JPH1123532A - 蛍光検出装置 - Google Patents
蛍光検出装置Info
- Publication number
- JPH1123532A JPH1123532A JP9190556A JP19055697A JPH1123532A JP H1123532 A JPH1123532 A JP H1123532A JP 9190556 A JP9190556 A JP 9190556A JP 19055697 A JP19055697 A JP 19055697A JP H1123532 A JPH1123532 A JP H1123532A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- glass tube
- detection device
- kinds
- excitation light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 リアルタイムで検出でき、高効率でコンパク
トなマルチカラー蛍光検出装置を提供する。 【解決手段】 ４種類の蛍光色素で標識されたサンプル
が泳動されるガラス管と、このガラス管に励起光を照射
する照射系と、励起光が照射されたサンプルから発せら
れる蛍光を検出する検出系とからなる蛍光検出装置にお
いて、前記検出系は、蛍光を集光する集光レンズと、４
種類のバンドパスフィルタと、４個の集合レンズと、４
個に分割されたセンサとからなることを特徴とする蛍光
検出装置。
トなマルチカラー蛍光検出装置を提供する。 【解決手段】 ４種類の蛍光色素で標識されたサンプル
が泳動されるガラス管と、このガラス管に励起光を照射
する照射系と、励起光が照射されたサンプルから発せら
れる蛍光を検出する検出系とからなる蛍光検出装置にお
いて、前記検出系は、蛍光を集光する集光レンズと、４
種類のバンドパスフィルタと、４個の集合レンズと、４
個に分割されたセンサとからなることを特徴とする蛍光
検出装置。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はマルチカラー蛍光検
出装置に関する。更に詳細には、本発明は複数の蛍光色
素で標識されたＤＮＡ構成塩基を電気泳動するためのゲ
ル電気泳動装置に関する。
出装置に関する。更に詳細には、本発明は複数の蛍光色
素で標識されたＤＮＡ構成塩基を電気泳動するためのゲ
ル電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。
【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。
【０００４】光を用いる方法では、蛍光色素でラベルし
たＤＮＡ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部か
ら、１５〜２０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出
器を設けておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測
する。例えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型
として酵素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩
基種が０かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに
蛍光体を標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニ
ン（Ａ）断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン
（Ｇ）断片群およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これら
の断片群を混合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン
溝に注入し、電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ
鎖状の重合体高分子のため、ゲル中を分子量に反比例し
た速度で移動する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほ
ど早く、長い（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくり
と移動するので、分子量によりＤＮＡを分画できる。
たＤＮＡ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部か
