JPH11225799A - 蛍光を利用した検出アッセイとそのためのキット - Google Patents
蛍光を利用した検出アッセイとそのためのキットInfo
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- JPH11225799A JPH11225799A JP10312790A JP31279098A JPH11225799A JP H11225799 A JPH11225799 A JP H11225799A JP 10312790 A JP10312790 A JP 10312790A JP 31279098 A JP31279098 A JP 31279098A JP H11225799 A JPH11225799 A JP H11225799A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は蛍光を利用した検出アッセイ用キッ
トと方法に関し、特に、蛍光シグナルへの干渉を減少ま
たは排除することができるキット、及び、そのキットを
用いた蛍光検出アッセイを行う方法を提供することであ
る。 【解決手段】 本発明は、サンプル中の標的分析物の量
等を検出する蛍光検出アッセイ用、第１の容器とそれに
対応する第２の容器を含有するキットであって、該第１
の容器には標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナルの
検出可能な変化を生み出すことができる、当該標的分析
物の結合パートナーを含み、また、第２の容器には、当
該標的分析物がサンプルに存在するとき、その標的分析
物含有量を変化させる反応の開始を誘発するような試薬
を含むか、そのような条件を含むキット、及び、そのキ
ットを用いた蛍光検出アッセイを行う方法を提供する。
トと方法に関し、特に、蛍光シグナルへの干渉を減少ま
たは排除することができるキット、及び、そのキットを
用いた蛍光検出アッセイを行う方法を提供することであ
る。 【解決手段】 本発明は、サンプル中の標的分析物の量
等を検出する蛍光検出アッセイ用、第１の容器とそれに
対応する第２の容器を含有するキットであって、該第１
の容器には標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナルの
検出可能な変化を生み出すことができる、当該標的分析
物の結合パートナーを含み、また、第２の容器には、当
該標的分析物がサンプルに存在するとき、その標的分析
物含有量を変化させる反応の開始を誘発するような試薬
を含むか、そのような条件を含むキット、及び、そのキ
ットを用いた蛍光検出アッセイを行う方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、通常、液体生物試
料における、リアルタイムに蛍光を利用したアッセイを
行うキットと方法に関する。このキットと方法は特に核
酸（即ち、分子）を利用した診断アッセイに適する。
料における、リアルタイムに蛍光を利用したアッセイを
行うキットと方法に関する。このキットと方法は特に核
酸（即ち、分子）を利用した診断アッセイに適する。
【０００２】
【従来の技術】核酸を利用したアッセイのプロセスは良
く知られており、種々の態様で実施されている。このよ
うな核酸を利用したアッセイの多くのプロセスの一態様
は核酸増幅プロセスである。一般的に、この態様におい
ては、まず核酸増幅反応を完了するまで行い、続いて核
酸プローブを用いて増幅した目的の核酸配列の存否を判
断する。このタイプのアッセイは終末点アッセイと称さ
れている。
く知られており、種々の態様で実施されている。このよ
うな核酸を利用したアッセイの多くのプロセスの一態様
は核酸増幅プロセスである。一般的に、この態様におい
ては、まず核酸増幅反応を完了するまで行い、続いて核
酸プローブを用いて増幅した目的の核酸配列の存否を判
断する。このタイプのアッセイは終末点アッセイと称さ
れている。
【０００３】終末点アッセイの一つの問題点は、増幅反
応で増幅された核酸（アンプリコン）を引き続きプロー
ブアッセイへ物理的に移さなければならないことであ
る。実験室環境からの雑物が移し替えることによりアン
プリコンへの混入する可能性が存在する。更に、サンプ
ルの物理的移送があるたびにサンプルの誤認識または各
々のサンプルの取り違えといった一般的な危険性も増加
する。
応で増幅された核酸（アンプリコン）を引き続きプロー
ブアッセイへ物理的に移さなければならないことであ
る。実験室環境からの雑物が移し替えることによりアン
プリコンへの混入する可能性が存在する。更に、サンプ
ルの物理的移送があるたびにサンプルの誤認識または各
々のサンプルの取り違えといった一般的な危険性も増加
する。
【０００４】試験ユニット内にサンプルを閉じこめ、そ
こに液体生物試料に統合された核酸増幅反応と核酸アッ
セイが実施できるように完備した試験ユニットの提案は
以前になされている。例えば、Paul N. Schnipelsky
らに与えられた米国特許第5,229,297号において、サン
プルと、増幅試薬と検出試薬を含むための多数の融通性
のある室、ならびに、サンプルと試薬室を検出室と廃物
室に連結する通路からなるＤＮＡ増幅と検出のためのキ
ュベットが記載されている。ローラーはサンプルと試薬
室を所望の順序通りに圧搾または圧迫するのに使用され
ており、それによりサンプルと検出試薬が通路を通して
検出室と廃物室へ押し出される。十分な圧力がローラー
により発生されるまで、サンプルと試薬室を通路から隔
離するために一時的なシールが使用されている。この配
置は増幅および検出の間、キュベット内にサンプルがと
どまることにおいて都合がよいが、一時的シールを破壊
して種々の液体の室間への流れを引き起こすためのロー
ラーが必須であることより望ましくない複雑化になった
ために、増幅反応とアッセイ法の自動化を困難にしてい
る。
こに液体生物試料に統合された核酸増幅反応と核酸アッ
セイが実施できるように完備した試験ユニットの提案は
以前になされている。例えば、Paul N. Schnipelsky
らに与えられた米国特許第5,229,297号において、サン
プルと、増幅試薬と検出試薬を含むための多数の融通性
のある室、ならびに、サンプルと試薬室を検出室と廃物
室に連結する通路からなるＤＮＡ増幅と検出のためのキ
ュベットが記載されている。ローラーはサンプルと試薬
室を所望の順序通りに圧搾または圧迫するのに使用され
ており、それによりサンプルと検出試薬が通路を通して
検出室と廃物室へ押し出される。十分な圧力がローラー
により発生されるまで、サンプルと試薬室を通路から隔
離するために一時的なシールが使用されている。この配
置は増幅および検出の間、キュベット内にサンプルがと
どまることにおいて都合がよいが、一時的シールを破壊
して種々の液体の室間への流れを引き起こすためのロー
ラーが必須であることより望ましくない複雑化になった
ために、増幅反応とアッセイ法の自動化を困難にしてい
る。
【０００５】更に、米国特許第5,639,428号において、
統合された核酸増幅反応と核酸アッセイを実施するため
の改良試験ユニットが開示されている。改良試験ユニッ
トにおいて、サンプルと試薬の流れは比較的簡単な回転
装置から加えられる遠心力により制御され、それにより
ローラーや他の複雑な機構が要求されない。また、米国
特許第5,229,297号に開示されている配置により改良さ
れているが、今に至っても、試験ユニット内の制御され
た液体流動を提供する必要性がいまだに存在し、望まれ
ている。
統合された核酸増幅反応と核酸アッセイを実施するため
の改良試験ユニットが開示されている。改良試験ユニッ
トにおいて、サンプルと試薬の流れは比較的簡単な回転
装置から加えられる遠心力により制御され、それにより
ローラーや他の複雑な機構が要求されない。また、米国
特許第5,229,297号に開示されている配置により改良さ
れているが、今に至っても、試験ユニット内の制御され
た液体流動を提供する必要性がいまだに存在し、望まれ
ている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上に議論した終末点ア
ッセイに加え、核酸アッセイの均質法も存在する。均質
法では増幅した物質を別のアッセイ部位への物理的移送
することは必要とされず、むしろ増幅反応と同時に作用
させる。既知の均質アッセイ法の例には蛍光偏光と、蛍
光エネルギー転移と、光吸収が含まれる。終末点アッセ
イと同様に、均質アッセイ法のための、試料を閉じ込め
た試験ユニットの提案が既になされている。例えば、米
国特許第5,236,827号とそれに対応する欧州特許第03477
71号に、微生物の同定するために、酵素の反応率を決定
するアッセイを行うための蛍光発生的な基質を伴った機
器が記載されている。
ッセイに加え、核酸アッセイの均質法も存在する。均質
法では増幅した物質を別のアッセイ部位への物理的移送
することは必要とされず、むしろ増幅反応と同時に作用
させる。既知の均質アッセイ法の例には蛍光偏光と、蛍
光エネルギー転移と、光吸収が含まれる。終末点アッセ
イと同様に、均質アッセイ法のための、試料を閉じ込め
た試験ユニットの提案が既になされている。例えば、米
国特許第5,236,827号とそれに対応する欧州特許第03477
71号に、微生物の同定するために、酵素の反応率を決定
するアッセイを行うための蛍光発生的な基質を伴った機
器が記載されている。
【０００７】欧州特許出願第0640828号には、多数の核
酸増幅反応と同時にモニタリングするための器具が開示
されている。この器具は熱サイクルと同時に多数の増幅
反応から放射された光を検出するセンサを含んでいる。
米国特許第5,219,762号には、標的分析物に酵素が作用
して検出かつ測定可能な酵素の副産物を生成して、酵素
反応の産物を測定するための機器と方法が記載されてい
る。欧州特許第0298669号には、核酸反応を行う方法と
乾燥状態の試薬を有する反応容器の操作が記載されてい
る。
酸増幅反応と同時にモニタリングするための器具が開示
されている。この器具は熱サイクルと同時に多数の増幅
反応から放射された光を検出するセンサを含んでいる。
米国特許第5,219,762号には、標的分析物に酵素が作用
して検出かつ測定可能な酵素の副産物を生成して、酵素
反応の産物を測定するための機器と方法が記載されてい
る。欧州特許第0298669号には、核酸反応を行う方法と
乾燥状態の試薬を有する反応容器の操作が記載されてい
る。
【０００８】更に、現在係属中の1997年6月18日出願の
米国特許出願第08/878,096号には、均質蛍光偏向アッセ
イのための機器と方法が記載されている。この機器が核
酸増幅反応と核酸プローブを利用したアッセイの両方に
必要とする全ての試薬を乾燥形態で含有し、これらの試
薬は実質上同時に液体生物試料によって再水和される。
機器の各サンプルセル内のサンプル量を最小にする目的
で、この機器は平坦なカード形状に作られている。それ
によって、その機器の予熱と、予熱された機器（即
ち、”ホットスタート”(hot start)という方法で）の
温度とそこに加えられた液体サンプルの温度との平衡状
態を迅速に達成することが可能となった。しかしなが
ら、実質上同時に乾燥した全ての核酸増幅試薬と乾燥し
たすべての核酸プローブアッセイ試薬の再水和が変動す
ることが、蛍光検出シグナルに再現性のない原因である
ことがつきとめられている。この再現性のないシグナル
は、蛍光性に標識された核酸プローブの不安定な再水和
が原因であると考えられ、また、干渉シグナルの再現性
のない性質により、所望の蛍光シグナルへの影響から除
外できない干渉の存在が原因となる。少量しか扱えない
ので、この機器でいくかのサンプルからのアンプリコン
を検出することには更に困難である。また、これでは臨
床診断に簡単に使用できる機器を提供できない。
米国特許出願第08/878,096号には、均質蛍光偏向アッセ
イのための機器と方法が記載されている。この機器が核
酸増幅反応と核酸プローブを利用したアッセイの両方に
必要とする全ての試薬を乾燥形態で含有し、これらの試
薬は実質上同時に液体生物試料によって再水和される。
機器の各サンプルセル内のサンプル量を最小にする目的
で、この機器は平坦なカード形状に作られている。それ
によって、その機器の予熱と、予熱された機器（即
ち、”ホットスタート”(hot start)という方法で）の
温度とそこに加えられた液体サンプルの温度との平衡状
態を迅速に達成することが可能となった。しかしなが
ら、実質上同時に乾燥した全ての核酸増幅試薬と乾燥し
たすべての核酸プローブアッセイ試薬の再水和が変動す
ることが、蛍光検出シグナルに再現性のない原因である
ことがつきとめられている。この再現性のないシグナル
は、蛍光性に標識された核酸プローブの不安定な再水和
が原因であると考えられ、また、干渉シグナルの再現性
のない性質により、所望の蛍光シグナルへの影響から除
外できない干渉の存在が原因となる。少量しか扱えない
ので、この機器でいくかのサンプルからのアンプリコン
を検出することには更に困難である。また、これでは臨
床診断に簡単に使用できる機器を提供できない。
【０００９】上記した技術背景から、この分野では均質
核酸増幅とリアルタイムで核酸プローブ検出用に、より
簡単な、一貫性があって、信頼のできる蛍光検出シグナ
ルが得られるアッセイのためのキットと方法に対する需
要は存在する。
核酸増幅とリアルタイムで核酸プローブ検出用に、より
簡単な、一貫性があって、信頼のできる蛍光検出シグナ
ルが得られるアッセイのためのキットと方法に対する需
要は存在する。
【００１０】
【課題を解決する手段】上記したキットと方法の欠点と
限界に取り込むために、本発明は、（１）核酸プライマ
ーと、標的分析物の量の変化に応じた蛍光シグナルの検
出可能な変化を生み出すことができる、当該標的分析物
に結合する結合パートナーを含む一または複数の第１の
容器（vessel）と、（２）サンプルに当該標的分析物が
存在するとき、該標的分析物量を変化させる反応の開始
を誘発するような試薬を含むか、又は、そのような条件
を可能にする、上記の一又は複数の第１の容器に対応す
る、一又は複数の第２の容器を含む、サンプル中の標的
分析物の存否、またはその含有量を決定するための蛍光
検出アッセイを行うのに有用なキットを提供する。
限界に取り込むために、本発明は、（１）核酸プライマ
ーと、標的分析物の量の変化に応じた蛍光シグナルの検
出可能な変化を生み出すことができる、当該標的分析物
に結合する結合パートナーを含む一または複数の第１の
容器（vessel）と、（２）サンプルに当該標的分析物が
存在するとき、該標的分析物量を変化させる反応の開始
を誘発するような試薬を含むか、又は、そのような条件
を可能にする、上記の一又は複数の第１の容器に対応す
る、一又は複数の第２の容器を含む、サンプル中の標的
分析物の存否、またはその含有量を決定するための蛍光
検出アッセイを行うのに有用なキットを提供する。
【００１１】更なる実施態様として、本発明のキット
は、第１のセクションと少なくとも一つ別のセクション
を有する容器を含む。この第１のセクションには、核酸
プライマーと、標的分析物に結合するパートナーであっ
て、標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナルの検出可
能な変化を生み出すことがきでる、当該標的分析物に結
