JPH11118806A

JPH11118806A - ヘモグロビンの安定化方法

Info

Publication number: JPH11118806A
Application number: JP9294896A
Authority: JP
Inventors: Michio Okamura; 道男岡村
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-10-13
Filing date: 1997-10-13
Publication date: 1999-04-30

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、ヘモグロビンを保護するための新た
な技術の提供を課題としている。【解決手段】本発明は、フェロシアン化合物と共存させ
ることによるヘモグロビンの安定化方法である。本発明
は、この安定化方法を応用したヘモグロビンの測定方法
や、糞便を懸濁させるための分散媒を合わせて提供す
る。【効果】本発明によれば、糞便懸濁液中等に存在するヘ
モグロビンを効果的に安定化することができる。本発明
は特にヘモグロビンの抗原性の保護効果に優れ、免疫学
的分析対象としてのヘモグロビンの安定化に有用な技術
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヘモグロビンの安定化
方法に関するものである。具体的には、検出の対象とな
る試料中のヘモグロビンや、陽性対照として用いる標準
物質としてのヘモグロビンの安定化技術に関するもので
ある。尿や糞便などに含まれるヘモグロビンの検出は、
多くの疾患の診断に有用である。特に糞便中のヘモグロ
ビン（便潜血）の検出は、大腸癌をはじめとする消化器
系の疾患の診断における重要な情報である。古くから便
中のヘモグロビン検出に利用されていた化学的な発色反
応に基づく試験紙法に代わり、近年はヘモグロビンに対
する抗体を利用した免疫学的手法による検出方法が普及
し、食事制限を必要としない手軽な検査方法として定着
している。

【０００２】

【従来技術の問題点】糞便等の試料中に含まれるヘモグ
ロビンを検出するには、糞便を採取後検査施設まで糞便
試料を輸送する必要がある。糞便試料の輸送には、採便
機構と糞便懸濁液のろ過機構を備えた輸送容器[ 1]が利
用されている。この種の容器を利用することにより、糞
便の定量的な採取が可能となり、また簡単に糞便懸濁液
をろ過することができる。糞便を採取した容器は、郵送
等の手段で検査施設に輸送される。

【０００３】輸送中は糞便に含まれる細菌やその他の多
くの成分とヘモグロビンが共存する状態にある。また一
般には温度の管理が困難なため、保存上好ましくない温
度条件にさらされることも避けられない。したがって輸
送中のヘモグロビンは、常に変性・分解の可能性があ
る。輸送中のヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結
果につながるので極力小さくすることが望まれる。

【０００４】ヘモグロビンに限らず、蛋白様物質の安定
化には他の蛋白や糖が用いられる。ヘモグロビンについ
ても、蛋白としてウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省
略する）、ウサギ血清アルブミン、あるいは卵白アルブ
ミン等が、また糖としてはショ糖等が安定化効果を示す
[ 2]ことが知られている。また動物血清の利用も報告さ
れている[ 3]。しかしこれらの一般的な安定剤は特に糞
便懸濁液中でのヘモグロビン安定化効果が小さく、十分
な保存性能を期待できない。糞便中には細菌や蛋白分解
酵素のようなヘモグロビンの変性・分解の原因となる多
くの成分が存在し、蛋白や糖のみではヘモグロビンを十
分に保護できないのである。

【０００５】更に動物血清では、精製された純粋な物質
ではないために安定化効果にロット差を生じ易い。加え
て、多くの成分を含む動物血清中には、ヘモグロビンに
対して変性作用をもたらす成分が存在する可能性を否定
できないので、望ましい安定化剤とは言い難い。またウ
シ血清でヘモグロビンの安定化を試みた報告[ 3]では、
１０−２０%v/vという多量の血清を加える必要があっ
た。高価な動物血清を多量に必要とする安定化技術は、
経済的には不利である。

【０００６】糞便懸濁液中のヘモグロビンを安定化する
技術としては、溶菌酵素の添加[ 4]、抗菌性化合物等の
利用[ 5][ 6]、動物ヘモグロビンの添加[ 7]、プロテア
ーゼ阻害物質の添加[ 8]、ｐＨのコントロール[ 9]、鉄
プロトポルフィリン[10]の添加、トランスフェリン[11]
[15]やペルオキシダーゼ[12]のような鉄含有蛋白質、そ
してフッ化ナトリウム[14]の添加等が公知である。ある
いは複数成分の組合せ[13]も試みられた。これらは細菌
の影響を抑制したり、あるいはヘモグロビンと構造的に
類似する化合物によりヘモグロビンに対する影響を分散
させることでヘモグロビンの保護効果を示すものと考え
られる。しかし糞便中にはこれらの公知のヘモグロビン
安定化技術ではなお影響を抑制することのできないヘモ
グロビン変性・分解作用が存在する。したがって現在の
ヘモグロビン安定化技術には、未だに改善の余地があ
る。

