JP3140937B2 - 好熱酵素を用いる鎖置換増幅法 - Google Patents

好熱酵素を用いる鎖置換増幅法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸標的配列の増幅法、
特に核酸標的配列の増幅のための等温法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】インビトロ核酸増幅技術は少量の核酸を
検出および分析するための有力な道具を提供した。それ
らの方法の著しい感度により、感染症および遺伝病の検
出、分析のための遺伝子の単離、ならびに法医学におけ
る特定の核酸の検出のためにそれらを発展させる試みが
なされた。核酸増幅技術はその方法の温度要件に従って
分類することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ；サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）ら．１９８５．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）、リガーゼ
連鎖反応（ＬＣＲ；ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）ら．１９８
９．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，５６０−５６９；バリンガー
（Ｋ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ）ら．１９９０．Ｇｅｎｅ
８９，１１７−１２２；；バラニー（Ｆ．Ｂａｒａｎ
ｙ）ら．１９９１．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８８，１８９−１９３）、転写に基づく増
幅（クー（Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ）ら．１９８９．Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３
−１１７７）、および制限増幅（米国特許第５，１０
２，７８４号明細書）は温度循環を必要とする。これに
対し鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；ウォー
カー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら．１９９２．Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２−
３９６およびウォーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら．
１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，１６９
１−１６９６、ならびに欧州特許第０ ４９７ ２７２
号明細書；３者すべての記載を本明細書に参考として引
用する）、自己持続型配列複製（３ＳＲ；グアテリ
（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら．１９９０．Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４
−１８７８）、およびＱβレプリカーゼ系（リザルディ
（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら．１９８８．ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２）などの方
法は等温反応である。さらに国際特許出願公開９０／１
００６４および９０／０３５７３号明細書には、核酸の
等温複製のためにバクテリオファージｐｈｉ２９複製起
点を用いることが記載されている。国際特許出願公開９
２／０５２８７号明細書には配列特異的オリゴヌクレオ
チドの等温製造法が記載され、その場合１本の鎖におけ
る修飾によって切断試薬が対向鎖を選択的に開裂するこ
とが可能となる。一本鎖状の相補的オリゴヌクレオチド
が放出され、さらに相補的オリゴヌクレオチドの再重合
が可能となる。等温増幅は、ＰＣＲなどの増幅反応に特
徴的な高温と低温の間での循環に対比して、一定の温度
で行われる。
【０００３】通常のＳＤＡ反応は約３７−４２℃の一定
の温度で行われる。これはｅｘｏ-クレノウＤＮＡポリ
メラーゼ、特に制限エンドヌクレアーゼ（たとえばＨｉ
ｎｃＩＩ）が熱不安定性（温度感受性）だからである。
従って増幅を駆動する酵素は反応温度が上昇するのに伴
って失活する。しかし従来可能であったものより高い温
度で等温増幅反応、たとえばＳＤＡを実施し得たとすれ
ば、幾つかの利点があるであろう。高い温度での増幅
は、増幅プライマーと鋳型ＤＮＡとの、よりストリンジ
ェントなアニーリングを可能にし、これにより増幅法の
特異性を向上させる。このように向上した増幅特異性の
結果として、バックグラウンド反応も減少するであろ
う。ＳＤＡの場合、重大なバックグラウンド反応源は増
幅プライマーが互いに相互作用した際に生成する短い
“プライマー二量体”である。プライマー二量体の形成
は、目的とする標的配列の特異的増幅の効率を著しく損
なう可能性がある。このようなプライマー二量体の形成
は、温度が低いほど起こりやすい。反応のストリンジェ
ンシーが低下するため、相同性が限定された配列間での
一過性ハイブリダイゼーションが増大する可能性がある
からである。高い温度でＳＤＡを実施しうるほど、潜在
的にプライマー二量体の相互作用が減少し、バックグラ
ウンドが減少し、特異的な標的増幅の効率が向上する。
さらに、高い温度で増幅させるほど、ポリメラーゼによ
る鎖置換を促進しうる。鎖置換活性の向上は標的増幅の
効率を高め、その結果増幅生成物の収率を高めるであろ
う。十分に熱安定性である酵素を使用すると、ＳＤＡ反
応に必要なすべての試薬を最初の熱変性工程の前に添加
することも可能になる。通常のＳＤＡでは、二本鎖状の
標的配列が加熱により変性されたのちに酵素を反応混合
物に添加する必要がある。
【０００４】ｄＵＴＰをＳＤＡにより増幅された標的Ｄ
ＮＡ中に取り込ませることができる。これによって、先
行する増幅からのアンプリコン（その後の増幅反応に混
入する可能性がある）をウラシルＤＮＡグリコシダーゼ
（ＵＤＧ）で処理することにより増幅不可能にすること
ができる。この脱混入（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏ
ｎ）法自体は、ＳＤＡ反応においてアンプリコンが生成
した温度に関係なく使用しうる。しかし低い温度（すな
わち３７−４２℃）で生成したＳＤＡ増幅生成物は、高
い水準の非特異的バックグラウンド生成物を含有する可
能性がある。大量のバックグラウンドアンプリコンの混
入は、混入する標的配列アンプリコンの除去を遅延また
は阻害し、従って脱混入処理の効率を低下させる可能性
がある。従ってより高い温度でＳＤＡを実施しうるなら
ば、生成する非特異的バックグラウンドアンプリコンの
量が抑制されることによってＵＤＧ脱混入法の効率を高
めることができるであろう。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＳＤＡ反応は、標的配
列の増幅に成功するためには幾つかの極めて特異的な酵
素活性を必要とする。好熱性ポリメラーゼは文献に広く
報告されている。しかし他の核酸増幅系はＳＤＡの酵素
活性を組み合わせる必要がないので、本発明以前にはＳ
ＤＡに必要な生物学的活性に関連するものとしての好熱
酵素の活性および反応要件に関しては、ほとんど知られ
ていなかった。さらにＳＤＡは２種類の酵素（制限エン
ドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ）による同時活性を
必要とするので、適合性のあるこのような好熱酵素の対
が存在するか否かは本発明以前には知られていなかっ
た。すなわち好熱性ポリメラーゼおよび好熱性制限エン
ドヌクレアーゼの両方が要求される。これら２酵素は、
両方が同一のＳＤＡ反応混合物中で効率的に機能するた
めには互いに、およびＳＤＡと適合する温度条件および
反応条件（たとえば塩）の要件をもたなければならな
い。さらにポリメラーゼは、１）自然に、または失活に
より５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠如し、２）
ＳＤＡに必要な修飾ヌクレオチド（αチオ−ｄＮＴＰま
たは他の修飾ｄＮＴＰ）を取り込み、３）一本鎖ニック
に始まる下流の一本鎖を二本鎖分子から置換し、かつ好
ましくは４）アンプリコン脱混入を可能にするためにｄ
ＵＴＰを取り込まなければならない。ポリメラーゼは遊
離３′−ＯＨにｄＮＴＰを付加することにより鋳型上に
相補鎖を伸長させなければならない。ポリメラーゼは高
いプロセシビティーをもつことも好ましい。すなわちポ
リメラーゼは伸長生成物を解離および終止させる前に可
能な限り多数のヌクレオチドを付加し得なければならな
い。制限エンドヌクレアーゼは、１）それの二本鎖認識
／開裂部位を、その認識／開裂部位が半修飾された（ｈ
ｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）時点でニックし（すなわちそ
の一本鎖を開裂し）、２）ポリメラーゼが、標的に効率
的に結合し、そして増幅させうるのに十分なほど速やか
にその認識／開裂部位から解離し、かつ好ましくは３）
その認識／開裂部位に取り込まれたｄＵＴＰにより影響
を受けないものでなければならない。さらに制限エンド
ヌクレアーゼはこれらの活性を、ポリメラーゼと適合性
の温度および反応条件下で示さなければならない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、通常のＳＤＡ
より広い温度範囲で実施しうる等温鎖置換増幅法（３７
−７０℃、“好熱ＳＤＡ”）を提供する。好熱ＳＤＡに
好ましい温度範囲は５０−７０℃である。特定の好熱性
制限エンドヌクレアーゼがＳＤＡに要求される半修飾さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位をニック
し、次いでその部位から解離しうることが見出された。
さらに特定の好熱性ポリメラーゼはそのニックから伸長
させ、一方では下流の鎖を置換しうることが見出され
た。これらの知見から、従来可能であったものより高い
温度で実施しうることによって、向上した特異性および
効率、減少した非特異的バックグラウンド増幅、ならび
に潜在的に向上した増幅生成物収率を有するＳＤＡ法の
開発が可能になった。さらに、変性温度で安定な酵素を
用いる場合、二本鎖標的の初期の熱変性後に別個の工程
で酵素を添加する必要性が除かれた。非特異的バックグ
