JPH11183A - ラット・カテプシンｋのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転移お
よびパジェット病を含め、機能不全または疾患の予防、
改善または矯正において役割を果たしうる、システイン
プロテアーゼのメンバーを同定および特徴付ける必要が
ある。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のラット・カテプ
シンＫのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
その全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有する
ヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列を有してなる単離されたポリヌク
レオチドを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
使用およびその生成に関する。さらに詳しくは、本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはシステインプ
ロテアーゼ科（以下、ラット・カテプシンＫという）に
関する。本発明はまた、かかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの作用を阻害または活性化することに関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】骨は
無機ミネラル成分が組み込まれているタンパク質マトリ
ックスからなっている。骨吸収は無機ミネラル成分の溶
解とタンパク質マトリックスのタンパク質分解減成の両
方を必要とする。システインプロテアーゼの原型阻害剤
はインビトロおよびインビボ実験を用いる破骨細胞介在
の骨吸収を妨げることができるため、システインプロテ
アーゼは骨吸収に関与していると考えられる。カテプシ
ンＫと称される、新規なシステインプロテアーゼがウサ
ギ（Tezuka,K−ｉ.、Tezuka,Y.、Maejima,A.、Sato,
T.、Nemoto,K.、Kamioka,H.、Hakeda,Y.およびKumegaw
a,M. J.Biol.Chem. 269,1106−1109（1994）、ヒト（S
hi,G-P.、Chapman,H.A.、Bhairi,S.M.、Deleeuw,C.、Re
ddy,V.Y.およびWeiss,S.J. FEBS Lett. 357、129−134
（1995）；Bromme,D.およびOkamoto,K. Biol.Chem.Hop
pe-Seyler 376、379−384（1995）；Li,Y.P.、Alexande
r,M.B.、Wucherpfennis,A.L.、Chen,W.、Yelick,P.およ
びStashenko,P. Mol.Biol.Cell 5、335ａ（1994）；In
aoka,T.、Bilbe,G.、Ishibashi,O.、Tezuka,K-ｉ、Kame
gawa,M.およびKokubo,T. Biochem.Biophys.Res.Commu
n. 206、89−96（1995））およびネズミ組織（Rantakok
ko,J.、Aro,H.T.、Savontaus,M.およびVuorio,E. FEBS
Letters 393、307−313（1996））より同定された。カ
テプシンKは破骨細胞にて豊富かつ選択的に発現される
ことがわかった（Drake,F.ら、J.Biol.Chem. 271：1251
1−12516 （1996））。システインプロテアーゼ科の他
の密接に関連するメンバー（カテプシンＳ、Ｌおよび
Ｂ）は破骨細胞中に極めて低いかまたは存在しないかの
いずれかである。破骨細胞におけるカテプシンＫの高レ
ベルの局在化発現は、骨吸収における役割を強く示唆し
ている。ヒトカテプシンＫの選択的阻害剤は、骨粗鬆
症、歯周病、関節炎およびパジェット（Paget's）病な
どの骨喪失に関する多くの疾患の治療にて有用でありう
る。潜在的なカテプシンK阻害剤を評価するためのアッ
セイは、多量の精製された酵素を必要とし、組換え分子
のクローニング、発現および精製を介して行うことがで
きる。骨吸収を防止するためのヒトカテプシンＫの阻害
剤の特徴付けおよび開発は、インビトロおよびインビボ
の、特にラット由来の動物実験系を利用する。ラットカ
テプシンＫオルトログのクローニングおよび発現は、ラ
ットとヒトのカテプシンKの間の阻害剤の薬理活性にお
ける種相違を評価するのに、およびラットカテプシン
Ｋ、ヒトカテプシンＫのいずれかに対し、またはその両
方に対する阻害活性を有する化合物を同定するのに著し
い価値がある。

【０００３】これは、システイン・プロテアーゼが治療
標的として確立され、かつ立証された歴史を有すること
を示している。限定するものではないが、骨粗鬆症、歯
周病、関節炎、癌、腫瘍転移およびパジェット病を含
め、機能不全または疾患の予防、改善または矯正におい
て役割を果たしうる、システインプロテアーゼのさらな
るメンバーを同定および特徴付ける必要があるのは明ら
かである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はラット・カテプシンＫのポリペプチドおよび組換え
材料ならびにその製法に関する。本発明の別の態様は、
そのようなラット・カテプシンKのポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドを用いる方法に関する。かかる使用
は、とりわけ、骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転
移およびパジェット病の治療を包含する。さらに別の態
様において、本発明は、該発明により得られる材料を用
いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法、
およびラット・カテプシンＫ平衡異常に付随する症状を
その同定した化合物を用いて治療することに関する。本
発明のさらに別の態様は不適当なラット・カテプシンＫ
活性またはレベルに伴う疾患を検出するための診断アッ
セイに関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】

定義 以下の定義は、本明細書で汎用する用語の理解を容易に
するためのものである。「ラット・カテプシンＫ」は、
とりわけ、一般に、配列番号2に示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその対立遺伝子変種をい
う。「ラット・カテプシンＫ活性またはラット・カテプ
シンＫのポリペプチド活性」または「ラット・カテプシ
ンＫまたはラット・カテプシンＫのポリペプチドの生物
学的活性」とは、類似の活性または改良された活性ある
いは望ましくない副作用の減じたこれらの活性を含め、
該ラット・カテプシンＫの代謝的または生理学的機能を
いう。該ラット・カテプシンＫの抗原的および免疫原的
活性も含まれる。

【０００６】「ラット・カテプシンＫ遺伝子」とは、配
列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドまたはその対立遺伝子変種および／またはそれ
らの相補物をいう。本明細書で用いる「抗体」は、ポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本
鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂの産物または他
の免疫グロブリン発現ライブラリーを含め、Ｆａｂフラ
グメントを包含する。「単離」とは、「人間の手によ
り」天然の状態から変えられたことを意味する。「単
離」された組成物または物質が天然に存在する場合、そ
の本来の環境から変えられるかもしくは取り除かれ、ま
たはその両方がなされたことを意味する。例えば、天然
の状態で生存動物に存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で
共存する物質から分離されているその同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語で
ある、「単離」がなされている。

