JPH11146786A - ｈ−Ｈｙｄ蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドおよび該蛋白質を認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトにおけるショウジョウバエｈｙｄ遺伝子
（ｄ−ｈｙｄ遺伝子）のホモログ遺伝子を単離し、その
塩基配列を決定し、該遺伝子がコードするホモログ蛋白
質を作製すること、さらに該蛋白質を認識する抗体を作
製することを課題とする。 【解決手段】 ヒトにおけるｄ−ｈｙｄホモログ蛋白質
（ｈ−Ｈｙｄ）、該蛋白質をコードする遺伝子（ｈ−Ｈ
ｙｄ遺伝子）を提供する。また、ｈ−Ｈｙｄの変異体を
提供する。また、前記の蛋白質を認識する抗体を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ショウジョウバエ
のハイパープラスチックディスク（ｈｙｄ）蛋白質のホ
モログ蛋白質および該ホモログ蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドに関する。また、前記ポリヌクレオチドの
アンチセンスポリヌクレオチドに関する。また、前記ホ
モログ蛋白質を認識する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊椎動物の中でもヒトは最も高度に分化
した神経系を持つ生物である。しかし、該神経系につい
ての解析はその複雑な機構のため遅れている。特に脳神
経系に発生する腫瘍については、他の腫瘍に比べその解
析が遅れている。脳神経系においては、悪性腫瘍はもち
ろんのこと、良性腫瘍であっても発生部位によっては患
者の生命を脅かすことがあり、脳神経腫瘍の発生機序の
解明の進展が待たれている。

【０００３】一方、ショウジョウバエでは、神経発生の
解析の過程で多くの突然変異体が得られており、その遺
伝学的解析が進んでいる。ショウジョウバエのハイパー
プラスチックディスク遺伝子（以降ｄ−ｈｙｄ遺伝子と
いうことがある）は、そのホモ欠失が致死であり、種々
の温度感受性変異体では、成虫原基の過形成を発生する
ことから、細胞増殖の制御因子と考えられる。この遺伝
子がコードするショウジョウバエのハイパープラスチッ
クディスク蛋白質（以降ｄ−ｈｙｄ蛋白質ということが
ある）は、２８９７アミノ酸からなる蛋白質であり、そ
のＣ末端側には、ｐｏｌｙ（Ａ）結合ドメインを有して
おり、しかも細胞内蛋白質分解系においてユビキチン・
ライゲースの活性部位であり、Ｅ６ＡＰのＣ末端相同ド
メインであるｈｅｃｔ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏＥ
６ＡＰ）ドメインを持つことが知られている。

【０００４】また、ラットにおけるｄ−ｈｙｄ遺伝子の
相同遺伝子（ホモログ遺伝子）の塩基配列および該遺伝
子がコードする蛋白質（ホモログ蛋白質）のアミノ酸配
列が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトにおけ
るｈｙｄ遺伝子の相同遺伝子（ホモログ遺伝子）を単離
し、その塩基配列を決定し、該遺伝子がコードする蛋白
質（ホモログ蛋白質）を作製し、さらに該蛋白質を認識
する抗体を取得することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ｈｙｄ遺伝
子の塩基配列をもとにＥＳＴデータベースを探索して該
データベースからｈｙｄ遺伝子とホモロジーのある塩基
配列を選び出した。そして、該塩基配列の一部の塩基配
列からなるプライマーを作製した。そして、該プライマ
ーを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーおよび慢性
骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）ｃＤＮＡライブラリー
を鋳型にしてＰＣＲを行うことでヒトにおけるホモログ
遺伝子であるヒトｈｙｄ（ｈ−Ｈｙｄ）遺伝子を単離
し、その塩基配列を決定した。

【０００７】また、本発明は、前記塩基配列の相補塩基
配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドをも提供す
る。

【０００８】また、本出願において、ｈ−Ｈｙｄ蛋白質
（以降、ｈ−Ｈｙｄということがある）の作製方法が開
示される。さらに具体的には、前記のｈ−Ｈｙｄ遺伝子
を導入した形質転換体にｈ−Ｈｙｄ蛋白質を作製させる
方法が開示される。また、ｈ−Ｈｙｄのアミノ酸配列の
うち１または複数のアミノ酸を置換、欠失または付加し
たｈ−Ｈｙｄの変異体の作製方法を開示するものであ
る。

【０００９】また、本発明は、前記ｈ−Ｈｙｄを認識す
る抗体を提供する。本出願において該抗体を作製し、ｈ
−Ｈｙｄの抗原性、すなわち一般にｈ−Ｈｙｄから抗体
を作製することが可能であることが開示される。

【００１０】また、本発明は、ノーザンブロットハイブ
リダイゼーション法による解析により、ヒトの各組織や
細胞株からｈ−ＨｙｄのｍＲＮＡを検出できる遺伝子プ
ローブを提供する。本発明の遺伝子プローブによりヒト
で天然にｈ−ＨｙｄのｍＲＮＡが発現していることが確
認される。

【００１１】また、本出願は、ｈ−Ｈｙｄ遺伝子につい
て染色体上の位置を開示する。

【００１２】

【発明の実施の形態】自然の変異によりまたは人工の変
異（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）１５．
１−１５．１１３ページに記載の方法）により、ポリヌ
クレオチドがコードする蛋白質の主たる機能に変化を与
えることなく、該ポリヌクレオチドの構造を変化させる
ことが可能である。この方法により、本発明のｈ−Ｈｙ
ｄについても配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
における一または複数のアミノ酸を置換、欠失または付
加したアミノ酸配列からなる蛋白質、すなわちｈ−Ｈｙ
ｄ変異体を作製することが可能である。より具体的に
は、ｃＤＮＡライブラリー等から得られた配列表の配列
番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡについて、ｐｏ
ｌｙ（Ａ）結合ドメインおよび細胞内蛋白質分解系にお
けるユビキチン・ライゲースの活性部位であるｈｅｃｔ
（Ｅ６ＡＰＣ末端相同）ドメインをコードする部分以外
の一部の塩基を置換、欠失または付加させるいわゆるポ
イントミューテーションを行って、該ＤＮＡの変異体を
得る。このＤＮＡ変異体を大腸菌等の適当な宿主に導入
して形質転換体を作製し、該形質転換体に、該導入した
ＤＮＡ変異体がコードする蛋白質を作製させることによ
りｈ−Ｈｙｄの変異体の作製が可能である。

【００１３】本発明のｈ−Ｈｙｄ変異体のアミノ酸配列
は、該変異体をコードする遺伝子の塩基配列から決定す
ることが可能である。例えば、市販のプログラム（例え
ば、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ（登録商標、ソフトウェア
ディベロプメント社製）を用いて可能である。

【００１４】遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチド
から生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。し
たがって、本発明のｈ−Ｈｙｄをコードするポリヌクレ
オチドとは、縮重の全てのパターンを含むものである。

