JPH11222499A - プロテアソーム抑制蛋白質およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 プロテアソームの活性制御に関連する新規な
蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、そのアン
チセンスポリヌクレオチド、及び、その抗体を提供す
る。 【解決手段】 本発明は、プロテアソーム制御因子とし
てプロテアソームの蛋白質分解活性を抑制する新規な蛋
白質、それをコードするポリヌクレオチド、及び、当該
蛋白質を認識する抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアソ−ムの
蛋白質分解活性を抑制する蛋白質および該蛋白質の変異
体、それらの蛋白質をコードするポリヌクレオチド並び
にそれを組み込んでなる形質転換体に関する。また、前
記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに
関する。また、前記蛋白質を認識する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテアソームは、別名、多機能性プロ
テアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネル
ギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。プ
ロテアソームは、酵母からヒトに至る真核生物に広く存
在しており、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓
では、全可溶性蛋白質の１％も占める。プロテアソーム
は同一分子内に複数の触媒活性部位を持ち、トリプシン
型酵素の基質である塩基性アミノ酸、キモトリプシン型
酵素の基質である中性アミノ酸、酸性アミノ酸を含む合
成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する
活性がある。酸性アミノ酸を含む合成ペプチドのカルボ
キシ末端のペプチド結合を切断する活性を有することは
プロテアーゼとしては稀である。しかしながら、種々の
既知の阻害剤にはプロテアソームに特異的かつ有効に作
用するものがないことから、プロテアソームは、既知の
プロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つと推定され
ている。

【０００３】また、プロテアソームは構造的には、１４
種類（α型７種類、β型７種類）の異なるサブユニット
のダイマーからなる総数２８個の多成分複合体である。
また、沈降係数２０Ｓ、分子量は約７５万と推定され、
プロテアーゼとしては例外的に大きい。本明細書におい
て、このプロテアソームを２０Ｓプロテアソームとい
う。また、プロテアソームを電子顕微鏡で観察すると７
種類のサブユニットが環状構造を形成し、これがα
_(1-7)β_(1-7)β_(1-7)α_(1-7)の４層構造をとる分子形状
を有していることが認められた。

【０００４】さらに、ヒトプロテアソームは、少なくと
も１４種類のサブユニットより、構成されていることが
わかり、このうちα型サブユニット群として、ＨＣ２、
ＨＣ３、ＨＣ８、ＨＣ９、Ｚｅｔａ、ｉｏｔａまたはＸ
ＡＰＣ７、β型サブユニット群として、ＨＣ５、ＨＣ７
−Ｉ、ＨＣ−１０、ＨＮ３、Ｘ、ｈＬＭＰ７、Ｙ、ｈＬ
ＭＰ２、ＺまたはＭＥＣＬ１等の一次構造が明かになっ
た（Tanahashi,N.et al.,Enzyme Protein,47,241,199
3）。かかるプロテアソームは、非リソゾーム系蛋白質
分解経路における主要酵素であり、蛋白質の修飾による
機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩な生理作用
を有していると推定される。さらに、最近、クラスＩ
ＭＨＣ抗原の提示に欠陥をもつＢ細胞変異株が分離さ
れ、それらにはクラスＩＩ ＭＨＣ領域約２００ｋｂに
欠失のあることが判明した。この領域には、ＴＡＰ１お
よびＴＡＰ２とよばれるペプチドを細胞質から小胞体へ
移送させるトランスポーター蛋白質の遺伝子がコードさ
れており、その近傍には、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７とよばれ
るプロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子が
存在することが判明した。さらに、ＬＭＰ２やＬＭＰ７
のノックアウトマウスがクラスＩ ＭＨＣ抗原提示が低
下していることがわかった。これらにより、プロテアソ
ームは内在性抗原のプロセシング酵素であると考えられ
ており、注目されている（Tanaka,K.,et al.,Adv.Immun
ol.,64.1,1997）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】プロテアソームは、こ
のような２０Ｓ型複合体としてみいだされたが、細胞内
では、大部分が不活性型の状態で存在しており、これは
何らかの制御因子が結合することによりその活性が阻害
され不活性型となっていると考えられていた。しかしな
がら、その制御因子の実体は長い間不明であって、その
制御因子の詳細を明らかにし、各種病態の診断、および
治療法を確立することが強く要請されていた。そこで、
本発明はプロテアソーム制御因子としてプロテアソーム
の蛋白質分解活性を抑制する蛋白質（「プロテアソーム
抑制蛋白質」と命名する。）を単離し、そのアミノ酸配
列をおよびその機能を明らかにすることを目的とするも
のである。また、本発明は前記プロテアソーム抑制蛋白
質の遺伝子の塩基配列を提供することを目的とするもの
である。また、本発明は、前記プロテアソーム抑制蛋白
質を認識する抗体を提供することを目的とするものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成可能とするため、前記プロテアソーム抑制蛋白質
について、機能等について詳細に研究を重ねた結果、新
規なプロテアソーム抑制蛋白質を単離同定し、その機能
について解明し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列からなるプロテアソーム抑制蛋白質（以下、「ヒトＰ
Ｉ３１」という。）または配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列をその一部に含むプロテアソーム抑制蛋白
質に関する。また、本発明は、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列における一または複数のアミノ酸を置
換、欠失または付加してなるアミノ酸配列からなりかつ
ヒトプロテアソームの蛋白質分解活性を抑制するプロテ
アソーム抑制蛋白質（以下、「ヒトＰＩ３１変異体」と
いう。）に関する。

【０００７】また、本発明は、前記ヒトＰＩ３１もしく
はヒトＰＩ３１を一部に含む蛋白質またはヒトＰＩ３１
変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。さら
に、本発明は前記のポリヌクレオチドのうちの一部であ
って、連続する９以上の塩基からなるポリヌクレオチド
に関する。また本発明は、請求項１又は２に記載の蛋白
質をコードするポリヌクレオチドを組み込んでなる形質
転換体に関する。さらに、本発明は前記のポリヌクレオ
チドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンス
ポリヌクレオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチ
ドの誘導体のうちの一部であって、連続する９以上の塩
基からなるアンチセンスポリヌクレオチドまたは該アン
チセンスポリヌクレチドの誘導体に関する。さらに、本
発明は化学修飾された前記のポリヌクレオチド（アンチ
センスポリヌクレオチドを含む）に関する。また、本発
明はヒトＰＩ３１もしくはヒトＰＩ３１を一部に含む蛋
白質またはヒトＰＩ３１変異体を認識する抗体に関す
る。なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ
酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ- ＩＵＢによ
る略号あるいは当該分野における慣用の略号を使用し
た。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。 （ＰＩ３１の精製）本発明に係るＰＩ３１はヒトだけで
はなく、各種動物の組織由来細胞から、透析、硫安沈殿
またはゲル濾過カラム、イオン交換カラムもしくはハイ
ドロキシアパタイトを吸着体としたクロマトグラフィ
ー、またはグリセロール密度勾配遠心法等の操作で単一
に精製することが可能である。また、各種クロマトグラ
フィーを組み合わせることにより、ＰＩ３１の精製は可
能である。精製したＰＩ３１画分は２０Ｓプロテアソー
ムの蛋白質分解活性を抑制する活性がある。精製したＰ
Ｉ３１を含む画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐ６３６−６
４０）や、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ等による２次元電気泳動
により分離した後、ゲルをクマシー染色すると、分子量
３１ｋＤａのバンドが観察される。

【０００９】（ＰＩ３１の単離）前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
や２次元電気泳動によるバンドからＰＩ３１を単離する
には、分子量約３１ｋＤａのバンドを選ぶことにより可
能である。すなわち電気泳動法より分離同定されたＰＩ
３１ををポリビニリデンジフルオロダイド（ＰＶＤＦ）
等にトランスファーすることが可能である。