【０００７】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、修飾
されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾された
ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれかのポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
いう。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖Ｄ
ＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子を包含するが、これに限定されるものではない。加え
て、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡま
たはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポ
リヌクレオチドなる用語はまた、一つまたはそれ以上の
修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならび
に安定性またはその他の理由で修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基
は、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなど
の通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよ
びＲＮＡに対してなされている。よって、「ポリヌクレ
オチド」は、典型的には天然において見いだされるよう
な化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリ
ヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な
化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、
「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチド
と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【０００８】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソス
ターにより互いに結合している２個またはそれ以上のア
ミノ酸を有してなるペプチドまたはタンパク質をいう。
「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチド
またはオリゴマーと称される短鎖、およびタンパク質と
称される長鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子によ
りコードされた２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を
含有してもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセッ
シングなどの自然の工程により、または当業者に周知の
化学修飾技法により修飾されたアミノ酸配列を含有す
る。このような修飾は基本テキストにて、およびさらに
詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献において
詳しく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ
酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポ
リペプチドのどこででも起こり得る。同一の型の修飾が
所定のポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得ることは理解されよう。また、所定の
ポリペプチドは多くの型の修飾を含んでいてもよい。ポ
リペプチドはユビキチネーションの結果として分岐して
いてもよく、分岐しているかまたはしていない、環状で
あってもよい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは翻訳後の天然プロセスにより生じたものであって
もよく、または合成法により製造されたものであっても
よい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有
結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド
結合形成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システ
イン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ
−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒ
ドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、
酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレ
ニル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
トランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸の
付加、ならびにユビキチネーションを包含する。例え
ば、PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、
第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、Ne
w York（1993）およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS、B.C.Johnson編、Academic Pre
ss、New York（1983）のWold,F.、Posttranslational P
rotein Modifications：Perspectives and Prospects、
1〜12頁；Seifterら、"Analysis for protein modifica
tions and nonprotein cofactors"、Meth.Enzymol.18
2：626-646（1990）およびRattanら、“Protein Synthe
sis：Posttranslational Modifications and Aging"、A
nn.N.Y.Acad.Sci. 663：48-62（1992）を参照のこと。

【０００９】本明細書で用いる「変種」なる用語は、各
々、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異な
るが、本質的な特性は保持しているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチドの
変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配
列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、
対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わっていなく
てもよい。ヌクレオチドの変化は、後記するように、対
照配列によりコードされるポリペプチドにてアミノ酸置
換、付加、欠失、融合および末端切断をもたらしうる。
典型的なポリペプチドの変種は、別の対照ポリペプチド
とはアミノ酸配列が異なる。一般に、差異は、対照ポリ
ペプチドおよび変種の配列が、全体的に極めて類似して
おり、多くの領域で同一であるように限定される。変種
および対照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、
付加、欠失のいずれかの組み合わせにより、アミノ酸配
列にて異なっていてもよい。置換または挿入されたアミ
ノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされたものであって
もなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の変種は、対立遺伝子変種のような天然物であってもよ
く、または天然に発生することが知られていない変種で
あってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
天然に生じない変種は、突然変異誘発技術により、また
は直接的合成により製造できる。

【００１０】「同一性」は、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列のある程度の同一性をいう。一般に、配列は
最高の対合が得られるように配置される。「同一性」自
体は、当該分野にて認識されている意義を有しており、
公開されている方法を用いて計算することができる。例
えば、（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.
編、Oxford University Press、New York、1988年；BIO
COMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith,
D.W.編、Academic Press、New York、1993年；COMPUTER
ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994
年；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von He
inje,G.、Academic Press、1987年；およびSEQUENCE AN
ALYSIS PRIMER，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ
Stockton Press、New York、1991年）を参照のこと。二
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同
一性を測定するのに多数の方法があるが、「同一性」な
る用語は当業者に周知である（Carillo,H.およびLipto
n,D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073（1988））。２
つの配列間の同一性または類似性を測定するために通常
用いられる方法は、Guide to Huge Computers、Martin
J. Bishop,編、Academic Press、San Diego、1994年、
およびCarillo,H.およびLipton,D.，SIAM J.Applied Ma
th.，48：1073（1988）に開示されているが、これらに
限定ｓａｒｅるものではない。同一性および類似性を決
定するための方法はコンピュータープログラムに集成さ
れている。二つの配列間の同一性および類似性を測定す
るための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣ
Ｇプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Aci
ds Research 12（1）：387（1984））、BLASTP、BLAST
N、FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol. 215：215-4
03（1990））を包含するが、これらに限定されるもので
はない。

【００１１】本発明のポリペプチド 一の態様において、本発明はラット・カテプシンＫのポ
リペプチドに関する。ラット・カテプシンＫのポリペプ
チドは、配列番号２のポリペプチド；ならびに配列番号
２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；および配列番
号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８
０％の同一性、より好ましくは配列番号２と少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を包含する。ラット・カテプシンＫのポリペプチドはま
た、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと
その全長にわたって少なくとも８０％の同一性、より好
ましくは配列番号２と少なくとも９０％の同一性、さら
により好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するア
ミノ酸配列からなるポリペプチドも包含する。好ましく
は、ラット・カテプシンＫのポリペプチドは少なくとも
１つのラット・カテプシンＫの生物学的活性を示す。

【００１２】ラット・カテプシンＫのポリペプチドは
「成熟」タンパク質の形態であってもよく、あるいは融
合タンパク質などの大型のタンパク質の一部であっても
よい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒス
チジン残基のごとき精製を促進する配列、または組換え
操作の間の安定性のための付加的な配列を含む付加的な
アミノ酸配列を含んでいることが有利なことがよくあ
る。

【００１３】ラット・カテプシンＫのポリペプチドの生
物学的に活性なフラグメントも本発明に含まれる。フラ
グメントは、前記のラット・カテプシンＫポリペプチド
のアミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ラッ
ト・カテプシンＫのポリペプチドでは、フラグメントは
「自立している」であるか、またはフラグメントが一部
分もしくは一領域を形成する大型のポリペプチド内に含
まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域
として含まれる。本発明のポリペプチドフラグメントの
典型例は、例えば、ラット・カテプシンＫのポリペプチ
ドのアミノ酸番号約１〜２０、２１〜４０、４１〜６
０、６１〜８０、８１〜１００および１０１から末端ま
でからなるフラグメントを包含する。この意味におい
て、「約」とは、片方または両端において、特記された
数よりも数個、５個、４個、３個、２個または１個だけ
多いかまたは少ない範囲を含む。

【００１４】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシル末端
を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端で
もう一方がカルボキシル末端を含む２つの一連の残基が
欠失していること以外は、ラット・カテプシンＫポリペ
プチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを包含
する。また、アルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形
成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒
性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領
域、基質結合領域および高抗原性指標領域を有するフラ
グメントなどの構造的または機能的属性により特徴付け
られるフラグメントも好ましい。生物学的に活性なフラ
グメントは、類似活性または改良された活性を有する、
あるいは望ましくない活性を減じたものを含め、ラット
・カテプシンＫ活性を媒介する、フラグメントである。
動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフ
ラグメントもまた含まれる。

