JPH1087509A - 腫瘍転移抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍細胞の転移を抑える副作用の少ない腫瘍
転移抑制剤を提供することを目的とする。 【解決手段】 血管内皮細胞増殖因子阻害剤を有効成分
とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍細胞の転移を
抑える副作用の少ない腫瘍転移抑制剤に関するものであ
り、医療、製薬技術に属するものである。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍の治療法として現在広く用いられて
いるものの多くは、化学療法であれ、放射線療法であれ
腫瘍細胞そのものをターゲットとしたものがほとんどで
ある。薬剤の投与による腫瘍に対する選択的攻撃は、腫
瘍細胞が他の正常な細胞に比べてはるかに活発に分裂、
増殖を繰り返しているという性状に依るところが大き
い。すなわち細胞の増殖機構そのものを破壊、ないしは
阻害することによって標的細胞を殺すという目的を達成
するものである。

【０００３】一方、固形腫瘍の増殖を抑制する方法に、
その栄養ならびに酸素の供給源を断つ、いわゆる兵糧責
めのアイディアが提唱されてきた。すなわち腫瘍細胞そ
のものを攻撃することなく、栄養や酸素を枯渇状態にお
としいれ、結果として腫瘍の増殖抑止、そして退縮とい
う治療効果をあげるというものである。この手法の具体
的な標的として、腫瘍に到達している血管があげられて
いる。

【０００４】すなわち一般に細胞が悪性転化し癌細胞が
発生したとしても、その増殖は初期においては非常にゆ
っくりしたものであると言われており、発生した腫瘍は
血管の到達無しには直径２mm以上には増殖しないとさえ
言われている(M. A. Gimbroneet al., J. Exp. Med. 13
6, 261, 1972) 。ところがこの病変部位にひとたび血管
が到達すると、その血管を通して供給される無尽蔵な栄
養と酸素により、腫瘍は爆発的に増殖を開始するのみな
らず、その血管を介して遠隔転移なども起こすことにな
り、血管新生が腫瘍の進行、転移と切っても切れない関
係にあると言われているのである。

【０００５】一方、血管の新生を誘起する、或いは血管
の構成細胞である血管内皮細胞の増殖を促進させる物質
として、aFGF、bFGF、EGF 、PD-ECGF 、VEGF( 血管透過
性因子：VPF とも略称されている) 、TGF-b 、Angiogen
in等多くの物質が報告されている(R. Bicknell and A.
L. Harris, Eur. J. Cancer 27, 6, 781, 1991) 。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、癌細胞
に血管の新生、遊走を誘起する因子を見出し、その機能
を阻害し、腫瘍の増殖を抑えさらには腫瘍の転移を抑え
ることによって、従来の腫瘍そのものをターゲットとし
た癌の治療方法とは異なる、新規かつ有効な癌の治療方
法及び予防方法が提供できるのでないかと考え、鋭意検
討を行ったのである。

【０００７】

【課題を解決する手段】本発明者等は、前記した血管の
新生を誘起する、あるいは血管の構成細胞である血管内
皮細胞の増殖を促進させる物質のどの物質が、どの様な
機作で前述の癌血管新生因子(TAF) の作用を担っている
のか判明していないなかで、特に前記因子のうちで血管
内皮細胞増殖因子／血管透過性因子が細胞外分泌に係わ
るシグナルペプチドを有すること、ならびに様々な癌細
胞で発現が見られることに注目し、当該血管内皮細胞増
殖因子／血管透過性因子が腫瘍血管新生になんらかの係
わりが有るのではないかという仮説をたてて研究を行
い、その結果血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子の
作用は腫瘍細胞そのものに対してではなく血管内皮細胞
に特異的に発揮され、生体内では血管の新生を促すこと
を見出し、この血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子
の作用を抑制することによって腫瘍の増殖を抑えるのみ
でなく、腫瘍の転移を抑制することが出来ることを見い
だし本発明を完成したのである。