【００１０】（プローブの作成）前記の処理後のＰＩ３
１を、リジルエンドペプチダーゼなどによる各種酵素処
理によりポリペプチドフラグメントの混合物とし、得ら
れたペプチドフラグメントの混合物を高速液体クロマト
グラフィーで分離する。前記得られたポリペプチドフラ
グメントのいくつかのフラグメントのアミノ酸配列を自
動アミノ酸シークエンサー等を用いて決定し、得られた
アミノ酸配列をコードするポリペプチドフラグメントの
うち縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補
的ポリヌクレオチドを合成する。得られた合成ポリヌク
レオチドはＰＩ３１をコードするポリヌクレオチドの検
索のためのプローブとして使用できる。また、複数のア
ミノ酸配列が得られた場合は、対応する相補的ポリヌク
レオチドを組み合わせて、ｃＤＮＡを鋳型にして、ＰＣ
Ｒ法により、より長い断片のＤＮＡプローブを得ること
もできる。以上のようにして、ＰＩ３１をコードするポ
リヌクレオチドをスクリーニングするためのポリヌクレ
オチドプローブが得られる。

【００１１】（ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスク
リーニング）本発明のＰＩ３１をコードするポリヌクレ
オチドをスクリーニングするためのｃＤＮＡライブラリ
ーの作製方法としては、一般的な方法が使用可能であ
り、例えば次のステップにより調製することができる。
すなわち、（ｉ）プロテアソーム産生細胞からメッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ｉｉ）該ｍＲＮ
Ａから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）
を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合成し、（ｉｉ
ｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミドまたはファー
ジに組み込み、（ｉｖ）得られた組換えプラスミドまた
はファージにより適当な宿主細胞を形質転換し、（ｖ）
得られた形質転換体を培養後、形質転換体から、適当な
方法、例えばコロニーハイブリダイゼーションまたはプ
ラークハイブリダイゼーションにより、目的とするポリ
ヌクレオチドを含有するプラスミドまたはファージを単
離し、（ｖｉ）そのプラスミドまたはファージから目的
とするポリヌクレオチドを切り出し、（ｖｉｉ）切り出
したポリヌクレオチド（クローン化ポリヌクレオチド）
を適当なプラスミドにサブクローニングする、というス
テップである。

【００１２】各ステップについてさらに詳しく説明す
る。 ステップ（ｉ）：ヒトＰＩ３１のポリペプチドをコード
するｍＲＮＡは、種々の動物の組織、器官、産生細胞か
ら、より具体的には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、胸
腺、肝癌細胞株、腎臓癌細胞株などから得ることができ
る。また前記細胞から全ＲＮＡを調製する方法として
は、グアニジウム／セシウムクロライド法（Ｇｕａｎｉ
ｄｉｕｍｕ／Ｃｅｓｉｕｍｕ Ｃｈｒｏｒｏｉｄｅｍｅ
ｔｈｏｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅ
ｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ
７．１９−７．２３，１９８９）やグアニジウムチオシ
アネート法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１６２，ｐ１５６−１５９，１９８７）等が
一般に用いられる。前記操作により得られる全ＲＮＡか
らのｍＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴ−セル
ロース（コラボレイティブ リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））やオリゴテッ
クス−ｄＴ３０（タカラ社）等を用いて吸着カラム法ま
たはバッチ法により実施できる。

【００１３】ステップ（ｉｉ）：このようにして得られ
たｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオ
カヤマ−バーグ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅ
ｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，ｐ２８０，１９８３）や
グブラーとホフマンの方法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｖ．ａｎｄ
Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ，２５，ｐ２６
３−２６９，１９８３）等に従いｃＤＮＡを合成する。

【００１４】ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡを
プラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラ
リーを調製する。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクタ
ーとしては、例えば、ＰＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９
５，１９７７）、ＰＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，４，１２
１，１９７８）、ＰＵＣ１２もしくはＰＵＣ１３（Ｇｅ
ｎｅ，１９，２５９，１９８２）、ＰＵＣ１８もしくは
ＰＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）、Ｐ
ＵＣ１１８もしくはＰＵＣ１１９（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３，１９８７）、
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８９）などが挙
げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製保
持されるものであれば、いずれも用いることができる。

【００１５】また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、例えば、λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．
Ｖ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．
Ｗ．，ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，１，４９，１９８５）、λｇｔ１１（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，１
１９４，１９８３）またはλＺＡＰＩＩ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８
９）などが使用可能であるが、その他のベクターであっ
ても、適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。

【００１６】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．）らの方法（前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇＳｅｃｏｎｄ Ｅｄｔ．，ｐ１．５３−１．７
３，１９８９）などが挙げられる。また、ファージベク
ターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えば、Ｈｙ
ｕｎｈ，Ｔ．Ｖ．等の方法（前掲のＤＮＡ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）などが使用可能である。

【００１７】ステップ（ｉｖ）：前記の方法により得ら
れたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿
主たとえば、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａＣｏｌｉ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）等に導入して、これを形質転換できる。プラスミド
ベクターで宿主を形質転換する方法としては、例えば、
モレキュラークローニング（前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、１．７４−１．８４ページ）記載の
エレクトロポーレーション法あるいはカルシウムクロラ
イド法などが挙げられる。また、ファージベクターに
は、例えば、増殖させた大腸菌にインビトロパッケージ
ング法を用いて導入することができる。

【００１８】ステップ（ｖ）：前記方法によるｃＤＮＡ
から目的のヒトプロテアソームのサブユニットＰ５８の
ｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プ
ラークハイブリダイゼーション法（前掲のＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔ．，
１．８５−１．１０４ページまたは２．１１２−２．１
２０ページ）などが使用可能である。

【００１９】前記のハイブリダイゼーションにおけるプ
ローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、ヒトＰ
Ｉ３１とハイブリダイズするポリヌクレオチドであれ
ば、何でもよく、例えばヒトＰＩ３１のアミノ酸配列に
基づいて化学合成したポリヌクレオチドが使用可能であ
る。以上のようにして、ヒトＰＩ３１をコードするポリ
ヌクレオチドが調製可能となる。

【００２０】（塩基配列の決定）前記に従い得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサム−ギルバ
ート（Ｍａｘｉａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９−５
６０，１９８０）、ジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，９，３０９，１９８１）、蛍光色素を用
いたＴａｑサイクルシークエンシング法（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４−４９９，１９８９）によ
り行うことができる。

【００２１】（ヒトＰＩ３１）決定されたヒトＰＩ３１
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、配
列表の配列番号２に記載したように、３０６４残基から
なり、オープンリーディングフレームは１２７番目のＡ
から９３９番目のＧまでの８１３塩基基であり、２７１
アミノ酸をコードする。本発明に係る前記ｃＤＮＡは、
前記配列の５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列
からなるｃＤＮＡを含む。また、ｃＤＮＡに限らず、配
列表の配列番号２に記載の塩基配列を一次構造とするＤ
ＮＡおよび該塩基配列に対応する塩基配列からなるＲＮ
Ａも、本発明のヒトＰＩ３１をコードするポリヌクレオ
チドに含まれる。

【００２２】本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＩ３
１のシグナルペプチドの部分または全部をコードする
５’−フランキングポリヌクレオチドを含むＤＮＡも含
む。さらに、遺伝暗号の縮重に従い、ポリヌクレオチド
から生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となくそのポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。従
って、本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝暗号の縮
重に基づく置換によって、その塩基配列がコードするア
ミノ酸配列が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
であるもの全てを含む。

【００２３】本発明のヒトＰＩ３１のアミノ酸配列は、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列である。該ア
ミノ酸配列からなる蛋白質の計算上の分子量は、２９，
７７２Ｄａであり、等電点は、５．３５である。本発明
に係るヒトＰＩ３１は、前記のアミノ酸配列のＮ末端に
メチオニンが結合していないポリペプチドを含む。ま
た、前記アミノ酸配列のＮ末端にヒトＰＩ３１のための
シグナルペプチドの一部分もしくは全部が結合または欠
損したポリペプチドも含む。

【００２４】また、自然の変異により、または人工の変
異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えること
なく、蛋白質をコードするＤＮＡの構造の一部を変化さ
せることが可能である。人工の変異としては、例えばポ
イントミューテーションの技術がある。この技術を利用
して、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡの構造を変
化させたＤＮＡ変異体を作製し、該ＤＮＡ変異体を適当
な宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体に
目的とする蛋白質の変異体を作製させることができる。
この技術を利用して、本発明のヒトＰＩ３１についても
その構造を変化させた変態を作製することができる。し
たがって、本発明は、ヒトＰＩ３１のアミノ酸配列が変
化しておりかつプロテアソームの蛋白質分解活性を抑制
するヒトＰＩ３１変異体も含む。