【００１５】配列表の配列番号２に記載の塩基配列から
なるＤＮＡは、天然に存在するｈ−Ｈｙｄ遺伝子であ
る。

【００１６】本発明は、前記ｈ−Ｈｙｄをコードするポ
リヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるア
ンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体を含むも
のである。該アンチセンスポリヌクレオチドには、配列
表の配列番号２に記載の塩基配列に相補な塩基配列から
なるＤＮＡまたは配列表の配列番号２に記載の塩基配列
からなるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補
な塩基配列からなるＲＮＡが挙げられる。本発明のアン
チセンスポリヌクレオチドは、ｈ−Ｈｙｄをコードする
ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なも
のであり、それがハイブリダイズするポリヌクレオチド
がコード領域のポリヌクレオチドであれば該ポリヌクレ
オチドがコードするポリペプチドの生合成を阻害するこ
とが可能である。なお、アンチセンスポリヌクレオチド
およびその誘導体は、ポリヌクレオチドに含まれるもの
であるが、本明細書において、特にアンチセンス鎖の塩
基配列からなることを明示する場合に、アンチセンスポ
リヌクレオチドという。

【００１７】一般に、ポリペプチドの生合成を阻害する
ためのアンチセンスポリヌクレオチドは、１５塩基以上
からなることが好ましい。一方、アンチセンスポリヌク
レオチドがあまり長くと、細胞内に該アンチセンスポリ
ヌクレオチドを取り込ませるのは困難である。細胞内に
アンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、ｈ−Ｈｙ
ｄの生合成を阻害させる場合、一般に、１２塩基以上３
０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、よ
り好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基からなる
アンチセンスポリヌクレオチドを用いるのがよい。本発
明のアンチセンスポリヌクレオチドにおいても、１２塩
基以上３９塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基
以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基
からなるものを用いるのがよい。

【００１８】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその一部分は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオ
チドが複数結合したものが、天然には存在しないものを
含めて全て含まれる。代表的なものは、アンチセンスＤ
ＮＡとアンチセンスＲＮＡである。

【００１９】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに
ついて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的のＤＮ
ＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択制、細胞透過性、ヌ
クレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なアンチセン
スポリヌクレオチド誘導体が得られる。

【００２０】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその誘導体を設計するとよいとされている。本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体は、
必要に応じ、ステムループを形成することが可能であ
る。

【００２１】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがっ
て、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体であって、ｈ−Ｈｙｄをコードする遺伝子または
ｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、
キャッピング部位、スプライス部位の相補的な配列を含
むものは、高い発現抑制効果が期待される。

【００２２】現在一般的に知られている誘導体は、ヌク
レアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少な
くとも一が高められた誘導体であることが好ましい。特
に好ましくは、フォスフォロチオエート結合を骨格構造
として有する誘導体である。本発明のポリヌクレオチド
およびその誘導体についても、これらの機能または構造
を有する誘導体が含まれる。

【００２３】天然型のアンチセンスポリヌクレオチドで
あれば、化学合成機を使用して合成したり、ｈ−Ｈｙｄ
をコードする遺伝子を鋳型とするＰＣＲ法により本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドを作製することができ
る。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチ
オエート型等、誘導体の中には、化学合成できるものも
ある。この場合には、化学合成機に添付されている説明
書にしたがって操作を行い、得られた合成産物を逆相ク
ロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製する
ことによっても、目的のアンチセンスポリヌクレオチド
またはその誘導体を得ることができる。

【００２４】本発明のｈ−Ｈｙｄをコードするポリヌク
レオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまたはそ
れらの一部（連続する１２塩基以上の塩基配列からなる
ポリヌクレオチド）であるポリヌクレオチドは、ｃＤＮ
Ａライブラリー等からｈ−Ｈｙｄ遺伝子をスクリーニン
グするためのプローブとして使用可能である。このとき
ＧＣ含有率が３０ないし７０％のものが好適に使用可能
である。また、連続する１５塩基以上の塩基配列からな
るポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドがハイブリ
ダイズする遺伝子が確率的に唯一である点で、特に好ま
しい。プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導
体であってもよい。通常、上記の塩基数以上の配列は特
異性のある配列であると認識されている。該プローブを
用いたスクリーニングにおいて使用するｃＤＮＡライブ
ラリーとしては、ｍＲＮＡから作製されたものが好まし
く使用できる。これらのｃＤＮＡライブラリーからラン
ダムサンプリングにより選択された一群のｃＤＮＡを検
索の試料とすることができる。また、市販のものでも使
用可能である。

【００２５】例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基
配列のうちの連続する１２塩基以上の塩基配列からなる
ＤＮＡまたは該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレ
オチド（アンチセンスポリヌクレオチド）は、ｃＤＮＡ
ライブラリー等からｈ−Ｈｙｄ遺伝子をスクリーニング
するためのプローブとして使用可能である。

【００２６】また、本発明のｈ−Ｈｙｄをコードするポ
リヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドま
たはそれらの一部であるポリヌクレオチドをプローブと
して、各組織由来のｍＲＮＡについてノーザンブロット
ハイブリダイゼーションを行うことにより、ｈ−Ｈｙｄ
遺伝子由来のｍＲＮＡが発現している組織を見出すこと
が可能である。

【００２７】ＤＮＡ又はＲＮＡを化学合成するときに、
側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化するこ
と、またはリン酸基部分のＯをＳ置換すること等の化学
的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表
の配列番号２に記載のＤＮＡを化学合成するときに、該
化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそのものと異
なる二次構造のＤＮＡを合成することが可能である。ま
た、ｃＤＮＡライブラリーから取得されたｃＤＮＡであ
っても放射性同位体等で標識することも可能である。し
たがって、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡは、上記の化学修
飾されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレ
オチドをその範囲に含むものである。化学修飾されたＤ
ＮＡまたはＲＮＡは、蛋白質をコードする機能またはプ
ローブとしての機能をいずれも発揮可能なものであり、
化学修飾されたアンチセンスポリヌクレオチドは、プロ
ーブまたは蛋白質の生合成を阻害する機能またはプロー
ブとしての機能をいずれも発揮可能なものである。

【００２８】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。本発明のｈ−Ｈｙｄ遺伝子を導入した形質転換体
を培養して遺伝子の増幅または蛋白質の発現を行わせ、
ｈ−Ｈｙｄを作製させることが可能である。また、同様
に、ｈ−Ｈｙｄ変異体をコードするＤＮＡを導入した形
質転換体を培養してｈ−Ｈｙｄ変異体を作製させること
が可能である。また、実施例にも示すようにｈ−Ｈｙｄ
をコードするｃＤＮＡのうちの任意の一部分を導入した
形質転換体を培養して該ｈ−Ｈｙｄの一部分を作製させ
ることが可能である。ｈ−Ｈｙｄの一部分を作製するこ
とにより、ｈ−Ｈｙｄの機能を有する低分子の蛋白質ま
たはペプチドを作製することができる。前記の作製物を
回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマ
トグラフィー等の操作を行うことにより、本発明のｈ−
Ｈｙｄ（その一部分を含む、以降、本明細書では特に断
らない限りｈ−Ｈｙｄの表記をその一部分を含むものと
して使用する。）またはｈ−Ｈｙｄ変異体を精製するこ
とが可能である。