【００１５】好ましくは、これらのポリペプチドフラグ
メントはすべて、抗原的活性を含め、ラット・カテプシ
ンKの生物学的活性を保持している。定義した配列の変
種およびフラグメントも本発明の一部を形成する。好ま
しい変種は、同類アミノ酸置換により対照と異なるもの
であり、すなわち、一の残基が同様の特徴を有する他の
残基により置換されているものである。典型的なかかる
置換は、Ala、Val、LeuおよびIleの間：SerおよびThrの
間；酸性残基AspおよびGluの間；AsnおよびGlnの間；な
らびに塩基性残基LysおよびArgの間；あるいは芳香族残
基PheおよびTyrの間におけるものである。数個、５ない
し１０個、１ないし５個、または１ないし２個のアミノ
酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加され
ている変種が特に好ましい。いずれか適当な方法にて本
発明のラット・カテプシンＫのポリペプチドを製造する
ことができる。かかるポリペプチドは、単離された天然
ポリペプチド、組換え技法で産生されたポリペプチド、
合成法により産生されたポリペプチド、またはこれらの
方法の組み合わせにより産生されたポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの製造手段は当該分野におい
てよく知られている。

【００１６】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つ別の態様はラット・カテプシンＫのポ
リヌクレオチドに関する。ラット・カテプシンＫのポリ
ヌクレオチドは、ラット・カテプシンＫのポリペプチド
をコードする単離ポリヌクレオチドおよびフラグメン
ト、ならびにそのポリヌクレオチドに密接に関連するポ
リヌクレオチドに関する。さらに詳細には、本発明のラ
ット・カテプシンＫのポリヌクレオチドは、配列番号2
のラット・カテプシンＫのポリペプチドをコードする配
列番号1に示されるヌクレオチド配列を有してなるポリ
ヌクレオチド、および配列番号1の特定の配列を有する
ポリヌクレオチドを包含する。ラット・カテプシンＫの
ポリヌクレオチドは、さらには、配列番号２のラット・
カテプシンＫのポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列とその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を
有するヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、および
配列番号１とその全長にわたって少なくとも８０％同一
であるポリヌクレオチドを包含する。この点において、
少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好
ましく、少なくとも９５％同一であるのがさらに好まし
い。さらには、少なくとも９７％同一であるのがより好
ましく、少なくとも９８−９９％の同一性を有するもの
がより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有す
るものが最も好ましい。さらに、増幅させるのにあるい
はプローブまたはマーカーとしての用途に用いることの
できる条件下で、ハイブリッド形成するのに配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列と十分な同一性を有するヌ
クレオチド配列もラット・カテプシンＫポリヌクレオチ
ドに含められる。本発明はまた、かかるラット・カテプ
シンＫポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
提供する。

【００１７】ラット・カテプシンＫをコードするｃＤＮ
Ａを配列決定した結果から明らかなように、本発明のラ
ット・カテプシンＫは、システインプロテアーゼの他の
タンパク質に構造的に関連付けられる。ｃＤＮＡ配列
は、３２９個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読
み枠を含んでいる。図１の配列のアミノ酸は、ヒト・カ
テプシンＫ（Drake,F.ら、J.Bone Miner.Res. 9：S17
7、1994）と、３２９個のアミノ酸残基にて約９２.４％
の同一性（FASTAを使用）を有する。さらには、ラット
・カテプシンKは、ウサギ・カテプシンＫ（Tezuka,K.
ら、J.Biol Chem. 269：1106、1994）と、３２９個のア
ミノ酸にわたって約９３.６％同一である。図１（配列
番号１）のヌクレオチド配列は、ヒト・カテプシンＫ
（Drake,F.ら、J.Bone Miner.Res. 9：S177、1994）
と、９９０個のヌクレオチド残基にて約８７.９％の同
一性（FASTAを使用）を有する。さらには、ラット・カ
テプシンKはウサギ・カテプシンK（Tezuka,K.ら、J.Bio
l Chem. 269：1106、1994）と９９０個のヌクレオチド
にわたって８８.１％同一である。

【００１８】ラットの骨（脊椎）の細胞中のｍＲＮＡか
ら由来のｃＤＮＡライブラリーより標準的クローニング
およびスクリーニングを用い、発現配列タグ（ＥＳＴ）
分析（Adams,M.D.ら、Science 252：1651-1656（199
1）；Adams,M.D.ら、Nature 355：632-634（1992）；Ad
ams,M.D.ら、Nature 377 Supp：3-174（1995））を用い
て、ラット・カテプシンＫをコードする本発明の１のポ
リヌクレオチドを得てもよい。ゲノムＤＮＡライブラリ
ーのごとき天然源から本発明のポリヌクレオチドを得る
こともでき、あるいはよく知られ、かつ商業上利用可能
な方法を用いて合成することもできる。

【００１９】配列番号2のラット・カテプシンＫのポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、図１（配列
番号１）に示されるコーディング配列とその全長にわた
って同一であってもよく、または配列番号２のポリペプ
チドをコードするこのヌクレオチド配列の縮重形であっ
てもよく、あるいは配列番号2のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と高度に同一とすることができ
る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ラット
・カテプシンＫのポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列と高度に同一の、好ましくは８０％同一である
か、またはラット・カテプシンＫのポリペプチドをコー
ドする図１（配列番号１）に含まれる配列と少なくとも
８０％同一であるか、または配列番号2のポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一
であるヌクレオチド配列を有する。

【００２０】本発明のポリヌクレオチドをラット・カテ
プシンＫのポリペプチドの組換え生産に用いる場合、ポ
リヌクレオチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそ
のフラグメントのコーディング配列を含むものであって
もよく；リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、もしく
はプレプロタンパク質配列をコードするコーディング配
列、または他の融合ペプチド部分などの、他のコーディ
ング配列を伴った読み枠中の成熟ポリペプチドまたはフ
ラグメントのコーディング配列を含むものであってもよ
い。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカ
ー配列をコードすることもできる。本発明のこの態様の
特に好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥ
ベクター（Qiagen,Inc.）で得られ、Gentzら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載されるよ
うな、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨ
Ａタグである。ポリヌクレオチドはまた、転写された非
翻訳配列、スプライスおよびポリアデニル化シグナル、
リボソーム結合部位およびmＲＮＡを安定化する配列な
どの非コーディング５’および３’配列を含有していて
もよい。