合する結合パートナーを包含する。この容器の他のセク
ションは、標的分析物がサンプルに存在するとき、標的
分析物量の変化させる反応の開始を誘導するような試薬
を含むか、そのような条件を可能にするものである。本
発明はまた、標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナル
の検出可能な変化を生み出すことができる標的結合パー
トナーを包含する第１の試薬製剤をサンプルに晒すステ
ップを含んでなる、サンプル中の標的分析物の存否と、
その含量を検出する方法を提供している。このようにし
て晒すことは、標的分析物がサンプルに存在するとき、
標的分析物が変化し得る第２の試薬製剤あるいは条件に
晒すために第１の混合物を作り出すためである。
は、第１のセクションと少なくとも一つ別のセクション
を有する容器を含む。この第１のセクションには、核酸
プライマーと、標的分析物に結合するパートナーであっ
て、標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナルの検出可
能な変化を生み出すことがきでる、当該標的分析物に結
合する結合パートナーを包含する。この容器の他のセク
ションは、標的分析物がサンプルに存在するとき、標的
分析物量の変化させる反応の開始を誘導するような試薬
を含むか、そのような条件を可能にするものである。本
発明はまた、標的分析物量の変化に応じた蛍光シグナル
の検出可能な変化を生み出すことができる標的結合パー
トナーを包含する第１の試薬製剤をサンプルに晒すステ
ップを含んでなる、サンプル中の標的分析物の存否と、
その含量を検出する方法を提供している。このようにし
て晒すことは、標的分析物がサンプルに存在するとき、
標的分析物が変化し得る第２の試薬製剤あるいは条件に
晒すために第１の混合物を作り出すためである。
【００１２】本発明は、リアルタイムで蛍光シグナルの
検出を行う（即ち、増幅反応が起きるのと同時に行う）
アッセイに関する。このようなアッセイでは、蛍光シグ
ナルの変化を検出する。このようなリアルタイムで蛍光
検出アッセイを有用にするためには、全過程を通して蛍
光シグナルの変化を検出可能な、かつモニターすること
ができるものにしなければならない。従って、蛍光バッ
クグランドの干渉（即ち、標的分析物の存在と異なる条
件による蛍光シグナル）は、コンスタントあるいは再現
性を有するものでなければ、リアルタイム蛍光検出アッ
セイにとっては有害なものである。即ち、蛍光バックグ
ランドの変化が（１）特定のシグナルにおける変化に比
べて小さい、あるいは（２）数値的なアルゴリズムに従
って補正することができる場合に限り、干渉バックグラ
ンドは特定のシグナルに比べて有意な大きさを持ちう
る。
検出を行う（即ち、増幅反応が起きるのと同時に行う）
アッセイに関する。このようなアッセイでは、蛍光シグ
ナルの変化を検出する。このようなリアルタイムで蛍光
検出アッセイを有用にするためには、全過程を通して蛍
光シグナルの変化を検出可能な、かつモニターすること
ができるものにしなければならない。従って、蛍光バッ
クグランドの干渉（即ち、標的分析物の存在と異なる条
件による蛍光シグナル）は、コンスタントあるいは再現
性を有するものでなければ、リアルタイム蛍光検出アッ
セイにとっては有害なものである。即ち、蛍光バックグ
ランドの変化が（１）特定のシグナルにおける変化に比
べて小さい、あるいは（２）数値的なアルゴリズムに従
って補正することができる場合に限り、干渉バックグラ
ンドは特定のシグナルに比べて有意な大きさを持ちう
る。
【００１３】しかしながら、リアルタイム蛍光検出アッ
セイが、乾燥した形態の試薬を再水和することにより構
成される場合、蛍光標識した試薬の再水和は一定性を有
せず、変化にも再現性がない干渉する蛍光バックグラン
ドを生じさせる。従って、この干渉性のバックグランド
は特定の蛍光変化を隠し、そして、数値的なアルゴリズ
ムに従って補正することができない。よって、本発明の
キットと方法は、蛍光標識した試薬の再水和後まで所望
の蛍光シグナル検出可能な変化を生み出すことができる
反応の開始を順延することにより、干渉性の蛍光バック
グランドを起こす原因を排除するように設計されてい
る。
セイが、乾燥した形態の試薬を再水和することにより構
成される場合、蛍光標識した試薬の再水和は一定性を有
せず、変化にも再現性がない干渉する蛍光バックグラン
ドを生じさせる。従って、この干渉性のバックグランド
は特定の蛍光変化を隠し、そして、数値的なアルゴリズ
ムに従って補正することができない。よって、本発明の
キットと方法は、蛍光標識した試薬の再水和後まで所望
の蛍光シグナル検出可能な変化を生み出すことができる
反応の開始を順延することにより、干渉性の蛍光バック
グランドを起こす原因を排除するように設計されてい
る。
【００１４】本発明の方法では、標的分析物を含んでい
るかもしれないサンプルに、核酸プライマーと蛍光標識
した標的分析物の結合パートナーとを含有する第１の試
薬製剤を晒すステップを含む。このステップにより、第
１の混合物が作り出される。そして、この第１の混合物
は、標的分析物が存在するとき、蛍光シグナルの検出可
能な変化を引き起こす条件あるいは第２の試薬製剤に晒
される。
るかもしれないサンプルに、核酸プライマーと蛍光標識
した標的分析物の結合パートナーとを含有する第１の試
薬製剤を晒すステップを含む。このステップにより、第
１の混合物が作り出される。そして、この第１の混合物
は、標的分析物が存在するとき、蛍光シグナルの検出可
能な変化を引き起こす条件あるいは第２の試薬製剤に晒
される。
【００１５】この方法には、蛍光標識した試薬（即ち、
蛍光標識した標的分析物に結合するパートナー）は、検
出反応の開始前に既に再水和されている。つまり、蛍光
標識した結合パートナーが再水和されるまで検出反応を
遅らせる。第１の試薬製剤に含まれる蛍光標識した標的
分析物に結合するパートナーは、標的分析物に特異的に
結合する能力を有し、他の関連分析物から標的分析物を
十分に区別できる化合物である。標的分析物が核酸分子
であるとき、典型的な結合パートナーは核酸分子である
のが好ましく、特に、結合パートナー核酸分子は標的分
析核酸分子と水素結合し得る、十分に相補性を有する核
酸分子であるのが好ましい。
蛍光標識した標的分析物に結合するパートナー）は、検
出反応の開始前に既に再水和されている。つまり、蛍光
標識した結合パートナーが再水和されるまで検出反応を
遅らせる。第１の試薬製剤に含まれる蛍光標識した標的
分析物に結合するパートナーは、標的分析物に特異的に
結合する能力を有し、他の関連分析物から標的分析物を
十分に区別できる化合物である。標的分析物が核酸分子
であるとき、典型的な結合パートナーは核酸分子である
のが好ましく、特に、結合パートナー核酸分子は標的分
析核酸分子と水素結合し得る、十分に相補性を有する核
酸分子であるのが好ましい。
【００１６】核酸分子に蛍光標識する使う方法（即ち、
抱合(conjugation)）は、当該分野の当業者にとっては
周知である。本発明に用いられる好ましい蛍光標識の試
料には、フルオロサイン(fluorosceins)、ローダミン(r
hodamine)、ローサミン(rosamines)のようなキサンテン
(xanthene)染料と、１−ジメチルアミノナフチル−５−
スルホン酸塩(1-dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat
e)、スルホン酸１−アニリノ−８−ナフタレン(1-anili
no-8-naphthalene sulfonate)、スルホン酸２−ｐ−ト
ルイジン−６−ナフタレン(2-p-toluidinyl-6-naphthal
ene sulfonate)のようなナフチルアミン類が含まれる。
抱合(conjugation)）は、当該分野の当業者にとっては
周知である。本発明に用いられる好ましい蛍光標識の試
料には、フルオロサイン(fluorosceins)、ローダミン(r
hodamine)、ローサミン(rosamines)のようなキサンテン
(xanthene)染料と、１−ジメチルアミノナフチル−５−
スルホン酸塩(1-dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat
e)、スルホン酸１−アニリノ−８−ナフタレン(1-anili
no-8-naphthalene sulfonate)、スルホン酸２−ｐ−ト
ルイジン−６−ナフタレン(2-p-toluidinyl-6-naphthal
ene sulfonate)のようなナフチルアミン類が含まれる。
【００１７】蛍光標識された核酸分子結合パートナー
は、目的とする標的核酸に特異的に結合する核酸プライ
マーと共に第１の試薬製剤に存在する。しかしながら、
第１の試薬製剤の中に他の試薬が存在してもよいが、検
出反応を開始し得る特定の第２試薬製剤、あるいは、検
出反応を開始し得る条件を、第１の試薬製剤と第１の試
薬製剤をサンプルに晒すことにより作成される第１の混
合物にふれないようにしなければならない。例えば、ポ
リメラーゼを利用した核酸増幅反応が検出反応の一部の
ときは、この第２の試薬製剤がポリメラーゼを包含して
もよい。それは、サンプルをポリメラーゼを含まない第
１の試薬製剤に晒しても検出アッセイを開始させる引き
がねとはならない一方、乾燥した蛍光標識された核酸分
子の結合パートナーの再水和を可能にすることからであ
る。同様に、この方法が特定の温度になるまで開始しな
いような検出アッセイに適用される場合には、サンプル
の添加による蛍光標識された核酸分子の結合パートナー
を含む第１の試薬製剤の再水和をより低い温度で行い、
そして、アッセイを開始する条件としてこの混合物を熱
に晒す。
は、目的とする標的核酸に特異的に結合する核酸プライ
マーと共に第１の試薬製剤に存在する。しかしながら、
第１の試薬製剤の中に他の試薬が存在してもよいが、検
出反応を開始し得る特定の第２試薬製剤、あるいは、検
出反応を開始し得る条件を、第１の試薬製剤と第１の試
薬製剤をサンプルに晒すことにより作成される第１の混
合物にふれないようにしなければならない。例えば、ポ
リメラーゼを利用した核酸増幅反応が検出反応の一部の
ときは、この第２の試薬製剤がポリメラーゼを包含して
もよい。それは、サンプルをポリメラーゼを含まない第
１の試薬製剤に晒しても検出アッセイを開始させる引き
がねとはならない一方、乾燥した蛍光標識された核酸分
子の結合パートナーの再水和を可能にすることからであ
る。同様に、この方法が特定の温度になるまで開始しな
いような検出アッセイに適用される場合には、サンプル
の添加による蛍光標識された核酸分子の結合パートナー
を含む第１の試薬製剤の再水和をより低い温度で行い、
そして、アッセイを開始する条件としてこの混合物を熱
に晒す。
【００１８】検出アッセイの開始は標的分析物の量の変
化の始まりである。標的分析物が核酸分子の場合に、標
的分析物の量の変化は、核酸増幅反応によりアンプリコ
ン（即ち、標的核酸分子分析物のコピー）の生成量の増
加によって引き起こされる。この核酸増幅反応はこの分
野で当業者に周知であり、このような反応に適した例と
して、鎖置換増幅法(Strand Displacement Amplificati
on(SDA))、ポリメラーゼ連鎖反応法(Polymerase Chain
Reaction(PCR))、リガーゼ連鎖反応法(LigaseChain Rea
ction(LCR))、転写媒介増幅法(Transcription Mediated
Amplification(TMA))、核酸配列ベース増幅法(Nucleic
Acid Sequence Based Amplification(NASBA))がある。
このような反応では、アンプリコン（即ち、標的分析物
の量の増加）の生成は、時間と共に増加する標的分析物
の量に対応しする光シグナルの検出可能な変化を引き起
こす（即ち、リアルタイム検出）。
化の始まりである。標的分析物が核酸分子の場合に、標
的分析物の量の変化は、核酸増幅反応によりアンプリコ
ン（即ち、標的核酸分子分析物のコピー）の生成量の増
加によって引き起こされる。この核酸増幅反応はこの分
野で当業者に周知であり、このような反応に適した例と
して、鎖置換増幅法(Strand Displacement Amplificati
on(SDA))、ポリメラーゼ連鎖反応法(Polymerase Chain
Reaction(PCR))、リガーゼ連鎖反応法(LigaseChain Rea
ction(LCR))、転写媒介増幅法(Transcription Mediated
Amplification(TMA))、核酸配列ベース増幅法(Nucleic
Acid Sequence Based Amplification(NASBA))がある。
このような反応では、アンプリコン（即ち、標的分析物
の量の増加）の生成は、時間と共に増加する標的分析物
の量に対応しする光シグナルの検出可能な変化を引き起
こす（即ち、リアルタイム検出）。
【００１９】例えば、蛍光エネルギー移転(fluoresence
energy transfer(FET))を利用したアッセイでは、蛍光
シグナルの強度の変化を検出する。このようなアッセイ
では、蛍光エネルギー供与部分と蛍光エネルギー受容部
分のいずれとも標的分析物の結合パートナーに存在す
る。この供与部分と受容部分がきわめて接近すると、供
与部分の蛍光シグナルの強度は受容部分により消され
る。従って、FETアッセイは以下のように設計されう
る。（１）蛍光シグナルの強度の増加を標的分析物の存
在を示唆するものとし（即ち、当初では供与部分と受容
部分はきわめて接近していて、標的分析物の存在がその
接近を減らす結果を示す）、あるいは（２）蛍光シグナ
ルの強度の減少を標的分析物の存在を示唆するものとす
る（即ち、当初では供与部分と受容部分は離れていて、
標的分析物の存在がそれらを近づける結果を示す）。
energy transfer(FET))を利用したアッセイでは、蛍光
シグナルの強度の変化を検出する。このようなアッセイ
では、蛍光エネルギー供与部分と蛍光エネルギー受容部
分のいずれとも標的分析物の結合パートナーに存在す
る。この供与部分と受容部分がきわめて接近すると、供
与部分の蛍光シグナルの強度は受容部分により消され
る。従って、FETアッセイは以下のように設計されう
る。（１）蛍光シグナルの強度の増加を標的分析物の存
在を示唆するものとし（即ち、当初では供与部分と受容
部分はきわめて接近していて、標的分析物の存在がその
接近を減らす結果を示す）、あるいは（２）蛍光シグナ
ルの強度の減少を標的分析物の存在を示唆するものとす
る（即ち、当初では供与部分と受容部分は離れていて、
標的分析物の存在がそれらを近づける結果を示す）。
【００２０】蛍光エネルギー供与部分と受容部分の接近
度を増加あるいは減少できるようににするために、この
結合パートナーはその二次構造を変化させることができ
る。蛍光供与部分と蛍光受容部分が接近していて蛍光シ
グナルを消すような核酸分子の二次構造の例として、G-
四量体（G-quartets）と、ステムループ、あるいはヘア
ピンループ等が挙げられる。このような二次構造の核酸
分子は、Varani, G.,Annu. Rev. Biophys. Biomol. Str
uct. 1995, 24: 379 - 404と、Williamson, J., Annu.
Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994, 23: 703 - 30
のような資料から、当分野において当業者間では周知な
ものである。また、これらの二次構造は、直鎖状の二次
構造に変形することによって、蛍光エネルギー供与部分
と蛍光エネルギー受容部分の接近度を減少し、蛍光シグ
ナルの消光をより少なくする。1997年5月30日出願にし
た米国特許出願第08/865,675号と、1997年5月13日に出
願した米国特許出願第08/855,085号によると、フルオレ
ッセイン−ROXあるいはDABCYL−フルオレッセインのよ
うな蛍光供与体−受容体対を使用して、アンプリコンの
存在下にヘアピン構造の再構築により、５〜１０倍の蛍
光シグナルの強度が観察されうる。ここでは、上記出願
の内容の全体を引用することにより本明細書の一部をな
すものとする。
度を増加あるいは減少できるようににするために、この
結合パートナーはその二次構造を変化させることができ
る。蛍光供与部分と蛍光受容部分が接近していて蛍光シ
グナルを消すような核酸分子の二次構造の例として、G-
四量体（G-quartets）と、ステムループ、あるいはヘア
ピンループ等が挙げられる。このような二次構造の核酸
分子は、Varani, G.,Annu. Rev. Biophys. Biomol. Str
uct. 1995, 24: 379 - 404と、Williamson, J., Annu.
Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994, 23: 703 - 30
のような資料から、当分野において当業者間では周知な
ものである。また、これらの二次構造は、直鎖状の二次
構造に変形することによって、蛍光エネルギー供与部分
と蛍光エネルギー受容部分の接近度を減少し、蛍光シグ
ナルの消光をより少なくする。1997年5月30日出願にし
た米国特許出願第08/865,675号と、1997年5月13日に出
願した米国特許出願第08/855,085号によると、フルオレ
ッセイン−ROXあるいはDABCYL−フルオレッセインのよ
うな蛍光供与体−受容体対を使用して、アンプリコンの
存在下にヘアピン構造の再構築により、５〜１０倍の蛍
光シグナルの強度が観察されうる。ここでは、上記出願
の内容の全体を引用することにより本明細書の一部をな
すものとする。
【００２１】特に、サンプルと第１の試薬製剤の混合物
をある条件ではなく、第２の試薬製剤に晒すとき、第１
の試薬製剤から第２の試薬製剤の物理的な分離は多くの
手段により達成されうる。具体的な態様として、対応す
るウエルのように第１と第２の容器にそれぞれ第１の試
薬製剤と第２の試薬製剤を含める。このような構成にお
いて、この対応する第１と第２のウエルは対応する印で
マークされる。例えば、この対応する第１と第２のウエ
ルは、この対応関連性指標となるバーコードやその他の
コード、あるいはカラーコードでマークし得る。この関
連性指標の表示は、対応するマルチウエルプレートある
いはその他の機器に使用されている場合、反応混合物を
第１のウエルから間違った第２のウエルに移動する可能
性を減少するのに有用である。
をある条件ではなく、第２の試薬製剤に晒すとき、第１
の試薬製剤から第２の試薬製剤の物理的な分離は多くの
手段により達成されうる。具体的な態様として、対応す
るウエルのように第１と第２の容器にそれぞれ第１の試
薬製剤と第２の試薬製剤を含める。このような構成にお
いて、この対応する第１と第２のウエルは対応する印で
マークされる。例えば、この対応する第１と第２のウエ
ルは、この対応関連性指標となるバーコードやその他の
コード、あるいはカラーコードでマークし得る。この関
連性指標の表示は、対応するマルチウエルプレートある
いはその他の機器に使用されている場合、反応混合物を
第１のウエルから間違った第２のウエルに移動する可能
性を減少するのに有用である。
【００２２】更に、ウエルのような単一の容器を、2以
上のセクションに分けることができる。このような態様
では、第１の試薬製剤をウエルの第一のセクションに、
第２の試薬製剤をウエルの第２セクションに含むことが
できる。上記したようにウエルのセクションもマークさ
れるが、この態様ではそれは重要ではない。これは、サ
ンプルに第１の試薬製剤を溶かして作り出した混合物
は、第２ウエルではなく、同一ウエルの別のセクション
に移動するだけからである。従って、間違った移動のリ
スクをより少なくし、リスクを減少するために、対応す
るセクションをマークする必要はそれほどない。
上のセクションに分けることができる。このような態様
では、第１の試薬製剤をウエルの第一のセクションに、
第２の試薬製剤をウエルの第２セクションに含むことが
できる。上記したようにウエルのセクションもマークさ
れるが、この態様ではそれは重要ではない。これは、サ
ンプルに第１の試薬製剤を溶かして作り出した混合物
は、第２ウエルではなく、同一ウエルの別のセクション
に移動するだけからである。従って、間違った移動のリ
スクをより少なくし、リスクを減少するために、対応す
るセクションをマークする必要はそれほどない。
【００２３】上にあるいずれの態様においても、第１の
試薬製剤と第２の試薬製剤は、一般に、容器の内壁上に
スポット状の乾燥された形態を採っている。乾燥された
第１の試薬製剤スポットと乾燥された第２の試薬製剤ス
ポットには、トレハロースあるいはその他の炭水化物の
ような、可溶性が高いマトリックスを含有する。これら
の試薬は、ウエルの中に添加される水溶性の液体に素早
く再水和する役割を担う。しかしながら、何れの態様も
第２試薬製剤は乾燥されない形態の場合にも有用であ
る。
試薬製剤と第２の試薬製剤は、一般に、容器の内壁上に
スポット状の乾燥された形態を採っている。乾燥された
第１の試薬製剤スポットと乾燥された第２の試薬製剤ス
ポットには、トレハロースあるいはその他の炭水化物の
ような、可溶性が高いマトリックスを含有する。これら
の試薬は、ウエルの中に添加される水溶性の液体に素早
く再水和する役割を担う。しかしながら、何れの態様も
第２試薬製剤は乾燥されない形態の場合にも有用であ
る。
【００２４】本発明の方法の好ましい実施態様のとし
て、本発明方法は核酸増幅反応を含み、蛍光供与部分と
蛍光受容部分とを有する核酸分子の結合パートナーを利
用する。第１のウエルにはこのような結合パートナーを
乾燥形状、そして、核酸増幅酵素以外の全ての試薬も乾
燥状態（即ち、第１の試薬製剤）で含む。このような酵
素（即ち、第２の試薬製剤）は対応する第２のウエルに
乾燥状態で含まれる。標的分析物（即ち、核酸分子）を
含むかもしれない液体サンプルを第１のウエルに添加し
て、第１の試薬製剤を再水和させ、そして、サンプルと
第１の試薬製剤との混合物を形成する。この混合物は次
いで第２ウエルに移動され、第２の試薬製剤を再水和さ
せ、均質核酸増幅とリアルタイム蛍光検出アッセイが始
まる。この第２のウエルを蛍光検出装置に置き、蛍光シ
グナルを読み取る。標的分析物が存在する場合には、ア
ンプリコンが生成され、蛍光供与部分と蛍光受容部分と
の間の距離が増大するに連れて、蛍光のクエンチが減っ
て、蛍光シグナルの増強が検出される。標的分析物の開
始量は、これにより、時間が経つに連れ増加した蛍光シ
グナルの数値的な分析を用いて推測され得る。蛍光率(f
luorescence rate)のデータから第１の標的数を推測す
るための数的な方法は、全般の勾配、最初のポジティブ
に要する時間の計算と最大変化率を含むものである。
て、本発明方法は核酸増幅反応を含み、蛍光供与部分と
蛍光受容部分とを有する核酸分子の結合パートナーを利
用する。第１のウエルにはこのような結合パートナーを
乾燥形状、そして、核酸増幅酵素以外の全ての試薬も乾
燥状態（即ち、第１の試薬製剤）で含む。このような酵
素（即ち、第２の試薬製剤）は対応する第２のウエルに
乾燥状態で含まれる。標的分析物（即ち、核酸分子）を
含むかもしれない液体サンプルを第１のウエルに添加し
て、第１の試薬製剤を再水和させ、そして、サンプルと
第１の試薬製剤との混合物を形成する。この混合物は次
いで第２ウエルに移動され、第２の試薬製剤を再水和さ
せ、均質核酸増幅とリアルタイム蛍光検出アッセイが始
まる。この第２のウエルを蛍光検出装置に置き、蛍光シ
グナルを読み取る。標的分析物が存在する場合には、ア
ンプリコンが生成され、蛍光供与部分と蛍光受容部分と
の間の距離が増大するに連れて、蛍光のクエンチが減っ
て、蛍光シグナルの増強が検出される。標的分析物の開
始量は、これにより、時間が経つに連れ増加した蛍光シ
グナルの数値的な分析を用いて推測され得る。蛍光率(f
luorescence rate)のデータから第１の標的数を推測す
るための数的な方法は、全般の勾配、最初のポジティブ
に要する時間の計算と最大変化率を含むものである。
【００２５】例えば、数量分析一態様として、複数の校
正用サンプル（即ち、スタンダード）における核酸配列
の既知量と、あるテストサンプルにおける核酸配列の未
知の量は、それぞれ、ある時間インターバルの間にパラ
レルに増幅される。そして、この時間インターバルのい
くつかの測定ポイントにおいて、校正用サンプルとテス
トサンプルにおいて増幅される核酸配列の量の指標は、
従来の技術を用いて測定される。サンプルがその中に蛍
光指標物質を含んでいるとき（即ち、蛍光色素、標識、
インターカレーション等）、この増幅される核酸配列の
量の指標は、蛍光シグナルから得ることができる（即
ち、蛍光の強度あるいは検出可能な蛍光エネルギーの変
移）。また、リアルタイム測定（即ち、放射性シグナ
ル）にふさわしい他の指標も使用されうる。
正用サンプル（即ち、スタンダード）における核酸配列
の既知量と、あるテストサンプルにおける核酸配列の未
知の量は、それぞれ、ある時間インターバルの間にパラ
レルに増幅される。そして、この時間インターバルのい
くつかの測定ポイントにおいて、校正用サンプルとテス
トサンプルにおいて増幅される核酸配列の量の指標は、
従来の技術を用いて測定される。サンプルがその中に蛍
光指標物質を含んでいるとき（即ち、蛍光色素、標識、
インターカレーション等）、この増幅される核酸配列の
量の指標は、蛍光シグナルから得ることができる（即
ち、蛍光の強度あるいは検出可能な蛍光エネルギーの変
移）。また、リアルタイム測定（即ち、放射性シグナ
ル）にふさわしい他の指標も使用されうる。
【００２６】次いで、第１のポテンシャルカットオフレ
ベルを得るために、各校正用サンプルにおいて増幅され
る核酸配列の量の測定された指標が第１のカットオフレ
ベルと同じになる、上記時間インタバール中の第１セッ
トの時間ポイントを決定するステップを行う。このステ
ップは、異なるいくつかのポテンシャルカットオフレベ
ルのそれぞれのために繰り返され、よって、時間インタ
ーバル中の時間ポイントのセットがそれぞれのポテンシ
ャルカットオフレベルについて得られる。この定量分析
の好ましい態様としては、次いで、校正用サンプルにお
ける核酸配列の既知量に対して、時間インターバル中の
統計上より満足できるポイントのセットを統計上の基準
に照らして決定するステップを実施する。そして、テス
トサンプル中の核酸配列の量が、統計上の基準をよりよ
くあるいはもっともよく満たすポイントのセットをベー
スにして決定される。
ベルを得るために、各校正用サンプルにおいて増幅され
る核酸配列の量の測定された指標が第１のカットオフレ
ベルと同じになる、上記時間インタバール中の第１セッ
トの時間ポイントを決定するステップを行う。このステ
ップは、異なるいくつかのポテンシャルカットオフレベ
ルのそれぞれのために繰り返され、よって、時間インタ
ーバル中の時間ポイントのセットがそれぞれのポテンシ
ャルカットオフレベルについて得られる。この定量分析
の好ましい態様としては、次いで、校正用サンプルにお
ける核酸配列の既知量に対して、時間インターバル中の
統計上より満足できるポイントのセットを統計上の基準
に照らして決定するステップを実施する。そして、テス
トサンプル中の核酸配列の量が、統計上の基準をよりよ
くあるいはもっともよく満たすポイントのセットをベー
スにして決定される。
【００２７】例えば、統計上の基準をよりよく満足する
ポイントのセットを決定するステップには、校正用サン
プルにおける核酸配列の既知の開始量の対数に対してフ
ィットするよりよい直線を提供する、時間インターバル
中のポイントのセットを求めるステップを包含し得る。
特に、このステップは、校正用サンプルにおける核酸配
列の既知の開始量の対数に対する、時間インターバル中