【０００７】この他にもエチレンジアミン４酢酸（以下
ＥＤＴＡと省略する）によるヘモグロビン安定化効果が
知られている[16]。しかし本発明者による追試の結果、
ＥＤＴＡでは糞便中のヘモグロビンに対して十分な安定
化作用を期待できないことが確認された。したがって保
存上はきわめて不利な条件である糞便中においては、Ｅ
ＤＴＡでヘモグロビンを安定化することができないとい
える。

【０００８】これらのヘモグロビン安定化因子に加え、
本出願人は新たに遷移金属イオンの水溶性金属錯体のヘ
モグロビンの安定化作用を見出し特許出願している[1
7]。更に、糞便成分に対する抗体が、糞便中に存在する
血液蛋白の安定化に寄与することを利用した血液蛋白の
安定化技術についても特許出願した[18]。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なヘモ
グロビン保護物質の提供を第一の課題としている。特に
変性・分解作用の強い糞便成分と共存するヘモグロビン
を、効果的に安定化するための技術の提供が本発明の最
も大きな課題である。

【００１０】また本発明の第二の課題は、分析用試料と
してのヘモグロビンを安定化する技術の提供にある。具
体的には、現在の主流であるヘモグロビンを認識する抗
体を利用した免疫学的な手法によるヘモグロビンの検出
方法において検出対象となるヘモグロビン安定化技術の
提供を課題としている。

【００１１】本発明の第三の課題は、新しいヘモグロビ
ン安定化剤を利用した、免疫学的な分析を目的とする糞
便試料懸濁用の分散媒や、これを利用した測定技術を提
供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、フェロシアン
化合物を共存させることによるヘモグロビンの安定化方
法、ならびにこの安定化方法を適用した糞便試料懸濁用
分散媒である。加えて本発明は、生体試料中に含まれる
ヒト・ヘモグロビンのヘモグロビンを認識する抗体によ
る免疫学的測定方法であって、フェロシアン化合物存在
下で保存した生体試料を分析対象とする測定方法を提供
する。

【００１３】本発明のヘモグロビン安定化方法は、生体
試料中に存在する分析対象としてのヘモグロビンを安定
化するために有用である。特にヘモグロビンを認識する
抗体を用いた免疫学的手法によるヘモグロビンの測定方
法において、測定対象となるヘモグロビンの抗原性を高
度に安定化する。ヘモグロビンを検出すべき生体試料に
は、糞便や尿が知られている。糞便中のヘモグロビンは
消化器における出血の指標となり、一方尿にヘモグロビ
ンを検出するときには尿路における出血が疑われる。特
に糞便中のヘモグロビンは、食事に由来するヘモグロビ
ンと識別するために高度な特異性を備えた免疫学的手法
が利用されることが一般的になってきており、その抗原
性を安定に維持する必要性が高い。

【００１４】本発明の安定化方法を、糞便試料に存在す
るヘモグロビンに応用する場合には、糞便を懸濁させる
分散媒にフェロシアン化合物を添加しておくと良い。通
常の糞便中のヘモグロビンの検出にあたっては、糞便を
適当な分散媒に懸濁させ必要に応じてろ過して免疫学的
な分析用試料とする。このときに用いる分散媒にフェロ
シアン化合物を添加しておくのが有利である。分散媒に
おけるフェロシアン化合物の濃度は、実験の結果０．５
ｍＭ以上が使用量となる。

