JPH11147833A - コラゲナーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 線維芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により
産生される間質系のコラゲナーゼを特異的に阻害し、炎
症や創傷、がんの転移、潰瘍形成、皮膚の老化等、コラ
ゲナーゼの関与する病態の改善，防止に有効なコラゲナ
ーゼ阻害剤を得る。 【解決手段】 ユーカリノキ（Eucalyptus globulus La
billardiere），その近縁植物（E.polybractea R.T.Bak
er，E.dives Schauer）、サルビア（Salvia officinali
s L.），その変種（S.officinalis var.tenuior）、ド
クダミ（Houttuynia cordata Thunb.）、ボタン（Paeon
ia suffruticosa Andrews（P.moutan Sims））、シャク
ヤク(Paeonia lactiflora Pallas（P.albiflora Pal
l.））、ヤマシャクヤク（P.japonica Miyabe et Taked
a）、ベニバナヤマシャクヤク（P.obovata Maxim.）、
センセキシャク（P.veitchii Lynch.）の抽出物の１種
又は２種以上を含有させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、主として間葉系細
胞により産生される間質系のコラゲナーゼに対し、特異
的に作用するコラゲナーゼ阻害剤に関する。さらに詳し
くは、ユーカリノキ等特定の植物の抽出物の１種又は２
種以上を含有して成るコラゲナーゼ阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、マトリックス線維の分解を促進す
るマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が種々の
病態に関与していることが明らかになってきた。ＭＭＰ
の中でも、線維芽細胞等の間葉系細胞や、炎症部位に存
在する好酸球等により産生される間質系のコラゲナーゼ
が、がん細胞の転移や潰瘍形成、歯周炎やう歯形成等に
関与することが報告されている。また前記コラゲナーゼ
は、皮膚真皮のコラーゲン線維を分解して皮膚弾性の低
下やしわの発生にも関与している。これらコラゲナーゼ
の産生が、紫外線やアレルゲン等の外部刺激により誘導
されるサイトカインによって促進されることも知られて
いる。

【０００３】それゆえ、前記のようなコラゲナーゼの活
性を阻害するコラゲナーゼ阻害剤のスクリーニングも盛
んに行われてきた。たとえば、アシルフェニルグリシン
誘導体（特開平７−１０１９２５）、ザクロ実，レモン
バーム実及び葉，グアバ，ハマメリスといった植物の抽
出物（特開平７−１９６５２６，同７−２９１８７３，
同８−２８３１３３）、ポリポレン酸及びこれを含有す
るホウロクタケ抽出物（特開平９−４０５５２）、ジカ
ルボン酸（特開平９−１２４４７２）、アスペルギルス
属微生物の産生物質（特開平９−２４１２８７）などが
開示されている。

【０００４】しかしながら、これまでに得られたコラゲ
ナーゼ阻害剤の中には、細菌性のコラゲナーゼに対し強
い阻害活性を示し、間質系のコラゲナーゼに対する特異
性の低いものや、阻害活性が十分でないもの、安定性に
欠けるものも存在していた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明において
は、線維芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により産生さ
れる間質系のコラゲナーゼに対し特異的に阻害活性を示
し、炎症や創傷、がんの転移、潰瘍形成、皮膚の老化
等、コラゲナーゼの関与する病態を改善し、或いは防止
し得るコラゲナーゼ阻害剤を得ることを目的とした。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明者らは安定性及び安全性が高く、しかも高活
性のコラゲナーゼ阻害剤のスクリーニングを行った。そ
の結果、ユーカリノキ，サルビア，ドクダミ，ボタン及
びシャクヤク又はこれらの近縁植物の抽出物に優れたコ
ラゲナーゼ阻害活性を見いだし、これを含有させること
によって、コラゲナーゼの関与する病態を良好に改善し
得るコラゲナーゼ阻害剤を得ることができた。

【０００７】すなわち本発明においては、ユーカリノキ
（Eucalyptus globulus Labillardiere），その近縁植
物（E.polybractea R.T.Baker，E.dives Schauer）、サ
ルビア（Salvia officinalis L.），その変種（S.offic
inalis var.tenuior）、ドクダミ（Houttuynia cordata
Thunb.）、ボタン（Paeonia suffruticosa Andrews
（P.moutan Sims））、シャクヤク(Paeonia lactiflora
Pallas（P.albiflora Pall.））、ヤマシャクヤク（P.
japonica Miyabe et Takeda）、ベニバナヤマシャクヤ
ク（P.obovata Maxim.）、センセキシャク（P.veitchii
Lynch.）の抽出物の１種又は２種以上を基剤に含有さ
せる。