【０００８】すなわち、本発明は、血管内皮細胞増殖因
子阻害剤からなる腫瘍転移抑制剤に関するものであり、
当該血管内皮細胞増殖因子阻害剤が抗血管内皮細胞増殖
因子抗体である腫瘍転移抑制剤に関するものであり、さ
らには当該抗血管内皮細胞増殖因子抗体が抗血管内皮細
胞増殖因子／血管透過性因子抗体である腫瘍転移抑制剤
に関するものであり、特には血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子のアミノ酸配列の一部である下記配列と反
応する抗血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子抗体か
らなる腫瘍転移抑制剤に関するものである。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ

【０００９】

【実施の形態】本発明の腫瘍転移抑制剤は、血管内皮細
胞増殖因子の機能を阻害するものであれば、如何なる形
態のものでもよく、最も一般的には、請求項２に記載し
た様な血管内皮増殖因子に作用する抗体、もしくはその
一部分が挙げられるが、本発明の腫瘍抑制剤はそれらに
限定されることなく、例えば、血管内皮細胞増殖因子の
作用を阻害する不活性な血管内皮細胞増殖因子、または
その一部分、血管内皮細胞増殖因子の受容体の機能を
損なう、例えば、血管内皮細胞増殖因子受容体に対する
抗体、または抗体の一部分、さらには、血管内皮細胞増
殖因子の産生そのものを抑制する薬剤等を挙げることが
できる。特に本発明においては、血管内皮細胞増殖因子
阻害剤としては、抗血管内皮細胞増殖因子抗体、さらに
は抗血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子抗体が挙げ
られ、特に特定のエピトープを有する抗血管内皮細胞増
殖因子／血管透過性因子抗体が好ましいものとして挙げ
られる。

【００１０】本発明によれば、血管内皮細胞増殖因子の
作用を抑え、腫瘍に栄養や酸素を供給する経路である腫
瘍血管の腫瘍への遊走を阻止し、腫瘍の増殖を抑制する
と共に腫瘍の転移を抑制するという作用が示されるので
ある。さらに本発明の腫瘍転移抑制剤は、既知の抗癌剤
と併用されると、両者の標的が異なる、すなわち抗癌剤
の標的は増殖腫瘍細胞であるのに対し、血管内皮細胞増
殖因子阻害剤はその名のとおり、血管内皮細胞という均
一な細胞を標的とするものであり作用機序が異なるた
め、腫瘍の増殖を抑えるとともにさらに有効に腫瘍の転
移を抑制するという作用が示される。

【００１１】以下本発明を詳細に説明する。 （１）抗血管内皮細胞増殖因子ポリクローナル抗体の作
製 単離した血管内皮細胞増殖因子のc ＤＮＡを大腸菌の中
でグルタチオンS トランスフェラーゼとの融合蛋白とし
て発現させ、得られた蛋白を抗原として常法に従いうさ
ぎを免疫した。抗体価の上昇した血清からDEAEのクロマ
トグラフィーでIgG を分画した。得られた抗体が血管内
皮細胞増殖因子と反応することを確認するために、血管
内皮細胞増殖因子を１２%SDS-PAGE で展開し、ゲルから
ナイロン膜に蛋白を移し、免疫して得られた抗体を反応
させWestern blotを行い、血管内皮細胞増殖因子の分子
量に相当する位置における特異的な交差反応により、作
成した抗体が血管内皮細胞増殖因子を認識することを確
認した。