【００２５】また、本発明は、ヒトＰＩ３１変異体をコ
ードする塩基配列をからなるポリヌクレオチドを含有す
る。ヒトＰＩ３１をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤ
ＮＡは、目的により、そのままあるいは制限酵素で切断
して使用することが可能である。

【００２６】（アンチセンスポリヌクレオチド）また、
本発明は、前記塩基配列の相補塩基配列からなるアンチ
センスポリヌクレオチドをも含むものである。本発明の
アンチセンスポリヌクレオチドは、ヒトＰＩ３１の生合
成を阻害するのに使用可能であり、またプローブとして
も使用可能である。一般に、アンチセンスポリヌクレオ
チドはポリヌクレオチドに含まれる。本明細書において
も、アンチセンスポリヌクレオチドはポリヌクレオチド
に含まれるものとして説明するが、特に、アンチセンス
鎖のポリヌクレオチドであるものを明確に指す場合に、
アンチセンスポリヌクレオチドという。ポリペプチドの
生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチド
は、１５塩基以上からなることが好ましい。一方、あま
りに長いアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞内に取
り込まれるには不適である。一般に、細胞内にアンチセ
ンスポリヌクレオチドを取り込ませ、目的とする蛋白質
の生合成を阻害させる場合、１２塩基以上３０塩基以
下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好まし
くは１８塩基以上２２塩基以下の塩基からなるアンチセ
ンスポリヌクレオチドを用いるのがよい。本発明のヒト
ＰＩ３１に対するアンチセンスポリヌクレチドにおいて
も、１２塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以
上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基
以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチドを用
いるのがよい。

【００２７】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合
したものが、天然には存在しないものを含めて全て含ま
れる。代表的なものは、アンチセンスＤＮＡとアンチセ
ンスＲＮＡである。本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チドについて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的
とするＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択制、細胞
透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々な
アンチセンスポリヌクレオチド誘導体が得られる。現在
一般的に知られている誘導体は、ヌクレアーゼ耐性、組
織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも一が高めら
れた誘導体であることが好ましい。特に好ましくは、フ
ォスフォロチオエート結合を骨格構造として有する誘導
体である。本発明のポリヌクレオチドおよびその誘導体
についても、これらの機能または構造を有する誘導体が
含まれる。ハイブリダイズのし易さの点では、一般的に
は、ステムループを形成している領域の塩基配列に相補
的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドまた
はその誘導体を設計するとよいとされている。本発明の
アンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体は、必
要に応じ、ステムループを形成することが可能である。

【００２８】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがっ
て、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体であって、ヒトＰＩ３１をコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部
位、キャッピング部位、スプライス部位の相補的な配列
を含むものは、高い発現抑制効果が期待される。天然型
のアンチセンスポリヌクレオチドであれば、化学合成機
を使用して合成したり、ヒトＰＩ３１をコードする遺伝
子を鋳型とするＰＣＲ法により本発明のアンチセンスポ
リヌクレオチドを作製することができる。また、メチル
フォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘
導体の中には、化学合成できるものもある。この場合に
は、化学合成機に添付されている説明書にしたがって操
作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー
等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、
目的のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体
を得ることができる。

【００２９】（ポリヌクレオチドプローブ）本発明のヒ
トＰＩ３１をコードするポリヌクレオチドもしくはその
一部（連続する９以上の塩基からなるポリヌクレオチ
ド）、または該ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖のア
ンチセンスポリヌクレオチドもしくはその誘導体（連続
する９以上の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチ
ドもしくはその誘導体）は、ｃＤＮＡライブラリー等か
らヒトＰＩ３１遺伝子をスクリーニングするためのプロ
ーブとして使用可能である。このときＧＣ含有率が３０
ないし７０％のものが好適に使用可能である。また、連
続する１２以上の塩基からなるポリヌクレオチドがより
好ましく、１５塩基以上であればさらに好ましい。プロ
ーブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であって
もよい。通常、前記の塩基数以上の配列は特異性のある
配列であると認識されている。該プローブを用いたスク
リーニングにおいて使用するｃＤＮＡライブラリーとし
ては、ｍＲＮＡから作製されたものが好ましく使用でき
る。これらのｃＤＮＡライブラリーからランダムサンプ
リングにより選択された一群のｃＤＮＡを検索の試料と
することができる。例えば、配列表の配列番号２に記載
の塩基配列のうちの連続する９以上の塩基からなるＤＮ
Ａまたは該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド（アンチセンスポリヌクレオチド）は、ｃＤＮＡライ
ブラリー等からヒトＰＩ３１遺伝子をスクリーニングす
るためのプローブとして使用可能である。また、本発明
のヒトＰＩ３１をコードするポリヌクレオチドもしくは
その一部をプローブとして、各組織由来のｍＲＮＡにつ
いてノザンブロットハイブリダイゼーション解析を行う
ことにより、ヒトＰＩ３１を遺伝子由来のｍＲＮＡが発
現している組織を見出すことが可能である。

【００３０】（化学修飾されたポリヌクレオチド）ＤＮ
Ａ又はＲＮＡを化学合成するときに、側鎖をメチル化す
ること、あるいはビオチン化すること、またはリン酸基
部分のＯ（酸素）をＳ（硫黄）に置換すること等の化学
的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表
の配列番号６ないし９に記載のＤＮＡを化学合成すると
きに、前記化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそ
のものと異なるものを合成することが可能である。ま
た、ｃＤＮＡライブラリーから取得されたｃＤＮＡであ
っても放射性同位体で標識することも可能である。した
がって、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡは、前記の化学修飾
されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオ
チドをその範囲に含むものである。化学修飾されたＤＮ
ＡまたはＲＮＡは、蛋白質をコードする機能またはプロ
ーブとしての機能をいずれも発揮可能なものであり、化
学修飾されたアンチセンスポリヌクレオチドは、プロー
ブまたは蛋白質の生合成を阻害する機能またはプローブ
としての機能をいずれも発揮可能なものである。

【００３１】（免疫疾患等の診断用測定方法）本発明の
ポリヌクレオチドもしくはその一部またはアンチセンス
ポリヌクレオチドもしくはその誘導体をプローブとして
用いることは、プロテアソームが関与する各種疾患の診
断等にも有効な手段を与える。さらにヒトＰＩ３１の遺
伝的多型性を調べることにより、前記各種疾患との関連
も明らかにでき、ポリヌクレオチド診断に有効に使用可
能となる。また、例えば、本発明のポリヌクレオチドを
プローブとして用いたＲＴ−ＰＣＲ解析や前記ノザンブ
ロットハイブリダイゼーション解析を行うことにより、
各種ヒト臓器のｍＲＮＡ発現量を定量的に測定すること
が可能となり、前記各種疾患の診断手段を与えるもので
ある。

【００３２】（組換ＰＩ３１の作製）また、本発明は、
前記のヒトＰＩ３１遺伝子を導入した形質転換体によっ
て作製された組換ヒトＰＩ３１を含むものである。また
本発明の開示によりヒトＰＩ３１のアミノ酸配列のうち
一または複数のアミノ酸を置換、欠失または付加したヒ
トＰＩ３１変異体の作製が可能となる。形質転換に用い
るベクターや宿主は前記ｃＤＮＡライブラリーの作製お
よびスクリーニングの項で説明したものが使用可能であ
る。また、ＰＩ３１の精製方法は、前記ヒトＰＩ３１の
精製の項で説明した方法が使用可能である。また、製造
段階において、製造するヒトＰＩ３１またはヒトＰＩ３
１変異体は、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして
形質転換体に作製させてもよい。この場合は、精製工程
において、ブロムシアン等の化学物質やプロテーゼ等の
酵素で処理して、ヒトＰＩ３１またはヒトＰＩ３１変異
体を切り出す操作が必要になる。

【００３３】（ＰＩ３１を認識する抗体）さらに本発明
において得られたヒトＰＩ３１に対するポリクロナール
またはモノクロナール抗体を作成することが可能であ
る。本発明は、ヒトＰＩ３１の抗原性について、実施例
２に例示するように、本発明のヒトＰＩ３１またはヒト
ＰＩ３１に特異的なアミノ酸配列からなるオリゴペプチ
ドをヒト以外の動物に免疫することで抗体が得られるも
のであることを明らかにするものである。したがって、
本発明のヒトＰＩ３１を認識する抗体（以降、ヒトＰＩ
３１抗体ということがある）は、ヒトＰＩ３１をヒト以
外の動物に免疫感作することにより得られる抗体であっ
て、該抗体が本発明のヒトＰＩ３１を認識することがウ
ェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法（例え
ばＦＡＣＳでの測定）等により確認される抗体をその範
囲内に含む。