【０００８】なお上記植物の抽出物は、従来より化粧料
や皮膚外用剤に配合されており、ユーカリノキ抽出物に
ついてはPorphyromonas gingivalisにより産生されたコ
ラゲナーゼを抑制する作用（特開平８−１０９１１
８）、サルビア抽出物については抗酸化作用（特公平５
−３４５４）等、ドクダミ抽出物については活性酸素消
去作用や抗炎症，抗そう痒作用等（特開平９−１４３０
２５）、ボタン，シャクヤクの各抽出物については保湿
作用（特開平９−３０９２７，特開平８−３２５１１
６）、ヒドロキシラジカル消去作用（特開平９−２０６
３３）、がん転移抑制作用（特開平７−２５８１０
４）、動脈硬化防止作用（特開平７−２３８０２５）、
スーパーオキシド消去作用（特開平４−５２３７）、が
んの治療効果（特開平３−１２７７３６）、ヒアルロニ
ダーゼ阻害作用（特開平１−１２８９３３）、Staphylo
coccus属細菌由来のプロテアーゼに対する阻害作用（特
開平１−１２８９３４）などが開示されているが、これ
ら植物抽出物の間質系コラゲナーゼに対する特異的な阻
害作用についてはいまだに報告されていない。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のコラゲナーゼ阻害剤に含
有させる抽出物を得るために用いるユーカリノキ（Euca
lyptus globulus Labillardiere）は、ユーカリ油の基
原植物として用いられるオーストラリア原産のフトモモ
科に属する常緑高木である。その近縁植物（E.polybrac
tea R.T.Baker，E.dives Schauer）も用いることができ
る。次にサルビア（Salvia officinalis L.）はヨーロ
ッパ原産のシソ科に属する多年草で、セージとも称され
る。その変種（S.officinalis var.tenuior）も同様に
用いることができる。ドクダミ（Houttuynia cordata T
hunb.）はジュウヤクの基原植物で、日本各地の陰湿地
に自生するドクダミ科の多年草である。ボタン（Paeoni
a suffruticosa Andrews又はP.moutan Sims）はボタン
ピの基原植物で、中国原産のボタン科に属する落葉低木
である。またシャクヤク(Paeonia lactiflora Pallas又
はP.albiflora Pall.）は生薬シャクヤクの基原植物で
あり、東アジア原産のボタン科に属する多年草である。
近縁植物であるヤマシャクヤク（P.japonica Miyabe et
Takeda）、ベニバナヤマシャクヤク（P.obovata Maxi
m.）、センセキシャク（P.veitchii Lynch.）も同様に
用いることができる。抽出には、前記植物の花，茎，
葉，根の各部位及び全草又は全木を用いることができ
る。本発明においては、これら抽出物より１種又は２種
以上を選択して用いる。

【００１０】上記植物は生のまま抽出操作に供しても良
いが、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理
を行った後抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶
媒に浸漬して行う。抽出効率を上げるため攪拌を行った
り、抽出溶媒中でホモジナイズすることもできる。抽出
温度としては５℃〜５０℃程度が適切である。抽出時間
は、４時間〜１０日間程度である。

【００１１】抽出溶媒としては、水の他、メタノール，
エタノール，プロパノール，イソプロパノール等の低級
アルコール、1,3-ブチレングリコール，プロピレングリ
コール，ジプロピレングリコール，グリセリン等の多価
アルコール、エチルエーテル，プロピルエーテル等のエ
ーテル類、酢酸エチル，酢酸ブチル等のエステル類、ア
セトン，エチルメチルケトン等のケトン類などの極性有
機溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以
上を選択して用いる。また、生理食塩水，リン酸緩衝
液，リン酸緩衝生理食塩水等を用いても良い。

【００１２】上記ユーカリノキ等の植物抽出物は、その
ままでもコラゲナーゼ阻害剤基剤に添加できるが、濃
縮，乾固したものを水や極性溶媒に再度溶解したり、或
いはコラゲナーゼ阻害作用を損なわない範囲で脱色，脱
臭，脱塩等の精製処理を行った後に添加しても良い。ま
た保存のためには、精製処理の後凍結乾燥し、用時に溶
媒に溶解させて用いることが好ましい。コラゲナーゼ阻
害剤への配合量は、上記植物の乾燥粉末を十分浸漬し得
る量の溶媒にて抽出し、抽出物を減圧乾固して得た固形
分を再度溶媒に溶解した状態で、０．００１〜１．０容
量％程度とするのが適当である。

