JPH1123558A - 分離法及びこれを用いた装置 - Google Patents
分離法及びこれを用いた装置Info
- Publication number
- JPH1123558A JPH1123558A JP9171949A JP17194997A JPH1123558A JP H1123558 A JPH1123558 A JP H1123558A JP 9171949 A JP9171949 A JP 9171949A JP 17194997 A JP17194997 A JP 17194997A JP H1123558 A JPH1123558 A JP H1123558A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mobile phase
- sample
- peptide
- separation
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ペプチドやタンパク質を含む試料を分離するに
際し、ペプチドやタンパク質を分離でき、さらに分離
後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製できる方法及び
その方法を用いた装置を提供する。 【解決の手段】ペプチド及び／又はタンパク質を含有す
る試料を順相液体クロマトグラフィーにより分離するに
あたり、該試料を分離カラムに注入した後、有機溶媒と
水及び／又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミ
ンを添加されてなる移動相を展開してペプチド及び／又
はタンパク質を分離する方法及び装置を用いる。
際し、ペプチドやタンパク質を分離でき、さらに分離
後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製できる方法及び
その方法を用いた装置を提供する。 【解決の手段】ペプチド及び／又はタンパク質を含有す
る試料を順相液体クロマトグラフィーにより分離するに
あたり、該試料を分離カラムに注入した後、有機溶媒と
水及び／又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミ
ンを添加されてなる移動相を展開してペプチド及び／又
はタンパク質を分離する方法及び装置を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、順相クロマトグラ
フィーにおいて使用される分離カラムと、有機溶媒と水
又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミンを添加
した移動相を用いて、ペプチドやタンパク質を含有する
試料を、分離する方法及びそれを用いた装置に関するも
のである。
フィーにおいて使用される分離カラムと、有機溶媒と水
又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミンを添加
した移動相を用いて、ペプチドやタンパク質を含有する
試料を、分離する方法及びそれを用いた装置に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】液体クロマトグラフィーを用いたペプチ
ドやタンパク質を分離する手法としては、逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーがある。しかし、順相クロ
マトグラフィーを用いて化学修飾しないネイティブなペ
プチドやタンパク質を分離精製した例や報告はなかっ
た。
ドやタンパク質を分離する手法としては、逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーがある。しかし、順相クロ
マトグラフィーを用いて化学修飾しないネイティブなペ
プチドやタンパク質を分離精製した例や報告はなかっ
た。
【０００３】この内、逆相クロマトグラフィーは、移動
相に揮発性の高い有機溶媒や酸を用いるため、ペプチド
やタンパク質を分離後、精製する目的においては大変有
用な方法であるが、その分離機構は試料中の各ペプチド
やタンパク質と分離カラムの固定相との疎水的相互作用
の違いを利用して行なうため、試料中の各ペプチドやタ
ンパク質に疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違い
があまり無い場合には分離することは困難であった。
相に揮発性の高い有機溶媒や酸を用いるため、ペプチド
やタンパク質を分離後、精製する目的においては大変有