のポイントの各セットのそれぞれの「グラフ」を回帰ラ
インにフィットさせるステップを包含することが好まし
い。時間ポイントの各セットと各回帰ライン間における
フィットの標準偏差が求められる。標準偏差が最も小さ
いフィットに対応する時間ポイントのセットを用いて、
ポテンシャルカットオフレベルから好ましいカットオフ
レベルを選択し、そして、好ましいカットオフレベルを
ベースにテストサンプル中の核酸の開始量を求める。こ
の有利な結果は、好ましくは、テストサンプル中の核酸
の量の測定結果が好ましいカットオフレベルに等しくな
る時間を求めることと、好ましい時間ポイントのセット
に対応する「好ましい」回帰ラインにこの時間をフィッ
トすることにより成し遂げられる。そして、テストサン
プル中の核酸配列の開始濃度の対数は、好ましい回帰ラ
インから求めることができる。
ポイントのセットを決定するステップには、校正用サン
プルにおける核酸配列の既知の開始量の対数に対してフ
ィットするよりよい直線を提供する、時間インターバル
中のポイントのセットを求めるステップを包含し得る。
特に、このステップは、校正用サンプルにおける核酸配
列の既知の開始量の対数に対する、時間インターバル中
のポイントの各セットのそれぞれの「グラフ」を回帰ラ
インにフィットさせるステップを包含することが好まし
い。時間ポイントの各セットと各回帰ライン間における
フィットの標準偏差が求められる。標準偏差が最も小さ
いフィットに対応する時間ポイントのセットを用いて、
ポテンシャルカットオフレベルから好ましいカットオフ
レベルを選択し、そして、好ましいカットオフレベルを
ベースにテストサンプル中の核酸の開始量を求める。こ
の有利な結果は、好ましくは、テストサンプル中の核酸
の量の測定結果が好ましいカットオフレベルに等しくな
る時間を求めることと、好ましい時間ポイントのセット
に対応する「好ましい」回帰ラインにこの時間をフィッ
トすることにより成し遂げられる。そして、テストサン
プル中の核酸配列の開始濃度の対数は、好ましい回帰ラ
インから求めることができる。
【００２８】別の定量分析として、カーブフィッティン
グ操作を、好ましいカットオフレベルの指標（即ち、好
ましい蛍光シグナルカットオフ）をより正確に推測する
ために行う。特に、それぞれの「データ」カーブを、個
々の校正用及びテストサンプルの測定された蛍光シグナ
ルとそれに対する対応した蛍光シグナルが測定された時
間インタベール中の時間ポイントの離散点の「グラフ」
とフィットすることが好ましい。ここに、非パラメトリ
ックカーブ(non-parametric curve)の平滑化操作は、共
通のベースラインに対して離散した点を正規化した後に
実行され得る。各「平滑化された」データカーブについ
てより低い信頼限界カーブを求めることにより、好まし
い指標カットオフレベルの精度をさらに改良することも
できる。このより低い信頼限界カーブは非パラメトリッ
クカーブの平滑化操作を用いることにより平滑化するこ
とができる。上述した時間インターバル中の時間ポイン
トの各セットは、各平滑化したより低い信頼限界とそれ
ぞれのポテンシャルカットオフレベルの間の交差点を求
めることにより決定することができる。
グ操作を、好ましいカットオフレベルの指標（即ち、好
ましい蛍光シグナルカットオフ）をより正確に推測する
ために行う。特に、それぞれの「データ」カーブを、個
々の校正用及びテストサンプルの測定された蛍光シグナ
ルとそれに対する対応した蛍光シグナルが測定された時
間インタベール中の時間ポイントの離散点の「グラフ」
とフィットすることが好ましい。ここに、非パラメトリ
ックカーブ(non-parametric curve)の平滑化操作は、共
通のベースラインに対して離散した点を正規化した後に
実行され得る。各「平滑化された」データカーブについ
てより低い信頼限界カーブを求めることにより、好まし
い指標カットオフレベルの精度をさらに改良することも
できる。このより低い信頼限界カーブは非パラメトリッ
クカーブの平滑化操作を用いることにより平滑化するこ
とができる。上述した時間インターバル中の時間ポイン
トの各セットは、各平滑化したより低い信頼限界とそれ
ぞれのポテンシャルカットオフレベルの間の交差点を求
めることにより決定することができる。
【００２９】上述のように、もっとも低い標準偏差のフ
ィットに対応する時間ポイントのセットは、好ましいカ
ットオフレベルを正確に求めること、そして、好ましい
カットオフレベルをベースにしたテストサンプル中の核
酸の開始量を求めることに用いられる。しかしながら、
別タイプの定量分析によれば、既知の核酸配列の開始量
を含有しているコントロールサンプルを用いて、好まし
いカットオフレベルの検出を容易にすることもできる。
特に、それぞれの回帰ラインを、校正用サンプルに一致
する時間インターバル内の時間ポイントの各セットにフ
ィットさせた後に、平均予想誤差（average predictive
error(APE)）を、各回帰ラインとコントロールサンプ
ルに対応する時間ポイントのセットとの間から求められ
得る。そして、平均予想誤差が最小である関連する回帰
ラインに対応するポテンシャルカットオフレベルを、テ
ストサンプル内の核酸の開始濃度を求めるに用いる。
ィットに対応する時間ポイントのセットは、好ましいカ
ットオフレベルを正確に求めること、そして、好ましい
カットオフレベルをベースにしたテストサンプル中の核
酸の開始量を求めることに用いられる。しかしながら、
別タイプの定量分析によれば、既知の核酸配列の開始量
を含有しているコントロールサンプルを用いて、好まし
いカットオフレベルの検出を容易にすることもできる。
特に、それぞれの回帰ラインを、校正用サンプルに一致
する時間インターバル内の時間ポイントの各セットにフ
ィットさせた後に、平均予想誤差（average predictive
error(APE)）を、各回帰ラインとコントロールサンプ
ルに対応する時間ポイントのセットとの間から求められ
得る。そして、平均予想誤差が最小である関連する回帰
ラインに対応するポテンシャルカットオフレベルを、テ
ストサンプル内の核酸の開始濃度を求めるに用いる。
【００３０】上の方法の記載から明らかであるように、
特に容器が標準の９６ウエルのマイクロウエルプレート
の場合などには、試薬製剤と容器は一のキットに組み合
わせるのに適している。このようなキットは対応する第
１と第２の容器を含む。その第１の容器には乾燥された
第１の試薬製剤を含む。また、第２の試薬は乾燥された
形態で第２の容器に含まれるか、キットに追加された別
の入れ物に液体製剤として含まれるかのいずれかの態様
で包含される。
特に容器が標準の９６ウエルのマイクロウエルプレート
の場合などには、試薬製剤と容器は一のキットに組み合
わせるのに適している。このようなキットは対応する第
１と第２の容器を含む。その第１の容器には乾燥された
第１の試薬製剤を含む。また、第２の試薬は乾燥された
形態で第２の容器に含まれるか、キットに追加された別
の入れ物に液体製剤として含まれるかのいずれかの態様
で包含される。
【００３１】乾燥した第１の試薬製剤は個々の第１の容
器の内壁に一または別々のスポットとしてくっ付けられ
る。乾燥した第２の試薬製剤は第１の容器に対応した第
２の容器の内壁に一または別々のスポットとしてくっ付
けられる。液体サンプルを各第１の容器の中に（ピペッ
トを用いて）添加することができる。同様に、サンプル
の添加により第１の試薬製剤の再水和した後に、これら
の二つの物質の混合物を対応する第２の容器に添加する
ことができる。下文で詳細に記載するように、第１のサ
ンプル容器に添加された液体生物試料は、サンプル容器
内の乾燥した第１の試薬製剤スポットに接触してそれを
溶解する。
器の内壁に一または別々のスポットとしてくっ付けられ
る。乾燥した第２の試薬製剤は第１の容器に対応した第
２の容器の内壁に一または別々のスポットとしてくっ付
けられる。液体サンプルを各第１の容器の中に（ピペッ
トを用いて）添加することができる。同様に、サンプル
の添加により第１の試薬製剤の再水和した後に、これら
の二つの物質の混合物を対応する第２の容器に添加する
ことができる。下文で詳細に記載するように、第１のサ
ンプル容器に添加された液体生物試料は、サンプル容器
内の乾燥した第１の試薬製剤スポットに接触してそれを
溶解する。
【００３２】第２の容器に第１の試薬製剤とサンプルの
混合物を添加した後に第２容器を密封するために、切片
（ストリップ）といった密封手段が提供される。特に、
密封手段の下面には感圧接着剤を付着させておくことが
できる。その一態様として、接着テープと同様にして柔
軟なシーリングストリップ（sealing strip）を貼り付
けて、第２の容器を永久に密封することができる。
混合物を添加した後に第２容器を密封するために、切片
（ストリップ）といった密封手段が提供される。特に、
密封手段の下面には感圧接着剤を付着させておくことが
できる。その一態様として、接着テープと同様にして柔
軟なシーリングストリップ（sealing strip）を貼り付
けて、第２の容器を永久に密封することができる。
【００３３】シーリングストリップを用いた第２容器の
密封法はいくつかの利点がある。第一の利点は、第２容
器から核酸のアンプリコンのリリースを防ぎ、またそれ
によって実験室環境の汚染をも防げることにある。第２
に、均質核酸増幅反応とリアルタイム蛍光検出アッセイ
において、第２容器から液体混合物の蒸発を防げること
にある。しかしながら、一般的なマイクロウエルプレー
トのウエル内の混合物の量は、カード（例えば、おおよ
そ300μＭ容量のウエルに対して20μＭ容量のカードサ
ンプルセル）のようなほかに知られた装置に比較すると
かなり大きく、マイクロウエルからの蒸発による損失は
カード装置に比べてそれほど重要な関心点ではない。
密封法はいくつかの利点がある。第一の利点は、第２容
器から核酸のアンプリコンのリリースを防ぎ、またそれ
によって実験室環境の汚染をも防げることにある。第２
に、均質核酸増幅反応とリアルタイム蛍光検出アッセイ
において、第２容器から液体混合物の蒸発を防げること
にある。しかしながら、一般的なマイクロウエルプレー
トのウエル内の混合物の量は、カード（例えば、おおよ
そ300μＭ容量のウエルに対して20μＭ容量のカードサ
ンプルセル）のようなほかに知られた装置に比較すると
かなり大きく、マイクロウエルからの蒸発による損失は
カード装置に比べてそれほど重要な関心点ではない。
【００３４】一般に、本願発明のキットと方法に使用さ
れる多様な液体生物試料は、異なる患者からの尿サンプ
ルや血液サンプル、あるいはその他の体液サンプルから
構成される。また、これらの試料には、均質核酸増幅反
応とリアルタイム蛍光検出アッセイにより、同じの病原
体に関する試験が行われる。しかしながら、一又は複数
の第１の容器に異なる第１の試薬製剤を入れて、同一患
者から得られる１以上の液体生物サンプルに対してテス
トを行う実施態様も考えられる。
れる多様な液体生物試料は、異なる患者からの尿サンプ
ルや血液サンプル、あるいはその他の体液サンプルから
構成される。また、これらの試料には、均質核酸増幅反
応とリアルタイム蛍光検出アッセイにより、同じの病原
体に関する試験が行われる。しかしながら、一又は複数
の第１の容器に異なる第１の試薬製剤を入れて、同一患
者から得られる１以上の液体生物サンプルに対してテス
トを行う実施態様も考えられる。
【００３５】第２の容器内の蛍光シグナルの変化を検出
するために、マイクロプレート蛍光光度計あるいはマイ
クロプレートリーダーのような、測定に適したいずれの
市販の蛍光測定装置も用いることができる。また、特殊
な装置を設計することもできる。均質核酸増幅反応とリ
アルタイム蛍光検出アッセイの温度要求に依存するの
で、通常ヒートブロックのような加熱手段を、第１のサ
ンプル容器及び／又は第２の容器に用いることができ
る。
するために、マイクロプレート蛍光光度計あるいはマイ
クロプレートリーダーのような、測定に適したいずれの
市販の蛍光測定装置も用いることができる。また、特殊
な装置を設計することもできる。均質核酸増幅反応とリ
アルタイム蛍光検出アッセイの温度要求に依存するの
で、通常ヒートブロックのような加熱手段を、第１のサ
ンプル容器及び／又は第２の容器に用いることができ
る。
【００３６】蛍光偏光（fluorescence polarization(F
P)）をベースとするアッセイにおいては、FP値の変化を
検出する。蛍光偏光アッセイにおいて、与えられた光の
波長の偏光された励起ビームは蛍光標識されたオリゴヌ
クレオチドの結合パートナーを励起するために使用され