ラウンドアンプリコンの量が減少すると、ＳＤＡ反応に
おける標的特異性アンプリコンのＵＤＧ脱混入も、より
効率的に行われる。
【０００７】本明細書において用いる下記の用語および
句は下記のとおり定義される：増幅プライマーは、プラ
イマー伸長により標的配列を増幅するためのプライマー
である。ＳＤＡについては、増幅プライマーの３′末端
（標的結合配列）が標的配列の３′末端にハイブリダイ
ズする。ＳＤＡ増幅プライマーは、さらにその５′末端
付近に制限エンドヌクレアーゼに対する認識／開裂部位
を含む。制限エンドヌクレアーゼを効率的に結合させる
ために、認識／開裂部位の５′側にさらにヌクレオチド
が存在してもよい。認識／開裂部位は、ウォーカー（Ｗ
ａｌｋｅｒ）ら（１９９２．ＰＮＡＳ、前掲）に記載さ
れるように、認識／開裂部位が半修飾された場合にＤＮ
Ａ二重らせんの一方の鎖をニックする制限エンドヌクレ
アーゼに対するものである。半修飾された認識／開裂部
位は、制限エンドヌクレアーゼに対する二本鎖状の認識
／開裂部位であって、一方の鎖が少なくとも１個の誘導
ヌクレオチドを含むものであり、これは２本のうち１本
の鎖が制限エンドヌクレアーゼにより切断されるのを阻
止する。大部分の場合、半修飾された認識／開裂部位
の、誘導ヌクレオチドを最初に含まない鎖が制限エンド
ヌクレアーゼによりニックされる。ただし１回目のＳＤ
Ａサイクルののちには、ニックされた鎖の認識／開裂部
位の半分が誘導ヌクレオチドを含むが、これにより後続
のニッキングが阻止されることはない。通常のＳＤＡの
ための好ましい半修飾された認識／開裂部位は、制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、Ａｖａ
Ｉ、ＮｃｉＩ、およびＦｎｕ４ＨＩに対するヘミホスホ
ロチオエート化された認識／開裂部位である。増幅プラ
イマーは３′−ＯＨ基をも含み、これは増幅プライマー
の標的結合配列が標的配列にハイブリダイズした場合に
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうる。大部分のＳＤＡ
反応につき、増幅プライマーが標的配列の増幅に関与す
る。
【０００８】伸長生成物は、プライマー（またはプライ
マーの一部）、およびプライマー結合部位の下流の標的
配列の相補体である新たに合成された鎖からなる核酸で
ある。伸長生成物は、標的配列へのプライマーのハイブ
リダイゼーション、および標的配列を鋳型として用いる
ポリメラーゼによるプライマーの伸長によって得られ
る。
【０００９】バンパー（ｂｕｍｐｅｒ）プライマーまた
はエクスターナル（ｅｘｔｅｒｎａｌ）プライマーは、
増幅プライマーより上流で標的配列にアニールし、従っ
てバンパープライマーの伸長によって下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物が置換される。バンパープラ
イマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置換す
るための１方法であるが、加熱も適している。
【００１０】同一の配列は同じ相補的ヌクレオチド配列
にハイブリダイズする。実質的に同一の配列とは、それ
らが一部相補的な同じヌクレオチド配列に同様にハイブ
リダイズするのに十分なほどそれらのヌクレオチド配列
が類似するものである。
【００１１】標的または標的配列という語は、増幅すべ
き核酸配列を意味する。これらには増幅すべき元の核酸
配列、その相補的第２鎖、および増幅反応において生成
する、元の配列のいずれかのコピー鎖が包含される。標
的配列は、ハイブリダイズした増幅プライマーの伸長の
ための鋳型とも呼ぶことができる。
【００１２】増幅反応生成物、増幅生成物またはアンプ
リコンは、標的配列のコピーを含み、増幅プライマーの
ハイブリダイゼーションおよび伸長により生成する。こ
の語は、元の標的配列のコピーを含む一本鎖および二本
鎖両方の増幅プライマー伸長生成物を意味し、これには
増幅反応の中間体も包含される。
【００１３】鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、核酸増幅の等温
法であって、その場合プライマーの伸長、半修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位のニッキング、
一本鎖状の伸長生成物の置換、伸長生成物（または元の
標的配列）へのプライマーのアニーリング、および後続
のプライマー伸長が、反応混合物中で同時に起こる。こ
れは、反応の温度循環性の結果として反応の各段階が別
個の時期またはサイクルで起こるＰＣＲと対照的であ
る。ＳＤＡは、１）制限エンドヌクレアーゼがその二本
鎖状の認識／開裂部位のヘミホスホロチオエート形の非
修飾鎖をニックしうること、および２）特定のポリメラ
ーゼがニックにおいて複製を開始し、下流の非鋳型鎖を
置換しうることに基づく。プライマーのアニーリングの
ために二本鎖標的配列を変性する高い温度（約９５℃）
における最初のインキュベーションののち、後続の重合
および新たに合成された鎖の置換が一定の温度で行われ
る。標的配列の新たなコピーそれぞれの産生は下記の５
工程からなる：１）元の標的配列、または先に重合して
置換された一本鎖状の伸長生成物への増幅プライマーの
結合、２）α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート（αチオ ｄＮＴＰ）を取り込む、５′−３′エキ
ソヌクレアーゼ欠如ポリメラーゼによるプライマーの伸
長、３）半修飾された二本鎖制限部位のニッキング、
４）ニック部位からの制限酵素の解離、ならびに５）ニ
ックの３′末端からの５′−３′エキソヌクレアーゼ欠
如ポリメラーゼによる伸長、およびこれに伴う下流の新
たに合成された鎖の置換。ニックからの伸長により他の
ニック可能な制限部位が再形成されるので、ニッキン
グ、重合および置換が一定の温度で同時かつ連続的に起
こる。それぞれが二本鎖標的配列の２本の鎖のうち１本
にハイブリダイズする一対の増幅プライマーを用いる場
合、増幅は指数的である。これは、センス鎖およびアン
チセンス鎖が後続ラウンドの増幅に際して対向プライマ
ーの鋳型として作用するからである。単一の増幅プライ
マーを用いる場合、１本の鎖がプライマー伸長のための
鋳型として作用するにすぎないので、増幅は直線的であ
る。α−チオ ｄＮＴＰが取り込まれた場合に自身の二
本鎖状の認識／開裂部位をニックする制限エンドヌクレ
アーゼの例は、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、Ａｖａ
Ｉ、ＮｃｉＩ、およびＦｎｕ４ＨＩである。これらすべ
ての制限エンドヌクレアーゼ、および要求されるニッキ
ング活性を示す他のものが、通常のＳＤＡに用いるのに
は適している。しかしそれらは比較的、熱不安定性であ
り、約４０℃を越えると活性を失う。
【００１４】ＳＤＡによって増幅するための標的は、標
的配列を切断しないエンドヌクレアーゼで、より大型核
酸をフラグメント化することによって調製しうる。しか
し一般に、ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選ば
れる制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標
的核酸を、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２．
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、前掲、および米国特許
第５，２７０，１８４号明細書（本明細書に参考として
引用する）の記載に従って製造することが好ましい。簡
単に述べると、標的配列が二本鎖である場合、４つのプ
ライマーがそれにハイブリダイズする。２つのプライマ
ー（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、２
つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）はエクスターナルまた
はバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2は、標的配
列をフランキングする二本鎖核酸の対向鎖に結合する。
Ｂ1およびＢ2は、それぞれＳ1およびＳ2の５′側（すな
わち上流）の標的配列に結合する。次いでエキソヌクレ
アーゼ欠如ポリメラーゼを用いて、３種類のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートおよび少なくとも１種類の
修飾デオキシヌクレオシドトリホスフェート（たとえば
２′−デオキシアデノシン−５′−Ｏ−（１−チオトリ
ホスフェート）“ｄＡＴＰαＳ”）の存在下に、４つの
プライマーすべてを同時に伸長させる。これによりＳ1
およびＳ2の伸長生成物は、Ｂ1およびＢ2の伸長によっ
て元の標的配列鋳型から置換される。置換された増幅プ
ライマーの一本鎖伸長生成物は対向する増幅およびバン
パープライマーの結合の標的となり（たとえばＳ1の伸
長生成物はＳ2およびＢ2に結合する）、次の伸長および
置換のサイクルの結果、それぞれの末端に半修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を備えた２つの
二本鎖核酸フラグメントが得られる。これらはＳＤＡに
よる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様に、
標的生成反応の各段階は同時かつ連続的に起こり、ＳＤ
Ａにおける制限酵素によるニッキングに必要な認識／開
裂部位を末端に備えた標的配列が生成する。ＳＤＡ反応
のすべての成分が既に標的生成反応に存在するので、標
的配列は自動的に生成し、かつ連続的にＳＤＡサイクル
に入り、そして増幅される。
【００１５】あるＳＤＡ反応に他のＳＤＡ反応の増幅生
成物が交差混入するのを防止するために、増幅反応を阻
害することなくｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増
幅ＤＮＡ中へ取り込ませることができる。次いでこのウ
ラシル修飾された核酸をＵＤＧを用いる処理によって特
異的に認識し、不活性化することができる。従って先行
反応においてｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡ中へ取り込ま
れた場合、二本鎖標的の増幅前に後続ＳＤＡ反応物をＵ
ＤＧで処理すると、先に増幅された反応からのｄＵ含有
ＤＮＡはいずれも増幅不可能となるであろう。後続反応
において増幅されるべき標的ＤＮＡはｄＵを含有しない
ので、ＵＤＧ処理により影響されないであろう。次いで
標的増幅の前にＵＤＧをＵｇｉ処理により阻害すること
ができる。あるいはＵＤＧを熱失活させることができ
る。好熱ＳＤＡの場合、より高い反応温度自体（＞５０