【００１５】他方、先に説明したように、現在は糞便の
採取・輸送・懸濁・ろ過を一つの容器で実施できる簡便
な輸送用容器が実用化されている。この種の容器には、
出荷時に分散媒が充填されており被検者が自身で糞便を
採取し、容器を検査施設に郵送すれば良いようになって
いる。一般には被検者はこのような作業に不慣れなた
め、糞便の採取量を厳密に制御できないケースを想定し
なければならない。また輸送中にフェロシアン化合物の
ヘモグロビン保護作用が多少低下しても問題の無いよう
に、過剰量で用いるのが望ましい。分散媒中でヘモグロ
ビンを速やかにフェロシアン化合物を接触させるために
も、過剰量で用いるのが望ましい条件である。したがっ
て、たとえばフェロシアン化カリウムをヒトのヘモグロ
ビンの安定化のために用いるケースを想定すると、設計
時に想定した糞便採取量１mg便に対して、０．０５〜１
０ｍＭ、より好ましくは０．０６〜１ｍＭの範囲でフェ
ロシアン化カリウムを加えるようにすると良い。

【００１６】本発明の保護剤であるフェロシアン化合物
の他、分散媒には公知の成分を添加することができる。
たとえば、ヘモグロビンの保存に有利なｐＨを与える緩
衝剤、微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤、ある
いはこれまでに知られている多くのヘモグロビン保護成
分の添加も有効である。なぜなら、本発明の保護剤であ
るフェロシアン化合物は、公知の保護成分とは異なった
作用機序でヘモグロビンを安定化しているものと推測さ
れるので、公知の安定化剤と組み合せることによりヘモ
グロビン保護作用の増強が期待できるためである。たと
えば次のような成分の保護効果が公知である。

【００１７】ヘモグロビンの安定化作用を持つ不活性蛋
白として、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、あるい
はヤギ等に由来する血清アルブミン、あるいは卵白に由
来するアルブミン等を示すことができる。リジンやヒス
チジン等のアミノ酸にもヘモグロビンの保護作用が認め
られる。抗菌性物質としては、溶菌酵素[ 4]、アジ化
物、安息香酸エチル、ペニシリン、ファンギソン[ 5]、
ストレプトマイシン、あるいはセファマイシン他非ペニ
シリン系の一連の抗生物質[ 6]等が公知である。トリプ
シンインヒビターやα２マクログロブリンのようなプロ
テアーゼ抑制物質がヘモグロビンを安定化することも知
られている[ 8]。フッ化ナトリウム[14]、あるいはＦｅ
（III）−ＥＤＴＡ錯体のような遷移金属イオンの水溶
性金属錯体[17]でも、ヘモグロビンの安定化作用が報告
されている。更にイオン強度を調節する塩類等を加える
ことができる。

【００１８】また分析やヘモグロビンの安定化を妨害し
ない範囲で、消臭剤、香料、あるいは色素等を併用する
ことも可能である。更に保存状態を確認できるようにｐ
Ｈ指示薬を組み合せたり、便の添加の有無や量を確認で
きるように正常な糞便に存在する成分の指示薬を加えて
おくこともできる。たとえば、ビリルビンと反応して変
色するジアゾニウム化合物を加えておけば、必要量の糞
便が採取されたかどうかを肉眼的に認識することができ
る。本発明に基づくヘモグロビン安定化用の溶液につい
て、具体的な組成の例を次に示す。フェロシアン化合物：０．５〜１００ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）：１０〜５００mM ＢＳＡ：０．１〜５% ＮａＮ3：０．１〜１%

【００１９】また分散媒のｐＨは、ヘモグロビンを安定
に保持できる範囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件
下ではヘモグロビンの安定性を損なう恐れがあり、また
フェロシアン化合物による保護作用を得にくくなるた
め、中性域のｐＨが望ましい。具体的には５〜１０、好
ましくは６〜８程度のｐＨとするとよい。ｐＨの維持の
ためには適当な緩衝剤を利用することができる。たとえ
ば、ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン
酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic
acid 、ＨＥＰＥＳと省略する）や、ピペラジン−ビス
（２−エタンスルホン酸）（Piperazine-N、N'-bis(2-e
thanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省略する）等のＧ
ＯＯＤ緩衝剤は、ヘモグロビンの構造を最も安定化する
と思われるｐＨ（６〜８）を与えると同時に、免疫反応
によってヘモグロビンを検出する時の反応用緩衝液とし
ても利用されているものであり特に好ましい緩衝剤とし
て挙げられる。この他、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝
液、グリシン緩衝液等を利用することもできる。

【００２０】本発明のヘモグロビンの安定化方法は、糞
便潜血の検出を目的とする糞便試料中のヘモグロビンの
安定化に利用することができる。特に抗原構造の保護が
要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロビンに
ついて、その抗原性の維持に有用である。