る。与えられた波長で励起したこれらの結合パートナー
からの蛍光発光の強度は励起偏光に平行な偏光面および
励起偏光に垂直な偏光面でも測定される。蛍光標識され
たオリゴヌクレオチドの結合パートナーが核酸アンプリ
コンへハイブリダイズした場合、励起面と平行な面の蛍
光発光の強度が増加する。一般的には、平行および垂直
の両方の強度が測定される。全強度の変化は、次式： Ｐ＝（ＩPARA−ＩPER）／（ＩPARA＋ＩPER） 式中： ＩPARA＝励起偏光の面に対して平行に偏光した面での蛍
光強度 ＩPER＝励起偏光の面に対して垂直に偏光した面での蛍
光強度 を応用することにより補償される。この式から偏光比
（Ｐ）と称される次元のない量が得られる。
P)）をベースとするアッセイにおいては、FP値の変化を
検出する。蛍光偏光アッセイにおいて、与えられた光の
波長の偏光された励起ビームは蛍光標識されたオリゴヌ
クレオチドの結合パートナーを励起するために使用され
る。与えられた波長で励起したこれらの結合パートナー
からの蛍光発光の強度は励起偏光に平行な偏光面および
励起偏光に垂直な偏光面でも測定される。蛍光標識され
たオリゴヌクレオチドの結合パートナーが核酸アンプリ
コンへハイブリダイズした場合、励起面と平行な面の蛍
光発光の強度が増加する。一般的には、平行および垂直
の両方の強度が測定される。全強度の変化は、次式： Ｐ＝（ＩPARA−ＩPER）／（ＩPARA＋ＩPER） 式中： ＩPARA＝励起偏光の面に対して平行に偏光した面での蛍
光強度 ＩPER＝励起偏光の面に対して垂直に偏光した面での蛍
光強度 を応用することにより補償される。この式から偏光比
（Ｐ）と称される次元のない量が得られる。
【００３７】励起偏光と平行な面の偏光強度がハイブリ
ダイゼーションの増加で増加する偏光強度であるので、
励起偏光に対して平行な面での偏光の強度を時間に関し
て測定すると時間に関するハイブリダイゼーションの増
加が示されるであろう。これは蛍光偏光の測定に対する
動力学的または動的アプローチであり、蛍光エネルギー
転移と光吸収アッセイでの使用にも適している。そのよ
うな動力学的または動的アプローチを用いることによ
り、各々のサンプルはそれ自体に対して測定され、従っ
て相対的な測定であるので絶対強度についての補償は幾
分重要でなくなる。よって蛍光偏光アッセイの場合、励
起偏光の面に平行な偏光面でのみ蛍光強度を測定するこ
とが必要になる。
ダイゼーションの増加で増加する偏光強度であるので、
励起偏光に対して平行な面での偏光の強度を時間に関し
て測定すると時間に関するハイブリダイゼーションの増
加が示されるであろう。これは蛍光偏光の測定に対する
動力学的または動的アプローチであり、蛍光エネルギー
転移と光吸収アッセイでの使用にも適している。そのよ
うな動力学的または動的アプローチを用いることによ
り、各々のサンプルはそれ自体に対して測定され、従っ
て相対的な測定であるので絶対強度についての補償は幾
分重要でなくなる。よって蛍光偏光アッセイの場合、励
起偏光の面に平行な偏光面でのみ蛍光強度を測定するこ
とが必要になる。
【００３８】下記する実施例と実施形態は、例の形で本
願発明の説明を提供する目的であり、如何なる方法であ
れ本発明を制約することは考えていない。当業者が上記
のものに施した種々の改変あるいは変更も、本願発明に
よるものと考えられ、本出願の特許請求の範囲に係る発
明の技術思想の範囲内に含まれるものである。
願発明の説明を提供する目的であり、如何なる方法であ
れ本発明を制約することは考えていない。当業者が上記
のものに施した種々の改変あるいは変更も、本願発明に
よるものと考えられ、本出願の特許請求の範囲に係る発
明の技術思想の範囲内に含まれるものである。
【００３９】
【実施例】以下の例は、ここに記載した本願発明の代表
的な実施態様に過ぎない。当分野の当業者にとって、本
発明に記載した発明をもとに多くの変更と改良が可能で
あることは明白なものであるが、それは本発明に係る発
明の範囲内から逸脱するものではないであろう。
的な実施態様に過ぎない。当分野の当業者にとって、本
発明に記載した発明をもとに多くの変更と改良が可能で
あることは明白なものであるが、それは本発明に係る発
明の範囲内から逸脱するものではないであろう。
【００４０】［例１］本発明のキットの第１の容器のみを使用して、本発明の
第１のステップに従って、乾燥した蛍光検出プローブの
再水和と標的分析物の増幅を行う比較のための例 これは、蛍光検出アッセイを実施するにあたり用いられ
た既存のキットと方法に関連して問題となる一実例とし
て列挙したものである。この例に使用するキットは、現
在同時係属している1997年6月17日に出願の米国特許出
願第08/878,096号（「DNAカード」）に記載されたよう
な、均質蛍光偏光アッセイ用の器具を含んでいるキット
である。この例の方法は当該特許出願を参照して実行し
た。要するに、上記従来の技術のセクションにおいて記
載した通り、このDNAカードは、核酸増幅反応と核酸プ
ローブを利用したアッセイの両方に必要とする全ての試
薬を乾燥した状態で包含し、そのような全ての試薬を実
質的に同時に液状生物製剤サンプルによる再水和する装
置である。
第１のステップに従って、乾燥した蛍光検出プローブの
再水和と標的分析物の増幅を行う比較のための例 これは、蛍光検出アッセイを実施するにあたり用いられ
た既存のキットと方法に関連して問題となる一実例とし
て列挙したものである。この例に使用するキットは、現
在同時係属している1997年6月17日に出願の米国特許出
願第08/878,096号（「DNAカード」）に記載されたよう
な、均質蛍光偏光アッセイ用の器具を含んでいるキット
である。この例の方法は当該特許出願を参照して実行し
た。要するに、上記従来の技術のセクションにおいて記
載した通り、このDNAカードは、核酸増幅反応と核酸プ
ローブを利用したアッセイの両方に必要とする全ての試
薬を乾燥した状態で包含し、そのような全ての試薬を実
質的に同時に液状生物製剤サンプルによる再水和する装
置である。
【００４１】［材料と方法］この例では、HIVが標的分
析物であり、均質リアルタイム蛍光検出アッセイにおい
て、ストランド置換増幅法（Strand Displacement Am
plification（”SDA”））を使用した。HIVのギャグ（g
ag）遺伝子の配列の番号付けは、Gurgo C.、Guo H.G.、
Franchini G.、Aldovini A.、Collalti E.、Farrell
K.、 Wong-Staal G.、Gallo R.C.とReitz M.S. Jr.(198
8) Virology 164, 53l-536の記載の忠実にしたがったも
のである。そのHIVのGAG-1遺伝子の一部はこの例の標的
として使用するために、pGEM11Zf(+)ベクターを用いて
クローニングをした。このクローニングされたGAG配列
は、Gurgoらの記載通りで、HIV MNと等しく、1222-1839
番の位置と一致した。
析物であり、均質リアルタイム蛍光検出アッセイにおい
て、ストランド置換増幅法（Strand Displacement Am
plification（”SDA”））を使用した。HIVのギャグ（g
ag）遺伝子の配列の番号付けは、Gurgo C.、Guo H.G.、
Franchini G.、Aldovini A.、Collalti E.、Farrell
K.、 Wong-Staal G.、Gallo R.C.とReitz M.S. Jr.(198
8) Virology 164, 53l-536の記載の忠実にしたがったも
のである。そのHIVのGAG-1遺伝子の一部はこの例の標的
として使用するために、pGEM11Zf(+)ベクターを用いて
クローニングをした。このクローニングされたGAG配列
は、Gurgoらの記載通りで、HIV MNと等しく、1222-1839
番の位置と一致した。
【００４２】バンパープライマーであるB1、5'dTACATCA
GGCCATATCACC（配列番号１）が、gagの1223-1241番位と
対応する。バンパープライマーであるB２、5'dGCAGCTTC
CTCATTGAT（配列番号２）が、1424-1408番位と対応す
る。増幅プライマーS１、5'dACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG
TGGTAAAAGTAGTAGAAG（配列番号３）と S2、5'dCGATTCCG
CTCCAGACTTCTCGGGGTGTTTAGCATGGTGTT（配列番号４）
が、gagの1260-1276番位と、1368-1348番位とそれぞれ
対応する。
GGCCATATCACC（配列番号１）が、gagの1223-1241番位と
対応する。バンパープライマーであるB２、5'dGCAGCTTC
CTCATTGAT（配列番号２）が、1424-1408番位と対応す
る。増幅プライマーS１、5'dACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG
TGGTAAAAGTAGTAGAAG（配列番号３）と S2、5'dCGATTCCG
CTCCAGACTTCTCGGGGTGTTTAGCATGGTGTT（配列番号４）
が、gagの1260-1276番位と、1368-1348番位とそれぞれ
対応する。
【００４３】最終のHIVのSDA反応の条件は以下の通りで
ある。最終の反応液50uL毎に、35mMのKP04(pH7.6)、0.1
mg/mLのアセチル化したウシ属の血清アルブミン、1μM
のプライマーS1、0.75μMのプライマーS2、何れとも0.0
5μMのプライマーB1とB2、400nMのFAM-ROX検出プローブ
(5'-FAM-dGTCACTCGAGAT(ROX)TCAGCATTATCAGAAGGAGCCAC
CCCAC-3'(配列番号５))、1.4mMのdCTPαS、0.5mMのdUT
P、何れとも0.2mMのdATPとdGTP、7.5mMの酢酸マグネシ
ウム、5%のDMSO、8%のグリセロール,500ngのヒト胎盤の
DNA、320ユニットのBsoB1、そして20ユニットのBSTを含
む。ドライダウン（Dry-Down）実施例では、十分なトレ
ハロースが加えられ、乾燥後に硬いガラス状のフィルム
を作り出した。使用したトレハロースの量は最終的なSD
A液の1％（w/v）であった。
ある。最終の反応液50uL毎に、35mMのKP04(pH7.6)、0.1
mg/mLのアセチル化したウシ属の血清アルブミン、1μM
のプライマーS1、0.75μMのプライマーS2、何れとも0.0
5μMのプライマーB1とB2、400nMのFAM-ROX検出プローブ
(5'-FAM-dGTCACTCGAGAT(ROX)TCAGCATTATCAGAAGGAGCCAC
CCCAC-3'(配列番号５))、1.4mMのdCTPαS、0.5mMのdUT
P、何れとも0.2mMのdATPとdGTP、7.5mMの酢酸マグネシ
ウム、5%のDMSO、8%のグリセロール,500ngのヒト胎盤の
DNA、320ユニットのBsoB1、そして20ユニットのBSTを含
む。ドライダウン（Dry-Down）実施例では、十分なトレ
ハロースが加えられ、乾燥後に硬いガラス状のフィルム
を作り出した。使用したトレハロースの量は最終的なSD
A液の1％（w/v）であった。
【００４４】［装置と計測］DNAカードはセルロースブ
チレートアセテートシートから打抜き型でカットされ、
背面の接着剤で組み立てられる。そして、二枚のシート
は乾燥した試薬を包含する窪みをもつように成形した。
そこに、第三枚目のシートを加えて64個のサンプル仕切
りを有するDNAカードを完成した。各サンプルの仕切り
は20μＭの容量を有し、サンプルの添加ポートを通して
仕切りにアクセスすることができる。第２のポートは排
出口として提供されている。サンプルを加えた後に、粘
着性を背面に有するシーリングストリップ(sealer stri
p)を、両方の開口に貼って混合物の蒸発とSDA反応への
汚染物の混入を防止した。蛍光測定はDNAカードの透明
なシートを通して行われる。
チレートアセテートシートから打抜き型でカットされ、
背面の接着剤で組み立てられる。そして、二枚のシート
は乾燥した試薬を包含する窪みをもつように成形した。
そこに、第三枚目のシートを加えて64個のサンプル仕切
りを有するDNAカードを完成した。各サンプルの仕切り
は20μＭの容量を有し、サンプルの添加ポートを通して
仕切りにアクセスすることができる。第２のポートは排
出口として提供されている。サンプルを加えた後に、粘
着性を背面に有するシーリングストリップ(sealer stri