用な方法であるが、その分離機構は試料中の各ペプチド
やタンパク質と分離カラムの固定相との疎水的相互作用
の違いを利用して行なうため、試料中の各ペプチドやタ
ンパク質に疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違い
があまり無い場合には分離することは困難であった。
【０００４】一方、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーを用いた方法では、
逆相クロマトグラフィーを用いた方法では分離できない
ような疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違いがあ
まり無い試料中のペプチドやタンパク質を分離すること
は可能であるものの、いずれの方法においても移動相と
して塩を含む緩衝溶液を使用するため、ペプチドやタン
パク質を分離後、精製するためには脱塩などの煩雑な操
作が伴うという課題があった。
水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーを用いた方法では、
逆相クロマトグラフィーを用いた方法では分離できない
ような疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違いがあ
まり無い試料中のペプチドやタンパク質を分離すること
は可能であるものの、いずれの方法においても移動相と
して塩を含む緩衝溶液を使用するため、ペプチドやタン
パク質を分離後、精製するためには脱塩などの煩雑な操
作が伴うという課題があった。
【０００５】一方、シリカカラム、アルミナカラムとい
ったカラムを用いる古典的かつ一般的な順相クロマトグ
ラフィーを用いた方法は、試料中の対象物質の極性を利
用して分離を行なうため、疎水性に基づく分離を行う逆
相クロマトグラフィーを用いる方法とは反対の性質を持
つが、移動相としてヘキサンなどの非水溶媒を用いて行
なうために、試料中の対象物質の移動相への溶解性が悪
く、ペプチドやタンパク質などの生体物質の分離に適用
されることは無かった。
ったカラムを用いる古典的かつ一般的な順相クロマトグ
ラフィーを用いた方法は、試料中の対象物質の極性を利
用して分離を行なうため、疎水性に基づく分離を行う逆
相クロマトグラフィーを用いる方法とは反対の性質を持
つが、移動相としてヘキサンなどの非水溶媒を用いて行
なうために、試料中の対象物質の移動相への溶解性が悪
く、ペプチドやタンパク質などの生体物質の分離に適用
されることは無かった。
【０００６】近年、シリカや樹脂などのゲル基材にアミ
ノ基、水酸基（ＯＨ）、アミド基といった極性基を結合
させた化学結合型の固定相が順相クロマトグラフィー用
として開発され、これらは有機溶媒と水又はアルコール
の混合液を移動相として用いることができるため、従来
の順相クロマトグラフィーによる方法において溶解性が
問題となり使用できなかった生体試料への適用が可能と
なった。
ノ基、水酸基（ＯＨ）、アミド基といった極性基を結合
させた化学結合型の固定相が順相クロマトグラフィー用
として開発され、これらは有機溶媒と水又はアルコール
の混合液を移動相として用いることができるため、従来
の順相クロマトグラフィーによる方法において溶解性が
問題となり使用できなかった生体試料への適用が可能と
なった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記記載の背景のもと
に、本発明の目的は、ペプチドやタンパク質を含む試料
を分離するに際し、ペプチドやタンパク質を分離でき、
さらに分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製でき
る方法及びその方法を用いた装置を提供することにあ
る。
に、本発明の目的は、ペプチドやタンパク質を含む試料
を分離するに際し、ペプチドやタンパク質を分離でき、
さらに分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製でき
る方法及びその方法を用いた装置を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、シリカや樹
脂などのゲル基材に水酸基（ＯＨ）やアミド基などの極
性基を結合させた化学結合型の固定相を用い、揮発性の
高い有機溶媒と水又はアルコールの混合液に酸やアミン
を添加した移動相を用いた順相クロマトグラフィーによ
る方法より、逆相クロマトグラフィーによる方法では分
離し難いペプチドやタンパク質を含む試料を分離するこ
とが可能であること、さらに、移動相として逆相クロマ