【００１３】さらに本発明に係るコラゲナーゼ阻害剤に
は、活性酸素消去剤，抗炎症剤，抗がん剤，美白剤，皮
膚細胞賦活剤，殺菌剤の他、油類，界面活性剤，保湿
剤，紫外線吸収剤，粉体，香料，防腐剤等、一般的な医
薬品及び化粧料原料をも含有させることができる。

【００１４】本発明に係るコラゲナーゼ阻害剤は、液
状，ゲル状，クリーム状，ペースト状又は粉末状の形態
で、ローション剤，乳剤，ゲル剤，クリーム剤，軟膏等
の剤型で提供することができる。

【００１５】

【実施例】さらに本発明の特徴について、実施例により
詳細に説明する。

【００１６】［実施例１〜実施例４］ユーカリノキ（Eu
calyptus globulus Labillardiere）の葉，サルビア（S
alvia officinalis L.）の葉，ドクダミ（Houttuynia c
ordata Thunb.）の花期の地上部、及びシャクヤク(Paeo
nia lactiflora Pallas）の根の各乾燥粉末５００ｇ
を、５０容量％エタノール水溶液１，０００ｍｌに浸漬
し、室温にて７日間静置した。その後植物粉末をろ別除
去し、溶媒を減圧留去して得られた固形分を５０容量％
エタノール水溶液５０ｍｌにて再溶解し、それぞれ実施
例１〜実施例４とした。

【００１７】［実施例５］ユーカリノキ（Eucalyptus g
lobulus Labillardiere）の葉５００ｇを、０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１，０００ｍｌ中に浸漬し
てホモジナイズし、室温にて一晩抽出する。抽出液をセ
ファデックスＧ-１５カラムクロマトグラフィーにより
脱塩した後凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を、１０．
０(w/v)％となるように前記リン酸緩衝液に溶解し、実
施例５とした。

【００１８】［実施例６］サルビアの変種（Salvia.off
icinalis var.tenuior）の全草５００ｇを、５０．０容
量％エタノール水溶液１，０００ｍｌ中に浸漬してホモ
ジナイズし、室温にて一晩抽出する。抽出液を減圧濃縮
して溶媒を除去し、乾固物を５０．０容量％1,3-ブチレ
ングリコール水溶液５０ｍｌに再度溶解し、活性炭処理
して実施例６とした。

【００１９】［実施例７］ボタン（Paeonia suffrutico
sa Andrews（P.moutan Sims））の根５００ｇを細切
し、２０容量％グリセリン１，０００ｍｌ中に攪拌しな
がら５日間２０℃で浸漬した。抽出液をろ別し、活性炭
処理した後１００ｍｌまで濃縮して実施例７とした。

【００２０】［実施例８］ドクダミ（Houttuynia corda
ta Thunb.）の全草，ベニバナヤマシャクヤク（P.obova
ta Maxim.）及びセンセキシャク（P.veitchii Lynch.）
の全木各５００ｇを乾燥粉砕し、それぞれ精製水５００
ｍｌ中に浸漬して攪拌し、５０℃にて６時間抽出した。
各抽出液をセファデックスＧ-１５カラムクロマトグラ
フィーにより脱塩した後１００ｍｌまで濃縮し、等容量
ずつ混合して実施例８とした。

【００２１】上記の各実施例について、Ｉ型コラゲナー
ゼ標品を用いてコラゲナーゼに対する阻害作用を評価し
た。コラゲナーゼ活性は、Ｉ型コラゲナーゼ標品を０．
２５ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）で標識したＩ型コラーゲンと３５℃で２時
間インキュベートし、反応液を３５℃で３０分間処理し
た後、エタノール沈殿法により分解されたコラーゲン含
有上清を得、この上清中に含有されるコラーゲンの蛍光
強度を蛍光分光光度計により、励起波長４９０ｎｍ，蛍
光波長５２０ｎｍで測定して求めた。本発明に係る実施
例のコラゲナーゼ阻害作用は、各実施例０．１ｍｇ／ｍ
ｌの存在下に前記Ｉ型コラゲナーゼ標品を前記標識コラ
ーゲンと作用させて酵素活性を測定し、（１）式により
コラゲナーゼ阻害率を算出して表した。結果は表１に示
した。