【００１２】（２）抗血管内皮細胞増殖因子モノクロー
ナル抗体の製造 抗血管内皮細胞増殖因子モノクローナル抗体は動物を血
管内皮細胞増殖因子で免疫し、その脾細胞を取り出しこ
れをミエローマ細胞と融合して得たハイブリドーマ細胞
を培養することにより製造することができる。このハイ
ブリドーマの製造は例えばKohlerとMilsteinの方法[Nat
ure,256:495(1975)]等により行うことができる。 抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
血管内皮細胞増殖因子１０〜１００μｇの量を抗原とし
て２〜３週間ごとに最低２〜３回免疫を行う。動物の飼
育及び脾細胞の採取は常法に従って行われる。尚、免疫
の際には抗原に例えばグルタチオン-Ｓ-トランスフェラ
ーゼ等を融合させて得られた蛋白質又はキーホールリン
ペットヘモシアニン等を結合させて得られた複合蛋白質
を抗原として用いることもできる。 ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマＳp2/０−Ａg
14(Ｓp2)、Ｐ3/ＮＳＩ/1-Ａg4-1(ＮＳ-1)、Ｐ3×63Ａg8
Ｕ.1等が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に
従って行われる。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１：１０の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。 ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０^-3〜１０^-5Ｍ)、アミノプテリン(１０^-6〜１０^-7
Ｍ)、チミジン(１０^-5〜１０^-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。 ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発
明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。 モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる。モノク
ローナル抗体の選別には酵素免疫測定法、ウエスタンブ
ロッティング法等が用いられる。又、モノクローナル抗
体のアイソタイプの決定はモノクローナル抗体の酵素免
疫測定法又はオクタロニー法等によって行うことができ
る。

【００１３】（３）モノクローナル抗体の反応部位の同
定 血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列の一部分に相当す
るペプチドの作製 血管内皮細胞増殖因子における連続した１２個のアミノ
酸を１つのペプチドとして血管内皮細胞増殖因子の全配
列を網羅する複数のペプチドを設計する。設計された各
ペプチドは例えばマルチピンペプチド合成法［Maeji,N.
J. et al.,J.Immunol.Method,134:23(1990)]等により合
成することができる。尚、合成したペプチドの定量はオ
ルトフタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量する事に
より行うことができる。 モノクローナル抗体と反応するペプチドの同定 以上のようにして合成した複数のペプチドは血管内皮細
胞増殖因子の全領域に対応するものである。従ってそれ
ら複数の全てのペプチドとモノクローナル抗体の反応性
を調べることによりモノクローナル抗体が血管内皮細胞
増殖因子のどの部位に反応しているかを明らかにするこ
とができる。反応性の測定には酵素免疫測定法，オクタ
ロニー法，ウエスタンブロッティング法等が用いられ
る。

【００１４】（４）モノクローナル抗体の腫瘍転移抑制
剤としての使用 本発明においてモノクローナル抗体又はキメラ抗体又は
ヒト化抗体を腫瘍転移抑制剤として投与する場合には投
与する対象を特に限定しない。例えば個々の腫瘍の転移
を抑制することを特異目的として用いることができる。
又投与する方法は経口又は非経口でもよく経口投与には
舌下投与を包含する。非経口投与には注射例えば皮下、
筋肉、血管内注射、点滴、座剤等を含む。又、その投与
量は動物か人間かによって、又年齢、投与経路、投与回
数により異なり、広範囲に変えることができる。この場
合モノクローナル抗体の有効量と適切な希釈剤および薬
学的に使用し得る担体の組成物として投与される有効量
は０.１〜１００mg/kg体重/日であり１日１回から数回
に分けて毎日又は数日に１回又は１〜２週間に１回投与
される。本発明においてモノクローナル抗体を経口投与
する場合はそれに適用される錠剤・顆粒剤・細粒剤・散
剤・カプセル剤等は通常それらの組成物中に製剤上一般
に使用される結合剤・包含剤・賦形剤・滑沢剤・崩壊剤
・湿潤剤のような添加剤を含有する。又、経口用液体製
剤としては内用水剤・懸濁剤・乳剤・シロップ剤等いず
れでの状態であってもよく、又、使用する際に再溶解さ
せる乾燥生成物であっても良い。更にその組成物は添加
剤・保存剤の何れを含有しても良い。また非経口投与の
場合には安定剤・緩衝剤・保存剤・膨張化剤等の添加剤
を含有し通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器
又はチューブの状態で提供される。上記の組成物は使用
する際に適当な担体たとえば発熱物質不含の滅菌された
溶解剤で再溶解させる粉体であっても良い。本発明の腫
瘍転移抑制剤は既知の抗癌剤と併用して用いることがで
き、併用される抗癌剤として格別に限定されるものはな
いが、具体的に例示すれば、マイトマイシン、シスプラ
チン、シクロホスアミド、ビンクリスチン等を挙げるこ
とができる。それら抗癌剤を併用する際は、それら抗癌
剤で指示に従えばよく、また減量することも可能であ
る。