℃）を、ＵＤＧの失活および標的の増幅に同時に利用す
ることができる。
【００１６】ＳＤＡは、５′−３′エキソヌクレアーゼ
活性を欠如するポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸中
の一本鎖ニックにおいて重合を開始し、ニックの下流の
鎖を置換し、一方ではニックされていない鎖を鋳型とし
て用いて新たな相補鎖を生成する。ポリメラーゼはヌク
レオチドを遊離３′−ＯＨに付加することにより伸長さ
せなければならない。ＳＤＡ反応を最適化するために
は、ポリメラーゼが高度にプロセシブであって、増幅可
能な標的配列の長さを最大限となしうることも望まし
い。高度にプロセシブなポリメラーゼは、伸長生成物の
解離および合成終止の前にかなりの長さの新たな鎖を重
合しうる。置換活性は増幅反応にとって必須である。こ
れによって、指数的増幅反応において標的が追加のコピ
ーの合成に利用され、一本鎖状の伸長生成物が生成し、
これに第２の増幅プライマーがハイブリダイズするのが
可能になるからである。ニッキング活性も極めて重要で
ある。反応を持続させ、後続ラウンドの標的増幅を開始
させうるのはニッキングだからである。
【００１７】ＳＤＡに適した温度における好熱性ポリメ
ラーゼの活性についてはこれまでほとんど知られていな
かったので、候補となる好熱性ポリメラーゼが存在する
場合にそれを同定するために、ポリメラーゼスクリーニ
ング系を開発した。このスクリーニング系は、ポリメラ
ーゼが二本鎖鋳型中の一本鎖ニックから始まる下流の鎖
を置換する効力を試験する伸長アッセイ法である。ポリ
メラーゼ置換活性の存在はＳＤＡにとって必須である。
しかし、他の点では適切な好熱性ポリメラーゼ中に５′
−３′エキソヌクレアーゼ活性が存在した場合、それを
当技術分野で知られているルーティン法により失活させ
ることができる（国際特許出願公開９２／０６２００号
明細書）。ポリメラーゼ中のエキソヌクレアーゼ活性を
選択的に失活させるための一般的方法の１つは、ポリメ
ラーゼに対する遺伝子をクローニングし、エキソヌクレ
アーゼ活性に関与する蛋白質ドメインをコードする部分
の遺伝子配列を同定し、それをインビトロ突然変異誘発
により不活性化するものである。あるいはエキソヌクレ
アーゼ活性は、ポリメラーゼをプロテアーゼで処理し
て、目的とする重合および置換活性のみを示すフラグメ
ントを単離することにより失活させることができる。従
って伸長アッセイにおいて同定された好熱性ポリメラー
ゼであって、適温で活性であり、ニックにおいて伸長を
開始し、修飾された、すなわち通常のものでないｄＮＴ
Ｐを取り込むが、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を
もつものは、好熱ＳＤＡに関する考察から除外されな
い。
【００１８】ポリメラーゼに関する伸長アッセイにおい
て、二本鎖核酸からの一本鎖の置換、およびニックにお
ける開始は、２種類のプライマーを両プライマーに相補
的な無傷の配列上に互いに隣接してアニールさせること
により企画することができる。これらのプライマーはそ
れらの５′末端において標識されている。ポリメラーゼ
が鎖置換活性をもち、隣接プライマーにより形成された
“ニック”において重合を開始することができ、かつ
５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠如する場合、両
プライマーが伸長され、２種類の伸長生成物が検出され
るであろう。ポリメラーゼが５′−３′エキソヌクレア
ーゼ活性を欠如するが、ニックにおいて伸長を開始する
ことができず（たとえばギャップを必要とする）、また
は置換活性をも欠如する場合、下流のプライマーの伸長
生成物のみが検出されるであろう。ニックにおいて開始
するが、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性をもつポリ
メラーゼは、上流プライマーの伸長生成物のみを生成す
るであろう。
【００１９】下記のポリメラーゼが本発明に用いるのに
必要な特性をすべて備えたものとして同定された：ｅｘ
ｏ-Ｖｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ
ズ）、ｅｘｏ-Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ニュー・イングラ
ンド・バイオラボズ）、Ｂｓｔ（バイオラド）、ｅｘｏ
-Ｐｆｕ（ストラタジーン）、Ｂｃａ（パンベラ）、お
よび配列決定用Ｔａｑ（プロメガ）。他は、以上の伸長
アッセイ法を利用して、発明的手腕を行使することなし
にルーティンに同定することができ、それらのポリメラ
ーゼすべてが好熱ＳＤＡに用いるのに適している。ポリ
メラーゼＴｔｈ（ベーリンガー）、Ｔｆｌ（エピセンタ
ー）、レプリナーゼ（ＲＥＰＬＩＮＡＳＥ、デュポ
ン）、およびレプリサーム（ＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭ、エ
ピセンター）はニックから鎖置換するが、５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性をも備えている。これらのポリメ
ラーゼは、たとえば遺伝子工学的方法でエキソヌクレア
ーゼ活性を除去したのちには本発明方法に有用である。
これまでに同定された大部分の好熱性ポリメラーゼは、
６５−７５℃で最適活性をもち、５０−６０℃で活性が
著しく低下する。しかし好熱性制限エンドヌクレアーゼ
の熱安定性は一般に６５℃未満に限定されているので、
低い温度で最適活性をもつ好熱性ポリメラーゼ（たとえ
ばＢｓｔおよびＢｃａ）ほど、この反応において好熱性
制限エンドヌクレアーゼとの適合性が高く、従って好ま
しい。
【００２０】制限エンドヌクレアーゼは、標的配列の効
果的な増幅が可能であるのに十分なほど速やかに認識／
開裂部位から解離し、ポリメラーゼを直ちにニックに結
合させ、伸長を開始し得なければならない。またＳＤＡ
に適した制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレ
アーゼに対する二本鎖状の半修飾された認識／開裂部位
のプライマー鎖のみを開裂しなければならない（“ニッ
キング”）。制限酵素は一般に二本鎖破断を生じるの
で、開裂部位の二重らせんにおける２本の鎖のうち１本
の開裂は選択的に阻止されなければならない。これは通
常は、合成に際してＤＮＡの一方の鎖中へヌクレオチド
類似体（たとえばデオキシヌクレオシドホスホロチオエ
ート）を導入し、従ってこの修飾された鎖がもはや開裂
を受けないことにより達成される。場合により、ヌクレ
オチド類似体の導入により非修飾鎖がもはや開裂を受け
ない結果となる可能性もある。非修飾鎖が開裂から保護
される場合は、ヌクレオチド類似体はニッキングを引き
起こすプライマーの合成に際して取り込ませてもよく、
これにより増幅反応にヌクレオチド類似体を添加する必
要性、およびポリメラーゼがそれらのヌクレオチド類似
体を取り込みうるという要件が除かれる。
【００２１】ただしヌクレオチド類似体置換はプライマ
ー鎖をすべての制限エンドヌクレアーゼから保護するわ
けではない。従って、利用しうる多数の好熱性制限エン
ドヌクレアーゼ中に適切な酵素が存在するとすれば、そ
れらの酵素を同定するために制限エンドヌクレアーゼの
ニッキング特性を評価する手段が必要である。従って二
本鎖状の制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位の一方
の鎖に取り込まれた修飾デオキシヌクレオチドが２本の
鎖のうち１本を保護しうることに基づいて、目的特性を
備えた好熱性制限エンドヌクレアーゼを同定するための
スクリーニング系が考案された。これは類似体誘導ニッ
キングアッセイ、または鎖保護アッセイと呼ばれる。
【００２２】アッセイに際しては、一本鎖鋳型および相
補的プライマーを合成する。次いでこの鋳型およびプラ
イマーを、好ましくは放射性標識で標識する。プライマ
ーおよび鋳型をハイブリダイズし、修飾されたｄＮＴＰ
をプライマーの伸長により取り込ませ、半修飾された制
限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を含む完全二本鎖
分子を産生させる。この生成物を開裂に適した条件下に
制限エンドヌクレアーゼで処理する。変性条件下での反
応生成物の電気泳動分析を利用して、認識／開裂部位が
ニックされたか、開裂したか、または切断されていない
かを、生成フラグメントの大きさにより判定する。認識
／開裂部位の２本の鎖のうちいずれ（すなわち修飾され
たもの、または修飾されていないもの）が開裂から保護
されたかということも、電気泳動におけるフラグメント
の大きさを利用して判定された。
【００２３】好熱ＳＤＡは本質的にはウォーカー（Ｗａ
ｌｋｅｒ）ら（１９９２．ＰＮＡＳおよびＮｕｃ．Ａｃ
ｉｄｓ．Ｒｅｓ．、前掲）が述べた通常のＳＤＡと同様
にして、ただし目的とする熱安定性ポリメラーゼおよび
熱安定性制限エンドヌクレアーゼに交換して実施され
る。もちろん反応温度は交換された酵素に適した、より
高い温度に調整され、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼ認識／開裂部位は選ばれた熱安定性エンドヌクレア
ーゼに適した制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位に
交換されるであろう。また専門家は、酵素が変性温度で
十分に安定である場合にはウォーカーらと異なり最初の
変性工程の前に酵素を反応混合物に含有させるであろ
う。好熱ＳＤＡに用いるのに好ましい制限エンドヌクレ
アーゼは、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、Ｂｓｌ
Ｉ、およびＢｓｏＢＩ（ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ）、ならびにＢｓｔＯＩ（プロメガ）である。好
ましい好熱性ポリメラーゼはＢｃａおよびＢｓｔであ
る。
【００２４】高い増幅係数（たとえば１０8−１０9）が
得られる最適ＳＤＡ系を開発するためには、緩衝系を評
価し、最適化することが推奨される。これは好熱ＳＤＡ
に用いる新規な制限酵素／ポリメラーゼ対を評価する際
にも適用される。製造業者は制限エンドヌクレアーゼに
推奨される緩衝液を供給しており、これは通常は１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2を含有するトリスである。それは５０−
１５０ｍＭのＮａＣｌおよび／またはＫＣｌをも含有し
うる。これらの条件は必ずしも好熱ＳＤＡに最適ではな
いが、その代わり推奨された温度で１００％の核酸二本
鎖開裂を提供する。ＳＤＡにおいては、制限エンドヌク
レアーゼはその二本鎖部位を認識するが、誘導ｄＮＴＰ