p)を、両方の開口に貼って混合物の蒸発とSDA反応への
汚染物の混入を防止した。蛍光測定はDNAカードの透明
なシートを通して行われる。
【００４５】フルオロスカンマイクロウエル蛍光光度計
（Fluoroskan microwell fluorometer (Labsystems, Ro
chester, NY)）は、DNAカードにおけるリアルタイムのS
DA反応にあわせて改造された。それは、ステージの高さ
の調整と、50から60℃の間の任意のセットポイントにお
いて+/-0.3℃で温度コントロールできるヒートステージ
の導入を含む改造である。ファイバ・オプティクッスの
束は、垂直方向から１５度オフセットしてDNAカードか
らの反射によるバックグランドを減らすようにした。バ
ンドパス干渉フィルタ（Bandpass interference filte
r）を用いて、励振(excitaion)（485nm）と放射光(emis
sion light)（535nm）を区別した。リアルタイムに64個
サンプルの仕切りに対する蛍光強度の測定を容易にする
めたに、GenesisTMのソフト(Labsystems, Rochester,N
Y)を改良した。1000nM以上の濃度まで線形性を維持しつ
つ、2倍のバックグランド蛍光における場合に、フルオ
レセインイソチオシアン酸塩の検出限度はおおよそ20nM
であった。一般的には、一回の測定時間は一秒で、ある
いはDNAカードの全64個のサンプルを一分間で読み取
る。
（Fluoroskan microwell fluorometer (Labsystems, Ro
chester, NY)）は、DNAカードにおけるリアルタイムのS
DA反応にあわせて改造された。それは、ステージの高さ
の調整と、50から60℃の間の任意のセットポイントにお
いて+/-0.3℃で温度コントロールできるヒートステージ
の導入を含む改造である。ファイバ・オプティクッスの
束は、垂直方向から１５度オフセットしてDNAカードか
らの反射によるバックグランドを減らすようにした。バ
ンドパス干渉フィルタ（Bandpass interference filte
r）を用いて、励振(excitaion)（485nm）と放射光(emis
sion light)（535nm）を区別した。リアルタイムに64個
サンプルの仕切りに対する蛍光強度の測定を容易にする
めたに、GenesisTMのソフト(Labsystems, Rochester,N
Y)を改良した。1000nM以上の濃度まで線形性を維持しつ
つ、2倍のバックグランド蛍光における場合に、フルオ
レセインイソチオシアン酸塩の検出限度はおおよそ20nM
であった。一般的には、一回の測定時間は一秒で、ある
いはDNAカードの全64個のサンプルを一分間で読み取
る。
【００４６】［手順］上記したSDA用試薬は、KPi、DMSO
とグリセロールを除いた５x混合物に添加された。ドラ
イダウン混合物におけるKPiバッファーの濃度は37.5ｍM
であった。一定の分量（4μＭ）の混合物を個々のDNAカ
ードサンプル仕切りに添加して、ガラス状のフィルムと
なるように単一のスポットへと乾燥した。31ｍM、KPi、
5.8％グリセロールと５％ DMSOに標的のHIVを調製し
た。標的のアリコート（aliquots）は個々のサンプル仕
切りに加え、その仕切りを密封して、３０分間の蛍光モ
ニター(485(励起)/535(放射))を行った。
とグリセロールを除いた５x混合物に添加された。ドラ
イダウン混合物におけるKPiバッファーの濃度は37.5ｍM
であった。一定の分量（4μＭ）の混合物を個々のDNAカ
ードサンプル仕切りに添加して、ガラス状のフィルムと
なるように単一のスポットへと乾燥した。31ｍM、KPi、
5.8％グリセロールと５％ DMSOに標的のHIVを調製し
た。標的のアリコート（aliquots）は個々のサンプル仕
切りに加え、その仕切りを密封して、３０分間の蛍光モ
ニター(485(励起)/535(放射))を行った。
【００４７】［実験結果と結論］図１のように、最初の
5分間の増幅反応において、そのシグナル変動は不安定
かつネガティブである結果を示した。そのような不安定
なシグナルの変動は数値的なアルゴリズムによって補正
することができない。更に、このような不安定なシグナ
ル変動は、このようなアッセイで得られた診断上の結果
が信頼できないことを示す。
5分間の増幅反応において、そのシグナル変動は不安定
かつネガティブである結果を示した。そのような不安定
なシグナルの変動は数値的なアルゴリズムによって補正
することができない。更に、このような不安定なシグナ
ル変動は、このようなアッセイで得られた診断上の結果
が信頼できないことを示す。
【００４８】［例２］バックグランドの増幅反応が実質に除去された更なる比
較のための例 この例は、更に蛍光検出アッセイを実施するために用い
られた既存のキットと方法に関連した問題となる一実例
として列挙したものである。その例に使用するキットは
例１のものと同様である。よって、その方法、材料、装
置と計測も例１に使用されたものと同様である。例１に
おいて、不安定なシグナル変動とそれによって生じた信
頼できない測定結果の原因を探るために、DNAカードの
同じ仕切りおいて、一つのスポットではなく、SDA試薬
を二つのスポットに分けて乾燥することにより、バック
グランドの増幅反応は実質上に排除されたこの例は行わ
れた。
較のための例 この例は、更に蛍光検出アッセイを実施するために用い
られた既存のキットと方法に関連した問題となる一実例
として列挙したものである。その例に使用するキットは
例１のものと同様である。よって、その方法、材料、装
置と計測も例１に使用されたものと同様である。例１に
おいて、不安定なシグナル変動とそれによって生じた信
頼できない測定結果の原因を探るために、DNAカードの
同じ仕切りおいて、一つのスポットではなく、SDA試薬
を二つのスポットに分けて乾燥することにより、バック
グランドの増幅反応は実質上に排除されたこの例は行わ
れた。
【００４９】具体的には、dUtpを除いた増幅に必要な全
ての試薬を含んだ第１の乾燥スポット（３μL）に加
え、除かれたdUtpを含む第２の乾燥スポットを追加する
以外は、全て例１と同様な手順で行った。トレハロース
の最終に濃度はそのまま維持されたが、個々のスポット
の量と比例したものとした。再水和バッファーも例１と
一致するように調整された。
ての試薬を含んだ第１の乾燥スポット（３μL）に加
え、除かれたdUtpを含む第２の乾燥スポットを追加する
以外は、全て例１と同様な手順で行った。トレハロース
の最終に濃度はそのまま維持されたが、個々のスポット
の量と比例したものとした。再水和バッファーも例１と
一致するように調整された。
【００５０】［結果と結論］図２のように、最初の１０
分間の増幅反応において、その蛍光シグナルはポジティ
ブ又はネガティブのいずれもが大きく変動する結果を示
した。例１と同様に、このような不安定なシグナルの変
動は数値的なアルゴリズムに従って補正することができ
ない。更に、このような不安定なシグナル変動は、この
ようなアッセイで得られた診断上の結果が信頼できない
ことを示す。この結果から、このような不安定な蛍光シ
グナルの作り出したのは、増幅反応過程における蛍光プ
ローブの再水和が原因であろうということを示唆してい
る。
分間の増幅反応において、その蛍光シグナルはポジティ
ブ又はネガティブのいずれもが大きく変動する結果を示
した。例１と同様に、このような不安定なシグナルの変
動は数値的なアルゴリズムに従って補正することができ
ない。更に、このような不安定なシグナル変動は、この
ようなアッセイで得られた診断上の結果が信頼できない
ことを示す。この結果から、このような不安定な蛍光シ
グナルの作り出したのは、増幅反応過程における蛍光プ
ローブの再水和が原因であろうということを示唆してい
る。
【００５１】［例３］標的分析物（HIV）の均質リアルタイム蛍光検出と増幅
のための方法において蛍光シグナルの安定化の例 例１と２に見られるように不安定なシグナル変化を生じ
た原因が、標的分析物の増幅反応における蛍光プローブ
の再水和である仮説を立証する目的で、SDA酵素（即
ち、BsoB1とBst）を、5%(w/v)のトレハロースと共に、3
7.5mMのMg(OAc)2、0.25mg/mLのBSA、7.5mMのKPiの存在
下に、DNAカードの各サンプル仕切りに４μＭずつの混
合物に分配して乾燥した以外は、上記例１にようにして
実施を行った。SDA試薬の残りは標的分析物とサンプル
と共に溶液状態でサンプル仕切りに加えられた。
のための方法において蛍光シグナルの安定化の例 例１と２に見られるように不安定なシグナル変化を生じ
た原因が、標的分析物の増幅反応における蛍光プローブ
の再水和である仮説を立証する目的で、SDA酵素（即
ち、BsoB1とBst）を、5%(w/v)のトレハロースと共に、3
7.5mMのMg(OAc)2、0.25mg/mLのBSA、7.5mMのKPiの存在
下に、DNAカードの各サンプル仕切りに４μＭずつの混
合物に分配して乾燥した以外は、上記例１にようにして
実施を行った。SDA試薬の残りは標的分析物とサンプル
と共に溶液状態でサンプル仕切りに加えられた。
【００５２】［結果と結論］図３のように、最初の１０
分間の増幅反応における蛍光シグナルはより安定である
結果を示した。このように、蛍光プローブの再水和と標
的の増幅は同時に行われないときに、より信頼できる診
断アッセイ結果が得ることができる。
分間の増幅反応における蛍光シグナルはより安定である
結果を示した。このように、蛍光プローブの再水和と標
的の増幅は同時に行われないときに、より信頼できる診
断アッセイ結果が得ることができる。
【００５３】［例４］標的分析物（Chlamydia）の均質リアルタイム蛍光検出
と増幅のための方法において蛍光シグナルの安定化の例 例３を確認するために、クラミジア（Chlamydia）核酸
配列の増幅と均質リアルタイム蛍光検出につき同様にし
て実験を行った。 ［材料と方法］この例において、クラミジアの原株（E
serovar）はノースカロライナ大学から入手して、標的
ストックとして使用する以前に95℃で５分間で溶解し
た。この標的配列は保存されたクラミジアの潜在プラス
ミドから得られる。
と増幅のための方法において蛍光シグナルの安定化の例 例３を確認するために、クラミジア（Chlamydia）核酸
配列の増幅と均質リアルタイム蛍光検出につき同様にし
て実験を行った。 ［材料と方法］この例において、クラミジアの原株（E
serovar）はノースカロライナ大学から入手して、標的
ストックとして使用する以前に95℃で５分間で溶解し
た。この標的配列は保存されたクラミジアの潜在プラス
ミドから得られる。
【００５４】SDA反応において、それぞれ、750nMと188n
Mの増幅用プライマーS1.1、5'-dACCGCATCGAATCGATGTCTC
GGGTAGAAAATCGCATGCAAGATA（配列番号６）とS2.1、5'-d
CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGCTGCCTCAGAATATACTCAG（配
列番号７）は使用された。バンパープライマーB1c 5'-
dTAAACATGAAAACTCGTTCCG（配列番号８）とB2c 5'-dTTT
TATGATGAGAACACTTAAACTCA（配列番号９）は、同じく75n
Mが使用された。最終的なSDAの条件は、40mMのKPi(pH
7.5)、6.5mMのMg(OAc)2、1.4mM のdCTPαS、それぞれ0.
2mMのdATPと、dTTPとdGTP、3%(v/v)のDMSO、8.2%(v/v)
グリセロール、50ng/μLのヒトの胎盤DNA、0.5U/μLのB
ST、4.5U/μLのAval、l%(w/v)のトレハロース、50μg/m
LのBSAからなる。
Mの増幅用プライマーS1.1、5'-dACCGCATCGAATCGATGTCTC
GGGTAGAAAATCGCATGCAAGATA（配列番号６）とS2.1、5'-d
CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGCTGCCTCAGAATATACTCAG（配
列番号７）は使用された。バンパープライマーB1c 5'-
dTAAACATGAAAACTCGTTCCG（配列番号８）とB2c 5'-dTTT
TATGATGAGAACACTTAAACTCA（配列番号９）は、同じく75n
Mが使用された。最終的なSDAの条件は、40mMのKPi(pH
7.5)、6.5mMのMg(OAc)2、1.4mM のdCTPαS、それぞれ0.