【００３４】また、免疫原として、該蛋白質の一部をウ
シ血清アルブミンなどの他のキャリア蛋白質に結合させ
たものを用いることは、よく用いられる方法である。該
蛋白質の一部は、例えばペプチド合成機を用いて合成し
てもよい。なお、蛋白質の一部としては、８アミノ酸残
基以上であることが好ましい。抗原性が明らかとなった
物質については、免疫感作によってポリクローナル抗体
が得られるならば、該免疫した動物のリンパ球を用いた
ハイブリドーマによりモノクローナル抗体が産生される
ことはよく知られている（前掲のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第６
章）。したがって本発明のヒトＰＩ３１抗体はモノクロ
ーナル抗体もその範囲内に含むものである。

【００３５】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂ 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとＦ（ａｂ’）₂ が得られ、パパイン
で分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂ を２−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。得られた
抗体を用いた免疫的測定法により、各種細胞中の該サブ
ユニットの変化を定量的に測定する手段が与えられる。
抗体を用いる方法としては具体的には、標識されたヒト
ＰＩ３１抗体を用いてヒトＰＩ３１を検出する方法、ヒ
トＰＩ３１抗体および該抗体の標識二次抗体を用いてヒ
トＰＩ３１を検出する方法が挙げられる。標識として
は、例えば放射性同位元素（ＲＩ）、酵素、アビジン又
はビオチン、もしくは蛍光物質（ＦＩＴＣやローダミン
等）が利用される。酵素反応を利用する方法としては、
例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロッ
ト法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同
定方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ ヒトＰＩ３１の同定 （１）ウシＰＩ３１の調製 （１−１）出発物質の調製 牛赤血球細胞からウシＰＩ３１を以下に記載の方法にし
たがって精製した。牛血液をヘパリン存在下で収集し、
２０００×ｇで１時間遠心し赤血球細胞を集めた後、得
られた沈殿を４倍体積のリン酸緩衝液に懸濁し、再沈殿
することにより洗浄した。この操作を４回繰り返した。
なお、以下のステップは特に述べない限り４℃で行っ
た。赤血球細胞（細胞体積で１５００ｍｌ）に３倍体積
の溶解バッファー（バッファーＨ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ βーメルカプトエタノール）を加
えて１０分間攪拌して溶解した。これを１６，０００×
ｇで６０分間遠心し、上清を集めて保存した。沈殿は再
度バッファーＨに懸濁し、遠心した後、得られた上清を
最初の上清に加えた。この上清画分を、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍ
Ｍ βーメルカプトエタノール、１０％グリセロールか
らなる緩衝液に対して透析処理を行った。

【００３７】（１−２）ＤＥ５２による調製 前記の透析画分５ｍｌに対し、バッファーＨで平衡化し
たＤＥＡＥセルロースレジン（ＤＥ５２、ワットマン社
製）１ｍｌを添加した。レジンをブフナー漏斗につけた
濾紙（ワットマン１（登録商標、ワットマン社製））上
でバッファーＨで洗浄した。該レジンに結合している蛋
白を０．５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＨで１０分間
緩やかに攪拌することにより溶出した（レジン：０．５
Ｍ ＮａＣｌ／バッファーＨ＝１：１）。さらに少量の
０．５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＨで溶出し、ヘモ
グロビンを含まない赤血球細胞からの抽出画分を得た。

【００３８】（１−３）硫安沈殿 前記得られた画分に４０％飽和になるまで３０分間ゆっ
くりと攪拌しながら硫安（硫酸アンモニウム）を添加し
た。さらに３０分間攪拌して沈殿した蛋白を遠心分離に
より集めた。この沈殿をダンス（ＤＯＵＮＣＥ）ホモジ
ナイザーを用いて大量のバッファーＨで再懸濁し、さら
に遠心し沈殿蛋白を得た。沈殿は１００ｍＭ ＮａＣｌ
を添加したバッファーＨ １０ｍｌに溶解し、同じ溶液
２０００ｍｌに対して１６時間透析した。透析後、不溶
物を３０，０００×ｇ、３０分間遠心して除き、上清画
分を得た。

【００３９】（１−４）セファクリルＳ−３００カラム
による精製 セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製、１００×
５ｃｍ）カラムをバッファーＨで平衡化後、（１−３）
で得た画分をアプライし、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む
バッファーＨで溶出し、１１ｍｌずつフラクションを集
めた。フラクションのうち２０Ｓプロテアームの蛋白質
分解活性を抑制する画分を集めた。２０Ｓプロテアーム
の蛋白質分解活性を抑制することの測定は（１−７）に
記載した。

【００４０】（１−５）ハイドロキシアパタイトによる
精製 （１−４）で得られた画分をバッファーＨで平衡化した
ハイドロキシアパタイト（バイオラッド社製、７×２．
５ｃｍ）にアプライし、リン酸緩衝液（２０−２００ｍ
ｌ）のリニアグラジエントにより８ｍｌずつ各フラクシ
ョンを溶出して集めた。前記各フラクションの活性画分
を集め、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＨで透析
し、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでＰＭ１０メンブラン
（アミコン社製）で濃縮した。

【００４１】（１−６）イオン交換カラムによる精製 （１−５）の活性画分を５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッ
ファーＨで平衡化したＤＥＡＥカラム（ファルマシア社
製、１．５０×２．０ｃｍ）にアプライし、５０ｍＭ−
２８０ｍＭ ＮａＣｌ／バッファーＨによるリニアグラ
ジエント（２８０ｍｌ）で溶出し、５ｍｌずつフラクシ
ョンを集めた。得られたフラクションのうち、抑制活性
の高い画分を集め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）
に対して透析を行った。

【００４２】（１−７）蛋白質分解抑制活性の測定方法 ＰＩ３１のプロテアソームの蛋白質分解活性に対する抑
制活性の測定は、２０ＳプロテアソームとＰＩ３１を混
合して２０Ｓプロテアソームの蛋白質分解活性を測定す
る方法により可能である。ＰＩ３１がヒトＰＩ３１でも
ウシＰＩ３１でも同様の方法で測定できる。反応は、５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、６０μＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 中、０．３μｇの２０Ｓプロテアソームと
精製各段階のＰＩ３１を添加して最終容積５０μｌで行
った。この反応液を、３７℃で４５分間プレインキュベ
ートし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
５ｍＭ βーメルカプトエタノール、５０μＭ ２０Ｓ
プロテアソーム、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ−ＡＭＣ（キモトリプシン様活性を測定するための
合成基質、ペプチド研究所社製）に添加し１０分間イン
キュベートして、蛍光を測定した。測定器は、島津社製
の吸光光度計を使用した。基質に対し、プロテアソーム
がキモトリプシンとして作用するとペプチドの末端のＡ
ＭＣがＭＣＡとして遊離し、蛍光を発することを利用し
て、蛍光強度を測定して、プロテアソームの蛋白質分解
活性を測定した。各精製段階にて得られる画分から、蛍
光強度が小さい、すなわちプロテアソームの蛋白質分解
活性が阻害されている画分をＰＩ３１蛋白質が含まれて
いる画分として選んだ。

【００４３】（２）ウシＰＩ３１の部分アミノ酸配列の
決定 （２−１）ウシＰＩ３１の単離 （１）の処理で得られたウシＰＩ３１を逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳ Ｐａｋ Ｄ４
−６１３カラム（登録商標、昭和電工社製）、（６×１
５０ｍｍ））を使用し以下の条件で分離した。 分離条件： 流速：０．７５ｍｌ／ｍｉｎ 温度：５０℃ 溶媒Ａ：０．０６％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） 溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／７０％アセトニトリル／３
０％水 ６４％溶媒Ａおよび３６％溶媒Ｂによりカラムを平衡化
し、３６−７０％の溶媒Ｂを用いたグラジエントで溶出
した。２１４ｎｍの波長で検出し、ピーク画分をスピー
ドバックコンセントレータ（セイバントインストルメン
ツ社製）で乾燥した。