に交換することによって、両鎖を開裂するのではなくプ
ライマー鎖をニックするようにエンドヌクレアーゼを誘
発する。従って製造業者が推奨する緩衝液は、この修飾
された制限エンドヌクレアーゼ挙動の発現に最適な緩衝
液ではないかも知れない。さらに、制限エンドヌクレア
ーゼはＳＤＡにおけるポリメラーゼと協調して機能しな
ければならない。従ってＳＤＡ反応が起こるためには、
緩衝系は制限酵素によるニッキング、およびポリメラー
ゼによる伸長／置換の両方を支持しなければならない。
【００２５】新規なＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼと共
に用いる緩衝系を評価する際には、一般にその制限酵素
に推奨される緩衝液を評価することにより緩衝液の最適
化に着手することが有用である。消去法を採用して、エ
ンドヌクレアーゼのニッキング作用にはいずれの成分が
必須であるかを判定することができる。この情報とＳＤ
Ａにおいてポリメラーゼ活性を高めることが知られてい
る緩衝液条件とを合わせると、原型となる緩衝液を開発
することができる。前記で述べたように、緩衝液の最適
化の重要な観点は成分の相互作用性である。このため、
１成分を一定に維持して他を一度に１つずつ変化させる
より、むしろ種々の濃度の異なる成分を試験する方が望
ましい。たとえばＫＰＯ4を一定に維持した状態で種々
のＭｇＣｌ2濃度を試験すると、そのＫＰＯ4濃度におい
て最良のＭｇＣｌ2濃度が求められる。しかし種々の組
み合わせのＭｇＣｌ2およびＫＰＯ4濃度を試験すると、
最良の結果を与えるＭｇＣｌ2およびＫＰＯ4の組み合わ
せ濃度が求められる。従って成分の協調効果によって確
実に最適増幅を得るためには、緩衝液の各成分を同時に
試験すべきである。この方法はドクターペリー・ハーラ
ンド（ＰｅｒｒｙＨａａｌａｎｄ）によるＥｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（マーセル・デッカー、ニューヨーク、１９
８９）に詳述されている。
【００２６】通常のＳＤＡに最適な緩衝液を求める方法
が、好熱ＳＤＡに有用である。通常のＳＤＡ（Ｈｉｎｃ
ＩＩ／ｅｘｏ−クレノウを用いる）のための緩衝液は下
記により開発された：制限エンドヌクレアーゼに用いら
れる市販の緩衝液それぞれを用いてＳＤＡを実施した。
これらの緩衝液は、２０−５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４
−８、５０−１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび／またはＫＣ
ｌ（または酢酸塩）ならびに５−１２ｍＭ ＭｇＣｌ2
を含有していた。ＨｉｎｃＩＩに関するＳＤＡを最も良
く支持した緩衝液はジブコ−ＢＲＬからのリアクト（Ｒ
ＥＡＣＴ）６であったが、製造業者は二本鎖開裂のため
にＨｉｎｃＩＩと共に用いるためにはリアクト４を推奨
している（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、および５０ｍＭ ＫＣｌ）。リアクト６緩衝液
は、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ ＫＣｌを
含有する。さらに実験を行い、その際ＭｇＣｌ2および
Ｋ+が最も重要な緩衝液成分であると判定された。従っ
てＫ+源としてトリスの代わりにＫＰＯ4緩衝液を使用し
た。この緩衝液は制限エンドヌクレアーゼ活性およびポ
リメラーゼ活性の両方を支持し、その結果通常のＳＤＡ
反応において高水準の増幅を与えた。ＫＰＯ4緩衝液を
制限エンドヌクレアーゼと共に用いることは一般的では
ないが、ＳＤＡにおける制限エンドヌクレアーゼ／ポリ
メラーゼの組み合わせに適していることが、緩衝液成分
の分析に際して証明された。より一般的な緩衝液（すな
わちトリス）を同様な様式で試験したが、増幅をこれ以
上高めない。
【００２７】好熱ＳＤＡに用いるいずれかの制限エンド
ヌクレアーゼ／ポリメラーゼの組み合わせに適した緩衝
液を判定するために、同様な最適化法を適用することが
でき、これには発明的手腕を行使しないルーティン試験
を必要とするにすぎない。多くの場合、通常のＳＤＡに
一般に用いられるＫＰＯ4／ＭｇＣｌ2緩衝液が、文献記
載のままで、またはこれらの成分の濃度をルーティンに
若干変更して、好熱ＳＤＡに適している（実施例５参
照）。
【００２８】
【実施例】
実施例１ ポリメラーゼの伸長アッセイスクリーニング プラスミドｐＢＲ３２２を標的として用いて、このプラ
スミド上で互いに隣接してアニールする２種類のプライ
マーを合成した。プライマーＰＢＲ１は上流プライマー
であり、ｐＢＲ３２２の塩基３６６１−３６９０に対応
した。プライマーＰＢＲ２はＰＢＲ１の下流にハイブリ
ダイズし、塩基３６９１−３７２０に対応した。これら
の３０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドはアプライド・バイ
オシステムズＤＮＡ合成装置、モデル３８０を用いて合
成され、変性用アクリルアミドゲルからの電気溶出によ
り精製された。これらのプライマーを別個に、１０μＭ
プライマー、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、７０μＣｉ32Ｐ−ＡＴＰ、および１０単位
のポリヌクレオチドキナーゼを用いるキナーゼ反応にお
いて、反応容量１０μＬで３７℃において３０分間標識
した。標識プライマーを２００ｎｇのＰｓｔＩ／Ｈｉｎ
ｃＩＩ消化ｐＢＲ３２２と、最終濃度０．２μＭ（各プ
ライマー）で混和した。標識ｐＢＲ３２２ ＤＮＡは、
２５ｍＭ ＫＰＯ4、ｐＨ７．４、２−８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、および０．２−１ｍＭ ｄＮＴＰを含有する緩衝
液中で９８℃において３分間、変性された。次いでこの
混合物を選ばれた反応温度（５０−７０℃）に２分間冷
却した。１単位のポリメラーゼを添加し、反応を１０分
間進行させた。等容量の９５％ホルムアミド／５０ｍＭ
ＥＤＴＡ／ブロモフェノールブルー色素の添加により反
応を停止した。２５μＬの反応物を６％変性用ゲル上で
電気泳動し、そしてこのゲルでオートラジオグラフフィ
ルム（コダック、ＸＡＲ５）を露光した。
【００２９】上記の反応条件を、５０℃、６０℃および
７０℃でポリメラーゼの活性を試験するアッセイに用い
た。それぞれの場合、ポリメラーゼはすべて通常のデオ
キシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の存在下で、または通常
のｄＮＴＰおよび１種類のチオ置換デオキシヌクレオチ
ド（αチオｄＣＴＰ、“ｄＣＴＰαＳミックス”）の存
在下で試験された。被験ポリメラーゼおよび反応条件を
次表に示す：
【表１】 両プライマーを伸長させて下流の新たに合成された鎖を
置換しうるポリメラーゼは、オートラジオグラフ上に２
本のバンドを形成した。大きい方のバンドは消化された
標的プラスミドのＨｉｎｃＩＩ部位に対するＰＢＲ１の
伸長生成物を表し、２４４ヌクレオチドの長さである。
小さい方のバンドはＨｉｎｃＩＩ部位に対して伸長され
たＰＢＲ２の伸長生成物であり、２１４ヌクレオチドの
長さである。１種類の伸長生成物のみが生成した場合、
オートラジオグラフ上に１本のバンドのみが検出され
た。この唯一のバンドが２本のうち小さい方である場
合、下流のプライマー（ＰＢＲ２）のみが伸長されてい
る。このようなポリメラーゼはＳＤＡに適していない。
それらはニックにおいて伸長を開始することによって上
流プライマーを伸長させることができないか、またはそ
れらはニックから下流の鎖を置換することができないか
らである。大きい方のバンドのみが検出された場合、重
合はニックにおいて開始したが、ポリメラーゼが５′−
３′−エキソヌクレアーゼ活性をも示したのである。
【００３０】伸長アッセイにおいて同定された、好熱Ｓ
ＤＡに有用なポリメラーゼの活性プロフィルを次表にま
とめる：
【表２】 Ｂｓｔポリメラーゼ（バイオラド）およびＢｃａポリメ
ラーゼ（パンベラ、タカラ；ラダーマンポリメラーゼと
しても知られている）はアッセイに際して両方の伸長生
成物を生成した。この実施例において試験したポリメラ
ーゼのうち、これら２種類のみが、要求されるすべての
特性（ニックにおける開始、鎖置換、およびチオ置換デ
オキシヌクレオチドの取り込み）を５０−７０℃の温度
範囲全体にわたって示した。従ってＢｃａおよびＢｓｔ
ポリメラーゼは、５０−７０℃の全範囲にわたって普通
の緩衝液条件下で好熱ＳＤＡ反応に有用である。第２群
のポリメラーゼ（ｅｘｏ-Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ-Ｄｅｅｐ
Ｖｅｎｔ、およびｅｘｏ-Ｐｆｕ）はこの温度範囲にわ
たってＰＢＲ２伸長生成物を生成したが、７０℃より低
い温度では有意量のＰＢＲ１伸長生成物の生成を行わな
かった。これら３種類のポリメラーゼを用いた場合、５
０℃では２４４ヌクレオチドのＰＢＲ１伸長生成物は検
出されず、６０℃では少量が検出されたにすぎない。し
かし７０℃ではこれら２種類の伸長生成物がそれぞれ有
意量検出された。これらの結果は、ｅｘｏ-Ｖｅｎｔ、
ｅｘｏ-Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、およびｅｘｏ-Ｐｆｕにつ
いては活性および／またはニックにおける開始が温度依
存性の活性であることを示す。しかしそれらはチオ置換
デオキシヌクレオチドを取り込むことができ、かつＳＤ
Ａに要求される他のすべての活性を備えていた。この第
２群のポリメラーゼは７０℃以上で機能する制限エンド
ヌクレアーゼ、好ましくは約７０℃に最適温度を有する
制限エンドヌクレアーゼと組み合わせた場合に好熱ＳＤ
Ａに有用である。あるいはそれらの置換活性は低温で、
溶剤、たとえば約１５％グリセリンまたは約１５％ＤＭ
ＳＯを添加することによって高めることができる。
【００３１】配列決定用のポリメラーゼＴａｑ、Ｔｔ
ｈ、Ｔｆｌ、レプリナーゼおよびレプリサームをアッセ
イにおいて試験した場合、ＰＢＲ１伸長生成物のみが認
められた。これらの結果は、これらのポリメラーゼがニ
ックにおいて重合を開始しうるが、それらは５′−３′
−エキソヌクレアーゼ活性をもつことを示す。当技術分
野で知られている方法で５′−３′−エキソヌクレアー
ゼ活性を選択的に除去すると、この群のポリメラーゼも
好熱ＳＤＡに有用である。
【００３２】実施例２ 制限エンドヌクレアーゼのスクリーニングのための鎖保
護アッセイ 制限エンドヌクレアーゼに対する半修飾された認識／開
裂部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを構築した。こ
れらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、まず長さ１６ヌク