【００２１】本発明は、前記ヘモグロビン安定化技術を
応用したヘモグロビンの免疫学的測定方法を提供する。
免疫学的な測定方法としては、ラテックス凝集反応法、
金コロイド凝集反応法、イムノクロマトグラフ法、ある
いはＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。いずれの測
定方法においても、ヘモグロビン含有試料にフェロシア
ン化合物を共存させることによって、保存中の抗原活性
は保護され測定値の低下が抑制される。

【００２２】またモノクローナル抗体のみで凝集反応系
を構成することも可能である。モノクローナル抗体のみ
で凝集反応を行うには、ヘモグロビン上の異なるエピト
ープを認識するものを複数種組み合せるのが有利であ
る。ヘモグロビンはα鎖とβ鎖が２つづつ会合した４量
体構造を持っており、原理的には１種類のモノクローナ
ル抗体であっても凝集する。しかし、ヘモグロビンは溶
液中ではαβという２量体構造と４量体構造との平衡状
態にあるので、単一のモノクローナル抗体ではその全て
と反応することができない。また単一のモノクローナル
抗体ではターゲットとなるエピトープが変性を受けると
反応できなくなってしまうので、複数種のモノクローナ
ル抗体を組み合せて用いるのは確率的にも有利である。

【００２３】

【作用】本発明におけるフェロシアン化合物は、保存期
間中におけるヘモグロビンの測定値低下を効果的に抑制
する作用を持つ。特に変性・分解作用成分を多く含み、
また保存条件の管理が困難な糞便懸濁液中のヘモグロビ
ンに対しても十分な保護作用を示す。フェロシアン化合
物がどのような作用機序によってヘモグロビンを保護す
るのかは不明である。

【００２４】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン安定化技術では、
ヘモグロビンに対して強い変性・分解作用を持つ糞便成
分との共存下においても保護作用を得ることができる。
したがって、糞便潜血の分析を目的とする試料に含まれ
るヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の
保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロ
ビンについて、その抗原性の維持に貢献する。本発明に
よって糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化さ
れ、ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止
を期待することができる。本発明に必要なフェロシアン
化合物は、安価であり、たとえば特殊な酵素や抗生物質
のような高価な物質に比べて経済的に有利である。また
フェロシアン化合物が少量で高い安定化効果を示すこと
からも、やはり経済的に有利な安定化技術と言うことが
できる。

【００２５】続いて実施例に基づいて本発明を更に詳細
に説明する。

【００２６】

【実施例】

１．フェロシアン化合物によるヘモグロビンの安定化あらかじめヘモグロビン量を測定したヒト糞便試料か
ら、ヘモグロビン量７００ng/ml以上の５種を選択し、フ
ェロシアン化合物（０〜１００mＭ）を含む分散媒（５
０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、０．１%ＢＳＡ
含有）に懸濁し、３７℃、２４時間保存したときの測定
値の変化を観察した。市販の採便容器（栄研化学製）に
フェロシアン化ナトリウム（和光純薬製）を０、５、１
０、２０、５０、１００mMそれぞれ含む分散媒２mlを分
注した容器を各２本用意し、採便容器の指示書に従い上
記５種の糞便を採取し、良く懸濁させた後、その各１本
のヘモグロビン量を測定し、残りの各１本は３７℃の恒
温槽に保存し２４時間後にヘモグロビン量を測定した。

【００２７】上記採便容器は、滴下部に孔を設けること
で内部の液体をろ過して取り出すことができる機構を採
便機構と組み合わせたもので、糞便採取用の棒で糞便を
採取して容器に装着すれば擦りきり機構によって採便を
定量的に採取することができる。実験に使った容器では
およそ１０mgの糞便を採取するように設計されている。

【００２８】ヘモグロビンの測定：採便容器の指示書に
したがって容器の滴下部分に孔を開け、容器を圧搾して
糞便懸濁液を滴下しろ過液を得た。市販のヘモグロビン
測定試薬ＯＣ−ヘモディアオートII‘栄研’（栄研化学
製）を用い、ろ過液５０μlに試薬を３００μl加えて３
７℃で３分間反応させた。この間の免疫学的凝集反応に
基づく５８５nmにおける吸光度変化量よりヘモグロビン
濃度を決定した。なお標準としては、試薬に添付のヒト
溶血液（１０００ng/mlヒト・ヘモグロビン含有ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液）を用いた。