【００４４】（２−２）電気泳動による分離 前記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバファーに
溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（前掲のＡｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
６３６−６４０ページ）により分離した。電気泳動が終
わったゲルは、イモビロン−ＰＶＤＦメンブラン（ミリ
ポア社製）にセミドライエレクトロブロティング装置ザ
ルトブロットＩＩ−Ｓ（ザルトリウス社製）を用いてト
ランスファーした。蛋白質をブロットした膜フィルター
は、蒸留水で洗浄した後、クマシーブルー染色液（０．
２％クマシーブリリアントブルーＲ２５０を含む４０％
メタノール、１０％酢酸溶液）で染色後、脱色液（６０
％メタノール溶液）に浸し、振とうしてバックグラウン
ドを脱色した。このメンブラン上の３１ｋＤａの位置の
スポットを切り出し、ｉｎ ｓｉｔｕでＬ−１−トシル
アミド−２−フェニルクロロメチルケトン処理トリプシ
ン（ワーシントンインザイム社製）、またはＬｙｓ−Ｃ
プロテアーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）により酵
素処理した。生成したペプチドはＨＰＬＣ（パーキンエ
ルマー社製）によって分離精製した（流速５０μｌ／ｍ
ｉｎ、０．１％ＴＦＡを溶媒とし０−７０％のアセトニ
トリルによるグラジエント、ＲＰ３００カラム（２．１
×１００ｍｍ））。得られたウシＰＩ３１の断片のポリ
ペプチドフラグメントのいくつかをペプチドシークエン
サー（パーキンエルマー社製プロテインシークエンサー
４９７型分析装置）により解析を行った。以上のアミノ
酸解析により次の３種類のペプチドフラグメントのアミ
ノ酸配列を決定した。 フラグメント１；ＳＥＬＬＰＶＥＳＮＨＮＫＤＬＹ（配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチ
ド） フラグメント２；ＦＤＰＦＧＰＩＧＴＳＰＳＧＰＮＰＤ
ＨＬＰＰＰＧＹＤＤ（配列表の配列番号４に記載のアミ
ノ酸配列からなるペプチド） フラグメント３；ＡＶＴＶＥＮＳＭＩＩＮＶＬＥＨ（配
列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチ
ド）

【００４５】（３）プライマーの合成 前記ペプチドフラグメントの配列をもとにＰＣＲプライ
マーを作製した。肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣ
Ｃから入手可能Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）からシングルス
トランドｃＤＮＡを作製した。前記ＨｅｐＧ２由来シン
グルストランドｃＤＮＡをテンプレートにしてＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。センスプライマーとして、５’−ＡＣＣ
（Ｔ）ＧＴＧ（Ｔ）ＧＡＧＡＡＴＴ（Ａ）Ｇ（Ｃ）Ｔ
（Ｃ）ＡＴＧＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＧ（Ｔ）ＣＴＧ
（Ｃ）ＧＡ−３’（配列表の配列番号６に記載の塩基配
列）、アンチセンスプライマ−として５’−ＧＴＡＧＣ
ＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡＧ（Ａ）ＧＴＧＧＴＣＧＧＧ
ＧＴＴＧＧＧＧＣＣ−３’（配列表の配列番号７に記載
の塩基配列）を用いた時に全長５４０ｂｐのｃＤＮＡフ
ラグメントが得られた。

【００４６】（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 （４−１）ｃＤＮＡの調製 ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２から、グアニジウムチオシアネ
イト法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６
−１５９、１９８７）によって全ＲＮＡを分離した。全
ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）ラテックス（タカラ社製、Ｏ
ｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０）を用いてＨｅｐＧ２細胞か
らｍＲＮＡ１０μｇを得た。前記の方法によって得られ
たポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、タイムセイバーｃＤＮＡ合
成キット（登録商標、ファルマシア社製）を用いてｃＤ
ＮＡを得た。より詳しくは、オリゴｄＴプライマーを前
記ｍＲＮＡのポリＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素
（Ｍｕｒｉｎｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）により、１本鎖ＤＮＡを合成し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼ１により、２本鎖ｃＤＮＡとして
合成した。得られた前記ｃＤＮＡの両端にＮｏｔＩ／Ｅ
ｃｏＲＩアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡライゲ
ース処理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行な
い、両端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡ
を得た。

【００４７】（４−２）インビトロパッケージング反応 得られた両端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をもつｃＤ
ＮＡをクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（スト
ラタジーン社製、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ処理λＺＡＰＩ
Ｉを含むλＺＡＰＩＩクローニングキット）のＥｃｏＲ
Ｉ間にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。ライゲー
ション反応溶液１ｍｌをギガパックＩＩゴールドパッケ
ージングエクストラクト（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ Ｇｏ
ｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ、登録商
標、ストラタジーン社製）によりパッケージングを行っ
た。パッケージングした組換えバクテリオファージを含
むパッケージング溶液と大腸菌ＤＨ５αを３７℃で１５
分間培養した。これを２〜３ｍｌのトップアガー（４８
℃）に加え１５０ｍｍ ＮＺＹアガープレート１０枚へ
プレーティングして、３７℃で１夜培養した。前記ＮＺ
Ｙアガープレートにプレーティングしてスクリーニング
に用いたプラークは、１０枚のプレート合計で約５×１
０⁵ ／個とした。

【００４８】（５）クローンの単離 （５−１）スクリーン用フィルタの調製 前記ＮＺＹアガープレートを４℃で２時間冷却し、この
プレート上にナイロンフィルタ（アマシャム社製、ハイ
ボンドＮ＋（登録商標））をのせ、２分間放置した。こ
れをはがしてフィルターペーパ上で乾燥し、紫外線照射
により固定してスクリーニング用フィルターを調製し
た。これを用いて以下のハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００４９】（５−２）ハイブリダイゼーションのため
のプローブは（３）で得られた５４０ｂｐのウシＰＩ３
１のＤＮＡを、ランダムプライムラベリング法（タカラ
社製、ランダムプライマＤＮＡラベリングキットＶｅ
ｒ．２（登録商標））で³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム社
製）で標識したものを使用した。プレハイブリダイゼー
ション溶液として、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）），５０％ホルムアミド、１×ｄｅｎｈａｒｄｔ
（０．２％ウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｖ）、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％Ｆｉｃ
ｏｌｌ４００）溶液、０．１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍ
ｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。フィルターは４２
℃、３時間、プレハイブリダイゼーション溶液でインキ
ュベートし、続いて標識プローブを加えたハイブリダイ
ゼ−ション溶液（１０％ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔ
ｅを含むプレハイブリダイゼーション溶液）で４２℃、
１６時間、インキュベートしてハイブリダイゼーション
を行った。以上の操作により４個のポジティブクローン
が得られた。

【００５０】（６）切り出し（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃ
ｉｓｉｏｎ）による大腸菌組換え体の作成 （５−２）で得られたポジティブクローンのアガープレ
ート中のポジティブＺＡＰファージクローンのプラーク
の中心を竹くしでつき、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０
μｌのクロロフォルム混合液中に溶出し、ボルテックス
をした後、一夜放置した。大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ２
００μｌとポジティブファージクローン２００μｌ（＞
１×１０⁵ ファージパーティクル）、１μｌのヘルパ
ーファージＲ４０８（＞１ｘ１０⁶ ｐｆｕ／ｍｌ）を５
０ｍｌチューブにて混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰ
とヘルパーファージを感染させた。５ｍｌの２×ＹＴ培
地（１０ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓ
ｔＥｘｔｒａｃｔ、１６ｇ Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ／１ｌ）を加え、３７℃で３時間振とうし培養し、大
腸菌よりファージミドを分泌させた。７０℃で２０分間
熱処理した後、４０００×ｇで５分間遠心し、菌体を死
滅させた。上清のファージミドを別の試験管に移した。
この上清にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）粒子が
含まれており、この上清２００μｌあるいは１００倍に
希釈した溶液２０μｌと大腸菌ＤＨ５α（ストラタジー
ン社製）２００μｌ（ＯＤ６００＝１．０）を混合し３
７℃で１５分間混合し感染させた。１〜１００μｌの培
養液をＬＢ／Ａｍｐプレートにプレーティングした後、
３７℃で一晩培養した。表れたコロニーはインサートＤ
ＮＡを含む２本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）
をもった大腸菌（ＤＨ５α）形質転換体である。４個の
ポジティブクローンの大腸菌からプラスミドをＱＩＡｐ
ｒｅｐＰｌａｓｍｉｄキット（キアゲン社製）を用いて
調製し、制限酵素ＮｏｔＩで切断して、そのうち最も長
いインサート（約３．１ｋｂ）をもつクローンについて
以下のＤＮＡ塩基配列の決定を行った。ヒトＰＩ３１ｃ
ＤＮＡの制限酵素地図を図２に示す。このヒトＰＩ３１
のインサートを導入した大腸菌ＤＨ５α形質転換体をｈ
ｕ−ＰＩ３１と命名して、工業技術院生命工学工業技術
研究所に平成１０年１月３０日に寄託した（受託番号：
ＦＥＲＭ Ｐ−１６６１９）。