トグラフィーによる方法で使用される揮発性の高い有機
溶媒、酸、アミンを選択することにより、ペプチドやタ
ンパク質を分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製
できることを見出し、本発明を完成するに至った。
課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、シリカや樹
脂などのゲル基材に水酸基（ＯＨ）やアミド基などの極
性基を結合させた化学結合型の固定相を用い、揮発性の
高い有機溶媒と水又はアルコールの混合液に酸やアミン
を添加した移動相を用いた順相クロマトグラフィーによ
る方法より、逆相クロマトグラフィーによる方法では分
離し難いペプチドやタンパク質を含む試料を分離するこ
とが可能であること、さらに、移動相として逆相クロマ
トグラフィーによる方法で使用される揮発性の高い有機
溶媒、酸、アミンを選択することにより、ペプチドやタ
ンパク質を分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製
できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を図面に基づいて詳
細に説明する。
細に説明する。
【００１０】尚、本明細書においては、「ペプチド」と
いう語は、その構成するアミノ酸をも含む意味で用いら
れる。
いう語は、その構成するアミノ酸をも含む意味で用いら
れる。
【００１１】図１は本発明の順相クロマトグラフィーに
よる方法を用いたペプチド及び／又はタンパク質の分離
を実施する装置を示すものである。
よる方法を用いたペプチド及び／又はタンパク質の分離
を実施する装置を示すものである。
【００１２】図１において、第１移動相瓶１と第２移動
相瓶２は移動相（本明細書においては、溶離液というこ
ともある）を貯蔵するための瓶であり、それぞれ、溶離
液１、溶離液２が貯蔵されている。これらの貯蔵されて
いる溶離液１及び溶離液２はその中の有機溶媒の濃度が
両者で異なる。また、瓶の大きさ、形状、材質は特に限
定されるものではなく、大きさとしては、分離や精製す
るために必要な移動相を越える量貯蔵できればよく、形
状も次に示す送液ポンプ３により、その貯蔵されている
溶液が送液できるものであればよい。材質としても移動
相を貯蔵した場合に安定的にその溶液が貯蔵できれば良
く、例えば、ガラスや高分子樹脂などが例示できる。
相瓶２は移動相（本明細書においては、溶離液というこ
ともある）を貯蔵するための瓶であり、それぞれ、溶離
液１、溶離液２が貯蔵されている。これらの貯蔵されて
いる溶離液１及び溶離液２はその中の有機溶媒の濃度が
両者で異なる。また、瓶の大きさ、形状、材質は特に限
定されるものではなく、大きさとしては、分離や精製す
るために必要な移動相を越える量貯蔵できればよく、形
状も次に示す送液ポンプ３により、その貯蔵されている
溶液が送液できるものであればよい。材質としても移動
相を貯蔵した場合に安定的にその溶液が貯蔵できれば良
く、例えば、ガラスや高分子樹脂などが例示できる。
【００１３】送液ポンプ３は第１移動相１と第２移動相
２とを勾配的に送液するためものである。送液の条件と
しては、特に限定はなく、試料中のペプチド及び／又は
タンパク質を分析するような小規模のシステムにより実
施する場合には、分離カラムの大きさにより異なるが、
通常１．５ｍｌ／分以下の流速により実施される。さら
に具体的には、カラムの内径が４．６ｍｍ程度の場合に
は、０．７〜１．０ｍｌ／分の範囲の流速が、カラムの
内径が２．０ｍｍ程度の場合には、０．１〜０．２ｍｌ
／分の範囲の流速が好ましく用いられ、このような流速
を達成できる送液ポンプであればよい。また、大規模の
システムにより試料中の特定のペプチド、タンパク質の
精製を実施する場合には、カラムの大きさや試料中の特
定のペプチド、タンパク質の分離パターン等に応じて適
宜必要な性能を有する送液ポンプを用いればよい。
２とを勾配的に送液するためものである。送液の条件と
しては、特に限定はなく、試料中のペプチド及び／又は
タンパク質を分析するような小規模のシステムにより実
施する場合には、分離カラムの大きさにより異なるが、
通常１．５ｍｌ／分以下の流速により実施される。さら
に具体的には、カラムの内径が４．６ｍｍ程度の場合に
は、０．７〜１．０ｍｌ／分の範囲の流速が、カラムの
内径が２．０ｍｍ程度の場合には、０．１〜０．２ｍｌ
／分の範囲の流速が好ましく用いられ、このような流速
を達成できる送液ポンプであればよい。また、大規模の
システムにより試料中の特定のペプチド、タンパク質の