2mMのdATPと、dTTPとdGTP、3%(v/v)のDMSO、8.2%(v/v)
グリセロール、50ng/μLのヒトの胎盤DNA、0.5U/μLのB
ST、4.5U/μLのAval、l%(w/v)のトレハロース、50μg/m
LのBSAからなる。
【００５５】［装置と測定］20mMのKPi(pH 7.5)、10ng/
μLのヒトの胎盤DNA、2.5U/μLのBST、22.5U/μLのAva
l、2mMのMg(OAc)2、5%(w/v)のトレハロース、0.02mg/mL
のBSAを含んでなる、ドライダウン混合物のアリコート
（4μL）は37℃コントロールされた低湿度の条件下で、
DNAカードのサンプル仕切りにガラス状フィルムに乾燥
された以外は、例１に使用された装置と測定とまったく
同様なものを使用した。
μLのヒトの胎盤DNA、2.5U/μLのBST、22.5U/μLのAva
l、2mMのMg(OAc)2、5%(w/v)のトレハロース、0.02mg/mL
のBSAを含んでなる、ドライダウン混合物のアリコート
（4μL）は37℃コントロールされた低湿度の条件下で、
DNAカードのサンプル仕切りにガラス状フィルムに乾燥
された以外は、例１に使用された装置と測定とまったく
同様なものを使用した。
【００５６】［手順］クラミジア標的、36mMのKPi、1.4
mMのdCTPαS、それぞれ0.2mMのdATPと、dTTPとdGTP、3%
(v/v)のDMSO、8.2%(v/v)のグリセロール、400mMのFAM-R
ox検出用プローブ（5'(FAM)dTAGCACCCGAGTGCT(ROX)AGAG
TCTTCAAATATCAGAGCTTTA CCTAACAA（配列番号１０））、
上記の濃度でのプライマー（S1.1、S1.2）とバンパー
（B1c、B2c）、48ng/μLのヒトの胎盤DNA、6.1mMのMg(O
Ac)2、46ug/mLのBSAを含んでなる再水和混合物は、97℃
2分間で加熱し変性され、55℃に予熱されたDNAカードに
加えられた。シーリングストリップ(sealer strip)が利
用され、蛍光測定装置により485(励起)/535(放射)nmに
おいて蛍光モニターされた。
mMのdCTPαS、それぞれ0.2mMのdATPと、dTTPとdGTP、3%
(v/v)のDMSO、8.2%(v/v)のグリセロール、400mMのFAM-R
ox検出用プローブ（5'(FAM)dTAGCACCCGAGTGCT(ROX)AGAG
TCTTCAAATATCAGAGCTTTA CCTAACAA（配列番号１０））、
上記の濃度でのプライマー（S1.1、S1.2）とバンパー
（B1c、B2c）、48ng/μLのヒトの胎盤DNA、6.1mMのMg(O
Ac)2、46ug/mLのBSAを含んでなる再水和混合物は、97℃
2分間で加熱し変性され、55℃に予熱されたDNAカードに
加えられた。シーリングストリップ(sealer strip)が利
用され、蛍光測定装置により485(励起)/535(放射)nmに
おいて蛍光モニターされた。
【００５７】［結果と結論］図４のように、蛍光シグナ
ルの結果からの考察は、増幅反応による特異な蛍光変化
が小さいなものであることが明らかであることを示し
た。このケースでは、蛍光変化量は標的の添加に比例し
た。このように、このような変化ならば、数値的なアル
ゴリズムに従って補正することができる。
ルの結果からの考察は、増幅反応による特異な蛍光変化
が小さいなものであることが明らかであることを示し
た。このケースでは、蛍光変化量は標的の添加に比例し
た。このように、このような変化ならば、数値的なアル
ゴリズムに従って補正することができる。
【００５８】［例５］ナイセリアゴノルホアーゼの（Neisseria gonorrhoeas
e）標的核酸配列の均質リアルタイム蛍光検出と増幅の
ための方法の現実的なキットの応用の例 上記例３と４の結果は、蛍光プローブの再水和を増幅反
応と分離して、増幅反応を優先に行う、標的核酸配列の
均質リアルタイム蛍光検出と増幅のための方法の有用性
を示した。しかし、この方法は、技術者によって最適と
考えられるものではなかった。
e）標的核酸配列の均質リアルタイム蛍光検出と増幅の
ための方法の現実的なキットの応用の例 上記例３と４の結果は、蛍光プローブの再水和を増幅反
応と分離して、増幅反応を優先に行う、標的核酸配列の
均質リアルタイム蛍光検出と増幅のための方法の有用性
を示した。しかし、この方法は、技術者によって最適と
考えられるものではなかった。
【００５９】従って、第１の容器に、このような反応の
ための、たとえば、乾燥した形態の蛍光プローブのよう
な増幅プライマーのような特定な試薬を封じ込めるが、
増幅反応の開始を引き起こすような試薬や条件を除外し
たキットが開発された。よって、この蛍光プローブはサ
ンプルの添加より再水和されるが、増幅反応は反応を引
き起こすような試薬や条件と再水和したプローブの混合
物を添加するまでには起きない。
ための、たとえば、乾燥した形態の蛍光プローブのよう
な増幅プライマーのような特定な試薬を封じ込めるが、
増幅反応の開始を引き起こすような試薬や条件を除外し
たキットが開発された。よって、この蛍光プローブはサ
ンプルの添加より再水和されるが、増幅反応は反応を引
き起こすような試薬や条件と再水和したプローブの混合
物を添加するまでには起きない。
【００６０】即ち、二つ対応するマイクロタイタープレ
ートを含むキットが開発された。第１のマイクロタイタ
ープレートのウエルにはプライマーと蛍光プローブを含
有し、第２のマイクロタイタープレートのウエルには増
幅反応のための酵素を含有している。更なる特徴とし
て、ナイセリアゴノルホアーゼ核酸の均質リアルタイム
蛍光検出と増幅のためのキットと方法が以下のように開
発された。
ートを含むキットが開発された。第１のマイクロタイタ
ープレートのウエルにはプライマーと蛍光プローブを含
有し、第２のマイクロタイタープレートのウエルには増
幅反応のための酵素を含有している。更なる特徴とし
て、ナイセリアゴノルホアーゼ核酸の均質リアルタイム
蛍光検出と増幅のためのキットと方法が以下のように開
発された。
【００６１】［材料と方法］第１のマイクロタイタープ
レートのいずれのウエルには、以下の構成物質を含む乾
燥した単一なスポットを含有している。 ・pH 7.6の37.5 mM リン酸カリウム ・3.5% トレハロース ・O.19mg/ml アセチル化BSA ・0.675 mM DTT ・3.75 mM アセテートマグネシウム ・1.9 マイクロモル 第１の増幅プライマー GCIR-AL5.3
(5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAACAGCTTGAAGTTTT3') (配
列番号１１) ・1.9 マイクロモル 第２の増幅プライマー GCIR-AR5.l
(5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTCCTTGCAGTTAGGC3') (配
列番号１２) ・O.19 マイクロモル 第１のバンパープライマー GCIR-
BL5.1(5'CGCAAATCATCAAAG3') (配列番号１３) ・O.19 マイクロモル 第２のバンパープライマー GCIR-
BR5.1(5'TCAAGACGCTTCACG3') (配列番号１４) ・0.75 マイクロモル FamRox 検出プローブ GCIR5-FD 1
0(5'TAGCACCCGAGTGCTTTCTCCGTCTGCTCTTTTATCTTCTC3')
(配列番号１５) ・0.94 mM dUTP ・3600ng 未加工の透析したヒトの胎盤のDNA
レートのいずれのウエルには、以下の構成物質を含む乾
燥した単一なスポットを含有している。 ・pH 7.6の37.5 mM リン酸カリウム ・3.5% トレハロース ・O.19mg/ml アセチル化BSA ・0.675 mM DTT ・3.75 mM アセテートマグネシウム ・1.9 マイクロモル 第１の増幅プライマー GCIR-AL5.3
(5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAACAGCTTGAAGTTTT3') (配
列番号１１) ・1.9 マイクロモル 第２の増幅プライマー GCIR-AR5.l
(5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTCCTTGCAGTTAGGC3') (配
列番号１２) ・O.19 マイクロモル 第１のバンパープライマー GCIR-
BL5.1(5'CGCAAATCATCAAAG3') (配列番号１３) ・O.19 マイクロモル 第２のバンパープライマー GCIR-
BR5.1(5'TCAAGACGCTTCACG3') (配列番号１４) ・0.75 マイクロモル FamRox 検出プローブ GCIR5-FD 1
0(5'TAGCACCCGAGTGCTTTCTCCGTCTGCTCTTTTATCTTCTC3')
(配列番号１５) ・0.94 mM dUTP ・3600ng 未加工の透析したヒトの胎盤のDNA
【００６２】第２のマイクロタイタープレートのいずれ
のウエルには、以下の構成物質を含む乾燥した単一なス
ポットを含有している。 ・pH 7.6の25 mM リン酸カリウム ・2.3% トレハロース ・O.125 mg/ml アセチル化BSA ・0.45 mM DTT ・10 mM アセテートマグネシウム ・320ユニットのBsoB1、 20ユニットのBstポリメラーゼ ・1.75 mM dCsTP ・0.25 mM dATP ・0.25 mM dGTP
のウエルには、以下の構成物質を含む乾燥した単一なス
ポットを含有している。 ・pH 7.6の25 mM リン酸カリウム ・2.3% トレハロース ・O.125 mg/ml アセチル化BSA ・0.45 mM DTT ・10 mM アセテートマグネシウム ・320ユニットのBsoB1、 20ユニットのBstポリメラーゼ ・1.75 mM dCsTP ・0.25 mM dATP ・0.25 mM dGTP
【００６３】そして、以下の手順に従って、実行され
た。プラスミドGC10を含んだサンプルのアリコート（〜
150μＭ）を、第１のマイクロタイタープレートの各ウ
エルに分け与えた。PUC18に挿入されたのはナイセリア
ゴノルホアーゼの遺伝子の一部800塩基対を含むGC10で
ある。第１のマイクロタイタープレートのウエルは密封
され、プレートは室温で約20分間放置された。そして、
第１のマイクロタイタープレートは開封され、75℃で10
分間保温され、それと同時に第２のマイクロタイタープ
レートは前もって52℃で10分間保温した。
た。プラスミドGC10を含んだサンプルのアリコート（〜
150μＭ）を、第１のマイクロタイタープレートの各ウ
エルに分け与えた。PUC18に挿入されたのはナイセリア
ゴノルホアーゼの遺伝子の一部800塩基対を含むGC10で
ある。第１のマイクロタイタープレートのウエルは密封
され、プレートは室温で約20分間放置された。そして、
第１のマイクロタイタープレートは開封され、75℃で10
分間保温され、それと同時に第２のマイクロタイタープ
レートは前もって52℃で10分間保温した。
【００６４】10分間のインキュベーション後、第１のマ
イクロタイタープレートの各ウエルから100μＭアリコ
ートは第２のマイクロタイタープレートの対応するウエ
ルに移し替えられた（ピペットにより）。この第２のマ
イクロタイタープレートは接着性のカバーで密封され、
現在係属中の1997年9月15日米国特許出願（Becton Dic
kinson Docket No.P-4067）に記載されているように
蛍光読取り機器に入れられた。ここではその特許出願の
全体を引用することにより本明細書の一部をなすものと
する。（その他の標準マイクロタイタープレート蛍光読
取り機器も同様に用いられ得る。） 第２のマイクロタイタープレートのウエルからの蛍光シ
グナルは60分間モニターされた。密封された第２のマイ
クロタイタープレートは密封されたバッグに処分され、
それは実験室環境の潜在的アンプリコン汚染に対する保
険である。
イクロタイタープレートの各ウエルから100μＭアリコ
ートは第２のマイクロタイタープレートの対応するウエ
ルに移し替えられた（ピペットにより）。この第２のマ
イクロタイタープレートは接着性のカバーで密封され、
現在係属中の1997年9月15日米国特許出願（Becton Dic
kinson Docket No.P-4067）に記載されているように
蛍光読取り機器に入れられた。ここではその特許出願の
全体を引用することにより本明細書の一部をなすものと
する。（その他の標準マイクロタイタープレート蛍光読
取り機器も同様に用いられ得る。） 第２のマイクロタイタープレートのウエルからの蛍光シ
グナルは60分間モニターされた。密封された第２のマイ
クロタイタープレートは密封されたバッグに処分され、
それは実験室環境の潜在的アンプリコン汚染に対する保
険である。
【００６５】［結果と結論］ウエルから得た蛍光シグナ
ルは時間と共に安定した増加を示し、さらに、そのシグ
ナルが補正のできない、例１と２のような不安定なしシ
グナル変動を示さなかった。
ルは時間と共に安定した増加を示し、さらに、そのシグ
ナルが補正のできない、例１と２のような不安定なしシ
グナル変動を示さなかった。
【００６６】［例６］クラミジアトラコーマ症の（Chalamydia trachomatis）
標的核酸配列の均質リアルタイム蛍光検出と増幅のため
の方法の現実的なキットの応用の例 例５のように、二つ対応するマイクロタイタープレート
を含むキットが開発された。第１のマイクロタイタープ
レートのウエルにはプライマーと蛍光プローブを含有
し、第２のマイクロタイタープレートのウエルには増幅
反応のための酵素を含有している。更なる特徴として、
クラミジアトラコーマ症の核酸の均質リアルタイム蛍光
検出と増幅のためのキットと方法が以下のように開発さ
れた。
標的核酸配列の均質リアルタイム蛍光検出と増幅のため
の方法の現実的なキットの応用の例 例５のように、二つ対応するマイクロタイタープレート
を含むキットが開発された。第１のマイクロタイタープ
レートのウエルにはプライマーと蛍光プローブを含有
し、第２のマイクロタイタープレートのウエルには増幅
反応のための酵素を含有している。更なる特徴として、
クラミジアトラコーマ症の核酸の均質リアルタイム蛍光
検出と増幅のためのキットと方法が以下のように開発さ
れた。
【００６７】［材料と方法］第１のマイクロタイタープ
レートのいずれのウエルには、以下の構成物質を含む乾
燥した単一なスポットを含有している。 ・pH 7.6の37.5 mM リン酸カリウム ・3.5% トレハロース ・O.19mg/mL アセチル化BSA ・0.675 mM DTT ・3.75 mM アセテートマグネシウム ・1.9 マイクロモル 第１の増幅プライマー GtpF8.AL1
(5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGACAAAATCAACACCTG3') (配
列番号１６) ・1.9 マイクロモル 第２の増幅プライマー GtpF8.AR1
(5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGGAGACTGTTAAAGATA3') (配
列番号１７) ・O.19 マイクロモル 第１のバンパープライマー GtpF
8.BL(5'CAGCAAATAATCCTTGG3') (配列番号１８) ・O.19 マイクロモル 第２のバンパープライマー GtpF
8.BR(5'CATTGGTTGATGAATTATT3') (配列番号１９) ・0.75 マイクロモル FamRox 検出プローブ GtpF8.FD1