ら、１５〜２０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出
器を設けておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測
する。例えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型
として酵素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩
基種が０かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに
蛍光体を標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニ
ン（Ａ）断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン
（Ｇ）断片群およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これら
の断片群を混合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン
溝に注入し、電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ
鎖状の重合体高分子のため、ゲル中を分子量に反比例し
た速度で移動する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほ
ど早く、長い（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくり
と移動するので、分子量によりＤＮＡを分画できる。
【０００５】塩基配列の決定においてＤＮＡを標識する
ために現に使用されている色素は例えば、イソチオシア
ン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ），イソチオシアン酸エ
オシン（ＥＩＴＣ），イソチオシアン酸テトラメチルロ
ーダミン（ＴＭＲＩＴＣ）及び置換イソチオシアン酸ロ
ーダミン（ＸＲＩＴＣ）などである。検体を１種類の色
素でラベルする方法の代わりに、２種類の色素でラベル
し、２種類の蛍光を測定すると分析のスループットが向
上する。
ために現に使用されている色素は例えば、イソチオシア
ン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ），イソチオシアン酸エ
オシン（ＥＩＴＣ），イソチオシアン酸テトラメチルロ
ーダミン（ＴＭＲＩＴＣ）及び置換イソチオシアン酸ロ
ーダミン（ＸＲＩＴＣ）などである。検体を１種類の色
素でラベルする方法の代わりに、２種類の色素でラベル
し、２種類の蛍光を測定すると分析のスループットが向
上する。
【０００６】例えば、ＤＮＡ断片を標識するための蛍光
色素として、ＦＩＴＣ及びＸＲＩＴＣを使用する場合、
この蛍光色素にレーザ光が照射されると、ここから波長
約５２０ｎｍ及び６０４ｎｍの蛍光がそれぞれ発生され
る。蛍光色素を２種類使用すると、蛍光色素を１種類使
用した場合に比べて、ゲル当たりのサンプル数を単純に
倍にすることができるばかりか、識別塩基長を長くする
こともできる。例えば、蛍光色素を１種類使用した場
合、１サンプル当たりのレーン数は４で、蛍光色素を２
種類使用する場合と同じであるが、ゲル当たりのサンプ
ル数は蛍光色素が１種類の場合は８であるのに対し、蛍
光色素が２種類の場合、サンプル数は１６に倍増する。
また、蛍光色素を１種類使用した場合、識別塩基長は４
００塩基対であるのに対し、蛍光色素が２種類の場合、
識別塩基長は４５０塩基対に増大させることができる。
色素として、ＦＩＴＣ及びＸＲＩＴＣを使用する場合、
この蛍光色素にレーザ光が照射されると、ここから波長
約５２０ｎｍ及び６０４ｎｍの蛍光がそれぞれ発生され
る。蛍光色素を２種類使用すると、蛍光色素を１種類使
用した場合に比べて、ゲル当たりのサンプル数を単純に
倍にすることができるばかりか、識別塩基長を長くする
こともできる。例えば、蛍光色素を１種類使用した場
合、１サンプル当たりのレーン数は４で、蛍光色素を２
種類使用する場合と同じであるが、ゲル当たりのサンプ
ル数は蛍光色素が１種類の場合は８であるのに対し、蛍
光色素が２種類の場合、サンプル数は１６に倍増する。
また、蛍光色素を１種類使用した場合、識別塩基長は４
００塩基対であるのに対し、蛍光色素が２種類の場合、
識別塩基長は４５０塩基対に増大させることができる。
【０００７】最近は分析のスループットを更に一層向上
するため、ＤＮＡの４つの塩基を異なるピーク波長の４
個の蛍光色素で標識したサンプルを使用するマルチカラ
ーＤＮＡシーケンサの開発が進められている。従来のこ
のようなマルチカラーＤＮＡシーケンサでは、例えば、
円板上に複数のバンドパスフィルタを配置し、検出光路