精製を実施する場合には、カラムの大きさや試料中の特
定のペプチド、タンパク質の分離パターン等に応じて適
宜必要な性能を有する送液ポンプを用いればよい。
【００１４】尚、第１移動相１と第２移動相２とを勾配
的に送液する必要がない場合には、第１移動相１又は第
２移動相２のいずれかのみを用いればよい。
的に送液する必要がない場合には、第１移動相１又は第
２移動相２のいずれかのみを用いればよい。
【００１５】４は試料注入装置であり、用いられる試料
の容量は任意の量に変えることができ、又、注入に際し
ては、手動によりもしくは自動的に注入できる。試料の
注入量としては、小規模の分析に用いる場合と大規模の
精製に用いる場合とではその容量は異なり、適宜必要な
試料容量を注入できる試料注入装置を用いればよい。
の容量は任意の量に変えることができ、又、注入に際し
ては、手動によりもしくは自動的に注入できる。試料の
注入量としては、小規模の分析に用いる場合と大規模の
精製に用いる場合とではその容量は異なり、適宜必要な
試料容量を注入できる試料注入装置を用いればよい。
【００１６】５は分離カラム、６は恒温槽であり、分離
カラム５は恒温槽６に入った状態にて一定の温度に保た
れる。又は、温度調整を必要としない場合には、分離カ
ラム５は恒温槽にて温度を調整を行わなくとも良い。
カラム５は恒温槽６に入った状態にて一定の温度に保た
れる。又は、温度調整を必要としない場合には、分離カ
ラム５は恒温槽にて温度を調整を行わなくとも良い。
【００１７】恒温槽６は、分離カラム５の温度を一定に
保つために用いられ、空気等のガスや水等の液体などを
媒体として、加熱及び／又は冷却の機構によりその温度
を一定に保つ機能を有するものである。ここで、恒温槽
の保つことができる温度としては、分離の対象、目的に
も左右されるため、一概にはいえないが、１０〜７０℃
の温度範囲が好ましく、さらに３０〜５０℃の温度範囲
が好ましい。この理由としては、移動相の氷点を越える
温度である必要があると共に、沸点をこれる温度であっ
てはならないという制約があるためである。さらに、こ
の範囲を外れるような条件の場合には、分離の対象とす
る試料中のペプチドやタンパク質が劣化してしまう場合
もあるからである。
保つために用いられ、空気等のガスや水等の液体などを
媒体として、加熱及び／又は冷却の機構によりその温度
を一定に保つ機能を有するものである。ここで、恒温槽
の保つことができる温度としては、分離の対象、目的に
も左右されるため、一概にはいえないが、１０〜７０℃
の温度範囲が好ましく、さらに３０〜５０℃の温度範囲
が好ましい。この理由としては、移動相の氷点を越える
温度である必要があると共に、沸点をこれる温度であっ
てはならないという制約があるためである。さらに、こ
の範囲を外れるような条件の場合には、分離の対象とす
る試料中のペプチドやタンパク質が劣化してしまう場合
もあるからである。
【００１８】７は検出器であるが、分離の対象とする試
料中のペプチド及び／又はタンパク質が検出でき、移動
相による妨害を受けない原理によるものであれば特に限
定されるものではなく、例えば、紫外吸収検出器、可視
吸収検出器、蛍光検出器、発光検出器等の公知手段を用
いることができ、検出波長についても公知の条件にて行
えばよい。さらに、この検出器を記録計に接続して得ら
れた信号を紙等へ出力又は電気記録媒体へ記録して分
析、精製に利用することができる。
料中のペプチド及び／又はタンパク質が検出でき、移動
相による妨害を受けない原理によるものであれば特に限
定されるものではなく、例えば、紫外吸収検出器、可視
吸収検出器、蛍光検出器、発光検出器等の公知手段を用
いることができ、検出波長についても公知の条件にて行
えばよい。さらに、この検出器を記録計に接続して得ら
れた信号を紙等へ出力又は電気記録媒体へ記録して分
析、精製に利用することができる。
【００１９】また、上記記載の１〜７の各部との間を接
続する送液管については、耐圧性があれば、その材質、
内径、外径、長さ等には特に限定されることはなく、通
常、ステンレス等の金属や、高分子樹脂などが好ましく
用いられる。
続する送液管については、耐圧性があれば、その材質、
内径、外径、長さ等には特に限定されることはなく、通
常、ステンレス等の金属や、高分子樹脂などが好ましく
用いられる。
【００２０】このように構成されたクロマトグラフ装置
において、以下に示す実施例においては、第１移動相瓶
１はアセトニトリル：水＝９７：３（体積基準）の割合
で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸を添加し