【００１５】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない （１）血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの作製 単離したヒト血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子
(以下ＶＥＧＦという）のcＤＮＡにて形質転換した酵母
の培養液よりヒトＶＥＧＦを精製し(特開平７−３１４
９６号参照)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬ
Ｈ)とグルタルアルデヒドを用いて複合体を作製し、得
られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノクロー
ナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-ＶＥＧＦで免疫し
たマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞(Ｓp2)をポリ
エチレングリコール存在下で細胞融合させた。得られた
ハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングした。
ＶＥＧＦとクローン化したハイブリドーマの培養上清の
反応性を酵素免疫測定法により調べ、ＶＥＧＦと反応す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択
した。又、このハイブリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体をＭＶ833と命名した。なお得られたモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマは通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５１９
２として寄託されている。

【００１６】（２）ＶＥＧＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製)を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。又、下記の方法で測定したＶＥＧＦ₁₂₁及びＶ
ＥＧＦ₁₆₅に対する解離定数は以下の通りであり本発明
のモノクローナル抗体はＶＥＧＦに対して強い親和性を
有することがわかる。 ○ ５.７０×１０^-11Ｍ±０.３５×１０^-11Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ₁₂₁) ○ １.１０×１０^-10Ｍ±０.１１×１０^-10Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ₁₆₅) 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し取り外
し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で一
晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
を３０μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで調
製したＶＥＧＦと¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ(¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧ
Ｆ₁₂₁はＶＥＧＦ₁₂₁をクロラミンＴ法により標識、¹²⁵
Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₆₅はアマシャム社より購入)反応混液を
穴あたり２００μl添加して一晩放置する。この反応混
液中のＶＥＧＦ濃度はＶＥＧＦ₁₂₁が０〜１ng/穴，ＶＥ
ＧＦ₁₆₅が０〜１０ng/穴、¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦが１×１
０４cpm/穴(¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₂₁; ６６.７pg/穴、¹²⁵
Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₆₅；１１６pg/穴)とする。穴から反応
混液を取り除き０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した
後、穴を１個ずつ切り離して分析用チューブに入れガン
マーカウンターにてカウントしその結果より作成した散
布図から解離定数を求める。又、下記の方法で測定した
本発明のモノクローナル抗体の等電点は pＩ＝５.２〜
５.５であった。現時点で報告のある他のＩgＧ1タイプ
の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の等電点は我々の報告
しているＭＶ101が pＩ＝７.０〜７.５でありジェネン
テック社のＡ４.６.１が pＩ＝４.２〜５.２[Kim,K.J.
et.al. Growth Factors,7:53(1992)]であり本発明の物
質はいずれの物質とも異なる物質である。 等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。

【００１７】（３）ＶＥＧＦ中のモノクローナル抗体の
反応部位の同定 （ａ）ＶＥＧＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプ
チドの作製 ヒトＶＥＧＦ₁₂₁のアミノ配列の連続した１２個のアミ
ノ酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種の
ペプチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合
成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用ピ
ンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニルメ
トキシカルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりＦmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジ
イミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-
アミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗
浄後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合さ
せ、この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合
成した。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行
い、さらにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。
ピン上で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すこ
とにより切り出した。合成したペプチドの定量はオルト
フタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量することによ
り行った。合成した６７種のペプチドのアミノ酸配列を
表１に示した。数字はペプチド識別番号を示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】（ｂ）ＭＶ833抗体と反応するペプチドの
同定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＥ
ＧＦ₁₂₁の全領域に対応するものである。したがって６
７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べること
によりＭＶ833抗体がＶＥＧＦのどの部位に反応してい
るかを明らかにすることができる。そこで酵素免疫測定
法により６７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を
調べた。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社製)に６７
種の２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時間放置し
た。０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３回洗浄し
た後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間放置し
た。２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１％ＢＳ
Ａ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％
ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識した
ヒツジ抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％ＢＳＡ-Ｐ
ＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ
-ＰＢＳで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニレンジア
ミン２塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含む０.２Ｍ
トリス−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて発色させ
た。反応は２規定硫酸を加えて停止させた後、吸光度
(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。以上の方法で測定し
た結果をグラフにプロットし図１に示した。