【数１】

【００２２】

【表１】 表１より明らかなように、本発明の各実施例はいずれも
危険率１％で、Ｉ型コラゲナーゼ標品に対し、有意なコ
ラゲナーゼ阻害作用を示していた。特に、実施例１，実
施例２，実施例４〜実施例６では、５８．０％以上の高
いコラゲナーゼ活性阻害率を示していた。

【００２３】次に本発明の実施例１について、０．０２
ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で、精製Ｉ型
コラゲナーゼ及びヒト線維芽細胞由来コラゲナーゼに対
する阻害作用を評価した。精製Ｉ型コラゲナーゼは、
０．２５ユニット／ｍｌの濃度で用いた。またヒト線維
芽細胞由来コラゲナーゼとしては、ヒト線維芽細胞を、
１ウェル当たり５×１０⁴個となるように４８穴マイク
ロプレートに播種し、２４時間後にインターロイキン-1
α（ＩＬ-1α）及び表皮成長因子（ＥＧＦ）各１０ｎｇ
／ｍｌを添加したダルベッコ修正基礎栄養培地（ＤＭＥ
Ｍ）に交換し、さらに３７℃で４８時間培養した後、培
地を採取し、採取した培地にトリプシンを０．０４ｍｇ
／ｍｌとなるように添加して、３７℃で３０分間反応さ
せ、上清中のコラゲナーゼを活性化したものを用いた。
コラゲナーゼ活性及びその阻害率は、前記と同様にして
求めた。その結果、表２に示すように、実施例１は前記
濃度範囲で濃度依存的に、精製Ｉ型及び線維芽細胞由来
コラゲナーゼを阻害することが示された。

【表２】

【００２４】続いて、本発明の各実施例について熱及び
光に対する安定性を評価した。各実施例を１００℃で１
０分間熱処理した場合、及び３カ月間露光保存した場合
のそれぞれについて、０．１ｍｇ／ｍｌ添加時のコラゲ
ナーゼ阻害率を測定し、未処理の場合のコラゲナーゼ阻
害率と比較して表３に示した。コラゲナーゼとしては、
Ｉ型コラゲナーゼ標品を用いた。表３より明らかなよう
に、いずれの実施例も熱及び光に対し非常に良好な安定
性を示し、１００℃で１０分間の熱処理を行った場合に
は８３％以上、３カ月間の露光保存を行った場合には９
２％以上のコラゲナーゼ阻害活性を保持していた。

【表３】

【００２５】また、本発明の各実施例について、培養ヒ
ト線維芽細胞に対する細胞毒性を評価した。ヒト由来線
維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０⁴個となるよ
うに９６穴マイクロプレートに播種し、２４時間後に、
実施例のそれぞれを１．０ｍｇ／ｍｌ〜１００．０ｍｇ
／ｍｌ含有する１．０容量％牛胎仔血清添加ＤＭＥＭに
て３７℃で２４時間さらに培養して、生細胞数を計測し
て細胞生存率を求め、５０％致死濃度（ＬＤ₅₀）を算出
した。その結果、表４に示すように、いずれの実施例に
おいてもＬＤ₅₀は１００．０ｍｇ／ｍｌより大きい値と
なっており、試験した濃度では細胞毒性は認められなか
った。

【表４】

【００２６】以上詳述したように、本発明により、線維
芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により産生される間質
系のコラゲナーゼに対し特異的に阻害活性を示すコラゲ
ナーゼ阻害剤を得ることができた。本発明に係るコラゲ
ナーゼ阻害剤は、炎症や創傷、がんの転移、潰瘍形成、
皮膚の老化等、コラゲナーゼの関与する病態の改善、或
いは防止に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＤＵＷ ＡＧＺ ＡＧＺ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ユーカリノキ（Eucalyptus globulus La
   billardiere），その近縁植物（E.polybractea R.T.Bak
   er，E.dives Schauer）、サルビア（Salviaofficinalis
   L.），その変種（S.officinalis var.tenuior）、ドク
   ダミ（Houttuynia cordata Thunb.）、ボタン（Paeonia
   suffruticosa Andrews（P.moutanSims））、シャクヤ
   ク(Paeonia lactiflora Pallas（P.albiflora Pal
   l.））、ヤマシャクヤク（P.japonica Miyabe et Taked
   a）、ベニバナヤマシャクヤク（P.obovata Maxim.）、
   センセキシャク（P.veitchii Lynch.）の抽出物の１種
   又は２種以上を含有して成る、コラゲナーゼ阻害剤。