【００２９】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、本発明に記載の塩基配列に基づいてｈ−Ｈｙ
ｄまたはｈ−Ｈｙｄ変異体を作製させることは、公知の
方法により可能である。このとき、宿主としては、大腸
菌等の細菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能である
が、特には動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入す
るには、リボソーム法、エレクトロポーレーション法等
を用いることができる。

【００３０】得られた培養物からｈ−Ｈｙｄまたはｈ−
Ｈｙｄ変異体を精製する精製方法には、免疫沈降法、塩
析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳
動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマ
トグラフィー法や抗体クロマトグラフィー法等の各種ア
フィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシ
ング法、吸着クロマトグラフィー法および逆相クロマト
グラフィー法等があり、適宜選択して行えばよい。

【００３１】また、製造段階において、製造するｈ−Ｈ
ｙｄまたはｈ−Ｈｙｄ変異体は、他のポリペプチドとの
融合ペプチドとして形質転換体に作製させてもよい。こ
の場合は、精製工程において、ブロムシアン等の化学物
質やプロテーゼ等の酵素で処理して、ｈ−Ｈｙｄまたは
ｈ−Ｈｙｄ変異体を切り出す操作が必要になる。

【００３２】本発明は、ｈ−Ｈｙｄの抗原性について、
実施例３、４に例示するように、前記方法により得られ
たｈ−Ｈｙｄまたはｈ−Ｈｙｄに特異的なアミノ酸配列
からなるオリゴペプチドをｈ−Ｈｙｄが由来する動物お
よびヒト以外の動物に免疫することで容易に抗体が得ら
れるものであることを明らかにするものである。したが
って、本発明のｈ−Ｈｙｄを認識する抗体（以降、ｈ−
Ｈｙｄ抗体ということがある）は、ｈ−Ｈｙｄをｈ−Ｈ
ｙｄが由来する動物およびヒト以外の動物に免疫感作す
ることにより得られる抗体であって、該抗体が本発明の
ｈ−Ｈｙｄを認識することがウェスタンブロット法、Ｅ
ＬＩＳＡ法や免疫染色法（例えばＦＡＣＳでの測定）等
により確認される抗体をその範囲内に含む。

【００３３】また、免疫原として、蛋白質の一部であっ
ても該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキ
ャリアー蛋白質に結合させたものを用いることは、よく
用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一
部としては、８アミノ酸残基以上であることが好まし
い。抗原性が明らかとなった物質については、免疫感作
によってポリクローナル抗体が得られるならば、該免疫
した動物のリンパ球を用いたハイブリドーマによりモノ
クローナル抗体が産生されることはよく知られている
（『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）第
６章）。したがって本発明のｈ−Ｈｙｄ抗体はモノクロ
ーナル抗体もその範囲内に含むものである。

【００３４】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂ 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとＦ（ａｂ’）₂ が得られ、パパイン
で分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂ を２−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。

【００３５】本発明の抗体は、ｈ−Ｈｙｄの発現等の機
能の解明や悪性腫瘍の形成機構の解明のために使用可能
である。

【００３６】ｈ−Ｈｙｄの検出については、抗体を用い
る方法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。抗体を
用いる方法としては具体的には、標識されたｈ−Ｈｙ
ｄ抗体を用いてｈ−Ｈｙｄを検出する方法、ｈ−Ｈｙ
ｄ抗体および該抗体の標識二次抗体を用いてｈ−Ｈｙｄ
を検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば放
射性同位元素（ＲＩ）、酵素、アビジン又はビオチン、
もしくは蛍光物質（ＦＩＴＣやローダミン等）が利用さ
れる。

【００３７】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロット
法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定
方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて、より詳細に本発明を
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。 ＜実施例１＞ｈ−Ｈｙｄ遺伝子の単離および塩基配列の
決定 １．ＥＳＴデータベースの検索 インターネットのＥＳＴデータベース（ｍＲＮＡの断片
の配列を登録してあるデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｄｂＥＳ
Ｔ）に登録された配列（ＥＳＴ）から、ショウジョウバ
エのｈｙｄ（ｄ−ｈｙｄ）遺伝子とホモロジーのある配
列を探索した。ｄ−ｈｙｄ蛋白質のアミノ酸配列の２６
４２ないし２８９４番目の部分をブラストサーチ（ＢＬ
ＡＳＴｓｅａｒｃｈ）で検索したところヒト胎児心臓ｃ
ＤＮＡ由来のＷ９５８５７として登録されている配列が
ヒットした。

【００３９】２．プライマーの合成 ｃＤＮＡライブラリーから、上記のＷ９５８５７の塩基
配列の一部の塩基配列からなるＤＮＡフラグメントを取
得するために以下のプライマーを合成した。アンチセン
スプライマーとしてＡＲプライマー 5'-TAGTAATATTACAC
AGCAATACAC-3'（配列表の配列番号４に記載の塩基配
列）およびＥｎｄプライマー 5'-CTACACAAAACCAAAATTCT
TGGT-3'（配列表の配列番号５に記載の塩基配列）を設
計し、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製、モデル３９２）にて
合成した。合成したプライマーは、蒸留水で２０ｐｍｏ
ｌ／μｌに調製した。これをＰＣＲプライマーとして用
いて、以下のＰＣＲ操作を行った。

【００４０】３．ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリーには、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブ
ラリー（ストラタジーン社製）および慢性骨髄性白血病
細胞株Ｋ５６２ｃＤＮＡライブラリー（ＵＫＨＧＭＰリ
ソースセンター製）を用い、それぞれについて、以下の
条件でＰＣＲを行った。なお、これらのｃＤＮＡライブ
ラリーは５’末端がＴ７配列となっている。まず、プラ
イマーとしてＴ７プライマー（センス側）とＡＲプライ
マー（アンチセンス側）を使用し、ＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲ操作は、以下の組成からなる液を試験管に入れ、そ
の上にミネラルオイルを２０μｌ重層し、９４℃で５分
間放置した。 ｃＤＮＡライブラリー（１μｇ／μｌ） ５μｌ ｄＮＴＰ混合液（各ＮＴＰを２０ｐｍｏｌ／μｌに蒸留水中に溶解） １μｌ Ｔ７センスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ＡＲアンチセンスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ １０倍濃度のＰＣＲ緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、 １Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ ＤＴＴ） ２μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ） ０．５μｌ 蒸留水 ９．５μｌ 合計 ２０μｌ その後、「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１．５分
間、続いて９４℃で３０秒間のサイクル」を５０回繰り
返して反応を行った。次いで５５℃で２分間、最後に７
２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣ
Ｒ操作を完了した。