【００２１】さらなる好ましい具体例は、図１（配列番
号２）のラット・カテプシンＫのポリペプチドのアミノ
酸配列を有し、数個、５ないし１０個、１ないし５個、
１ないし３個、１ないし２個または１個のアミノ酸残基
がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されて
いるラット・カテプシンＫ変種をコードするポリヌクレ
オチドである。本発明は、さらには、本明細書において
前記した配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド
にも関する。この点において、本発明は、特に、本明細
書において前記したポリヌクレオチドにストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チドに関する。本明細書で用いる用語の「ストリンジェ
ントな条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好まし
くは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブ
リダイゼーションが起こることを意味する。

【００２２】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列に対して同一または十分に
同一であり、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリ
ダイゼーションプローブとして用いてラット・カテプシ
ンＫポリペプチドをコードする全長のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離し、ラット・カテプシンＫ遺伝子に
対して高配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。かかるハイ
ブリダイゼーション法は当業者に知られている。典型的
には、これらのヌクレオチド配列は、対照配列と７０％
同一、好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同
一である。一般には、プローブは少なくとも１５個のヌ
クレオチドを含むであろう。好ましくは、かかるプロー
ブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少なくと
も５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ま
しいプローブは３０ないし５０個のヌクレオチドの範囲
にある。

【００２３】一の具体例において、ラット・カテプシン
Ｋをコードするポリヌクレオチドを得るには、適当なラ
イブラリーをストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で配列番号１を有する標識したプローブまたは
そのフラグメントでスクリーニングし、該ポリヌクレオ
チド配列を含有する全長のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離する工程からなる。そのようなハイブリダイゼ
ーション法は当業者に周知である。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件は、前記されているとおり
であるか、あるいはまた５０％ホルムアミド、５ｘＳＳ
Ｃ（１５０ｍＭNaCl、１５ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘ
Denhardt's溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０マ
イクログラム／ｍｌの変性切断サケ精子ＤＮＡを有して
なる溶液中で一夜４２℃でインキュベートし、つづいて
そのフィルターを約６５℃で０.１ｘＳＳＣにて洗浄す
る条件である。研究試薬ならびに動物およびヒトの疾患
の治療および診断を見いだすための材料として本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いてもよい。

【００２４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（複数でも
可）を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作す
る宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプチ
ドの製造にも関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤ
ＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質
を製造できる。

【００２５】組換え体を製造するために、宿主細胞を遺
伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドについての発
現系もしくはそれらの一部を組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davisら、BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）；Sambrook
ら、MOLECUR CLONING：A LABORATORY MANUAL、第２版、
Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring H
arbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験マ
ニュアルに記載される方法により行うことができ、例え
ばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベク
ション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介
トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラ
ンスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入
または感染等がある。

【００２６】適当な宿主の代表的なものとして、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtili
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞、例えばCHO、CO
S、HeLa、Ｃ１２７、３Ｔ３、BHK、HEK２９３およびボ
ウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられ
る。

【００２７】多種の発現系を用いることができる。この
ような系として、とりわけ、染色体、エピソームおよび
ウイルス由来系、例えば細菌プラスミドから、バクテリ
オファージから、トランスポゾンから、酵母エピソーム
から、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントか
ら、バキュロウイルス、パポバウイルスなどの、例えば
ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘
ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルスから由来のベクター、ならびにその組み合わ
せから由来のベクター、例えばコスミドおよびファージ
ミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因
子から由来のベクターが挙げられる。発現系は発現を制
御および引き起こす調節領域を含有していてもよい。一
般に、ポリヌクレオチドを保持、伸長または発現させ、
宿主にてポリペプチドを産生するのに適した系またはベ
クターを使用できる。種々の周知かつ慣用的な技法、例
えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY
MANUAL（前掲）に記載されている技法により、適当なヌ
クレオチド配列を発現系に挿入できる。

【００２８】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナ
ルを所望のポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに固有のシグナルであって
もよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。ラ
ット・カテプシンＫのポリペプチドをスクリーニングア
ッセイにて用いるために発現させる場合、一般に、その
ポリペプチドを細胞表面で生成させることが好ましい。
この場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞
を集めてもよい。ラット・カテプシンＫのポリペプチド
が培地中に分泌されるならば、培地を回収してポリペプ
チドを回収し精製することができる。細胞内に生成され
るならば、まず細胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを
回収しなければならない。ラット・カテプシンＫポリペ
プチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作
用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含め、周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製できる。高性
能液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ま
しい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性
する場合、タンパク質を再生するための周知方法を用
い、再び活性な立体配座とすることができる。

【００２９】診断アッセイ 本発明はまた診断薬として用いるためのラット・カテプ
シンＫのポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全
に関与するラット・カテプシンＫ遺伝子の変異形の検出
は、ラット・カテプシンＫの過少発現、過剰発現または
発現の変化よりもたらされる疾患の診断または疾患の疑
いを特定することのできる診断手段を提供する。ラット
・カテプシンＫ遺伝子に変異のある個体は、種々の方法
によりＤＮＡレベルで検出できる。

【００３０】診断に供する核酸は、対象の細胞、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出するのに直接使用
してもよく、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅させてもよい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることがで
きる。正常な遺伝子型との比較における増幅産物の大き
さの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然
変異は、増幅ＤＮＡを標識化ラット・カテプシンＫのヌ
クレオチド配列とハイブリッド形成させることにより同
定できる。完全に対合した配列はＲＮase消化により、
または融解温度の違いにより、誤対合二重らせんから区
別できる。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性物質と一緒に
またはなしで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動
の移動度の変化により、または直接的ＤＮＡ配列決定法
により検出できる。例えばMyersら、Science 230：1242
（1985）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化は
また、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRＮaseおよび
Ｓ１保護または化学的切断法によっても明らかにするこ
とができる。Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，8
5：4397-4401（1985）を参照のこと。もう１つの具体例
において、ラット・カテプシンＫのヌクレオチド配列ま
たはそのフラグメントからなるオリゴヌクレオチドプロ
ーブのアレイ（array）を構築して、例えば遺伝的変異
の効果的なスクリーニングを行うことができる。アレイ
法はよく知られており、適用範囲が広く、その方法を用
いて、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変化を含
め、分子遺伝学における種々の問題と取り組むことがで
きる（例えば、M.Cheeら、Science, Vol 274, pp610-61
3（1996）を参照のこと）。