レオチドの共通プライマー（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：１または配列番号：２）、および長さ４４−５
７ヌクレオチドの種々の鋳型鎖を合成することにより構
築された。それぞれの鋳型鎖は多数の認識／開裂部位を
縦列に（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）含み、通常は充填配列
（ｆｉｌｌｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を各部位の間に含
む。開裂部位はオリゴヌクレオチド上に、各部位のニッ
キングまたは開裂の結果、ゲル上でサイズにより識別し
うるフラグメントを生じるように配置された。エンドヌ
クレアーゼが縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）認識／開裂
部位を示す場合、これらの幾つかを試験した。合成され
た鋳型は下記のものであった：
【化１】 配列番号：１は配列番号：５−１０をプライミングし、
配列番号：２は配列番号：３−４をプライミングする。
これらの鋳型は下記の制限エンドヌクレアーゼに対する
認識／開裂部位を含む：ＡｃｃＩ、ＡｓｐＩ、Ｂｓａ
Ｉ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｉＹＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＩ（２
つの縮重部位）、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＨ
Ｉ、ＢｓｐＷＩ、ＢｓｏＢＩ（４つの縮重部位）、Ｂｓ
ｏＦＩ、ＢｓｒＩ（２つの縮重部位）、ＢｓｒＢＲＩ、
ＢｓｒＤＩ（２つの縮重部位）、Ｂｓｔ７ｌＩ、Ｂｓｔ
ＮＩ（２つの縮重部位）、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｄ
ｐｎＩ、ＨａｅＩＩ、ＭａｍＩ、ＭｂｏＩＩ、Ｍｖａ
Ｉ、ＭｗｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＴｔｈ１１１Ｉ。
【００３３】これらのプライマーおよび鋳型を合成後に
ゲル電気泳動により精製し、標準法によりゲルスライス
から電気溶出した。次いでそれらをのちにオートラジオ
グラフ検出するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
およびγ−［32Ｐ］−アデノシントリホスフェートを用
い５′−末端標識した。一般的キナーゼ反応物は２μＬ
の１０×キナーゼ緩衝液（ニュー・イングランド・バイ
オラボズ）、１０μＬのγ−［32Ｐ］−ＡＴＰ（３００
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ−デュポン）、最終濃度１μ
Ｍとなる量のプライマーまたは鋳型、２０単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイ
オラボズ）、および全反応容量２０μＬとなる量の水を
含有していた。キナーゼ反応を３７℃で３０分間実施
し、次いで沸騰水中で５分間加熱することにより停止し
た。次いでプライマーをそれぞれの鋳型にハイブリダイ
ズさせ、ポリメラーゼおよび種々のホスホロチオエート
置換ヌクレオチドを用いて伸長させ、認識／開裂部位が
半修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドを生成させた。
ニッキング活性に対する影響を調べるために、種々の実
験において誘導ｄＮＴＰを認識／開裂部位の２本の鎖の
うちのいずれか一方に取り込ませた。次いで放射性標識
されたプライマーおよび鋳型を、それらの各２μＬ、１
μＬのリアクト−１緩衝液（ライフ・テクノロジー
ズ）、および１１．５μＬの脱イオン蒸留水を密閉式の
０．５ｍＬポリプロピレン製微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆ
ｕｇｅ ｔｕｂｅ）中で混合することによりアニールさ
せた。この混合物を沸騰水浴中で３分間加熱し、次いで
水浴を熱源から取り出すことにより、徐々に３７℃に放
冷した。次いで遠心管を３７℃のインキュベーターに移
し、ハイブリダイズしたプライマーを鋳型上で、１μＬ
のデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）
（少なくとも１種類のチオ−ｄＮＴＰを含有）、２μＬ
の１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および０．
５μＬのエキソヌクレアーゼ欠如クレノウポリメラーゼ
１０単位／μＬ溶液（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ）の添
加により伸長させた。伸長反応における各ｄＮＴＰの最
終濃度は２５０μＭであった。プライマー伸長反応を２
０分間進行させ、次いで７５℃に１０分間加熱すること
により停止した。
【００３４】伸長後にアリコートを、制限エンドヌクレ
アーゼの供給業者が推奨する、制限エンドヌクレアーゼ
活性に適した緩衝液中へ１０倍希釈した。アッセイにお
けるＤＮＡ分子の最終濃度は１０ｎＭであった。それぞ
れの反応混合物に５−１０単位の適宜な制限エンドヌク
レアーゼを添加することにより、鎖保護アッセイを開始
した。反応物を制限エンドヌクレアーゼの供給業者が推
奨する温度でインキュベートした。試料を一定間隔で取
り出し、等容量の配列決定反応停止用ホルムアミド溶液
（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ）に添加して、反応を停止
した。停止した試料をすべてが採集されるまで氷上に保
存した。次いで試料を沸騰水浴中で３分間加熱し、トリ
ス−硼酸緩衝液中の８％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素
からなるＤＮＡ配列決定用ゲル（ジブコ−ＢＲＬ）上に
装填した。電気泳動を５７Ｗの一定の電力水準で１時間
実施した。放射性標識ＤＮＡバンドをフジＲＸ用Ｘ線フ
ィルムにより視覚化した。
【００３５】試験した好熱性制限エンドヌクレアーゼの
うち、完全またはほぼ完全に半修飾認識／開裂部位をニ
ックした１１種類をこの実験で確認した。それらを次表
に挙げる。場合により、鎖保護アッセイにおいて半修飾
した際に、制限エンドヌクレアーゼに対する１つの縮重
部位のみがニックされた。種々のホスホロチオエート置
換の結果と共に、鋳型中の認識／開裂部位の位置をヌク
レオチドの位置により示す。ｄＮＴＰαＳの取り込みに
よって完全またはほぼ完全に誘導鎖が保護された場合
（すなわち非修飾鎖がニックされた）、そのヌクレオチ
ド置換を挙げる。“無”はニッキングを生じるヌクレオ
チド置換が認められなかったことを示す。
【００３６】
【表３】 ＊ 認識部位を鋳型鎖の５′末端からのヌクレオチドで
表す。
【００３７】配列番号：５中の１０−１５におけるＢｓ
ｍＩに対する認識部位が非修飾鎖の保護を示す点、すな
わち修飾鎖がニックされる点に注目すると興味深い。こ
れは、通常の非修飾プライマーの代わりにこの認識部位
をチオ誘導プライマーと組み合わせて、好熱ＳＤＡに利
用しうることを示唆する。この系においては、誘導ｄＮ
ＴＰの不在下でニッキングおよび置換が進行し、ポリメ
ラーゼが誘導ｄＮＴＰを取り込みうる必要性は除かれ
る。
【００３８】候補となるこれらの制限エンドヌクレアー
ゼをさらに、５０−６５℃の範囲におけるそれらの熱安
定性につき試験した。ＡｃｃＩのみがこの範囲において
不満足な安定性を示し、一般的な安定剤、たとえば二本
鎖ＤＮＡおよびＢＳＡの添加によって安定化し得なかっ
た。残り９種類の制限エンドヌクレアーゼを実施例３の
場合と同様に直線的ＳＤＡ反応において試験した。Ｍｗ
ｏＩ以外のすべてが増幅生成物を生成した。この酵素は
そのニックした認識／開裂部位からの解離が遅すぎる
か、または１回目の伸長工程でチオール化ヌクレオチド
を認識／開裂部位の両鎖に取り込んだのちにその部位を
再びニックすること（すなわち後続の増幅サイクルを開
始すること）ができないという可能性がある。あるいは
ＭｗｏＩニッキング活性は上記の緩衝系と不適合であっ
て前記に従って最適化することができ、これによりＭｗ
ｏＩも好熱ＳＤＡに有用となるのかも知れない。
【００３９】ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、Ｂｓ
ｍＡＩ、およびＢｓｌＩを使用し、ＴＴＰをｄＵＴＰに
交換して、実施例３の場合と同様な直線的ＳＤＡを実施
した。これはこれらの制限エンドヌクレアーゼとＵＤＧ
脱混入法との適合性を確認するためのものであった。Ｂ
ｓｏＢＩ、ＢｓｔＮＩ、およびＢｓｍＡＩはそれらの認
識／開裂部位においてｄＵにより負の影響を受けなかっ
たが、ＢｓｒＩおよびＢｓｌＩについてはこれらの条件
下で直線的ＳＤＡの効率が低下した。ＢｓｔおよびＢｃ
ａポリメラーゼはｄＮＴＰ交換により影響されないと思
われるので、ＢｓｒＩおよびＢｓｌＩについてニッキン
グ活性が低下したのは恐らくｄＵを酵素の認識／開裂部
位に取り込んだためであろう。ＢｓｌＩについての開裂
部位は縮重配列中に生じるので、この部位を変更してこ
の酵素のニッキング活性に対するｄＵの影響を克服しう
ると考えられる。
【００４０】鎖保護アッセイの初期スクリーニング条件
下で部分的な、または低いニッキング活性をもつ幾つか
の好熱性制限エンドヌクレアーゼが同定された（たとえ
ばＴｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｉＹＩ、およびＢｓｏＦＩ）。
反応条件を最適化することにより（たとえば緩衝液を最
適化し、または反応温度を調整することにより）これら
のエンドヌクレアーゼのニッキング活性を最適化して、
それらを好熱ＳＤＡに対してより有用なものにすること
ができる。さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂
部位をフランキングする配列がエンドヌクレアーゼ活性
に影響を及ぼす可能性のあることが知られているので、
鋳型のフランキング配列を変更することによっても、部
分的にニックしたにすぎないエンドヌクレアーゼのニッ
キング活性が改良され、またはこの実施例の条件下では
ニックしなかったエンドヌクレアーゼのニッキング活性
が向上する可能性がある。
【００４１】実施例３ 直線的好熱ＳＤＡ ポリメラーゼＢｓｔおよび制限エンドヌクレアーゼＢｓ
ｒＩを、６０℃で実施された直線的ＳＤＡ反応により試
験した。標的配列の増幅に成功したことは、このポリメ
ラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの両方が好熱ＳＤ
Ａ反応の条件下で機能することだけでなく、ＳＤＡ“代