【００４１】その後、上記で得たＰＣＲ産物を鋳型とし
て、Ｔ７プライマー（センス側）およびＥｎｄプライマ
ー（アンチセンス側）を用いて２度目のＰＣＲ操作を行
った。２度目のＰＣＲ操作は、以下の組成からなる液を
試験管に入れ、その上にミネラルオイルを２０μｌ重層
し、９４℃で５分間放置した。 上記で得たＰＣＲ産物（１μｇ／μｌ） ５μｌ ｄＮＴＰ混合液 １μｌ Ｔ７プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ Ｅｎｄプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ １０倍濃度のＰＣＲ緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、 １Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ ＤＴＴ） ２μｌ 蒸留水 ９．５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ） ０．５μｌ 合計 ２０μｌ その後、「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、
続いて９４℃で３０秒間のサイクル」を４０回繰り返し
て反応を行った。次いで５５℃で２分間、最後に７２℃
で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操
作を完了した。

【００４２】４．形質転換体の作製 上記で得たｈ−ＨｙｄのＤＮＡをミニゲル電気泳動
（０．７５％アガロースゲル）させて、該ＤＮＡのバン
ド（２．７ｋｂｐ）をゲルから切り出した。ＧｅｎｅＣ
ｌｅａｎ（登録商標、バイオ１０１社製）でＤＮＡを回
収して、ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。

【００４３】ＤＮＡを１μｌ取り、９９μｌのＴＥにて
希釈した。２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６０）を測定
し、ＤＮＡ濃度を計算した（Ａ２６０が１．０のときの
ＤＮＡ濃度を５０μｌ／ｍｌとした。）。ＤＮＡ濃度が
１μｇ／μｌになるようにＴＥでＤＮＡを希釈した。

【００４４】上記の塩基配列からなる全長のｈ−Ｈｙｄ
遺伝子をｐＣＧＮベクターに挿入し、該ベクターを大腸
菌ＭＮ５２２に導入して形質転換体を作製した。この形
質転換体をｈ−Ｈｙｄと名付け、平成９年１０月１日に
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４５３）。

【００４５】５．塩基配列の決定 前記形質転換体から、アルカリ法（『Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ』
１．３３−１．４３ページに記載の方法）により、プラ
スミド（ｐＣＲＩＩベクター）を回収し、キアウェル
（登録商標）８プラスミドキット（ＯＩＡｗｅｉｉ ８
ｐｌａｓｍｉｄ ｋｉｔ）（キアゲン社製）によりプ
ラスミドを精製した。このプラスミドについて、Ｔ７プ
ライマー、Ｍ１３リバースプライマー、前記ＡＲプライ
マーおよび前記Ｅｎｄプライマーを用いて、ダイターミ
ネーター法により、オートシークエンサー（ＡＢＩモデ
ル３７３Ａ）を用いて、ＤＮＡシークエンスを行い、ｈ
−Ｈｙｄ遺伝子の塩基配列を決定した。この塩基配列を
配列表の配列番号２に示す。

【００４６】なお、ＰＣＲに用いたＡＲプライマーは、
ｈ−Ｈｙｄ遺伝子の３’非コード領域の塩基配列に相補
な塩基配列からなるプライマーであり、Ｅｎｄプライマ
ーは、ｈ−Ｈｙｄ遺伝子の終止コドンを含むコード領域
の３’末端の２４塩基に相補な塩基配列からなるプライ
マーである。

【００４７】６．アミノ酸配列の決定 上記の塩基配列より、ｈ−Ｈｙｄのアミノ酸配列を決定
した。このアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
また、ｈ−Ｈｙｄ（ｈｕｍａｎ−Ｈｙｄ）、ｄ−ｈｙｄ
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−Ｈｙｄ）およびラットにおけ
るｈｙｄ蛋白質ｒ−ｈｙｄ（ｒａｔ−Ｈｙｄ）の細胞内
蛋白質分解系におけるユビキチン・ライゲースの活性部
位であるｈｅｃｔ（Ｅ６ＡＰＣ末端相同）ドメインを対
比させた結果を図１に示す。図１中、白抜き文字が各ｈ
ｙｄに共通するアミノ酸部分である。ｈ−Ｈｙｄのｈｅ
ｃｔ（Ｅ６ＡＰＣ末端相同）ドメインは、配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列の６７２番目のＧｌｎから
８９０番目のＶａｌまでの部分である。

【００４８】＜実施例２＞ｈ−Ｈｙｄの各組織における
発現 ヒトの各組織のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびヒト
の各種細胞のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）それぞれにつ
いて、各２μｇをブロットしたメンブレン（Ｈｕｍａｎ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔ 、同ＩＩ、同ＩＩＩおよびＨｕｍａｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（クローン
テック社製））に、標識化した全長のｈ−Ｈｙｄ遺伝子
を、ハイストリンジェンシーの条件下で、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ７．３
９ページないし７．５２ページの記載にしたがってハイ
ブリダイズさせ、ノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン法による解析を行った。

【００４９】ｈ−Ｈｙｄ遺伝子の標識化は以下の操作に
より行った。 １）Ｔａｋａｒａ ＭＥＧＡ ＬＡＢＥＬキット（登録
商標、宝酒造社製）を用いて取扱説明書の通りに標識し
た。 ２）次に、下記の組成のＤＮＡ反応液を調製し、この液
を３７℃で３０分間インキュベートした後、７０℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させた。 ＤＮＡプローブ（２ｐｍｏｌ／μｌ） ２μｌ １０倍ホスホライレイション緩衝液 ２μｌ 〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（３７０ＭＢｑ／ｍｌ）（アマシャム製） ５μｌ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 合計１０μｌ

【００５０】３）ＴＥ５０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化されたＳｅ
ｐｈａｄｅｘＧ−２５（登録商標、ファルマシア社製）
を１．５ｍｌポリプレップカラム（バイオラッド社製）
にベッドボリュームが１ｍｌになるように詰め、２）で
熱処理をしたＤＮＡ反応液を該カラムに載せた。 ４）その後、２００μｌＴＥ５０をカラムに４回流し、
２回目の２００μｌで溶出した画分から標識化ＤＮＡプ
ローブを得た。

【００５１】各組織についての結果の写真を、図２、３
および４に示す。写真より、ｈ−ＨｙｄのｍＲＮＡ（８
ｋｂのバンド）が全ての組織で発現していることが分か
った。特に、心臓、精巣での発現が強いことが分かっ
た。