【００５１】（７）塩基配列の決定 前記で得られた約３．１ｋｂのクローンの塩基配列を、
パーキンエルマー社製ＤＮＡシークエンサー３７３Ａを
用い、Ｔａｑサイクルシークエンシング法により決定し
た。図２にプライマーウォーキングでシークエンスした
部分を矢印で示す。得られたヒトＰＩ３１のｃＤＮＡの
塩基配列の解析結果を配列表の配列番号２および図１に
示す。決定した塩基数は３０６４残基で、オープンリー
ディングフレームは配列表の配列番号２に記載の塩基配
列の１２７番目のＡから９３９番目のＧまでの８１３塩
基であり、２７１個のアミノ酸がコードされている。こ
のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示す。配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＰＩ３１
の計算上の分子量は２９７７２であり、等電点は、５．
３５である。図１では、オープンリーディングフレーム
の塩基がコードするアミノ酸を塩基配列の下段に示す。
プロリンは白抜き表示で示す。下線部は、（２−２）記
載の牛赤血球より精製したウシＰＩ３１の断片のペプチ
ドシークエンスと相同性のある部分を示すものであり、
ウシＰＩ３１のアミノ酸と異なるアミノ酸は下線を点線
にして示す。また、本発明のヒトＰＩ３１ｃＤＮＡにつ
いて、プライマーウォーキングによるシーケンスの過程
を図２に示しておく。

【００５２】実施例２ ヒトＰＩ３１に反応するポリク
ローナル抗体の作製 （１）ヒトＰＩ３１のＮ端側１９アミノ酸（ＬＧＶＧＤ
ＱＰＧＰＮＤＫＫＳＥＬＬＰＡ、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列の３８番目のＬｅｕから５６番目の
Ａｌａまで）を選択し、このポリペプチドのＣ末端にシ
ステインを付加したペプチドをＦ−Ｍｏｃ法（Ｓｏｌｉ
ｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９年，Ａｔｈｅ
ｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．著）によ
り、パーキンエルマー社製ペプチド合成機４３３Ａを用
いて合成した。

【００５３】合成したペプチドの脱保護は、以下の方法
で行った。ペプチドクッカーの中に、乾燥した合成後の
樹脂とフットボール型撹拌子を入れた。シリコン栓が閉
じているのを確認してから、０．１ｍｍｏｌの樹脂に対
して、ｍ−クレゾール０．３ｍｌ、エタンジチオール
０．９ｍｌ、チオアニソール１．８ｍｌ、トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）１２．０ｍｌを加えた。ふたを閉めて、
液がふたにかからないようにペプチドクッカーをスター
ラーに斜めに固定し、室温で２時間撹拌した。テフロン
撹拌子を入れた５０ｍｌ遠心管にジョイントを付けペプ
チドクッカーに差し込んだ。ペプチドクッカーのテフロ
ン栓を開け、ジョイントの枝部にアスピレーターをつな
ぎ、ペプチドクッカーのふたをゆるめ、アスピレーター
を吸引し、ペプチドクッカー内の炉液を遠心管に落とし
た。２ｍｌのＴＦＡをペプチドクッカーの上部から洗い
込むように入れ、アスピレーターで吸引した。回収した
ペプチド溶液が入っている遠心管に枝付き封じ栓を取り
付け、スタンドを使用してスターラーの上に固定した。
枝付き封じ栓にＮ₂ ガスボンベからのチューブおよび排
気用チューブをつないだ。ドラフト内の流しに水を張
り、その中に前記排気用チューブを呼び込んだ。Ｎ₂ ガ
スボンベの栓を開け、遠心管内の液面が揺れる程度にガ
スを吹き付けた。スターラーで混ぜながら２０分間液を
濃縮した。濃縮後の遠心管を氷水中、スターラーの上に
固定し、撹拌した。撹拌しながら冷ジエチルエーテルを
４０ｍｌ入れて、ふたをして転倒混和した。遠心管を氷
づけにして３０分以上静置し、白い沈殿を沈めた。遠心
管を４０００回転、５分間遠心分離し、撹拌子を落とさ
ないように上清をビーカーに捨て、その後、沈殿をテフ
ロン撹拌子で崩した後、冷エーテルを４５ｍｌ加えスタ
ーラーを併用しながら混ぜ、氷中に５分間静置しペプチ
ドを沈殿させることを４回繰り返した。４回目の操作後
のペプチドを吸引鍾に入れ、アスピレーターで軽く風乾
した後、２０ｍｌの０．１％ＴＦＡで沈殿を溶かし、
０．４５μｍのフィルターで濾過した。脱保護基後のペ
プチドの精製はＣ¹⁸ＯＤＳカラム（島津社製、Ｓｙｎ
ＰｒｏＰｅｐカラム、４．６×１５０ｍｍ、０．１％Ｔ
ＦＡ、０−８０％アセトニトリルグラジエント）を用い
た。

【００５４】（２）前記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコ
ンジュゲイションキット（ピアス社製）を用いて結合さ
せペプチド−ＫＬＨ複合体を前記のキット中のカラムに
より調製した。 （３）初回約１５０μｇをフロインドの完全アジュバン
ト（ＦＣＡ、キャペル社製）とともにエマルジョンに
し、ラビット（ジャパニーズホワイト）の背中に免疫し
た。その後２週間おきに３回不完全アジュバント（ＦＩ
Ａ）により同様に免疫した。初回免疫後、７、８、９週
目にＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定し、後抗体価の上
昇を確認後全採血を行なった。

【００５５】（４）ウサギ血液は、室温で３時間静置
後、セパラピッドチューブ（積水化学社製）にアプライ
し、３０００回転で３０分間の遠心によりヒトＰＩ３１
に対する血清を得た。 （５）また、ヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２をＳＤＳサンプ
ルバッファーに溶かし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動（前掲のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、６３６−６４０ページ）で
分離し、これをＰＶＤＦメンブランにエレクトロトラン
スファーし、抗ヒトＰＩ３１抗体を含む前記抗血清およ
び免疫していないラビット抗血清を一次抗体としてＥＣ
Ｌ検出キット（アマシャム社製）により検出した。この
イムノブロットの結果を図３に示す。図３のレーン１が
免疫していないラビット抗血清を用いた場合の結果であ
り、レーン２が抗ＰＩ３１抗体を用いた場合の結果であ
る。レーン２にのみ３１ｋＤの位置にバンドが見られ、
抗ヒトＰＩ３１抗体がヒトＰＩ３１を特異的に認識する
ことが確認された。