たものを用いたが、有機溶媒としては、プロトンの供
与、受容にあまり関与せず、水又はアルコールと混和で
きることが必須である。このような有機溶媒としては、
シアン化炭化水素等が好ましく用いられ、さらにアセト
ニトリルが好ましく用いられる。その濃度としては、分
離能の面から、移動相全量の６０容積％以上が、さらに
７０容積％以上が好ましい。
において、以下に示す実施例においては、第１移動相瓶
１はアセトニトリル：水＝９７：３（体積基準）の割合
で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸を添加し
たものを用いたが、有機溶媒としては、プロトンの供
与、受容にあまり関与せず、水又はアルコールと混和で
きることが必須である。このような有機溶媒としては、
シアン化炭化水素等が好ましく用いられ、さらにアセト
ニトリルが好ましく用いられる。その濃度としては、分
離能の面から、移動相全量の６０容積％以上が、さらに
７０容積％以上が好ましい。
【００２１】また、水としては、上記記載の検出器に影
響を与えないものであれば特に限定されず、冷水、温水
のいずれも用いることができる。さらに、水の代わりに
用いられることのあるアルコールとしては、有機溶媒と
混和できるものであれば特に限定されないが、分離する
際に有機溶媒と完全に混和でき、また、分離の対象とす
る試料中のペプチドやタンパク質が劣化しないようなも
のであればよい。例えば、メチルアルコール、エチルア
ルコール等が例示できる。さらに、水とアルコールとを
併用することもできる。
響を与えないものであれば特に限定されず、冷水、温水
のいずれも用いることができる。さらに、水の代わりに
用いられることのあるアルコールとしては、有機溶媒と
混和できるものであれば特に限定されないが、分離する
際に有機溶媒と完全に混和でき、また、分離の対象とす
る試料中のペプチドやタンパク質が劣化しないようなも
のであればよい。例えば、メチルアルコール、エチルア
ルコール等が例示できる。さらに、水とアルコールとを
併用することもできる。
【００２２】有機溶媒と水又はアルコールとの混合比率
としては、分離能の点から、（水又はアルコール）／
（有機溶媒）が０〜０．３となる範囲（体積基準）であ
ることが好ましい。尚、ここでいう混合比率とは、ペプ
チド及び／又はタンパク質を含む試料を分離する際に実
質的に使用される場合のことをいう。
としては、分離能の点から、（水又はアルコール）／
（有機溶媒）が０〜０．３となる範囲（体積基準）であ
ることが好ましい。尚、ここでいう混合比率とは、ペプ
チド及び／又はタンパク質を含む試料を分離する際に実
質的に使用される場合のことをいう。
【００２３】さらに、移動相にゲル基材へのイオン的な
吸着対策、すなわち、ペプチド等を含む試料の回収率を
向上させる手段として、移動相に酸を添加する。酸の種
類としては、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸などの有機
酸や、無機酸が好ましく用いられ、さらに、精製に使用
する場合に有効である脱塩操作を必要としない揮発性の
点から有機酸が、特にトリフルオロ酢酸が好ましく用い
られる。その含有比率としては、移動相全量に対して、
体積基準で０．０１〜２０％の範囲で用いることが好ま
しい。
吸着対策、すなわち、ペプチド等を含む試料の回収率を
向上させる手段として、移動相に酸を添加する。酸の種
類としては、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸などの有機
酸や、無機酸が好ましく用いられ、さらに、精製に使用
する場合に有効である脱塩操作を必要としない揮発性の
点から有機酸が、特にトリフルオロ酢酸が好ましく用い
られる。その含有比率としては、移動相全量に対して、
体積基準で０．０１〜２０％の範囲で用いることが好ま
しい。
【００２４】また、アミン類も酸と一緒にもしくは酸の
代わりとして用いることができる。用いられるアミンの
種類としては、３級のアミンが好ましく、さらにトリエ
チルアミン、トリメチルアミンが好ましく用いられる。
その含有比率としては、全移動相に対して、体積基準で
０．０１〜２０％の範囲で添加することが出来る。
代わりとして用いることができる。用いられるアミンの
種類としては、３級のアミンが好ましく、さらにトリエ
チルアミン、トリメチルアミンが好ましく用いられる。
その含有比率としては、全移動相に対して、体積基準で
０．０１〜２０％の範囲で添加することが出来る。
【００２５】第２移動相瓶２に貯蔵する移動相として
は、実施例においては、アセトニトリル：水＝５５：４