【００５２】各種細胞株についての結果の写真を図５に
示す。写真より、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）
およびＫ５６２で強く発現していることが分かった。

【００５３】＜実施例３＞ｈ−Ｈｙｄを認識する抗体の
作製（１） １．抗原の作製 配列表の配列番号１に記載のｈ−Ｈｙｄのアミノ酸配列
の４５３番目のＡｒｇから５０３番目のＰｈｅまでのア
ミノ酸配列のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を付加した
アミノ酸配列であるアミノ酸配列Ａ（配列表の配列番号
３に記載の配列）からなるペプチドを合成した。システ
インの付加はスカシ貝ヘモシアニン（ＫＨＬ）と結合さ
せるために付加した。合成は岩城硝子（株）に委託し
た。合成したペプチド２ｍｇをマレイミド化ＫＬＨ（ピ
アス社製）２ｍｇに結合させた。反応はピアス社のキッ
トの説明書に記載の方法にしたがった。

【００５４】２．免疫 配列Ａからなる抗原について、抗原液（１μｇ／ｍｌ）
１００μｌ、ＰＢＳ０．５ｍｌを及びフロイントコンプ
リートアジュバンド（ディフコ社製）０．５ｍｌをシリ
ンジに取り、混合してエマルジョンとし、ウサギの背に
４箇所に分けて皮下接種した。１週間後、２回目の免疫
を行った。２回目からはアジュバンドをフロイントイン
コンプリートアジュバンド（ディフコ社製）に変えて免
疫を行った。その他の操作は１回目と同様である。２回
目以降は１週間間隔を開けて、合計６回免疫を行った。

【００５５】３．抗体の精製 最終免疫の１週間後、採血した。この血液を室温で３時
間静置し、十分に血液凝固を行った後、３，０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離を行い、上清（血清）を回収した。
この血清に飽和硫安を最終濃度が５０％になるように加
えて塩析した。このサンプルを遠心分離して、抗体が含
まれる画分を沈殿させた。その後、沈殿物をＰＢＳに溶
解し、さらにＰＢＳに対して塩析した。その後、プロテ
インＧセファロースカラム（登録商標、ファルマシア社
製）を用いて、抗体をアフィニティー精製した。その結
果、全量で５ｍｇのペプチド特異的抗体が得られた。

【００５６】＜実施例４＞ｈ−Ｈｙｄを認識する抗体の
作製（２） １．抗原の作製 ＧＳＴ遺伝子を組み込んだベクターｐＧＥＸ−２ＴＨ
（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ間
に、配列表の配列番号２の１３５７番目のＡから２６７
３番目のＧまでを含むｈ−Ｈｙｄ遺伝子の３’末端側の
部分を挿入し、該ベクターを大腸菌ＤＨ５αに導入して
形質転換体を作製した。該形質転換体にｈ−ＨｙｄのＣ
末端側部分の蛋白質（配列表の配列番号１の４５３番目
のＡｒｇから８９０番目のＶａｌまでのアミノ酸配列か
らなる蛋白質）のＮ末端にＧＳＴを結合させたＧＳＴ−
ｈ−Ｈｙｄを作製させた。作製したペプチド２ｍｇをマ
レイミド化ＫＬＨ（ピアス社製）２ｍｇに結合させた。
反応はピアス社のキットの説明書に記載の方法にしたが
った。

【００５７】２．免疫 実施例３と同様にして、抗原液（１μｇ／ｍｌ）１００
μｌ、ＰＢＳ ０．５ｍｌを及びフロイントコンプリー
トアジュバンド（ディフコ社製）０．５ｍｌをシリンジ
に取り、混合してエマルジョンとし、ウサギの背に免疫
した。

【００５８】３．抗体の精製 実施例３と同様にして、ウサギの血液から抗体を精製し
た。これによりｈ−Ｈｙｄを抗原とする抗体が作製され
た。

【００５９】＜実施例５＞ウェスタンブロット 実施例４で作製したＧＳＴ−ｈ−Ｈｙｄをスロンビンで
消化し、ｈ−ＨｙｄとＧＳＴに切断した。ＧＳＴ−ｈ−
Ｈｙｄ、ｈ−Ｈｙｄ（４５３番目のＡｒｇから８９０番
目のＶａｌまでの部分蛋白質）およびＧＳＴについて１
０−２０％のグラジエントゲルで電気泳動した。電気泳
動後、トランスブロットシステム（マリソル社製）を用
い、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース
膜を１０％スキムミルク／ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０に浸し、１時間放置し、ブロッキングした。その
後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５分間ずつ２回
洗浄した。

【００６０】実施例４で作製した抗ｈ−Ｈｙｄ抗体を１
μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した後、ニトロセルロース膜
に加え、室温で４０分間反応させた。その後、０．３％
Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。次
いで、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（アマシャ
ム社製）をＰＢＳで２００００倍希釈した液を、ニトロ
セルロース膜に加え、さらに４０分間室温にて反応させ
た。その後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５分間
ずつ３回洗浄した。

【００６１】次いで、ＥＣＬキット（アマシャム社製）
の発色液を５ｍｌだけニトロセルロース膜に加え、１分
間反応させた。その後、このメンブレンをＸ線フィルム
に２０秒間露光し、現像した後、写真撮影した。

【００６２】コントロールとして、抗ｈ−Ｈｙｄ抗体の
代わりに抗ＧＳＴ抗体を用いて同様の操作を行った。結
果を図６に示す。抗ｈ−Ｈｙｄ抗体（図中α−ＧＳＴ−
ｈｙｄで示される）を用いた場合を左側に、ＧＳＴ抗体
（図中α−ＧＳＴで示される）を用いた場合を右側に示
す。抗ｈ−Ｈｙｄ抗体を用いた場合にのみ、ｈ−Ｈｙｄ
（図中ｈｙｄで示される）のバンドが観察され、実施例
４で作製した抗体が、ｈ−Ｈｙｄを認識することが確認
された。

【００６３】＜実施例６＞染色体マッピング ｈ−Ｈｙｄの全長遺伝子の染色体マッピングを以下のよ
うにして行った。 １．ＰＣＲ ＰＣＲは、ジーンブリッジ４ラジエーションハイブリッ
ドスクリーニングパネル（ＧＥＮＥＢＲＩＤＧＥ ４
Ｒｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎｉ
ｎｇ Ｐａｎｅｌ（リサーチジェネティクス社製）を鋳
型にして、ｈ−Ｈｙｄ遺伝子の一部をプライマーとして
行った。プライマーは、Ｓ１プライマー（センス方向）
5'-AGAGAGAGAC CGGGAAAGGG AGAGAGAAAG G-3'（配列表の
配列番号６に記載の塩基配列）とＡＳ１プライマー（ア
ンチセンス方向）5'-TCTCCAAGAGCCTGCCGATG T-3'（配列
表の配列番号７に記載の塩基配列）をＤＮＡ合成機によ
り合成し、それぞれ蒸留水中に２０ｐｍｏｌ／μｌとな
るように溶解したものを用いた。