【００２０】ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中で
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＥＧ
ＦのＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲ
Ｐ配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反応してい
ることが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出し
ている部分を認識すると考えられるため、この２種類の
アミノ酸配列部分はＶＥＧＦの表面に露出している部分
であると言える。又、モノクローナル抗体は抗原決定基
が単一であると言われているが、高次構造をとっている
蛋白質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が立体的に
抗原を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体の反応性
を調べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配列に反応
することがある。ＭＶ833抗体がＶＥＧＦ中の二箇所の
アミノ酸配列部分に反応したことより、本抗体は二箇所
のアミノ酸配列部分を立体的に同時に認識していると考
えられる。

【００２１】微量タンパク質やウイルスの研究を行う場
合現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩基
配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。この
アミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索し、
その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用いてい
る。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824(1981)]などを用
いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあてはまる
とは限らない。したがって本発明によりＶＥＧＦの表面
に露出している部位の中で腫瘍増殖に重要である部分が
明らかにされたことにより強い抗腫瘍活性を有したＶＥ
ＧＦ抗体を容易に作製できるようになり、また、本発明
に採用された方法は蛋白質の表面に露出している部位を
明らかにする方法としても適用されるものである。

【００２２】（４）ＶＥＧＦモノクローナル抗体の抗腫
瘍・転移抑制試験−１ ヒト大腸癌細胞株ＴＫ−４の小腫瘍片５mmを５週令のヌ
ードマウスの雄(Balb/c-nu/nu nude mice)の盲腸漿膜壁
に直接縫着した。腫瘍移植１日目よりモノクローナル抗
体を１００μg/０.２ml/マウスを１回/４日の投与量で
投与した群（ＶＥＧＦ−１Ｄ：ｎ＝１２）と移植１０日
目よりモノクローナル抗体を腹腔内に投与した群（ＶＥ
ＧＦ−１０Ｄ：ｎ＝６）の４２日目における腫瘍増殖及
び肝転移抑制効果を観察した。尚、比較コントロール群
としては、生理食塩水又はマウスＩgＧを腫瘍移植１日
目より投与した群（それぞれＮＳＳ／Ｃont-ＩgＧ：ｎ
＝１２）を用いた。各群における原発腫瘍重量、肉眼的
肝転移巣数及びマウス体重は、図２、図３及び図４に示
されるとおりであり、ヒト大腸癌における腫瘍増殖及び
肝転移抑制効果が示され、体重減少などの副作用は認め
られず、該抗体は抗腫瘍及び転移療法に有効なものであ
ることが示された。 （５）ＶＥＧＦモノクローナル抗体の抗腫瘍・転移抑制
試験−２ ヒト大腸癌細胞株ＴＫ−１３を用い、腫瘍移植１０日目
よりモノクローナル抗体を１００μg/０.２ml/マウスを
１回/２日の投与量で腹腔内投与した群と比較コントロ
ール群としては、生理食塩水を投与した群について上記
と同様に試験を行い、移植後４２日目に評価した。各群
における原発腫瘍重量、肉眼的肝転移巣数及びマウス体
重は表２のとおりであり、ヒト大腸癌細胞株ＴＫ−１３
についても腫瘍増殖及び肝転移抑制効果が有意に認めら
れた。