【００３１】診断アッセイは、記載した方法によりラッ
ト・カテプシンＫ遺伝子中の変異を検出することによ
る、骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転移およびパ
ジェット病の疑いを診断または測定する方法を提供す
る。加えて、骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転移
およびパジェット病は、対象から由来の試料より、異常
に上昇または低下したラット・カテプシンＫのポリペプ
チドまたはラット・カテプシンＫのｍＲＮＡのレベルを
測定することを特徴とする方法によって診断することが
できる。発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの
定量法として当該分野で周知の方法、例えば、ＰＣＲ、
ＲＴ-ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティングお
よび他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベ
ルで測定できる。宿主から由来の試料中のラット・カテ
プシンＫのポリペプチドなどのタンパク質のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ法は、当業者
に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。

【００３２】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異
的に標的とし、これとハイブリッド形成しうる。本発明
に従って、関連する配列を染色体にマッピングする工程
は、それらの配列を遺伝子関連疾患と関連づける重要な
第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図の
データと関連づけることができる。かかるデータは、例
えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（J
ohns Hopkins University Welch Medical Libraryから
オンラインで利用できる）にて見られる。ついで、連鎖
分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）により、同
じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡま
たはゲノム配列の相違も測定することができる。いくつ
かまたはすべての罹病個体において変異が観察される
が、正常個体においては観察されない場合、その変異は
該疾患の原因である可能性がある。

【００３３】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントま
たはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免
疫原として用いて、ラット・カテプシンＫのポリペプチ
ドに対して免疫特異的な抗体を得ることもできる。「免
疫特異的」なる語は、抗体が先行技術における他の関連
ポリペプチドに対するアフィニティーよりも、本発明の
ポリペプチドに対して実質的により大きなアフィニティ
ーを有することを意味する。

【００３４】ラット・カテプシンＫのポリペプチドに拮
抗して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担
持フラグメント、アナログまたは細胞を、動物、好まし
くはヒト以外の動物に、通常の実験法を用いて投与する
ことにより得ることができる。モノクローナル抗体の産
生には、連続的セルライン培養により得られる抗体を提
供するいずれの方法も用いることができる。例えば、ハ
イブリドーマ法（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature
256：495-497（1975）、トリオーマ法、ヒトB-細胞ハ
イブリドーマ法（Kozborら、Immunology Today 4：72
（1983）およびEBV-ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCL
ONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY、７７−９６頁、
Alan R.Liss,Inc.（1985））が挙げられる。

【００３５】一本鎖抗体を産生するのに記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）を適用して、本発明の
ポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生できる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含め、
他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発現するク
ローンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニ
ティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し
てもよい。ラット・カテプシンＫのポリペプチドに対す
る抗体を用いて、とりわけ、骨粗鬆症、歯周病、関節
炎、癌、腫瘍転移およびパジェット病を治療してもよ
い。

【００３６】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を
誘起する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じさせるに十分なラット・カテプシンＫのポリ
ペプチドまたはそのフラグメントを哺乳動物に接種し
て、とりわけ、骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転
移およびパジェット病から該動物を防御することからな
る方法に関する。本発明のもう１つ別の態様は、哺乳動
物における免疫学的応答を誘導する方法であって、ラッ
ト・カテプシンＫのポリペプチドをベクターを介してデ
リバリーし、かかる免疫学的応答を誘発させ、抗体を産
生し、該動物を疾患から保護するように、インビボにて
ラット・カテプシンＫのポリヌクレオチドの発現を指令
することからなる方法に関する。

【００３７】本発明のさらなる態様は免疫学的／ワクチ
ン処方（組成物）であって、哺乳動物宿主中に導入され
た場合、その哺乳動物にてラット・カテプシンＫのポリ
ペプチドに対する免疫学的応答を誘導する処方（該組成
物はラット・カテプシンＫのポリペプチドまたはラット
・カテプシンＫ遺伝子を含んでなる）に関する。ワクチ
ン処方は、さらに適当な担体を含んでいてもよい。ラッ
ト・カテプシンＫのポリペプチドは胃で分解されるかも
しれないため、好ましくは非経口的（皮下、筋肉内、静
脈内、皮内注射等を包含する）に投与する。非経口投与
に適した処方は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤および
処方を患者の血液と等張にする溶質を含有してもよい水
性および非水性滅菌注射用溶液；ならびに懸濁剤または
増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液
を包含する。処方を１回投与または複数回投与用容器、
例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて提供して
もよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい
凍結乾燥状態にて保存してもよい。またワクチン処方
は、水中油系および当該分野で知られた他の系などの処
方の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含んでい
てもよい。用量は、ワクチンの個々の活性に依存してお
り、通常の実験により容易に決定することができる。

【００３８】スクリーニングアッセイ 本発明のラット・カテプシンＫのポリペプチドは、本発
明のラット・カテプシンＫのポリペプチドの活性を活性
化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニストまたは阻
害剤とも称される）する化合物についてのスクリーニン
グ法にて用いてもよい。かくして、本発明のポリペプチ
ドを用いて、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラ
リーおよび天然物の混合物からのアゴニストまたはアン
タゴニストを評価し、同定してもよい。これらのアゴニ
ストまたはアンタゴニストは、場合によっては、本発明
のポリペプチドの天然の基質、リガンド、レセプターな
どであってもよく、あるいは本発明のポリペプチドの構
造または機能を模倣したものであってもよい。Coligan
ら、Current Protocols in Immunology 1（2）：第5章
（1991）を参照のこと。

【００３９】ラット・カテプシンＫのポリペプチドは哺
乳動物宿主中に偏在しており、種々の病原性を含め、多
くの生物学的機能に関与している。したがって、一方で
ラット・カテプシンＫのポリペプチドを刺激する化合物
および薬剤を、他方でラット・カテプシンＫのポリペプ
チドの機能を阻害しうる化合物または薬剤を見いだすこ
とが望ましい。一般に、アゴニストは、骨粗鬆症、歯周
病、関節炎、癌、腫瘍転移およびパジェット病のような
症状についての治療および予防目的に利用される。アン
タゴニストは、骨粗鬆症、歯周病、関節炎、癌、腫瘍転
移およびパジェット病などの症状の種々の治療および予
防目的に利用できる。

【００４０】一般に、かかるスクリーニング操作は、本
発明のラット・カテプシンＫのポリペプチドを発現する
か、またはラット・カテプシンＫのポリペプチドに応答
する適当な細胞を用いることからなる。かかる細胞は、
哺乳動物、酵母、DrosophilaまたはE.coli由来の細胞を
包含する。ついで、ラット・カテプシンＫのポリペプチ
ド（または発現したポリペプチドを有する細胞膜）を発
現するか、またはラット・カテプシンＫのポリペプチド
に応答する細胞を、試験化合物と接触させて結合または
機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候補化合物
と接触させた細胞の能力を接触させていない同じ細胞と
ラット・カテプシンＫ活性について比較する。