【００６４】ＰＣＲ操作は、以下のように行った。下記
の組成からなる液を試験管に入れ、その上にミネラルオ
イル１５μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。 キットのパネル １μｌ ｄＮＴＰ混合液 １μｌ Ｓ１プライマー １μｌ ＡＳ１プライマー １μｌ １０倍濃度のＰＣＲ緩衝液 １．５μｌ 蒸留水 ９μｌ Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ 合計 １５μｌ その後、「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で３０秒
間、続いて９５℃で３０秒間」のサイクルを３５回繰り
返して反応を行った。次いで、６０℃で２分間、最後に
７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰ
ＣＲ操作を完了した。その後、ＰＣＲ産物の５μｌを、
２．０％アガロースゲル電気泳動した。

【００６５】２．マッピング その結果、前記プライマー（Ｓ１またはＡＳ１）がハイ
ブリダイズしたパネルのセクション番号を、Ｗｈｉｔｅ
ｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔ
ｐ：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃ
ｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐ
ｌ．）へ電子メールで送り、該番号のパネルの染色体位
置および塩基配列の情報を得た。その結果、ｈ−Ｈｙｄ
は、染色体８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ遺伝子の近傍）に位置
づけられた。

【００６６】

【発明の効果】本発明のｈ−Ｈｙｄは、そのアミノ酸配
列から予想される構造（ｐｏｌｙ（Ａ）結合ドメインお
よびｈｅｃｔドメイン）から細胞内蛋白分解と細胞増殖
に関わることが予想される。特に、そのｍＲＮＡの発現
が顕著に見られる心臓や精巣内で細胞内蛋白分解と細胞
増殖に関わることが予想される。したがって、本発明の
ｈ−Ｈｙｄまたはｈ−Ｈｙｄは悪性腫瘍の発生の機序解
析に有効である。

【００６７】本発明のｈ−Ｈｙｄをコードするポリヌク
レオチド、そのうちの連続する１２塩基以上の塩基配列
からなるポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオ
チドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（アンチセ
ンスポリヌクレオチドを含む）は、ｃＤＮＡライブラリ
ー等からｈ−Ｈｙｄ遺伝子をスクリーニングするための
プローブとして使用可能である。

【００６８】さらに本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チドはｈ−Ｈｙｄの生合成を阻害することができる。

【００６９】本発明の抗体は、ｈ−Ｈｙｄの発現等の機
能の解明や悪性腫瘍の発生の機序の解明のために使用可
能である。

【００７０】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：８９０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Met Ser Ala Arg Gly Asp Phe Leu Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Met 1 5 10 15 Arg Ser His Asn Asp Glu His Ser Asp Val Leu Pro Val Leu Asp Val 20 25 30 Cys Ser Leu Lys His Val Ala Tyr Val Phe Gln Ala Leu Ile Tyr Trp 35 40 45 Ile Lys Ala Met Asn Gln Gln Thr Ala Leu Asp Thr Pro Gln Leu Glu 50 55 60 Arg Lys Arg Thr Arg Gly Leu Leu Glu Leu Gly Ile Asp Asn Glu Asp 65 70 75 80 Ser Glu His Glu Asn Asp Asp Asp Thr Asn Gln Ser Ala Thr Leu Asn 85 90 95 Asp Lys Asp Asp Asp Ser Leu Pro Ala Glu Thr Gly Gln Asn His Pro 100 105 110 Phe Phe Arg Arg Ser Asp Ser Met Thr Phe Leu Gly Cys Ile Pro Pro 115 120 125 Asn Pro Phe Glu Val Pro Leu Ala Glu Ala Ile Pro Leu Ala Asp Gln 130 135 140 Pro His Leu Leu Gln Pro Asn Ala Arg Lys Glu Asp Leu Phe Gly Arg 145 150 155 160 Pro Ser Gln Gly Leu Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Ser Gly Lys Cys Leu 165 170 175 Met Glu Val Thr Val Asp Arg Asn Cys Leu Glu Val Leu Pro Thr Lys 180 185 190 Met Ser Tyr Ala Ala Asn Leu Lys Asn Val Met Asn Met Gln Asn Arg 195 200 205 Gln Lys Lys Glu Gly Glu Glu Gln Pro Val Leu Pro Glu Glu Thr Glu 210 215 220 Ser Ser Lys Pro Gly Pro Ser Ala His Asp His Ala Ala Gln Leu Lys 225 230 235 240 Ser Ser Leu Leu Ala Glu Ile Gly Leu Thr Glu Ser Glu Gly Pro Pro 245 250 255 Leu Thr Ser Phe Arg Pro Gln Cys Ser Phe Met Gly Met Val Ile Ser 260 265 270 His Asp Met Leu Leu Gly Arg Trp Arg Leu Ser Leu Glu Leu Phe Gly 275 280 285 Arg Val Phe Met Glu Asp Val Gly Ala Glu Pro Gly Ser Ile Leu Thr 290 295 300 Glu Leu Gly Gly Phe Glu Val Lys Glu Ser Lys Phe Arg Arg Glu Met 305 310 315 320 Glu Lys Leu Arg Asn Gln Gln Ser Arg Asp Leu Ser Leu Glu Val Asp 325 330 335 Arg Asp Arg Asp Leu Leu Ile Gln Gln Thr Met Arg Gln Leu Asn Asn 340 345 350 His Phe Gly Arg Arg Cys Ala Thr Thr Pro Met Ala Val His Arg Val 355 360 365 Lys Val Thr Phe Arg Asp Glu Pro Gly Glu Gly Ser Gly Val Ala Arg 370 375 380 Ser Phe Tyr Thr Ala Ile Ala Gln Ala Phe Leu Ser Asn Glu Lys Leu 385 390 395 400 Pro Asn Leu Glu Cys Ile Gln Asn Ala Asn Lys Gly Thr His Thr Ser 405 410 415 Leu Met Gln Arg Leu Arg Asn Arg Gly Glu Arg Asp Arg Glu Arg Glu 420 425 430 Arg Glu Arg Glu Met Arg Arg Ser Ser Gly Leu Arg Ala Gly Ser Arg 435 440 445 Arg Asp Arg Asp Arg Asp Phe Arg Arg Gln Leu Ser Ile Asp Thr Arg 450 455 460 Pro Phe Arg Pro Ala Ser Glu Gly Asn Pro Ser Asp Asp Pro Glu Pro 465 470 475 480 Leu Pro Ala His Arg Gln Ala Leu Gly Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Val 485 490 495 Gln Ala Met Gln Pro Ala Phe Ala Ser Lys Ile Thr Gly Met Leu Leu 500 505 510 Glu Leu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asp Ser 515 520 525 Leu Arg Ala Arg Val Asp Glu Ala Met Glu Leu Ile Ile Ala His Gly 530 535 540 Arg Glu Asn Gly Ala Asp Ser Ile Leu Asp Leu Gly Leu Val Asp Ser 545 550 555 560 Ser Gln Lys Val Gln Gln Glu Asn Arg Lys Arg His Gly Ser Ser Arg 565 570 575 Ser Val Val Asn Met Asp Leu Asp Asp Thr Asp Asp Gly Asp Asp Asn 580 585 590 Ala Pro Leu Phe Tyr Gln Pro Gly Lys Arg Arg Phe Tyr Thr Pro Arg 595 600 605 Pro Gly Lys Asn Thr Glu Ala Arg Leu Asn Cys Phe Arg Asn Ile Gly 610 615 620 Arg Ile Leu Gly Leu Cys Leu Leu Gln Asn Glu Leu Cys Pro Ile Thr 625 630 635 640 Leu Asn Arg His Val Ile Lys Val Leu Leu Gly Arg Lys Val Asn Trp 645 650 655 His Asp Phe Ala Phe Phe Asp Pro Val Met Tyr Glu Ser Leu Arg Gln 660 665 670 Leu Ile Leu Ala Ser Gln Ser Ser Asp Ala Asp Ala Val Phe Ser Ala 675 680 685 Met Asp Leu Ala Phe Ala Ile Asp Leu Cys Lys Glu Glu Gly Gly Gly 690 695 700 Gln Val Glu Leu Ile Pro Asn Gly Val Asn Ile Pro Val Thr Pro Gln 705 710 715 720 Asn Val Tyr Glu Tyr Val Arg Lys Tyr Ala Glu His Arg Met Leu Val 725 730 735 Val Ala Glu Gln Pro Leu His Ala Met Arg Lys Gly Leu Leu Asp Val 740 745 750 Leu Pro Lys Asn Ser Leu Glu Asp Leu Thr Ala Glu Asp Phe Arg Leu 755 760 765 Leu Val Asn Gly Cys Gly Glu Val Asn Val Gln Met Leu Ile Ser Phe 770 775 780 Thr Ser Phe Asn Asp Glu Ser Gly Glu Asn Ala Glu Lys Leu Leu Gln 785 790 795 800 Phe Lys Arg Trp Phe Trp Ser Ile Val Glu Lys Met Ser Met Thr Glu 805 810 815 Arg Gln Asp Leu Val Tyr Phe Trp Thr Ser Ser Pro Ser Leu Pro Ala 820 825 830 Ser Glu Glu Gly Phe Gln Pro Met Pro Ser Ile Thr Ile Arg Pro Pro 835 840 845 Asp Asp Gln His Leu Pro Thr Ala Asn Thr Cys Ile Ser Arg Leu Tyr 850 855 860 Val Pro Leu Tyr Ser Ser Lys Gln Ile Leu Lys Gln Lys Leu Leu Leu 865 870 875 880 Ala Ile Lys Thr Lys Asn Phe Gly Phe Val 885 890

