＳＤＡの温度で極めて効
率よく働くという知見は、実験者が、ＢｓｏＢＩのよう
なあまり一般的に用いられない酵素の増加費用を負担す
ることなく、ｔＳＤＡの向上した性能を利用することを
可能にする。アナベナ・バリアビリスに由来する（例え
ば、ＡｖｒＩ）、アナベナ属の種に由来する（例えば、
ＡｓｐＢＩ、ＡｓｐＣＩおよびＡｓｐＤＩ）、および近
縁の属のアナベノプシス属種に由来する（例えば、Ａｃ
ｒＩ）ＡｖａＩのアイソシゾマーは、ｔＳＤＡに関して
同様の性質を有すると予想されるであろう。それが商業
的に入手できない場合、選択されたアイソシゾマーは、
M.G.C.デュヴェステイン（Duyvesteyn）ら（1983.Arch.
Microbiol.134,276-281）によって記載のように、微生
物から単離することができる。ｔＳＤＡ反応で用いられ
る選択された制限エンドヌクレアーゼの量は臨界的では
ないし、増幅される特定の標的も、選択されたプライマ
ーも臨界的ではない。当業者は、ＳＤＡについて文献に
記載されたように所望の結果を得るために、これらのパ
ラメーター並びに時間、温度および反応体濃度を常套手
段によって調整することができる。前述の実施例は、本
発明の一つの実施態様を単に例証するために与えられて
おり、請求の範囲で規定された発明の範囲を制限すると
解釈されるべきではない。
（アナベナ属種およびアナベノプシス属種に由来するＡ
ｖａＩおよびそのアイソシゾマー）が、それらの認めら
れた温度安定性ゆえに、これらの反応に典型的に選択さ
れる好熱性制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｏＢ
Ｉ）とほぼ同等の増幅効率であるならば、高性能ｔＳＤ
Ａを支持するという知見に基づいている。ＡｖａＩは、
ＢｓｏＢＩよりも容易に入手可能であり且つあまり高価
でないという利点を有し、そしてｔＳＤＡにおいてＢｓ
ｏＢＩの代わりにそれを代用することは、ＢｓｏＢＩ系
のために従来開発された増幅プライマーの再設計を必要
としない（すなわち、酵素認識部位は同じである）。こ
の制限エンドヌクレアーゼがｔＳＤＡの温度で極めて効
率よく働くという知見は、実験者が、ＢｓｏＢＩのよう
なあまり一般的に用いられない酵素の増加費用を負担す
ることなく、ｔＳＤＡの向上した性能を利用することを
可能にする。アナベナ・バリアビリスに由来する（例え
ば、ＡｖｒＩ）、アナベナ属の種に由来する（例えば、
ＡｓｐＢＩ、ＡｓｐＣＩおよびＡｓｐＤＩ）、および近
縁の属のアナベノプシス属種に由来する（例えば、Ａｃ
ｒＩ）ＡｖａＩのアイソシゾマーは、ｔＳＤＡに関して
同様の性質を有すると予想されるであろう。それが商業
的に入手できない場合、選択されたアイソシゾマーは、
M.G.C.デュヴェステイン（Duyvesteyn）ら（1983.Arch.
Microbiol.134,276-281）によって記載のように、微生
物から単離することができる。ｔＳＤＡ反応で用いられ
る選択された制限エンドヌクレアーゼの量は臨界的では
ないし、増幅される特定の標的も、選択されたプライマ
ーも臨界的ではない。当業者は、ＳＤＡについて文献に
記載されたように所望の結果を得るために、これらのパ
ラメーター並びに時間、温度および反応体濃度を常套手
段によって調整することができる。前述の実施例は、本
発明の一つの実施態様を単に例証するために与えられて
おり、請求の範囲で規定された発明の範囲を制限すると
解釈されるべきではない。
【００１６】
【００１７】(2) 配列情報 配列番号:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:1: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40
【００１８】(2) 配列情報 配列番号:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:2: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTGTACT GAGATCCCCT 40
【００１９】(2) 配列情報 配列番号:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:3: CGATCGAGCA AGCCA 15
【００２０】(2) 配列情報 配列番号:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:4: CGAGCCGCTC GCTGA 15
【図１】図１は、ＡｖａＩを用いるｔＳＤＡ反応におい
て種々の温度で得られた増幅因子を図示する。
て種々の温度で得られた増幅因子を図示する。
Claims (7)
- 【請求項１】 標的核酸配列を増幅する方法であって、
ＡｖａＩ、アナベナ属（Anabaena）に由来するＡｖａＩ
のアイソシゾマーおよびアナベノプシス属（Anabaenops
is）に由来するＡｖａＩのアイソシゾマーから成る群よ
り選択される制限エンドヌクレアーゼを含む鎖置換増幅
反応において標的核酸配列を約４５〜６０℃で増幅させ
ることを含む上記方法。 - 【請求項２】 制限エンドヌクレアーゼが、ＡｖａＩ、
ＡｓｐＢＩ、ＡｓｐＣＩ、ＡｓｐＤＩ、ＡｖｒＩおよび
ＡｃｒＩから成る群より選択される請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 標的核酸配列を約４７〜５７℃で増幅さ
せる請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 標的核酸配列を約５０〜５５℃で増幅さ
せる請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 標的核酸配列を約３０分間増幅させる請
求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 増幅された標的核酸配列を検出すること
を更に含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 増幅された標的核酸配列を、標識された
オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション
によって検出する請求項６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66599696A | 1996-07-17 | 1996-07-17 | |
| US665996 | 1996-07-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084979A true JPH1084979A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=24672390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9191129A Pending JPH1084979A (ja) | 1996-07-17 | 1997-07-16 | ＡｖａＩを用いる好熱性鎖置換増幅 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0819768A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1084979A (ja) |
| AU (1) | AU2849197A (ja) |
| BR (1) | BR9704016A (ja) |
| CA (1) | CA2210608A1 (ja) |
| SG (1) | SG88731A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003008642A2 (en) | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Amplification of nucleic acid fragments using nicking agents |
| WO2003008624A2 (en) | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Nucleic acid amplification using nicking agents |
| US7314714B2 (en) | 2003-12-19 | 2008-01-01 | Affymetrix, Inc. | Method of oligonucleotide synthesis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5648211A (en) * | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
-
1997
- 1997-07-04 AU AU28491/97A patent/AU2849197A/en not_active Abandoned
- 1997-07-07 SG SG9702377A patent/SG88731A1/en unknown
- 1997-07-15 EP EP97112013A patent/EP0819768A3/en not_active Withdrawn
- 1997-07-16 CA CA 2210608 patent/CA2210608A1/en not_active Withdrawn
- 1997-07-16 JP JP9191129A patent/JPH1084979A/ja active Pending
- 1997-07-17 BR BR9704016A patent/BR9704016A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2849197A (en) | 1998-01-29 |
| BR9704016A (pt) | 1998-09-15 |
| EP0819768A3 (en) | 1999-02-24 |
| SG88731A1 (en) | 2002-05-21 |
| EP0819768A2 (en) | 1998-01-21 |
| CA2210608A1 (en) | 1998-01-17 |
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