中で円板を回転することによりフィルタを順次切り換
え、サンプルの蛍光を検出する方式が採られている。し
かし、この方式では、時間的にフィルタを切り換えする
必要があるため、リアルタイムでの検出は不可能である
ばかりか、回転機構が必要となるため、分析装置全体の
機構が複雑化するばかりか大型化する。別法として、蛍
光検出光学系の途中に分光プリズムを挿入し、サンプル
の分光を行う方式が採用されている。しかし、この方式
では、集光レンズにより取り込んだ光を平行光にし、プ
リズムで分光した後、各色をセンサ上に集光するが、色
収差、プリズムによる収差などを補正する必要があり、
構造的に難がある。
するため、ＤＮＡの４つの塩基を異なるピーク波長の４
個の蛍光色素で標識したサンプルを使用するマルチカラ
ーＤＮＡシーケンサの開発が進められている。従来のこ
のようなマルチカラーＤＮＡシーケンサでは、例えば、
円板上に複数のバンドパスフィルタを配置し、検出光路
中で円板を回転することによりフィルタを順次切り換
え、サンプルの蛍光を検出する方式が採られている。し
かし、この方式では、時間的にフィルタを切り換えする
必要があるため、リアルタイムでの検出は不可能である
ばかりか、回転機構が必要となるため、分析装置全体の
機構が複雑化するばかりか大型化する。別法として、蛍
光検出光学系の途中に分光プリズムを挿入し、サンプル
の分光を行う方式が採用されている。しかし、この方式
では、集光レンズにより取り込んだ光を平行光にし、プ
リズムで分光した後、各色をセンサ上に集光するが、色
収差、プリズムによる収差などを補正する必要があり、
構造的に難がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はリアルタイムで検出でき、高効率でコンパクトなマル
チカラー蛍光検出装置を提供することである。
はリアルタイムで検出でき、高効率でコンパクトなマル
チカラー蛍光検出装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記課題は、光軸に垂直
な平面内に透過領域が異なるバンドパスフィルタを配置
して平行光束をエリア別に分光し、更にエリア別に分光
された光を各エリア毎の別々のレンズにより、別々のセ
ンサに集光することにより解決される。
な平面内に透過領域が異なるバンドパスフィルタを配置
して平行光束をエリア別に分光し、更にエリア別に分光
された光を各エリア毎の別々のレンズにより、別々のセ
ンサに集光することにより解決される。
【００１０】
【発明の実施の形態】図１は本発明のマルチカラー蛍光
検出装置の一例の構成を示す概要斜視図である。本発明
のマルチカラー蛍光検出装置では、ガラス管１（内径＜
１００μｍ）内のポリアクリルアミドゲル又はその他の
泳動媒体として適当なポリマーを充填し、４色の蛍光色
素でＤＮＡを構成する各塩基を標識したサンプルを同一
のガラス管内に入れ、電気泳動する。
検出装置の一例の構成を示す概要斜視図である。本発明
のマルチカラー蛍光検出装置では、ガラス管１（内径＜
１００μｍ）内のポリアクリルアミドゲル又はその他の
泳動媒体として適当なポリマーを充填し、４色の蛍光色
素でＤＮＡを構成する各塩基を標識したサンプルを同一
のガラス管内に入れ、電気泳動する。
【００１１】ガラス管１内を所定の長さ（例えば、３０
〜４０ｃｍ）泳動した位置に蛍光励起用のレーザをサン
プルのバンド幅に対して十分に小さい（例えば、０．１
〜０．４ｍｍ）ビーム径で照射する。照射系はレーザ光
源３とコリメータレンズ５及びシリンドリカルレンズ７
からなる。レーザ光源３の種類は特に限定されないが、
使用する蛍光色素との関係から、例えば、励起波長が４
８８又は５１４．５ｎｍのアルゴンレーザなどを使用す
ることが好ましい。
〜４０ｃｍ）泳動した位置に蛍光励起用のレーザをサン
プルのバンド幅に対して十分に小さい（例えば、０．１
〜０．４ｍｍ）ビーム径で照射する。照射系はレーザ光
源３とコリメータレンズ５及びシリンドリカルレンズ７
からなる。レーザ光源３の種類は特に限定されないが、
使用する蛍光色素との関係から、例えば、励起波長が４
８８又は５１４．５ｎｍのアルゴンレーザなどを使用す
ることが好ましい。
【００１２】ガラス管１内のゲル電解質層に沿って泳動
されてきた蛍光標識サンプルに照射系からの励起光が入
射するすると、このサンプルから蛍光が発生する。発生
した蛍光はガラス管１の中心を焦点位置に設定した集光
レンズ９により検出系に平行光として取り込まれる。検
出系の光路中には、各蛍光色素のピーク波長付近を透過
する４種類のバンドパスフィルタ（Ｂｐ1〜Ｂｐ4）１１
ａ，１１ｂ，１１ｃ及び１１ｄが光軸に垂直な平面内に
一体的に配置されている。取り込まれた平行光はこのフ
ィルタ１１ａ〜１１ｄにより光軸に垂直な平面内で４つ
のエリアに分けてそれぞれ分光される。分光された光は