【００７１】配列番号：２ 配列の長さ：２６７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG ATG TCT GCA CGA GGA GAC TTC CTA AAT TAT GCT CTG TCT CTA ATG 48 CGG TCT CAT AAT GAT GAG CAT TCT GAT GTT CTT CCA GTT TTG GAT GTT 96 TGC TCA TTG AAG CAT GTG GCA TAT GTT TTT CAA GCA CTT ATA TAC TGG 144 ATT AAG GCA ATG AAT CAG CAG ACA GCA TTG GAT ACA CCT CAA CTA GAA 192 CGC AAA AGG ACG CGA GGA CTC TTG GAA CTG GGT ATT GAT AAT GAA GAT 240 TCA GAA CAT GAA AAT GAT GAT GAC ACC AAT CAA AGT GCT ACT TTG AAT 288 GAT AAG GAT GAT GAC TCT CTT CCT GCA GAA ACT GGC CAA AAC CAT CCA 336 TTT TTC CGA CGT TCA GAC TCC ATG ACA TTC CTT GGG TGT ATA CCC CCA 384 AAT CCA TTT GAA GTG CCT CTG GCT GAA GCC ATC CCC TTG GCT GAT CAG 432 CCA CAT CTG TTG CAG CCA AAT GCT AGA AAG GAG GAT CTT TTT GGC CGT 480 CCA AGT CAG GGT CTT TAT TCT TCA TCT GCC AGT AGT GGG AAA TGT TTA 528 ATG GAG GTT ACA GTG GAT AGA AAC TGC CTA GAG GTT CTT CCA ACA AAA 576 ATG TCT TAT GCT GCC AAT CTG AAA AAT GTA ATG AAC ATG CAA AAC CGG 624 CAA AAA AAA GAA GGG GAA GAA CAG CCC GTG CTG CCA GAA GAA ACT GAG 672 AGT TCA AAA CCA GGG CCA TCT GCT CAT GAT CAT GCT GCA CAA TTA AAA 720 AGT AGC TTA CTA GCA GAA ATA GGA CTT ACT GAA AGT GAA GGG CCA CCT 768 CTC ACA TCT TTC AGG CCA CAG TGT AGC TTT ATG GGA ATG GTT ATT TCC 816 CAT GAT ATG CTG CTA GGA CGT TGG CGC CTT TCT TTA GAA CTG TTC GGC 864 AGG GTA TTC ATG GAA GAT GTT GGA GCA GAA CCT GGA TCA ATC CTA ACT 912 GAA TTG GGT GGT TTT GAG GTA AAA GAA TCA AAA TTC CGC AGA GAA ATG 960 GAA AAA CTG AGA AAC CAG CAG TCA AGA GAT TTG TCA CTA GAG GTT GAT 1008 CGG GAT CGA GAT CTT CTC ATT CAG CAG ACT ATG AGG CAG CTT AAC AAT 1056 CAC TTT GGT CGA AGA TGT GCT ACT ACA CCA ATG GCT GTA CAC AGA GTA 1104 AAA GTC ACA TTT AGG GAT GAG CCA GGA GAG GGC AGT GGT GTA GCA CGA 1152 AGT TTT TAT ACA GCC ATT GCA CAA GCA TTT TTA TCA AAT GAA AAA TTG 1200 CCA AAT CTA GAG TGT ATC CAA AAT GCC AAC AAA GGC ACC CAC ACA AGT 1248 TTA ATG CAG AGA TTA AGG AAC CGA GGA GAG AGA GAC CGG GAA AGG GAG 1296 AGA GAA AGG GAA ATG AGG AGG AGT AGT GGT TTG CGA GCA GGT TCT CGG 1344 AGG GAC CGG GAT AGA GAC TTT AGA AGA CAG CTT TCC ATC GAC ACT AGG 1392 CCC TTT AGA CCA GCC TCT GAA GGG AAT CCT AGC GAT GAT CCT GAG CCT 1440 TTG CCA GCA CAT CGG CAG GCA CTT GGA GAG AGG CTT TAT CCT CGT GTA 1488 CAA GCA ATG CAA CCA GCA TTT GCA AGT AAA ATC ACT GGC ATG TTG TTG 1536 GAA TTA TCC CCA GCT CAG CTG CTT CTC CTT CTA GCA AGT GAG GAT TCT 1584 CTG AGA GCA AGA GTG GAT GAG GCC ATG GAA CTC ATT ATT GCA CAT GGA 1632 CGG GAA AAT GGA GCT GAT AGT ATC TTG GAT CTT GGA TTA GTA GAC TCC 1680 TCA CAA AAG GTA CAG CAG GAA AAC CGA AAG CGC CAT GGC TCT AGT CGA 1728 AGT GTA GTA AAT ATG GAT TTA GAT GAT ACA GAT GAT GGT GAT GAC AAT 1776 GCC CCT TTG TTT TAC CAA CCT GGG AAA AGA AGA TTT TAT ACT CCA AGG 1824 CCT GGC AAG AAC ACA GAA GCA AGG TTG AAT TGT TTC AGA AAC ATT GGC 1872 AGG ATT CTT GGA CTA TGT CTG TTA CAG AAT GAA CTA TGT CCT ATC ACA 1920 TTG AAT AGA CAT GTA ATT AAA GTA TTG CTT GGT AGA AAA GTC AAT TGG 1968 CAT GAT TTT GCT TTT TTT GAT CCT GTA ATG TAT GAG AGT TTG CGG CAA 2016 CTA ATC CTC GCG TCT CAG AGT TCA GAT GCT GAT GCT GTT TTC TCA GCA 2064 ATG GAT TTG GCA TTT GCA ATT GAC CTG TGT AAA GAA GAA GGT GGA GGA 2112 CAG GTT GAA CTC ATT CCT AAT GGT GTA AAT ATA CCA GTC ACT CCA CAG 2160 AAT GTA TAT GAG TAT GTG CGG AAA TAC GCA GAA CAC AGA ATG TTG GTA 2208 GTT GCA GAA CAG CCC TTA CAT GCA ATG AGG AAA GGT CTA CTA GAT GTG 2256 CTT CCA AAA AAT TCA TTA GAA GAT TTA ACG GCA GAA GAT TTT AGG CTT 2304 TTG GTA AAT GGC TGC GGT GAA GTC AAT GTG CAA ATG CTG ATC AGT TTT 2352 ACC TCT TTC AAT GAT GAA TCA GGA GAA AAT GCT GAG AAG CTT CTG CAG 2400 TTC AAG CGT TGG TTC TGG TCA ATA GTA GAG AAG ATG AGC ATG ACA GAA 2448 CGA CAA GAT CTT GTT TAC TTT TGG ACA TCA AGC CCA TCA CTG CCA GCC 2496 AGT GAA GAA GGA TTC CAG CCT ATG CCC TCA ATC ACA ATA AGA CCA CCA 2544 GAT GAC CAA CAT CTT CCT ACT GCA AAT ACT TGC ATT TCT CGA CTT TAC 2592 GTC CCA CTC TAT TCC TCT AAA CAG ATT CTC AAA CAG AAA TTG TTA CTC 2640 GCC ATT AAG ACC AAG AAT TTT GGT TTT GTG TAG 2673