謝回転”が起こっていること、すなわち制限エンドヌク
レアーゼが半修飾された認識／開裂部位をニッキングし
たのち解離し、これにより重合の開始が可能となり、重
合に続くサイクルが反復することをも示す。
【００４２】下記のヌクレオチド配列をもつ２種類のＤ
ＮＡオリゴマーを合成した：
【化２】 これらのオリゴマーは２１塩基対がオーバーラップし、
一本鎖５′末端が突出した（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）状
態で、互いにハイブリダイズする。ＢｓｒＩ認識／開裂
部位を配列番号：１１に下線付きイタリック体で示す。
【００４３】これらのオリゴマーを１００℃で３分間イ
ンキュベートすることによりアニールさせたのち、６０
℃に徐冷した。次いでＢｓｔポリメラーゼ、３種類の通
常のデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およ
びｄＧＴＰ、それらのうち１種類はα−32Ｐ標識を保有
する）、および２′−デオキシアデノシン５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）（ｄＡＴＰαＳ）を用い
てそれらを伸長させ、完全二本鎖フラグメントを形成さ
せた。この二重らせんは９２ヌクレオチドの長さであっ
た。次いでＢｓｒＩエンドヌクレアーゼを添加して増幅
反応を開始した（時間＝０）。ＢｓｒＩは、相補鎖が修
飾アデノシンを含む場合に２個のＣ間で認識／開裂部位
の非修飾鎖をニックする。次いでポリメラーゼはニック
において開始し、５′−３′方向に重合を行い、長さ７
０ヌクレオチドの一本鎖オリゴマーを置換する。第１サ
イクルの重合後にエンドヌクレアーゼ認識／開裂部位は
再生されるが、予め修飾されていない認識／開裂部位の
鎖は、ニックに対して３′側でｄＡαＳにより部分交換
される。しかしこれはＳＤＡを妨害しない。ニッキング
および重合の反復サイクルにより、反応に最初に存在し
ていた二重らせんそれぞれの７０ヌクレオチド伸長生成
物の多数のコピーが生成する。
【００４４】ＳＤＡ反応は、２５ｍＭ ＫiＰＯ4 ｐＨ
７．６；６ｍＭ ＭｇＣｌ2；５０ｍＭ ＫＣｌ、０．
５ｍＭ ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰα
Ｓ；１００μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）；５０ｎＭの各オリゴマー；５０単位のＢ
ｓｒＩエンドヌクレアーゼおよび２単位のＢｓｔポリメ
ラーゼを含有する緩衝液２０μＬ中で６０℃において実
施された。５、１０および２０分後に反応物からアリコ
ート（５μＬ）を取り出した。標識生成物を変性用ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、オー
トラジオグラフィーにより視覚化した。第１系列のＳＤ
Ａ反応は完全な上記試薬リストを含有していた。第２系
列のＳＤＡ反応においては、ＢｓｒＩを排除した。第３
系列のＳＤＡ反応においては、二重らせんの形成後、制
限エンドヌクレアーゼの添加前に、加熱（１００℃、５
分間）によりＢｓｔポリメラーゼを失活させた。
【００４５】予想した７０ヌクレオチド伸長生成物は、
第１反応系列において第１時点（５分）以後に検出され
た。長さ９２ヌクレオチドの無傷の相補鎖の対応するバ
ンドも見られた。第２系列の反応は、ＢｓｒＩのニッキ
ング活性なしでは７０ヌクレオチド伸長生成物は生成し
得ないので９２ヌクレオチドの反応生成物のみを示し
た。第３系列の反応は二重らせんのニッキングのみを示
した。これは長さ７０ヌクレオチドのかすかなバンドお
よび長さ９２ヌクレオチドのかすかなバンドにより立証
された。両者とも反応に最初に存在した非増幅二重らせ
んにより生じるものである。この実験におけるＳＤＡサ
イクルの代謝回転速度は、フィルムの濃度から約１ｍｉ
ｎ-1であると推定された。
【００４６】実施例４ 指数的好熱ＳＤＡ ＢｓｏＢＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズによ
りバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種から単離）およ
びＢｃａポリメラーゼ（パンベラ・コーポレーション、
バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
ｌｄｏｔｅｎａｘ）からクローン化）を用いて、好熱Ｓ
ＤＡによる標的配列の指数的増幅を証明した。二本鎖標
的配列（配列番号：１３）の２本の一本鎖として作用す
る相補的オリゴマーを合成した。種々の濃度のこの標的
配列を含有する５μＬをそれぞれの反応混合物に添加し
た。若干の反応には標的配列を添加しなかった。同様に
増幅プライマーを合成した。プライマーＸＢｓｏＢ１−
１（配列番号：１４）はＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレア
ーゼ認識／開裂部位を一本鎖状で含み、プライマーＸＢ
ｓｏＢ１−２（配列番号：１５）も同様であった。
【００４７】プライマーＸＢｓｏＢ１−１は標的配列の
一方の鎖にハイブリダイズして、突出した一本鎖５′末
端を含む１７塩基対のオーバーラップを形成する。退出
した（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）二本鎖３′末端がポリメラー
ゼによって伸長することにより、二本鎖状の半修飾Ｂｓ
ｏＢＩ認識／開裂部位を含む長さ１０３ヌクレオチドの
完全二本鎖状のフラグメントが得られる。同様にプライ
マーＸＢｓｏＢ１−２は標的配列の他方の鎖にハイブリ
ダイズして、突出した一本鎖５′末端を含む１７塩基対
の二本鎖オーバーラップを形成する。この構造もポリメ
ラーゼによりフィルドインされて、二本鎖状の半修飾Ｂ
ｓｏＢＩ認識／開裂部位を含む二本鎖１０３ｍｅｒを生
成する。
【００４８】反応混合物からＢｃａおよびＢｓｏＢＩを
除いたものを３分間加熱して標的ＤＮＡを変性させ、次
いで６０℃の反応温度に冷却した。３分間平衡化したの
ち、４単位のＢｃａおよび１６単位のＢｓｏＢＩを全容
量５μＬ中に添加した。反応混合物（最終容量５０μ
Ｌ）中の試薬の最終濃度は下記のとおりであった：２５
ｍＭ ＫiＰＯ4 ｐＨ７．６；それぞれ１．３７５ｍＭ
のｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；
１００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミン；
６．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．０５μＭ ＸＢｓｏＢ１
−１；０．０５μＭＸＢｓｏＢ１−２；１６単位のＢｓ
ｏＢＩ；４単位のＢｃａ，＋／−標的配列。増幅反応を
１時間進行させ、次いで試験管を沸騰水浴に５分間装入
することにより停止した。
【００４９】増幅反応生成物は下記により検出された。
１０μＬアリコートの各反応物を取り出し、32Ｐ−標識
プライマー（配列番号：１６）を添加した。存在するい
ずれかの増幅生成物にプライマーをハイブリダイズさせ
たのち、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら．１９９２．Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（前掲）に従ってポリメラ
ーゼを添加することによりプライマーを検出可能な長さ
にまで伸長させた。１０μＬの変性用装填溶液を上記ア
リコートに添加し、次いでこれを加熱した。分析のため
に１０μＬを変性用ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。
【００５０】この実験において検出可能なオリゴヌクレ
オチドの推定長さは下記のとおりであった：１）５８ヌ
クレオチド；ニックされ、置換された増幅生成物上での
プライマーの伸長により生成したもの、２）８１ヌクレ
オチド；無傷の全長標的上でのプライマーの伸長により
生成したもの。本方法は、反応条件が最適化されていな
くても増幅反応物に１５０程度のわずかな分子が付加さ
れた場合に増幅生成物を検出するのに十分なほど感度が
高い。
【００５１】実施例５ 通常のＳＤＡと好熱ＳＤＡの比較 ＢｓｏＢＩを制限エンドヌクレアーゼとして用いる直線
的好熱ＳＤＡを、ＨｉｎｃＩＩを用いる通常の直線的Ｓ
ＤＡと比較した。増幅反応は下記の条件下で実施され
た： ＨｉｎｃＩＩ（反応条件Ａ） ４５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７．６ １０％ ＤＭＳＯ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰαＳ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ １００μｇ／ｍｌ アセチル化ウシ血清アルブミン ６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｎＭ プライマー／標的コンプレックス（配列番
号：１７および配列番号：１８） １５０単位 ＨｉｎｃＩＩ １０ＵＳＢ単位 ｅｘｏ-クレノウポリメラーゼ ０．０１ｍＣｉ α−32Ｐ−ｄＣＴＰ ＢｓｏＢＩ（反応条件Ｂ） ２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ８．３ 各０．２５ｍＭ ｄＣＴＰαＳ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ １００μｇ／ｍｌ アセチル化ウシ血清アルブミン １５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｎＭ プライマー／標的コンプレックス（配列番
号：１５および配列番号：１３相補鎖） １６単位 ＢｓｏＢＩ ４単位 Ｂｃａポリメラーゼ ０．０１ｍＣｉ α−32Ｐ−ｄＡＴＰ ＢｓｏＢＩ（反応条件Ｃ） ２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ８．３ 各０．２５ｍＭ ｄＣＴＰαＳ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ １００μｇ／ｍｌ アセチル化ウシ血清アルブミン ６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｎＭ プライマー／標的コンプレックス（配列番
号：１５および配列番号：１３相補鎖） １６単位 ＢｓｏＢＩ ４単位 Ｂｃａポリメラーゼ ０．０１ｍＣｉ α−32Ｐ−ｄＡＴＰ 反応混合物（酵素を除いたもの）を３分間加熱して標的
ＤＮＡを変性させ、プライマーをアニールさせる増幅の
ための目的温度（ＨｉｎｃＩＩについては４０℃、Ｂｓ