５の割合で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸
を添加したものを用いた。この場合、第１移動相瓶１と
同様に、その有機溶媒、水、アルコール、酸又はアミン
の種類、量比を変えることができる。
は、実施例においては、アセトニトリル：水＝５５：４
５の割合で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸
を添加したものを用いた。この場合、第１移動相瓶１と
同様に、その有機溶媒、水、アルコール、酸又はアミン
の種類、量比を変えることができる。
【００２６】分離カラムとしては、その一例としてアミ
ド基（カルバモイル基）をゲル基材に共有結合させた、
ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）
を用いた。このようなゲル基材としては、化学結合型で
順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定
されるものではないが、無機系シリカ、アルミナ、有機
高分子系樹脂などが好ましく用いられ、特に分離能、耐
久性などの面から無機系シリカが好ましく用いられる。
ド基（カルバモイル基）をゲル基材に共有結合させた、
ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）
を用いた。このようなゲル基材としては、化学結合型で
順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定
されるものではないが、無機系シリカ、アルミナ、有機
高分子系樹脂などが好ましく用いられ、特に分離能、耐
久性などの面から無機系シリカが好ましく用いられる。
【００２７】また、このようなゲル基材に結合される官
能基としては、順相クロマトグラフィーを行えるもので
あれば特に限定されるものではないが、アミノ基、アミ
ド基（カルバモイル基）、水酸基、カルボキシル基、ス
ルホン酸基が結合したものが好ましく用いられ、さら
に、アミド基（カルバモイル基）、水酸基が、特に、分
離能、耐久性などの面からアミド基（カルバモイル基）
を結合させたものが好ましく用いられる。また、これら
の官能基が２種以上あってもよい。
能基としては、順相クロマトグラフィーを行えるもので
あれば特に限定されるものではないが、アミノ基、アミ
ド基（カルバモイル基）、水酸基、カルボキシル基、ス
ルホン酸基が結合したものが好ましく用いられ、さら
に、アミド基（カルバモイル基）、水酸基が、特に、分
離能、耐久性などの面からアミド基（カルバモイル基）
を結合させたものが好ましく用いられる。また、これら
の官能基が２種以上あってもよい。
【００２８】さらに具体的には、上記記載のＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ−８０や、水酸基をゲル基材に共有結合
させた、ＴＳＫｇｅｌ ＯＨ−１２０（東ソー株式会社
製）、一般的に順相法で良く用いられるＴＳＫｇｅｌ
Ｓｉｌｉｃａ−６０（東ソー株式会社製）、分離機構に
プロトン供与、受容に関与するイオン交換カラムであ
る、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ
−２ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ
ＣＭ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２ＰＷ（以上、東
ソー株式会社製）などを挙げることができる。
ｌ Ａｍｉｄｅ−８０や、水酸基をゲル基材に共有結合
させた、ＴＳＫｇｅｌ ＯＨ−１２０（東ソー株式会社
製）、一般的に順相法で良く用いられるＴＳＫｇｅｌ
Ｓｉｌｉｃａ−６０（東ソー株式会社製）、分離機構に
プロトン供与、受容に関与するイオン交換カラムであ
る、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ
−２ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ
ＣＭ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２ＰＷ（以上、東
ソー株式会社製）などを挙げることができる。
【００２９】本発明の方法においては、移動相として高
い比率の有機溶媒を用いているために試料が移動相に溶
解しにくい場合があるが、その場合は、蟻酸等に溶解し
てから移動相２、移動相１の順で希釈すればよい。試料