【００７２】配列番号３ 配列の長さ：５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Asp Phe Arg Arg Gln Leu Ser Ile Asp Thr Arg Pro Phe Arg Pro 1 5 10 15 Ala Ser Glu Gly Asn Pro Ser Asp Asp Pro Glu Pro Leu Pro Ala His 20 25 30 Arg Gln Ala Leu Gly Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Val Gln Ala Met Gln 35 40 45 Pro Ala Phe Cys 50

【００７３】配列番号４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TAGTAATATT ACACAGCAAT ACAC 24

【００７４】配列番号５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTACACAAAA CCAAAATTCT TGGT 24

【００７５】配列番号６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AGAGAGAGAC CGGGAAAGGG AGAGAGAAAG G 31

【００７６】配列番号７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TCTCCAAGAG CCTGCCGATG T 21

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈ−Ｈｙｄ、ｄ−ｈｙｄ、ｒ−ｈｙｄのｈｅｃ
ｔドメインを対比させた図である。

【図２】ヒト各組織のｍＲＮＡについて、ｈ−Ｈｙｄの
ＤＮＡをハイブリダイズさせたノーザンブロットハイブ
リダイゼーションの結果を示す電気泳動写真である。

【図３】ヒト各組織のｍＲＮＡについて、ｈ−Ｈｙｄの
ＤＮＡをハイブリダイズさせたノーザンブロットハイブ
リダイゼーションの結果を示す電気泳動写真である。

【図４】ヒト各組織のｍＲＮＡについて、ｈ−Ｈｙｄの
ＤＮＡをハイブリダイズさせたノーザンブロットハイブ
リダイゼーションの結果を示す電気泳動写真である。

【図５】ヒト各細胞株のｍＲＮＡについて、ｈ−Ｈｙｄ
のＤＮＡをハイブリダイズさせたノーザンブロットハイ
ブリダイゼーションの結果を示す電気泳動写真である。

【図６】ＧＳＴ−ｈ−Ｈｙｄ、ｈ−ＨｙｄおよびＧＳＴ
について抗ｈ−Ｈｙｄ抗体および抗ＧＳＴ抗体を用い
て、ウェスタンブロット法による解析を行った結果を示
す電気泳動写真である。

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【手続補正書】

【提出日】平成９年１１月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 本多 慶臣 熊本県熊本市南熊本一丁目９番23号 (72)発明者 安藤 正幸 熊本県熊本市三郎一丁目７番53号 (72)発明者 佐谷 秀行 熊本県熊本市渡鹿一丁目16番６号31

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を少なくとも有するアミノ酸配列からなる蛋白質
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列における一または複数のアミノ酸を置換、欠失または
   付加してなるアミノ酸配列からなり、かつＣ末端側に、
   細胞内蛋白質分解系におけるユビキチン・ライゲースの
   活性部位でありかつＥ６ＡＰのＣ末端相同ドメインであ
   るｈｅｃｔドメインを有する蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の蛋白質をコー
   ドするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のポリヌクレオチドのう
   ちの一部であって、連続する１２塩基以上からなるポリ
   ヌクレオチド。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のポリヌクレオチドのア
   ンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌク
   レオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導
   体のうちの一部であって、連続する１２塩基以上からな
   るアンチセンスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポ
   リヌクレオチドの誘導体。
6. 【請求項６】 化学修飾された請求項３ないし５に記載
   のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項１または２に記載の蛋白質を認識
   する抗体。