ｏＢＩについては６０℃）に冷却した。３分間平衡化し
たのち、２μＬのポリメラーゼを添加し、伸長反応を２
０分間進行させて、ＨｉｎｃＩＩ系については長さ８５
ヌクレオチド、ＢｓｏＢＩについては長さ１０３ヌクレ
オチドの相補的二本鎖標的を生成させた。次いで伸長反
応の対照として３．５μＬアリコートを５μＬの停止溶
液に取り出した。次いで適宜な制限エンドヌクレアーゼ
を添加した（２μＬ）。ＨｉｎｃＩＩについては５、２
０および６０分の時点が採用された。ＢｓｏＢＩについ
ては１、３および６分の時点が採用された。各時点につ
いてのアリコートを直接に５μＬの停止溶液に添加し
た。次いで試料を２分間加熱沸騰させ、５μＬを電気泳
動のために変性用ポリアクリルアミドゲルに装填した。
ゲルをオートラジオグラフィーにより分析した。
【００５２】ＨｉｎｃＩＩによる通常のＳＤＡ反応につ
いての予想反応生成物は、全長の無傷標的分子（長さ８
５ヌクレオチド）、および長さ６０ヌクレオチドのニッ
クされ、置換された増幅生成物であった。ＢｓｏＢＩ反
応についての予想反応生成物は、全長の標的（長さ１０
３ヌクレオチド）、および８１ｍｅｒ増幅生成物であっ
た。これらの生成物はすべて検出された。しかし通常の
ＨｉｎｃＩＩ／ｅｘｏ-クレノウ系とＢｓｏＢＩ／Ｂｃ
ａ系との間には反応速度に著しい相違があった。Ｈｉｎ
ｃＩＩ反応は、検出可能な水準のニックされ、置換され
た増幅生成物を生成するために約６０分を要した。これ
に対しＢｓｏＢＩ系は、検出可能な水準の標的配列増幅
を生成するために約６分を要したにすぎない。ＢｓｏＢ
Ｉ系につき試験した２反応条件のうち、低い方の濃度の
ＭｇＣｌ2を用いる反応条件Ｃは、反応条件Ｂと比較し
て向上した速度の増幅を生じた。
【００５３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GCGGATCCGG CCGAGT 16
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CACTTGATGC CTCCGTGTAA G 21
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：４５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： TACAATAGTC CCAATCTACC CGAGCTTACA CGGAGGCATC AAGTG 45
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：４５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： TACAATAGTC CCAATCTACT CGGGCTTACA CGGAGGCATC AAGTG 45
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：５６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CCGGAATTCG AATGCCAAAA GACTGGGTCT CCAGGAACCA ACTCGGCCGG ATCCGC 56
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：５６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CCGGAATTCT GGTTCCTGGA GACCCAGTCT TTTGGCATTC ACTCGGCCGG ATCCGC 56
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：５４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GGAATTCCGT CCCAGTGATG AAGATCGCAG CGCCCGAGAC TCGGCCGGAT CCGC 54
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：５２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GGAATTCCCT CGGGCGCTGA TCTTCATCAC TGTCCCACTC GGCCGGATCC GC 52
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：４９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GGAATTCCCG AGGAAGGTAG ACGCAATGGC GGCACTCGGC CGGATCCGG 49
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GGAATTCGCA GCCATTGCGT CTACCAACCT CGGGACTCGG CCGGATCCGG 50
【００６３】配列番号：１１ 配列の長さ：５６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CCACCTCTGA CTTGAGCGTC CCAGTGTCAA TACGGCGGAG CCTATGGAGT AACGCC 56
【００６４】配列番号：１２ 配列の長さ：５７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GCAAAAGGCC AGGAACCGAT AAAAGGATGC GTTGCTGGCG TTACTCCATA GGCTCCG 57
【００６５】配列番号：１３ 配列の長さ：７０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGCAGCAATG 60 GCAACAACGT 70
【００６６】配列番号：１４ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GTATTCTGCT GCTCTGTTCC GCCTCGGGTA GACACGTTGT TGCCATTGCT 50
【００６７】配列番号：１５ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GGATTCGCCT CCAGATCTGG TCCTCGGGTA GACCCGGAGC TGAATGAAGC 50
【００６８】配列番号：１６ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CATCGTGGTG TCACGCTCGT CGT 23
【００６９】配列番号：１７ 配列の長さ：４９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG TTACTGGAAC GTTGTGAGG 49
【００７０】配列番号：１８ 配列の長さ：５７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GAGAATTCGT GGACTGCAGA TCGTTGACGT GATTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACC 57
【００７１】配列番号：１９ 配列の長さ：５５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GAGAATTCGT GGACTGCAGA TGTCTCCAAT CCCCCCTCAC AACGTTCCAG TAACC 55
【図面の簡単な説明】
【図１】ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２．Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前掲）のＳＤＡ標的生成方
式を示す。
【図２】２種類の増幅プライマーを用いる二本鎖標的に
対するＳＤＡ反応サイクル（指数的増幅）を示す。１種
類の増幅プライマーを用いる反応サイクルを示す図２の
部分は直線的ＳＤＡを示す。
【符号の説明】
Ｔ１，Ｔ２ 標的配列 Ｓ１，Ｓ２ ＳＤＡ増幅プライマー Ｂ１，Ｂ２ バンパープライマー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 メリンダ・エス・フレイザー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27704，ダーラム，メイナード・アベニ ュー 104 (72)発明者 キャサリン・エイ・スパーゴー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27511，キャリー，ダンダルク・ウェイ 503 (72)発明者 ジョージ・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボ ラス・ロード 209 (72)発明者 マーク・ヴァン・クリーブ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27707，ダーラム，カリバー・パーク・ ドライブ 7301，ナンバー 202 (72)発明者 デービッド・ジェームズ・ライト アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27510，カーボロ，エステイツ・ドライ ブ 201−ビー (56)参考文献 特開 平５−276947（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．287 （1992）ｐ．971−977 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 Ｂｉｏｓｉｓ Ｐｒｅｖｉｅｗｓ

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的配列を増幅するための下記を含む方
    法： ａ）標的配列を含む一本鎖核酸フラグメントを用意し、
    該フラグメントは５′末端および３′末端を有し； ｂ）ＳＤＡのための増幅プライマーを該フラグメントの
    ３′末端に、該プライマーが５′側一本鎖オーバーハン
    グを形成するように結合させ、該増幅プライマーは標的
    核酸配列を切断しない好熱性制限エンドヌクレアーゼに
    対する認識／開裂部位を含み； ｃ）フラグメント上の増幅プライマーを約５０℃−６０
    ℃において下記の存在下に伸長させ： ｉ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ；該ポリメラーゼは約６
    ５℃−７５℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