【００２９】結果を表１および図１に示す。表中の数字
は、３７℃、２４時間保存後の糞便５種のヘモグロビン
測定値を実験開始時の測定値を１００とする％で表した
ものであり、図１は各糞便のヘモグロビン安定化に対す
るフェロシアン化ナトリウムの濃度の効果を折れ線グラ
フで示したものである。ヘモグロビンの安定化効果はフ
ェロシアン化合物濃度５mMをピークに高濃度になるに従
い低下しているものの、無添加に比べ顕著な安定化作用
が認められた。

【００３０】

【表１】

【００３１】フェロシアン化合物をフェロシアン化カリ
ウム（和光純薬製）に代え、糞便試料を１０種に増加し、
５mM以下の低濃度域における安定化効果を検討した。測
定方法は１と同様である。結果を表２および図２に示
す。フェロシアン化カリウム濃度1.2mMでほぼプラトー
に達するレスポンス曲線が得られた。

【００３２】

【表２】

【００３３】1.2mMのフェロシアン化カリウムと他のヘ
モグロビン安定剤２種との効果を比較した。ウシヘモグ
ロビン（シグマ社製）５００μｇと鉄−ＥＤＴＡ錯体
（Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ（同仁化学製））２mM分をそれ
ぞれ２mlの分散媒に加え、他は２と同様に、３７℃、２
４時間後のヘモグロビン残存率を測定した。結果を図３
に示す。糞便ごとに安定化効果にばらつきのあるもの
の、フェロシアン化合物は、従来安定性に効果的とされ
る動物ヘモグロビンおよびＦｅ(III)−ＥＤＴＡと同等
以上の安定加化効果を示した。

【００３４】引用文献 [ 1] 実公平５−１７６５２ [ 2] 特開昭６３−２４３７５６ [ 3] 特開平４−１４５３６６ [ 4] 特公平５−６９４６６ [ 5] 特開昭６３−２７１１６０ [ 6] 特開平７−７２１５４ [ 7] 特開平２−２９６１４９ [ 8] 特開平３−２７９８５９ [ 9] 特開平５−２８１２２６ [10] 特開平５−２８１２２７ [11] 特開平８−２９４２９ [12] 特開平８−２９４３０ [13] 特開平６−２８１６５４ [14] 特開平７−１９１０２６ [15] 特開平８−２６２０２０ [16] 特開平２−２２１８５９ [17] 特開平７−２２９９０２ [18] 特願平７−３０２０５１

【図面の簡単な説明】

【図１】高濃度域フェロシアン化ナトリウムのヘモグロ
ビン安定化効果

【図２】低濃度域フェロシアン化カリウムのヘモグロビ
ン安定化効果

【図３】フェロシアン化カリウムと各種安定化剤との安
定性比較

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フェロシアン化合物を共存させることによ
るヘモグロビンの安定化方法
【請求項２】ヘモグロビンが糞便懸濁液中に存在してお
り、この懸濁液の分散媒がフェロシアン化合物を含んで
いる請求項１のヘモグロビンの安定化方法
【請求項３】ヘモグロビンが尿中に存在しており、尿に
フェロシアン化合物を加えることによる請求項１のヘモ
グロビンの安定化方法
【請求項４】フェロシアン化合物がフェロシアン化ナト
リウムまたはフェロシアン化カリウムである請求項１〜
３のヘモグロビンの安定化方法
【請求項５】ヘモグロビンが、ヘモグロビンを認識する
抗体を利用した免疫学的な手法によって分析される分析
対象成分であり、その抗原活性を安定化する請求項１の
ヘモグロビンの安定化方法
【請求項６】ヘモグロビンがヒト・ヘモグロビンである
請求項１のヘモグロビンの安定化方法
【請求項７】フェロシアン化合物濃度が０．５〜１００
ｍＭである請求項１のヘモグロビンの安定化方法
【請求項８】ヘモグロビンの存在を試験すべき糞便試料
を懸濁させるための分散媒であって、予めフェロシアン
化合物を添加した分散媒
【請求項９】懸濁すべき糞便１mg当たり、０．０５−１
００ｍＭのフェロシアン化合物を添加した請求項９の分
散媒
【請求項１０】生体試料中に含まれるヒト・ヘモグロビ
ンの、ヘモグロビンを認識する抗体を利用した免疫学的
測定方法であって、フェロシアン化合物の共存下で保存
された生体試料を分析対象とする測定方法