【００２３】

【表２】 注：＊＝ｐ＜０.０５、＊＊＝ｐ＜０.０１、＊＊＊＝ｐ＜０.００１

【００２４】（６）ＶＥＧＦモノクローナル抗体・抗癌
剤併用の抗腫瘍・転移抑制試験 ヒト胃癌細胞株ＭＴ−２を用い、５週令のヌードマウス
の雄(Balb/c-nu/nu nude mice)の胃壁に直接縫着し、
１）コントロール群、２）モノクローナル抗体単独投与
群、３）マイトマイシンＣ単独投与群、４）モノクロー
ナル抗体・マイトマイシンＣ併用投与群に分けた。マイ
トマイシンＣを投与する２群、すなわち、マイトマイシ
ンＣ単独投与群と併用投与群にはマイトマイシンＣを腫
瘍移植１０日から７日目毎に２mg/kg を計３回腹腔内投
与し、コントロール群には生食を同容量投与した。また
モノクローナル抗体を投与する２群、すなわち、モノク
ローナル抗体単独投与群と併用投与群にはモノクローナ
ル抗体を移植１２日から１００μg/マウスを週２回ずつ
計８回腹腔内投与し、コントロール群にはマウスＩgＧ
を同量投与し、移植６日目に評価を行った。各群におけ
る原発腫瘍重量、肝転移匹数、マウス体重及び脾重量は
図５、図６、図７及び図８に示されるとおりであり、原
発腫瘍重量及び肝転移個数について解析した結果を表３
に示した。これらの結果から、ヒト胃癌における原発腫
瘍重量に関しては、モノクローナル抗体、マイトマイシ
ンＣ単独投与群及び併用投与群において有意に抑制効果
が認められ、肝転移においても、特に併用投与群におい
て顕著に抑制効果が示された。体重減少などの副作用は
マイトマイシンＣを投与した２群では認められたが、モ
ノクローナル抗体投与群では認められず、該抗体が抗腫
瘍及び転移療法に有効なものであることがこの結果から
も示された。

【００２５】

【表３】 注：＊＝ｐ＜０.０５、＊＊＝ｐ＜０.０１、＊＊＊＝ｐ＜０.００１

【００２６】

【発明の効果】本発明により腫瘍の転移が抑制され、本
発明の薬剤は転移療法に有効に利用されるものである。

【００２７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＶＥＧＦ₁₂₁中の一部分に相当する６７
種のペプチドに対するモノクローナル抗体ＭＶ833の反
応性を調べた図である。

【図２】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体を投与した際の
原発腫瘍重量を示す図である。

【図３】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体を投与した際の
肉眼的肝転移巣数を示す図である。

【図４】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体を投与した際の
マウス体重を示す図である。

【図５】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体とマイトマイシ
ンＣを併用投与した際の原発腫瘍重量を示す図である。

【図６】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体とマイトマイシ
ンＣをを投与した際の肝転移匹数を示す図である。

【図７】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体とマイトマイシ
ンＣをを投与した際のマウス体重を示す図である。

【図８】 ＶＥＧＦモノクローナル抗体とマイトマイシ
ンＣをを投与した際の脾重量を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 馬塲 正三 静岡県浜松市半田町3776 医大宿舎Ｆ− 224 (72)発明者 浅野 誠 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 鈴木 日出夫 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血管内皮細胞増殖因子阻害剤からなる
   腫瘍転移抑制剤。
2. 【請求項２】 血管内皮細胞増殖因子阻害剤が抗血管
   内皮細胞増殖因子抗体であることを特徴とする請求項１
   記載の腫瘍転移抑制剤。
3. 【請求項３】 抗血管内皮細胞増殖因子抗体が抗血管
   内皮細胞増殖因子／血管透過性因子抗体であることを特
   徴とする請求項２記載の腫瘍転移抑制剤。
4. 【請求項４】 抗血管内皮細胞増殖因子／血管透過性
   因子抗体が当該因子のアミノ酸配列の一部である下記配
   列と反応する抗体であることを特徴とする請求項３記載
   の腫瘍転移抑制剤。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