【００４１】コードされたポリペプチドおよびプロセッ
シングされた形態は、ラット・カテプシンＫの阻害剤を
同定し、インビトロにおける機能アッセイまたはインビ
ボにおけるラットの試験の前に化合物の活性を評価する
ためのスクリーニングアッセイに適している。スクリー
ニングアッセイは、発色性または蛍光性タグを含んでい
てもよいタンパク質またはペプチドなどの適当な基質
の、タンパク質分解の切断またはその阻害をモニターす
ることができる。スクリーニング操作により選択された
化合物を、インビトロ機能アッセイまたはインビボにて
試験してもよい。この点にて有用なインビトロアッセイ
は、骨吸収アッセイ、例えば、Fetal RatLong Bone ass
ay、Fetal Rat Parietal Bone assay または骨スライス
上のラット破骨細胞による骨吸収の空隙の形成をモニタ
ーすること（「ピット」（pit）アッセイ」を包含す
る。インビボアッセイとして、例えば、ＰＴＨ処理の甲
状腺上皮小体摘出したラットおよび卵巣摘出したラット
が挙げられる。コードされたポリペプチドおよびプロセ
ッシングされた形態はまたタンパク質の構造を特徴付
け、ラット・カテプシンＫに対する抗体を得るのに有用
である。

【００４２】該アッセイは、候補化合物に直接または間
接的に結合した標識を用いて、あるいは標識競争物質と
の競争を用いるアッセイにおいて、ラット・カテプシン
Ｋのポリペプチドを有する細胞への付着を検出する、候
補化合物の結合を試験するだけであってもよい。さらに
は、候補化合物がラット・カテプシンＫのポリペプチド
の活性化により発生するシグナルを生じるかどうかを、
ラット・カテプシンＫのポリペプチドを有する細胞に適
した検出系を用いて、これらのアッセイにより試験して
もよい。活性化の阻害剤は、一般に、既知アゴニストの
存在下でアッセイされ、候補化合物が存在することによ
るアゴニストの活性化に対する作用を観察する。かかる
スクリーニングアッセイを行うための標準操作は当該分
野において周知である。

【００４３】潜在的なラット・カテプシンＫのポリペプ
チドのアンタゴニストの例は、抗体、またはある場合に
は、場合によってはラット・カテプシンＫのポリペプチ
ドのリガンド、基質、レセプターなどに密接に関連する
オリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、リガン
ド、基質、レセプターのフラグメント、または本発明の
ポリペプチドの活性が妨げられるように、該ポリペプチ
ドに結合するが、応答を惹起しない、小型分子を包含す
る。

【００４４】予防および治療方法 本発明は、過剰または不十分な量の両方のラット・カテ
プシンＫのポリペプチド活性に関連する、異常な症状の
治療方法を提供する。ラット・カテプシンＫのポリペプ
チド活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いることが
できる。１の方法は、リガンドのラット・カテプシンＫ
のポリペプチドとの結合を遮断することにより、または
別のシグナルを阻害することにより活性化を阻害するの
に効果的な量の前記した阻害化合物（アンタゴニスト）
を医薬上許容される担体と共に対象に投与し、そのこと
により異常な症状を改善することからなる。もう１つ別
の方法において、内在性ラット・カテプシンＫのポリペ
プチドと競争してリガンドとの結合能を有する可溶形の
ラット・カテプシンＫのポリペプチドを投与してもよ
い。かかる競争物質の典型例はラット・カテプシンＫの
ポリペプチドのフラグメントからなる。

【００４５】さらにもう１つ別の方法において、発現遮
断法を用いて内在性ラット・カテプシンＫのポリペプチ
ドをコードする遺伝子の発現を阻害してもよい。公知の
かかる方法は、内部生成した、あるいは別個に投与され
たアンチセンス配列の使用からなる。例えば、Oligodeo
xynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expr
ession，CRC Press，Boca Raton, FL（1988）中、O'Con
nor、J.Neurochem 56：560（1991）を参照のこと。別法
として、遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌク
レオチドを供給することもできる。例えば、Leeら、Nuc
leic Acids Res 6：3073（1979）；Cooneyら、Science
241：456（1988）；Dervanら、Science 251：1360（199
1）を参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体投与
することができ、あるいは関連するオリゴマーをインビ
ボで発現させることもできる。

【００４６】ラット・カテプシンＫおよびその活性の過
少発現に関連する異常な症状を治療するのに、またいく
つかの方法が利用可能である。１の方法は、ラット・カ
テプシンＫのポリペプチドを活性化する治療上有効量の
化合物（すなわち、前記のアゴニスト）を医薬上許容さ
れる担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な
状態を改善することからなる。別法として、遺伝子治療
を用いて、対象中の関連細胞によるラット・カテプシン
Ｋの内因的生成を有効ならしめてもよい。例えば、前記
のごとく、複製欠損レトロウイルスベクターにて発現す
るように、本発明のポリヌクレオチドを操作してもよ
い。ついで、該レトロウイルス発現構築物を単離し、本
発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ含有のレトロウ
イルスプラスミドベクターでトランスダクションしたパ
ッケージング細胞中に導入して、パッケージング細胞が
目的とする遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成する
ようにしてもよい。これらのプロデューサー細胞を対象
に投与して細胞をインビボで操作し、インビボでポリペ
プチドを発現するようにしてもよい。遺伝子治療の概説
としては、Human Molecular Genetics, T.Strachan and
A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd（1996）
中、第２０章、Gene Therapy and other Molecular Gen
etic-based Therapeutic Approaches（およびその中の
引用文献）を参照のこと。

【００４７】処方および投与 可溶形のラット・カテプシンＫのポリペプチドのごとき
ペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペ
プチドまたは小型分子を、適当な医薬担体と組み合わせ
て処方してもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリ
ペプチドまたは化合物、および医薬上許容される担体も
または賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、食塩
水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびその組み合わせを包含するが、これ
らに限定されない。処方は投与経路に適したものとすべ
きであり、当業者によく知られている。さらに本発明
は、前記した本発明の組成物の１種またはそれ以上の成
分を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる
医薬パックおよびキットにも関する。