(5'TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA3')
(配列番号２０) ・0.94 mM dUTP ・3600ng 未加工の透析したヒトの胎盤のDNA
レートのいずれのウエルには、以下の構成物質を含む乾
燥した単一なスポットを含有している。 ・pH 7.6の37.5 mM リン酸カリウム ・3.5% トレハロース ・O.19mg/mL アセチル化BSA ・0.675 mM DTT ・3.75 mM アセテートマグネシウム ・1.9 マイクロモル 第１の増幅プライマー GtpF8.AL1
(5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGACAAAATCAACACCTG3') (配
列番号１６) ・1.9 マイクロモル 第２の増幅プライマー GtpF8.AR1
(5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGGAGACTGTTAAAGATA3') (配
列番号１７) ・O.19 マイクロモル 第１のバンパープライマー GtpF
8.BL(5'CAGCAAATAATCCTTGG3') (配列番号１８) ・O.19 マイクロモル 第２のバンパープライマー GtpF
8.BR(5'CATTGGTTGATGAATTATT3') (配列番号１９) ・0.75 マイクロモル FamRox 検出プローブ GtpF8.FD1
(5'TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA3')
(配列番号２０) ・0.94 mM dUTP ・3600ng 未加工の透析したヒトの胎盤のDNA
【００６８】第２のマイクロタイタープレートのいずれ
のウエルには、以下の構成物質を含む乾燥した単一なス
ポットを含有している。 ・pH 7.6の25 mM リン酸カリウム ・2.3% トレハロース ・O.125 mg/ml アセチル化BSA ・0.45 mM DTT ・10 mM アセテートマグネシウム ・320ユニットのBsoB1、 20ユニットのBstポリメラーゼ ・1.75 mM dCsTP ・0.25 mM dATP ・0.25 mM dGTP
のウエルには、以下の構成物質を含む乾燥した単一なス
ポットを含有している。 ・pH 7.6の25 mM リン酸カリウム ・2.3% トレハロース ・O.125 mg/ml アセチル化BSA ・0.45 mM DTT ・10 mM アセテートマグネシウム ・320ユニットのBsoB1、 20ユニットのBstポリメラーゼ ・1.75 mM dCsTP ・0.25 mM dATP ・0.25 mM dGTP
【００６９】そして、以下の手順に従って、実行され
た。プラスミドpC16を含んだサンプルのアリコート（〜
150μＭ）を、第１のマイクロタイタープレートの各ウ
エルに分け与えた。PUC18に挿入されたのはクラミジア
トラコーマ症の遺伝子のＢとＦ部位を含むpC16である。
第１のマイクロタイタープレートのウエルは密封され、
プレートは室温で約20分間放置された。そして、第１の
マイクロタイタープレートは開封され、75℃で10分間保
温され、それと同時に第２のマイクロタイタープレート
は前もって52℃で10分間保温した。
た。プラスミドpC16を含んだサンプルのアリコート（〜
150μＭ）を、第１のマイクロタイタープレートの各ウ
エルに分け与えた。PUC18に挿入されたのはクラミジア
トラコーマ症の遺伝子のＢとＦ部位を含むpC16である。
第１のマイクロタイタープレートのウエルは密封され、
プレートは室温で約20分間放置された。そして、第１の
マイクロタイタープレートは開封され、75℃で10分間保
温され、それと同時に第２のマイクロタイタープレート
は前もって52℃で10分間保温した。
【００７０】10分間のインキュベーション後、第１のマ
イクロタイタープレートの各ウエルから100μＭアリコ
ートは第２のマイクロタイタープレートの対応するウエ
ルに移し替えられた（ピペットにより）。この第二のマ
イクロタイタープレートは接着性のカバーで密封され、
現在係属中の1997年9月15日米国特許出願（Becton Dic
kinson Docket No.P-4067）に記載されているように
蛍光読取り機器に入れられた。ここではその特許出願の
全体を引用することにより本明細書の一部をなすものと
する（その他の標準マイクロタイタープレート蛍光読取
り機器も同様に用いられ得る）。第二のマイクロタイタ
ープレートのウエルからの蛍光シグナルは60分間モニタ
ーされた。密封された第二のマイクロタイタープレート
は密封されたバッグに処分されたが、それは実験室環境
の潜在的アンプリコン汚染に対する保険である。
イクロタイタープレートの各ウエルから100μＭアリコ
ートは第２のマイクロタイタープレートの対応するウエ
ルに移し替えられた（ピペットにより）。この第二のマ
イクロタイタープレートは接着性のカバーで密封され、
現在係属中の1997年9月15日米国特許出願（Becton Dic
kinson Docket No.P-4067）に記載されているように
蛍光読取り機器に入れられた。ここではその特許出願の
全体を引用することにより本明細書の一部をなすものと
する（その他の標準マイクロタイタープレート蛍光読取
り機器も同様に用いられ得る）。第二のマイクロタイタ
ープレートのウエルからの蛍光シグナルは60分間モニタ
ーされた。密封された第二のマイクロタイタープレート
は密封されたバッグに処分されたが、それは実験室環境
の潜在的アンプリコン汚染に対する保険である。
【００７１】［結果と結論］例５と同様に、ウエルから
得た蛍光シグナルは時間と共に安定した増加を示し、さ
らに、そのシグナルが補正のできない、例１と２のよう
な不安定なシグナル変動を示さなかった。
得た蛍光シグナルは時間と共に安定した増加を示し、さ
らに、そのシグナルが補正のできない、例１と２のよう
な不安定なシグナル変動を示さなかった。
【００７２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING<110> Vonk, Glenn P. Little, Michael C. <120> Kit and method for Fluorescence Based Detection Assay <130> P981018 <140> JP 1998-312790 <141> 1998-11-04 <150> US 08/964,020 <151> 1997-11-04 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 1 tacatcaggc catatcacc 19 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 2 gcagcttcct cattgat 17 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 3 accgcatcga atgcatgtct cgggtggtaa aagtagtaga ag 42 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 4 cgattccgct ccagacttct cggggtgttt agcatggtgt t 41 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detectot Probe <400> 5 gtcactcgag attcagcatt atcagaagga gccaccccac 40 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 6 accgcatcga atcgatgtct cgggtagaaa atcgcatgca agata 45 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 7 cgattccgct ccagacttct cgggagctgc ctcagaatat actcag 46 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Bumper Primer <400> 8 taaacatgaa aactcgttcc g 21 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 9 ttttatgatg agaacactta aactca 26 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector Probe <400> 10 tagcacccga gtgctagagt cttcaaatat cagagcttta cctaacaa 48 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 11 cgattccgct ccagacttct cgggaacagc ttgaagtttt 40 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 12 accgcatcga atgcatgtct cgggtccttg cagttaggc 39 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Bumper Primer <400> 13 cgcaaatcat caaag 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 14 tcaagacgct tcacg 15 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Detector Probe <400> 15 tagcacccga gtgctttctc cgtctgctct tttatcttct c 41 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 16 cgattccgct ccagacttct cgggacaaaa tcaacacctg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification Primer <400> 17 accgcatcga atgcatgtct cggggagact gttaaagata 40 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 18 cagcaaataa tccttgg 17 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper Primer <400> 19 cattggttga tgaattatt 19 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector Probe <400> 20 tagcacccga gtgctcgcag ccaaaatgac agcttctgat ggaa 44
【図１】全てのアッセイ用試薬を単一のスポットに乾燥
した周知の装置で行われた、増幅と均質な蛍光リアルタ
イム検出アッセイの比較例の結果を表す。
した周知の装置で行われた、増幅と均質な蛍光リアルタ
イム検出アッセイの比較例の結果を表す。
【図２】アッセイ用試薬を単一のスポットに乾燥した周
知の装置で行われた、増幅と均質な蛍光リアルタイム検
出アッセイにおける第２の比較例の結果を表す。
知の装置で行われた、増幅と均質な蛍光リアルタイム検
出アッセイにおける第２の比較例の結果を表す。
【図３】再水和した蛍光プローブと共にＨＩＶ核酸配列
が増幅された実施例において、行われた増幅と均質な蛍
光リアルタイム検出アッセイの例の結果を表す。
が増幅された実施例において、行われた増幅と均質な蛍
光リアルタイム検出アッセイの例の結果を表す。
【図４】再水和した蛍光プローブと共にクラミジア核酸
配列が増幅された実施例において、行われた増幅と均質
な蛍光リアルタイム検出アッセイの例の結果を表す。
配列が増幅された実施例において、行われた増幅と均質
な蛍光リアルタイム検出アッセイの例の結果を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 グレン・ピー・ヴォンク アメリカ合衆国ノースカロライナ州27526, フーキー‐ヴァリナ，パイニー‐グロー ヴ・ウィルボン・ロード 2717
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ） 核酸プライマーと、標的分析物
量の変化に応じた蛍光シグナルの検出可能な変化を生み
出すことができる、当該標的分析物に結合する結合パー
トナーとを含む一又は複数の第１の容器（vessel）と、 （ｂ） サンプルに当該標的分析物が存在するとき、該
標的分析物の量を変化させる反応を開始するような試薬
を含むか、そのような条件を可能にする、上記の一また
は複数の第１の容器に対応する、一または複数の第２の
容器と、を含んで成る、サンプル中の標的分析物の存
否、またはその含有量を決定するための蛍光検出アッセ
イ用キット。 - 【請求項２】 第１の容器と第２の容器との対応関係
が、関連性を示す指標で表されていることを特徴とす
る、請求項１に記載のキット。 - 【請求項３】 第１の容器と第２の容器が共にウエルで
あることを特徴とする、請求項１に記載のキット。 - 【請求項４】 標的分析物が核酸分子であることを特徴
とする、請求項１に記載のキット。 - 【請求項５】 前記試薬が核酸増幅反応のために必要な
酵素であることを特徴とする、請求項４に記載のキッ
ト。 - 【請求項６】 上記条件が温度の変化であることを特徴
とする、請求項１に記載のキット。 - 【請求項７】 一または複数の第２の容器に接着でき
る、あるいは、第２の容器を密封できる密封膜をさらに
含んで成るキットであることを特徴とする、請求項１に
記載のキット。 - 【請求項８】 サンプル中の標的分析物の存否あるいは
その量を検出する蛍光検出アッセイ用キットであり、第
１の区画と少なくとも一つの別の区画を含有する一の容
器を含むキットであって、該第１の区画には上記標的分
析物量の変化に応じた蛍光シグナルの検出可能な変化を
生み出すことができる、当該標的分析物に結合する結合
パートナーを含み、また、前記の少なくとも一つの別の
区画は、当該標的分析物がサンプルに存在するとき、そ
の標的分析物含有量を変化させる反応を開始する試薬を
含むか、そのような条件を可能にすることを特徴とする
キット。 - 【請求項９】 サンプル中の標的分析物の存否、あるい
は、その合計含有量を決定するために蛍光検出アッセイ
を行う方法であって、 （ａ） 当該標的分析物の結合パートナーであって、標
的分析物量の変化に応じた蛍光シグナルの検出可能な変
化を生み出すことができる結合パートナーを含む、第１
の試薬製剤にサンプルを晒すことにより混合物を合成す
るステップと、 （ｂ） 上記混合物を、上記標的分析物が存在するとき
その標的分析物量を変化させうるような第２の試薬製剤
あるいは条件に晒すステップとを含んで成ることを特徴
を有する方法。 - 【請求項１０】 上記第２試薬製剤あるいは上記条件に
上記混合物をさらした後に、その混合物を封じ込めるス
テップをさらに含んで成ることを特徴とする、請求項９
に記載の方法。
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