エリア別に設けられた集合レンズ１３ａ，１３ｂ，１３
ｃ及び１３ｄによりそれぞれ、４分割センサ１５の各セ
ンサエリア（Ｓ1〜Ｓ4）に対して、Ｂｐ1：Ｓ1，Ｂ
ｐ2：Ｓ2，Ｂｐ3：Ｓ3及びＢｐ4：Ｓ4の対応関係でセン
サ１５上に集光される。４分割センサ１５は例えば、４
分割ホトダイオードセンサを使用できる。
されてきた蛍光標識サンプルに照射系からの励起光が入
射するすると、このサンプルから蛍光が発生する。発生
した蛍光はガラス管１の中心を焦点位置に設定した集光
レンズ９により検出系に平行光として取り込まれる。検
出系の光路中には、各蛍光色素のピーク波長付近を透過
する４種類のバンドパスフィルタ（Ｂｐ1〜Ｂｐ4）１１
ａ，１１ｂ，１１ｃ及び１１ｄが光軸に垂直な平面内に
一体的に配置されている。取り込まれた平行光はこのフ
ィルタ１１ａ〜１１ｄにより光軸に垂直な平面内で４つ
のエリアに分けてそれぞれ分光される。分光された光は
エリア別に設けられた集合レンズ１３ａ，１３ｂ，１３
ｃ及び１３ｄによりそれぞれ、４分割センサ１５の各セ
ンサエリア（Ｓ1〜Ｓ4）に対して、Ｂｐ1：Ｓ1，Ｂ
ｐ2：Ｓ2，Ｂｐ3：Ｓ3及びＢｐ4：Ｓ4の対応関係でセン
サ１５上に集光される。４分割センサ１５は例えば、４
分割ホトダイオードセンサを使用できる。
【００１３】色、すなわち塩基の判別は、例えば、Ｓ1
〜Ｓ4までのセンサ出力のうち、最大となるセンサを判
別することにより、対応する蛍光ピーク波長の色素が決
まることにより行われる。別法として、個々の色素の各
フィルタへの漏れ込み量を求めておき、検出された信号
に対して逆算して色素を判別することもできる。
〜Ｓ4までのセンサ出力のうち、最大となるセンサを判
別することにより、対応する蛍光ピーク波長の色素が決
まることにより行われる。別法として、個々の色素の各
フィルタへの漏れ込み量を求めておき、検出された信号
に対して逆算して色素を判別することもできる。
【００１４】図２は、各蛍光色素の特性とバンドパスフ
ィルタの透過領域との関係を示す特性図であり、縦軸は
蛍光強度を示し、横軸は波長を示す。図２において、Ｆ
Ｌ1〜ＦＬ4は各蛍光色素の蛍光分光特性を示す波形であ
り、Ｂｐ1〜Ｂｐ4はバンドパスフィルタの透過領域を示
す。図示されているように、各バンドパスフィルタは各
蛍光色素のピーク波長を特定的に透過させることがで
き、優れた分離特性を有する。
ィルタの透過領域との関係を示す特性図であり、縦軸は
蛍光強度を示し、横軸は波長を示す。図２において、Ｆ
Ｌ1〜ＦＬ4は各蛍光色素の蛍光分光特性を示す波形であ
り、Ｂｐ1〜Ｂｐ4はバンドパスフィルタの透過領域を示
す。図示されているように、各バンドパスフィルタは各
蛍光色素のピーク波長を特定的に透過させることがで
き、優れた分離特性を有する。
【００１５】図１では、ガラス管１は１本しか図示され
ていないが、複数本（例えば、４０〜１００本）のガラ
ス管を使用できる。また、図１では、照射系と検出系と
がガラス管を挟んで直交するように配置されているが、
この配置構成に限定されず、例えば、照射系と検出系と
がガラス管を挟んで対峙するように配置することもでき
る。図示されていないが、ガラス管の上部は上部バッフ
ァ槽のバッファ液に、下部は下部バッファ槽のバッファ
液に浸漬されている。上部バッファ槽には更に上部電極
が、また、下部バッファ槽には下部電極がそれぞれ配設
され、電極間に電圧を印加することにより電気泳動が行
われる。このような複数本のガラス管を使用するゲル電
気泳動装置は例えば、特開平５−７２１７７号公報に開
示されている。
ていないが、複数本（例えば、４０〜１００本）のガラ
ス管を使用できる。また、図１では、照射系と検出系と
がガラス管を挟んで直交するように配置されているが、
この配置構成に限定されず、例えば、照射系と検出系と
がガラス管を挟んで対峙するように配置することもでき
る。図示されていないが、ガラス管の上部は上部バッフ
ァ槽のバッファ液に、下部は下部バッファ槽のバッファ
液に浸漬されている。上部バッファ槽には更に上部電極
が、また、下部バッファ槽には下部電極がそれぞれ配設
され、電極間に電圧を印加することにより電気泳動が行
われる。このような複数本のガラス管を使用するゲル電
気泳動装置は例えば、特開平５−７２１７７号公報に開
示されている。
【００１６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
各センサともリアルタイムで蛍光を検出できるため、感
度の向上が図れる。また、光軸に対して平行な光軸で光
を分離するため、効率良く分光される。また、機構的に
駆動系を全く必要としないため、装置全体の構成上コン
パクト化が可能となる。
各センサともリアルタイムで蛍光を検出できるため、感
度の向上が図れる。また、光軸に対して平行な光軸で光
を分離するため、効率良く分光される。また、機構的に
駆動系を全く必要としないため、装置全体の構成上コン