【００４８】本発明のポリペプチドおよび他の化合物を
単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他
の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身系
投与の好ましい形態は、典型的には静脈注射による注射
を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注射
経路を用いることもできる。全身系投与のための別の手
段は、胆汁酸塩またはフシジン酸などの浸透剤または他
の界面活性剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含す
る。加えて、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方
されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物
の投与は、膏薬、パスタ、ゲル等の形態にて、局所的お
よび／または局在化であってもよい。

【００４９】必要な用量範囲は、ペプチドの選択、投与
経路、処方の性質、対象の症状の性質、および顧問医の
判断に依存する。しかしながら、適当な用量は対象１ｋ
ｇ当たり０.１ないし１００μｇの範囲である。しか
し、種々の使用化合物および種々の投与経路の効力の違
いを考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思われ
る。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必
要であると考えられる。当該分野においてよく知られた
最適化のための標準的な経験的慣用操作を用いてこれら
の用量の変更を行うことができる。しばしば「遺伝子治
療」と称される前記した治療方法において、治療に用い
られるポリペプチドを対象中において内在的に得ること
もできる。よって、例えば、レトロウイルスプラスミド
ベクターを用いて対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲＮＡ
などのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドをエク
スビボでコードしてもよい。次いで、細胞を対象に導入
する。

【００５０】

【実施例】以下の実施例は、特記する場合を除き、当業
者に周知かつ慣用的な、標準方法を用いて行う。実施例
は例示であって、本発明を限定するものではない。

【００５１】実施例１ ラット脊椎より筋肉および周りの組織を切除する。トリ
ゾール（TriZOL）試薬（GIBCO/BRL、Gaithersburg、M
D）中にホモジナイズさせることにより全ＲＮＡを骨か
ら抽出させ、イソプロパノール沈降により濃縮する。オ
リゴ−ｄＴクロマトグラフィーによりポリＡ＋ｍＲＮＡ
を調製する。コーディング配列の５'および３'末端にあ
るヒト、ウサギおよびマウスｃＤＮＡの保存領域を基礎
として変性ＰＣＲプライマーを設計した。これらのプラ
イマーは、ＡＴＧで開始するコーディング領域の最初の
２１個の塩基（ＳＢ９２１４）および停止コドンＴＧＡ
で終える最後の２１個の塩基（ＳＢ９２１６）に対して
相補的である。Life Technologies Stratascript II Pr
e-amplification System（GIBCO／BRL、Gaithersburg、
MD）および前記したプライマーでのポリメラーゼ連鎖反
応を用いて、９９０個の塩基対ＤＮＡフラグメントを増
幅させ、ｐＣＲ２ベクター（Invitrogen、San Diego、C
A）にサブクローンした。このフラグメントの２つの別
々に誘導したクローンを配列決定し、ヒト・カテプシン
Ｋと略８８％の相同性が、ヒト・カテプシンＳと７０％
だけの相同性があることがわかった。その配列を確認す
るために、第２のＲＴ−ＰＣＲ誘導のクローンをラット
関節炎の足関節のｃＤＮＡより単離した。このクローン
の配列は原型のクローン（クローン名 ＲＣＫ２）と完
全に適合した。３'末端の配列を確認するために、ヒト
およびウサギｃＤＮＡの３'末端の非翻訳領域の保存部
分を基礎としてプライマーを設計した。このプライマー
（ＳＢ２２６８）をラット遺伝子特異的な内部プライマ
ー（ＳＢ９７３７）と一緒に用い、ＲＴ−ＰＣＲにより
ラットの骨（脊椎）ｃＤＮＡからの３６０個の塩基対フ
ラグメントを増幅した。この３'フラグメントを配列決
定し、その原型のクローンの配列が正確であることを確
認した。

【００５２】この配列を異種系（Ｅ.coliおよびバキュ
ロウイルス）にて発現させ、高レベルのタンパク質を産
生させた。これらの系にて産生し、精製した組換えタン
パク質は、触媒活性の阻害剤を同定するためのスクリー
ニングアッセイにて有用であり、同様に構造研究および
抗体産生のための材料源として有用である。

【００５３】

【配列表】

（１）一般的情報 （ｉ）出願人：フェイルド，ジョン ブラン，キンバリー （ｉｉ）発明の名称：ラット・カテプシンＫのポリヌク
レオチドおよびポリペプチド配列 （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）郵送先 （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード・７０９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：USA （Ｆ）郵便番号：19406 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windowsバージョン２.０用FastSE
Q （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号：不明 （Ｂ）出願日：1997年2月26日 （Ｃ）分類番号：不明 （ｖｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）名称：ハン，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：34344 （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＨ50005 （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話番号：610-270-5219 （Ｂ）ファックス番号：610-270-4026 （Ｃ）テレックス番号：

【００５４】 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９９０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGTGGGGGC TCAAGGTTCT GCTGCTACCC GTGGTGAGCT TTGCTCTATC CCCGGAGGAA 60 ACGCTGGACA CGCAGTGGGA GCTGTGGAAG AAGACCCACG GGAAGCAGTA CAACAGCAAG 120 GTGGATGAAA TCTCTCGGCG TTTAATTTGG GAAAAAAACC TGAAGAAAAT TTCTGTCCAT 180 AATCTTGAGG CCTCTCTTGG TGCCCATACG TATGAGCTGG CCATGAATCA CCTGGGAGAC 240 ATGACCAGCG AAGAAGTGGT TCAGAAGATG ACTGGACTCA GAGTGCCACC TTCGCGTTCC 300 TTCAGTAATG ACACTCTCTA TACCCCAGAG TGGGAAGGCA GAGTCCCAGA CTCCATCGAC 360 TATCGAAAGA AAGGCTATGT TACTCCAGTC AAAAACCAGG GCCAGTGTGG TTCCTGTTGG 420 GCTTTCAGCT CTGCGGGTGC CCTGGAGGGC CAACTCAAGA AGAAAACTGG CAAACTCTTA 480 GCTCTGAGTC CCCAGAATCT TGTGGACTGT GTGTCTGAGA ACTATGGCTG TGGAGGCGGC 540 TATATGACCA CTGCCTTCCA ATATGTGCAG CAGAATGGAG GCATTGACTC TGAAGACGCT 600 TACCCGTATG TGGGGCAGGA TGAAAGTTGT ATGTATAACG CCACGGCAAA GGCAGCTAAG 660 TGCAGAGGGT ACAGAGAGAT CCCTGTGGGG AACGAGAAAG CCCTGAAGAG AGCAGTGGCT 720 CGGGTAGGAC CCGTCTCTGT GTCCATCGAT GCAAGCTTGA CATCTTTCCA ATTTTACAGC 780 AGAGGTGTGT ACTATGACGA AAACTGCGAC CGTGATAATG TGAACCATGC CGTGTTGGTG 840 GTGGGCTATG GCACCCAGAA GGGAAATAAG TACTGGATAA TTAAAAACAG CTGGGGAGAA 900 AGCTGGGGAA ACAAAGGCTA TGTTCTCTTG GCTCGGAATA AGAACAATGC CTGTGGCATT 960 ACCAACCTGG CCAGCTTCCC CAAGATGTGA 990