    性を有し、かつ５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠
    如する、 ｉｉ）デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 ｉｉｉ）少なくとも１種類の誘導デオキシヌクレオシド
    トリホスフェート、および ｉｖ）前記の認識／開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
    に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
    ゼ；該エンドヌクレアーゼは約５０℃−６５℃の二本鎖
    ＤＮＡの切断の最適温度を有する、 これにより、標的配列に対して相補的な新たに合成され
    た第１鎖、および二本鎖状の半修飾された制限エンドヌ
    クレアーゼ認識／開裂部位を含む、増幅プライマーの第
    １伸長生成物を産生させ； ｄ）この二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアー
    ゼ認識／開裂部位を制限エンドヌクレアーゼによりニッ
    クし； ｅ）このニックからＤＮＡポリメラーゼにより伸長さ
    せ、これにより前記の新たに合成された第１鎖をフラグ
    メントから置換し、そして新たに合成された第２鎖を含
    む第２伸長生成物を生成させ、そして； ｆ）このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
    て、これにより標的配列を増幅する。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡポリメラーゼがＢｃａポリメラー
    ゼおよびＢｓｔポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 制限エンドヌクレアーゼがＢｓｒＩ、Ｂ
    ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｏＢＩおよびＢ
    ｓｔＯＩよりなる群から選ばれる、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 標的配列を増幅するための下記を含む方
    法： ａ）標的配列を含む第１および第２一本鎖フラグメント
    を用意し、第１および第２一本鎖フラグメントはそれぞ
    れ５′末端および３′末端を有し； ｂ）ＳＤＡのための第１増幅プライマーを第１一本鎖フ
    ラグメントの３′末端に、かつＳＤＡのための第２増幅
    プライマーを第２一本鎖フラグメントの３′末端に、第
    １および第２増幅プライマーがそれぞれ第１および第２
    一本鎖フラグメント上に５′側一本鎖オーバーハングを
    形成するように結合させ、第１および第２増幅プライマ
    ーはそれぞれ標的核酸配列を切断しない好熱性制限エン
    ドヌクレアーゼに対する認識／開裂部位を含む５′末端
    を含み； ｃ）フラグメント上の第１および第２増幅プライマーを
    約５０℃−６０℃においてそれぞれ下記の存在下に伸長
    させ： ｉ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ；該ポリメラーゼは約６
    ５℃−７５℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
    性を有し、かつ５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠
    如する、 ｉｉ）デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 ｉｉｉ）少なくとも１種類の誘導デオキシヌクレオシド
    トリホスフェート、および ｉｖ）前記の認識／開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
    に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
    ゼ；該エンドヌクレアーゼは約５０℃−６５℃の二本鎖
    ＤＮＡの切断の最適温度を有する、 これにより、ｉ）第１一本鎖フラグメントに対して相補
    的な新たに合成された第１鎖、および第１の二本鎖状の
    半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、
    第１増幅プライマーの第１伸長生成物、ならびにｉｉ）
    第２一本鎖フラグメントに対して相補的な新たに合成さ
    れた第２鎖、および第２の二本鎖状の半修飾された制限
    エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を含む第２伸長生成
    物を産生させ； ｄ）第１および第２の半修飾された制限エンドヌクレア
    ーゼ認識／開裂部位を好熱性制限エンドヌクレアーゼに
    よりニックし； ｅ）これらのニックからＤＮＡポリメラーゼにより伸長
    させ、これにより前記の新たに合成された第１鎖を第１
    一本鎖フラグメントから置換し、かつ新たに合成された
    第２鎖を第２一本鎖フラグメントから置換し、これによ
    りそれぞれ新たに合成された第３鎖および第４鎖を生成
    させ； ｆ）このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
    て、これにより標的配列を増幅する。
  5. 【請求項５】 標的配列を含む二本鎖フラグメントが下
    記を含む方法により生成する、請求項４に記載の方法： ａ）標的配列を含む核酸フラグメントに第１および第２
    増幅プライマーを結合させ、第１および第２増幅プライ
    マーは核酸フラグメントの対向鎖上の標的配列の３′側
    に結合し； ｂ）フラグメント上の第１および第２増幅プライマーを
    伸長させ、これにより、第１増幅プライマーの第１伸長
    生成物および第２増幅プライマーの第２伸長生成物を産
    生させ； ｃ）第１および第２バンパープライマーを伸長させるこ
    とにより第１および第２伸長生成物を置換し、そして； ｄ）置換された第１および第２伸長生成物に対する相補
    鎖を誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在
    下に合成し、これによりＳＤＡによって増幅しうる標的
    配列を含む二本鎖フラグメントが生成する。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡポリメラーゼがＢｃａポリメラー
    ゼおよびＢｓｔポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
    請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 制限エンドヌクレアーゼがＢｓｒＩ、Ｂ
    ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｏＢＩおよびＢ
    ｓｔＯＩよりなる群から選ばれる、請求項６に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 標的配列を増幅するための下記を含む方
    法： ａ）標的配列を含む一本鎖核酸フラグメントにＳＤＡの
    ための増幅プライマーを結合させ、該フラグメントは
    ５′末端および３′末端を有し、増幅プライマーは標的
    核酸配列を切断しない好熱性制限エンドヌクレアーゼに
    対する認識／開裂部位を含み、かつ標的配列の３′側で
    フラグメントに結合し； ｂ）フラグメント上の増幅プライマーを約５０℃−６０
    ℃において下記の存在下に伸長させ： ｉ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ；該ポリメラーゼは約６
    ５℃−７５℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
    性を有し、かつ５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠
    如する、 ｉｉ）デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 ｉｉｉ）少なくとも１種類の誘導デオキシヌクレオシド
    トリホスフェート、および ｉｖ）前記の認識／開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
    に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
    ゼ；該エンドヌクレアーゼは約５０℃−６５℃の二本鎖
    ＤＮＡの切断の最適温度を有する、 これにより、新たに合成された第１鎖を含む、増幅プラ
    イマーの第１伸長生成物を産生させ； ｃ）この第１伸長生成物をフラグメントから置換し； ｄ）第１伸長生成物に対する相補鎖を少なくとも１種類
    の誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下
    に合成し、これにより二本鎖状の半修飾された制限エン
    ドヌクレアーゼ認識／開裂部位を生成させ； ｅ）この二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアー
    ゼ認識／開裂部位を好熱性制限エンドヌクレアーゼによ
    りニックし； ｆ）このニックからポリメラーゼにより伸長させ、これ
    により前記の新たに合成された第１鎖をフラグメントか
    ら置換して、新たに合成された第２鎖を含む第２の伸長
    生成物を生成させ、そして； ｇ）このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
    て、これにより標的配列を増幅する。
  9. 【請求項９】 ＤＮＡポリメラーゼがＢｃａポリメラー
    ゼおよびＢｓｔポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
    請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 制限エンドヌクレアーゼがＢｓｒＩ、
    ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｏＢＩおよび
    ＢｓｔＯＩよりなる群から選ばれる、請求項９に記載の
    方法。
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