【００５６】実施例３ 組み換えヒトＰＩ３１の大腸菌
での発現 全長のヒトＰＩ３１遺伝子をｐＰＥＴ−２８（＋）ベク
ターに挿入し、該ベクターをコンピテントセル大腸菌Ｂ
Ｌ２１に導入して形質転換体を作製した。作成方法は、
以下の通りである。ＰＣＲプライマ−としてフォワ−ド
プライマ−、５’−ＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴ
ＧＧＡ−３’（配列表の配列番号８に記載の塩基配列、
ＣＡＴＡＴＧ：ＮｄｅＩサイト）、とリバ−スプライマ
−、５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＣ
ＡＧＧ−３’（配列表の配列番号９に記載の塩基配列、
ＡＡＧＣＴ：ＨｉｎｄＩＩＩサイト）を合成した。これ
を用いて、ヒトＰＩ３１が挿入されたｐＢｌｅｕｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ（−）ベクター（実施例１で最終的に得られ
たポジティブクローン）をＰＣＲ法で増幅した。得られ
た約０．８３ｋｂのＤＮＡを精製して、ｐＰＥＴ−２８
（＋）ベクター（Ｎ端にヒスチジンタグがついている）
のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲ−スを用い
て結合させ、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。得られた
形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培養液で培養してＯＤ
（６００ｎｍ）＝０．６になったところで、０．５ｍＭ
ＩＰＴＧを添加して３時間培養した。大腸菌を８ｍｌ
の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁して、３回洗浄し、
リゾチ−ム（１ｍｇ／ｍｌ）で３０分間、４℃で処理
し、凍結融解を１回繰り返した。ソニケ−トして遠心
後、可溶性画分をニッケルアガロ−スカラムにアプライ
して、結合画分を０−２５ｍＭのイミダゾ−ルで溶出し
た。ＰＩ３１を含む画分をプ−ルして２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノ−ルで透析し、
組み換え蛋白質ヒトＰＩ３１を最終的に精製した。この
組み換え蛋白質ヒトＰＩ３１ １０μｌを、等量のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーおよび１μｌの２−
メルカプトエタノール（２ＭＥ）と混和し、９５℃で熱
処理を５分間行った。その後、５−２０％のグラディエ
ントゲルで電気泳動した。電気泳動後、ゲルをクマシー
染色したところ３１ｋＤの位置にバッンドが観察され、
組み換えヒトＰＩ３１が作製されたことが確認された。

【００５７】実施例４ ヒトＰＩ３１のプロテアソ−ム
活性抑制効果 ヒトＰＩ３１がプロテアソ−ムの蛋白質分解活性の抑制
効果があるかどうかを検討した。ＭｃＧｕｉｒｅらの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、９９
５、１８１−１８６、１９８９）で標識化したカゼイン
（ｍｅｔｈｙｌ−¹⁴Ｃ−Ｃａｓｅｉｎ、２８００ｄｐｍ
／μｇ）を基質として、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、６
０μＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 中でヒト２０Ｓプ
ロテアソ−ムを最終濃度４１ｎＭになるように添加（２
μｇ、４１ｎＭ）して、最終体積７０μｌで分解させた
（この際の分解活性を１００％とした）。この系に組み
換えヒトＰＩ３１と赤血球細胞から精製したヒトＰＩ３
１（製法は、実施例１でウシＰＩ３１について示したも
のと同様）を最終濃度０ないし１４０ｎＭとなるように
添加した際の効果を調べた。ヒト２０Ｓプロテアソーム
によって分解された¹⁴Ｃの定量は、液体シンチレーショ
ンカウンター（ヒューレットパッカード社製）を用い
て、前記ＭｃＧｕｉｒｅらの方法に従い行った。その結
果を図４に示す。図４より、ヒトＰＩ３１は濃度依存的
にプロテアソームの蛋白質分解を抑制することが分かっ
た。組み替えヒトＰＩ３１と精製したヒトＰＩ３１には
差がなく、約７０ｎＭで５０％の抑制効果があることが
分かる。これらのことから、組み換えＰＩ３１は精製し
たＰＩ３１とほぼ同等のプロテアソ−ムの蛋白質分解活
性を抑制する活性（プロテアソーム抑制活性）をもつこ
とがわかった。