パクト化が可能となる。
【図１】本発明のマルチカラー蛍光検出装置の一例の構
成を示す概要斜視図である。
成を示す概要斜視図である。
【図２】各蛍光色素の特性とバンドパスフィルタの透過
領域との関係を示す特性図である。
領域との関係を示す特性図である。
１ ガラス管 ３ レーザ光源 ５ コリメータレンズ ７ シリんドリカルレンズ ９ 集光レンズ １１ バンドパスフィルタ １３ 集合レンズ １５ ４分割センサ
Claims (4)
- 【請求項１】 ４種類の蛍光色素で標識されたサンプル
が泳動されるガラス管と、このガラス管に励起光を照射
する照射系と、励起光が照射されたサンプルから発せら
れる蛍光を検出する検出系とからなる蛍光検出装置にお
いて、前記検出系は、蛍光を集光する集光レンズと、４
種類のバンドパスフィルタと、４個の集合レンズと、４
個に分割されたセンサとからなることを特徴とする蛍光
検出装置。 - 【請求項２】 集光レンズはガラス管の中心を焦点位置
に設定されており、４種類のバンドパスフィルタは光軸
に垂直な平面内に一体的に配置され、４個の集合レンズ
は光軸に垂直な平面内に一体的に配置され、各バンドパ
スフィルタは各光軸上の各センサにそれぞれ対応してい
る請求項１の装置。 - 【請求項３】 複数本のガラス管を一体的に束ねて使用
する請求項１の装置。 - 【請求項４】 ゲル電気泳動装置である請求項１の装
置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9190556A JPH1123532A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 蛍光検出装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9190556A JPH1123532A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 蛍光検出装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1123532A true JPH1123532A (ja) | 1999-01-29 |
Family
ID=16260045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9190556A Pending JPH1123532A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 蛍光検出装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1123532A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013508718A (ja) * | 2009-10-23 | 2013-03-07 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 複数の蛍光信号を監視する装置 |
| CN111272715A (zh) * | 2018-12-04 | 2020-06-12 | 长光华大基因测序设备（长春）有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
-
1997
- 1997-07-01 JP JP9190556A patent/JPH1123532A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013508718A (ja) * | 2009-10-23 | 2013-03-07 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 複数の蛍光信号を監視する装置 |
| US9228947B2 (en) | 2009-10-23 | 2016-01-05 | Koninklijke Philips N.V. | Device for monitoring a plurality of discrete fluorescence signals |
| CN111272715A (zh) * | 2018-12-04 | 2020-06-12 | 长光华大基因测序设备（长春）有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
| CN111272715B (zh) * | 2018-12-04 | 2023-03-14 | 长春长光华大智造测序设备有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
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