【００５５】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu 1 5 10 15 Ser Pro Glu Glu Thr Leu Asp Thr Gln Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr 20 25 30 His Gly Lys Gln Tyr Asn Ser Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Lys Ile Ser Val His Asn Leu Glu Ala 50 55 60 Ser Leu Gly Ala His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp 65 70 75 80 Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Arg Val Pro 85 90 95 Pro Ser Arg Ser Phe Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Thr Pro Glu Trp Glu 100 105 110 Gly Arg Val Pro Asp Ser Ile Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr 115 120 125 Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser 130 135 140 Ala Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ala Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Tyr Gly 165 170 175 Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Gln Asn 180 185 190 Gly Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Asp Glu 195 200 205 Ser Cys Met Tyr Asn Ala Thr Ala Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr 210 215 220 Arg Glu Ile Pro Val Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala 225 230 235 240 Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ser Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe 245 250 255 Gln Phe Tyr Ser Arg Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Asn Cys Asp Arg Asp 260 265 270 Asn Val Asn His Ala Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Thr Gln Lys Gly 275 280 285 Asn Lys Tyr Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Ser Trp Gly Asn 290 295 300 Lys Gly Tyr Val Leu Leu Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile 305 310 315 320 Thr Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met 325

【図面の簡単な説明】

【図１】 ラット・カテプシンＫからのヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を示す（配列番号1および２)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 ＺＮＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/53 37/54 ＡＢＪ 33/68 ＺＮＡ ＡＣＫ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キンバリー・ブラン アメリカ合衆国19136ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、オークモント・ストリー ト4510番

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のラット・カテプシンＫのポ
   リペプチドをコードするヌクレオチド配列とその全長に
   わたって少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチ
   ド配列、またはそのヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
   オチド配列を有してなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である請求
   項１記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るラット・カテプシンＫのポリペプチドをコードする配
   列を有してなる請求項３記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項3のポリヌクレオチドの少なくと
   も連続した15個のヌクレオチドを有してなるポリヌクレ
   オチドのプローブまたはプライマー。
7. 【請求項７】 発現系を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ
   分子であって、その発現系が適合可能な宿主細胞中にあ
   る場合に、配列番号2のポリペプチドと少なくとも９５
   ％の同一性を有するアミノ酸配列を有してなるラット・
   カテプシンＫのポリペプチドの産生能を有するＤＮＡま
   たはＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７の発現系を有してなる宿主細
   胞。
9. 【請求項９】 請求項８の宿主を、そのポリペプチドを
   産生するのに十分な条件下で培養することからなるラッ
   ト・カテプシンＫのポリペプチドの産生法。
10. 【請求項１０】 さらに、そのポリペプチドを培養物か
    ら回収することからなる請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 ラット・カテプシンＫのポリペプチド
    を産生する細胞の産生法であって、宿主細胞が、適当な
    培養条件下、ラット・カテプシンＫのポリペプチドを産
    生するように、該宿主細胞を請求項７の発現系で形質転
    換またはトランスフェクションすることからなる方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１の方法により産生される細
    胞。
13. 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸配列とその全長
    にわたって少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
    配列からなるラット・カテプシンＫのポリペプチド。
14. 【請求項１４】 配列番号２のアミノ酸配列からなる請
    求項１３記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 配列番号２のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 請求項１０の方法により調製されるラ
    ット・カテプシンＫのポリペプチド。
17. 【請求項１７】 請求項１３のラット・カテプシンＫの
    ポリペプチドに免疫特異的な抗体。
18. 【請求項１８】 ラット・カテプシンＫのポリペプチド
    活性を強化する必要性のある対象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該ポリペプチドに対する
    アゴニストを投与し；および／または（ｂ）インビボに
    て該ポリペプチド活性を生じさせるような形態にてラッ
    ト・カテプシンＫのポリヌクレオチドを対象に付与する
    ことからなる方法。
19. 【請求項１９】 ラット・カテプシンＫのポリペプチド
    活性を阻害する必要性のある対象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該ポリペプチドに対する
    アンタゴニストを投与し；および／または（ｂ）該対象
    に該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現
    を阻害する核酸分子を投与し；および／または（ｃ）該
    対象にそのリガンド、基質またはレセプターについて該
    ポリペプチドと競合する治療上有効量のポリペプチドを
    投与することからなる方法。
20. 【請求項２０】 対象におけるラット・カテプシンＫの
    ポリペプチドの発現または活性に関連付けられる対象の
    疾患または疾患の疑いの診断方法であって、 （ａ）該対象のゲノム中のラット・カテプシンＫのポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列における変異の
    有無を測定し；および／または（ｂ）該対象から由来の
    試料中のラット・カテプシンＫのポリペプチド発現の存
    在または量について分析することからなる方法。
21. 【請求項２１】 ラット・カテプシンＫのポリペプチド
    を阻害（拮抗）または作動する化合物の同定方法であっ
    て、 （ａ）候補化合物を、ラット・カテプシンＫのポリペプ
    チドを発現する細胞（またはラット・カテプシンＫのポ
    リペプチドを発現する細胞膜）またはラット・カテプシ
    ンＫのポリペプチドに応答する細胞と接触させ；（ｂ）
    結合あるいは機能的応答の刺激または阻害を観察する
    か；または候補化合物と接触させた細胞（または細胞
    膜）の能力を、接触させていない同じ細胞と、ラット・
    カテプシンＫのポリペプチド活性について比較すること
    からなる方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１の方法により同定されるア
    ゴニスト。
23. 【請求項２３】 請求項２１の方法により同定されるア
    ンタゴニスト。
24. 【請求項２４】 ストリンジェントなハイブリダイゼー
    ション条件下、ラット・カテプシンＫ遺伝子を含有する
    適当なライブラリーを、配列番号１の配列を有するプロ
    ーブまたはそのフラグメントでスクリーニングし、その
    ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできるＤＮ
    Ａ配列を有してなるポリヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 配列番号１のヌクレオチド配列を有し
    てなるヌクレオチド配列を発現させることにより得られ
    るポリペプチド。