【００５８】

【発明の効果】本発明のＰＩ３１によりプロテアソーム
の制御が可能となる。また、ＰＩ３１のアンチセンスポ
リヌクレオチドもＰＩ３１を介してプロテアソームの制
御に利用可能である。また、本発明の抗体による免疫反
応による方法、さらにポリヌクレオチドプリーブ（アン
チセンスポリヌクレオチドを含む）を利用する方法で、
プロテアソームが関与する各種病態の診断および治療へ
の応用が可能となると考えられる。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２７１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ala Gly Leu Glu Val Leu Phe Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ile Thr 1 5 10 15 Cys Arg Gln Asp Ala Leu Val Cys Phe Leu His Trp Glu Val Val Thr 20 25 30 His Gly Tyr Cys Gly Leu Gly Val Gly Asp Gln Pro Gly Pro Asn Asp 35 40 45 Lys Lys Ser Glu Leu Leu Pro Ala Gly Trp Asn Asn Asn Lys Asp Leu 50 55 60 Tyr Val Leu Arg Tyr Glu Tyr Lys Asp Gly Ser Arg Lys Leu Leu Val 65 70 75 80 Lys Ala Ile Thr Val Glu Ser Ser Met Ile Leu Asn Val Leu Glu Tyr 85 90 95 Gly Ser Gln Gln Val Ala Asp Leu Thr Leu Asn Leu Asp Asp Tyr Ile 100 105 110 Asp Ala Glu His Leu Gly Asp Phe His Arg Thr Tyr Lys Asn Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Arg Ser Arg Ile Val Ser Gly Ile Ile Thr Pro Ile His Glu 130 135 140 Gln Trp Glu Lys Ala Asn Val Ser Ser Pro His Arg Glu Phe Pro Pro 145 150 155 160 Ala Thr Ala Arg Glu Val Asp Pro Leu Arg Ile Pro Pro His His Pro 165 170 175 His Thr Ser Arg Gln Pro Pro Trp Cys Asp Pro Leu Gly Pro Phe Val 180 185 190 Val Gly Gly Glu Asp Leu Asp Pro Phe Gly Pro Arg Arg Gly Gly Met 195 200 205 Ile Val Asp Pro Leu Arg Ser Gly Phe Pro Arg Ala Leu Ile Asp Pro 210 215 220 Ser Ser Gly Leu Pro Asn Arg Leu Pro Pro Gly Ala Val Pro Pro Gly 225 230 235 240 Ala Arg Phe Asp Pro Phe Gly Pro Ile Gly Thr Ser Pro Pro Gly Pro 245 250 255 Asn Pro Asp His Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Asp Asp Met Tyr Leu 260 265 270 配列番号：２ 配列の長さ：３１９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATTCGCGGCC GCTGCAAGAA CCAGCGCAAG AGGGAAGCGG AGTTATAGCT ACCCCGGCCG 60 CGGAGCCGGC TCACTGCACT ACCCCCGCCC CCTTCTTTCC TCCAGACGCC GAAGTCGCGG 120 GCGCTC ATG GCG GGC CTG GAG GTA CTG TTC GCA TCG GCA GCG CCG GCC 168 ATC ACC TGC AGG CAG GAC GCG CTC GTC TGC TTC TTG CAT TGG GAA GTG 216 GTG ACA CAC GGT TAC TGC GGC TTG GGT GTC GGT GAC CAG CCG GGT CCC 264 AAT GAT AAG AAG TCA GAA CTG CTG CCA GCT GGG TGG AAC AAC AAT AAA 312 GAC CTG TAT GTC CTC CGG TAT GAG TAT AAG GAT GGG TCC AGA AAG CTC 360 CTT GTG AAA GCC ATC ACC GTG GAG AGC AGC ATG ATC CTC AAT GTG CTG 408 GAA TAT GGC TCA CAG CAA GTG GCA GAC TTG ACC CTG AAC TTG GAT GAT 456 TAT ATT GAT GCA GAA CAC CTG GGT GAC TTC CAC AGG ACC TAC AAG AAC 504 AGT GAG GAG CTT CGG TCT CGT ATT GTG TCT GGA ATC ATC ACA CCT ATC 552 CAT GAG CAG TGG GAA AAG GCT AAT GTA AGC AGT CCC CAC CGG GAG TTC 600 CCC CCT GCT ACC GCC AGA GAG GTG GAC CCA CTC CGG ATT CCT CCA CAC 648 CAC CCA CAC ACC AGT CGG CAG CCT CCC TGG TGT GAT CCC CTG GGC CCG 696 TTT GTT GTC GGG GGA GAA GAC TTA GAC CCT TTT GGG CCT CGG AGA GGT 744 GGC ATG ATT GTG GAT CCC CTG AGA TCT GGC TTC CCA AGA GCA CTT ATT 792 GAC CCT TCC TCA GGC CTC CCG AAC CGA CTT CCT CCA GGC GCT GTG CCC 840 CCA GGA GCT CGC TTT GAC CCC TTT GGA CCC ATT GGG ACC AGC CCA CCC 888 GGA CCT AAC CCA GAC CAT CTC CCC CCG CCG GGC TAC GAT GAC ATG TAC 936 CTG TGA AGGCCTCAAG AATGTAACAT CCCAGGCTTC CCTCCATTCT CCTGGAGCTG 992 CCACCGCTGT CCCCATCAGC AACCATGTTC TTGCAGGCTG GGGGCAAGGG ATTCTGCTCA 1052 TGTGTGTGGA GACCGGCTGG GATAGCCTCC CCACCCCTTA TCAGAGNCAA GACACCTGCT 1112 GGAGCTCTCC ACCTAGCTGG AGATAGCTCC CAAAGAGAAA TCAGTGTGTC TCTTNCACCA 1172 TCAGCTCCTC CCCTTACACC ACCAGCTCCT CTCCACTTCC CANGGGAGAC TCCGGCANCC 1232 TTCAGCAACA TATATCCTCG ACCAGATGCA GTGCTATAAG AACAGAACGC ATTTTGGATG 1292 TTATTATTAA GAACCAAATG TCAATACAGA ATTCATGTTG CCGGTTTCCC ACTTTTCTTT 1352 TTACATTAAT GCATAGCTGC TTCCATTTAT GAGACTTTAG AGTTTGAGTT TCTGTAGGGC 1412 TGAATGACTC TTTTTCCTGC CCAGGGCCCA TTCTTGCTTC TCAGGCACCT TCCGTTTATT 1472 AATTGCCATT GCTCCTGACA TCACTAAGAT GGGTCCCCTT CTGGCTGCAT GAATGGAAAT 1532 GAGTGACTGG AAATCCCATA GGCCACAAGA ATGACTTTCA CAAGGGCAGG AACATTGTGG 1592 AAAGACTGCA TCATTCTGAT GAGGCAAAAT CCTCCAGCTA TTCCTGTCTG GGCCAGTTTT 1652 GTAGGTCCAT CTGTGCATGG GCAGCAGTAG TCACAAAGCC AAGGANAAAA CAGAGCAGAC 1712 CTGAAGGCTA ATCTTATTTT TGCCACTAAC TTAGTGANTG ACCCTAAGCA AGTTCCTTCT 1772 CCTCTTAGGG CCTTGTGCCA AGCCTATGAA ATTGGAGGTG NCTTTCCTGC TCTAAAGCAT 1832 TTTGATGTCT CATTCTGTGT TTGGTAACCC CTATAAACTG GGGCAGAGGA AAAGAATGAT 1892 GGTTCAAGGC CATACTTCCC TTGAACCTTG TGTGGTTCTT GCCTAACTCT GTGGTTTTTG 1952 GACCCCATGG GGCCCAGACA GAGCACAGGA GCATGGGCTG CCTCTGAGTG TGGTGTTGAA 2012 CTTCGGGAGG AGCAGGGAGC CCTGCACCTT GTGTCCTGGC CCACCTGACC TTTGGTGTTC 2072 TCCGGATCCT TTTCAGCCCG AGGCCTGACA GACGCGGGCA GTGATGAGCC CTGTTCTGGA 2132 GTGGAAAGAG CACGATAGAG CACCAGGCTA AGAGGCACGA GATCAAGGCG GTAGTCACTT 2192 CCGCTCTGCA GCTAGCATTT CAACCATATG TGGATCCTTT CATTTCTCAG CTCCCTGGAT 2252 TCCTTCCCCT AAATTAGGAC CTATTATTTA CCTGTAGGTA AGCAAGCTAC TGTAGCTCTT 2312 CTGAGGTATC TCCCAGGCTG TTTTCTGTAG CCTCAGANTG CCTATCTNCT TAGCCTGAGA 2372 ACAGGTAGAT GNAAACTAAA CTGATGCCTA GGCCCAGGGT CAGTCTCAGA TGGAAGCTGG 2432 GCCTGGGTGG GGAGGCTAGC ATGCGTGGCT CCCTGGGTAT TTCTGTCAGT CCCCATGGCA 2492 AGCAGTGATT TAGTAAAACA CCCCAGAGTC AGGGAAGCCA ACCACCTTGA AACCTTTAGG 2552 ACATCTCTGC TTTGGAGAAA GACCCAGAGA TCAGGCAGAG GTGCAGATTC ANTCATTACT 2612 CATAACCTTT GAGAGATGTC ACNTGGGNGG AGTGTTAGTC TTTGTTTTGG AGNTGGGCCA 2672 TTCTTGCACC CCCCAGGACT TAGAGCAGTT TGNTCATAAA GACATCCTTT ATTATAAAAG 2732 GAAGTATTTA TAGGATGATA GAGACCATCA GATAGAAGCA GGGGGGGTAG ATAACTTTTA 2792 GGNCCTTGAT GTGTGGAGAA GATAAAATTT AAACAATAAA TTTGCCACTT AGATTTTCTA 2852 NCACCACAGT CCGACGAAAG ATAGTTATAT ACAACATTCT GTTTTCTGAT AACAACNNTG 2912 TGATTCACCT TCAGAATTGG CCATTTTTTT TGTGAGTTTC CTTGCATCAA GGACACTGAG 2972 AAACACAGTC ATTGTCTTAG GTGTTCTATG GGAGGAAGTG AATAGAGCCT TTAGGAACTT 3032 CCTGGTCAAG CTTATGGTGC TTATTTTGAT CTGGGCCACT TCCCTCCTTC CAGTCATGAG 3092 TAATCATCAA GGAGCAAGTT GGAGTGTTTC AGGTGTATAT TTTGTAGAAC CCAAAAGATT 3152 GGAGCCTTAA CAATAAACAT CAGAGCGGCC GCGAATTC 3190 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Glu Leu Leu Pro Val Glu Ser Asn His Asn Lys Asp Leu Tyr 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Asp Pro Phe Gly Pro Ile Gly Thr Ser Pro Ser Gly Pro Asn Pro 1 5 10 15 Asp His Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Asp Asp 20 25 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Val Thr Val Glu Asn Ser Met Ile Ile Asn Val Leu Glu His 1 5 10 15 配列番号：６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ACYGTKGAGA ATWSYATGAT TATTAATGTK CTSGA 35 配列番号：７ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GTAGCCGGGG GGGGGCARGT GGTCGGGGTT GGGGCC 36 配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CTCCATATGG CGGCCTGGA 19 配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GAGAAGCTTG AGGCCTTCAC AGG 23

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＰＩ３１のｃＤＮＡの塩基配列およびアミ
ノ酸配列を示す図である。

【図２】ヒトＰＩ３１ｃＤＮＡについてプライマーウォ
ーキングによるシーケンスの過程を示す図である。図中
の矢印は１回のシーケンスを行った部位とシーケンスの
方向を示す。黒塗部はコード領域である。

【図３】ヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２の細胞抽出液と抗ヒ
トＰＩ３１抗体を含むラビット抗血清を反応さえたイム
ノブロットの結果を示す電気泳動写真である。

【図４】ヒトＰＩ３１がプロテアソ−ムの蛋白質分解活
性を濃度依存的に抑制することを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/576 Ｂ 33/576 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を少なくとも有するアミノ酸配列からなるプロテアソ
   ーム抑制蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列における一または複数のアミノ酸を置換、欠失または
   付加してなるアミノ酸配列からなり、かつヒトプロテア
   ソームの蛋白質分解活性を抑制するプロテアソーム抑制
   蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の蛋白質をコー
   ドするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列か
   らなるポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 請求項３または請求項４に記載のポリヌ
   クレオチドのうちの一部であって、連続する９以上の塩
   基からなるポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項１又は２に記載の蛋白質をコード
   するポリヌクレオチドを組み込んでなる形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項３に記載のポリヌクレオチドのア
   ンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌク
   レオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導
   体のうちの一部であって、連続する９以上の塩基からな
   るアンチセンスポリヌクレオチドまたは該アンチセンス
   ポリヌクレオチドの誘導体。
8. 【請求項８】 化学修飾された請求項３ないし６に記載
   のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチ
   ドもしくは該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導体。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載の蛋白質を認識
   する抗体。