中の最終的な蟻酸濃度は、注入試料全量に対して、体積
基準で７０％まで使用することができる。
い比率の有機溶媒を用いているために試料が移動相に溶
解しにくい場合があるが、その場合は、蟻酸等に溶解し
てから移動相２、移動相１の順で希釈すればよい。試料
中の最終的な蟻酸濃度は、注入試料全量に対して、体積
基準で７０％まで使用することができる。
【００３０】吸着されたペプチド及び／又はタンパク質
を含む試料は、試料注入後まもなく移動相液２を送液ポ
ンプ３によって移動相中の水もしくはアルコールの濃度
を勾配的に増加させることによって溶出させる。実施例
においては、溶出のための勾配は一例として、表１に示
すようなグラジエントカーブによって行った。
を含む試料は、試料注入後まもなく移動相液２を送液ポ
ンプ３によって移動相中の水もしくはアルコールの濃度
を勾配的に増加させることによって溶出させる。実施例
においては、溶出のための勾配は一例として、表１に示
すようなグラジエントカーブによって行った。
【００３１】
【表１】
【００３２】ここで、溶出のための勾配の条件として
は、直線勾配のみならず、曲線勾配としても良く、試料
中の分離対象物質により適宜変更しても良い。
は、直線勾配のみならず、曲線勾配としても良く、試料
中の分離対象物質により適宜変更しても良い。
【００３３】このようにして分離カラムから溶出されて
きたペプチド、タンパク質は、検出される。図２におい
ては、吸収波長２１５ｎｍの紫外吸収検出器により検出
し、種々のペプチドを分離したクロマトグラムが得られ
た。ここで、検出の方法としては、溶出された分離対象
物質を直接検出しても良いが、図１に示される検出器の
前に、送液ポンプ及び検出用溶液を加え、分離カラムか
ら送液された溶液と合流させるという方法を用いても良
い。この際に用いられる、送液ポンプとしては上記記載
のものと同じような構成でよく、また、検出用溶液とし
ては、分離対象物質と反応して、紫外あるいは可視の吸
収を有する物質となったり、蛍光性物質となるようなも
の、例えば、ニンヒドリンやオルトフタルジアルデヒド
などの化合物を含む溶液を用いることで達成される。
きたペプチド、タンパク質は、検出される。図２におい
ては、吸収波長２１５ｎｍの紫外吸収検出器により検出
し、種々のペプチドを分離したクロマトグラムが得られ
た。ここで、検出の方法としては、溶出された分離対象
物質を直接検出しても良いが、図１に示される検出器の
前に、送液ポンプ及び検出用溶液を加え、分離カラムか
ら送液された溶液と合流させるという方法を用いても良
い。この際に用いられる、送液ポンプとしては上記記載
のものと同じような構成でよく、また、検出用溶液とし
ては、分離対象物質と反応して、紫外あるいは可視の吸
収を有する物質となったり、蛍光性物質となるようなも
の、例えば、ニンヒドリンやオルトフタルジアルデヒド
などの化合物を含む溶液を用いることで達成される。
【００３４】図２は実施例として示されるクロマトグラ
ムである。図２において、（Ａ）は従来の逆相クロマト
グラフィーによる方法であり、カラムとしてＴＳＫｇｅ
ｌＯＤＳ−８０Ｔｓが使用され、（Ｂ）は本発明の順相
クロマトグラフィーによる方法であり、カラムとしてＴ
ＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０が使用された。クロマト
グラフィーの条件としては、（Ａ）においては、移動相
１として０．１容積％のトリフルオロ酢酸及び５容積％
のアセトニトリルを含む水溶液、移動相２として０．１
容積％のトリフルオロ酢酸及び５５容積％のアセトニト
リルを含む水溶液を、８３．３分間にて移動相１より移
動相２へと直線濃度勾配により溶出させたものである。
（Ｂ）においては、移動相１として０．１容積％のトリ
フルオロ酢酸及び９７容積％のアセトニトリル、移動相
２として０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５５容積％
のアセトニトリル（以上、残りは水）を、７０分間にて
移動相１より移動相２へと直線濃度勾配により溶出させ
たものである。試料の容量は２０μｌ、分離温度は４０
℃である。図２より明らかなように、本発明の方法によ
れば、各ペプチドがその分離カラムとの疎水的相互作用
に依存した順に溶出され、分離能の点においても従来の
逆相クロマトグラフィーによる方法と比較して優れてい
ることが分かる。
ムである。図２において、（Ａ）は従来の逆相クロマト
グラフィーによる方法であり、カラムとしてＴＳＫｇｅ
ｌＯＤＳ−８０Ｔｓが使用され、（Ｂ）は本発明の順相
クロマトグラフィーによる方法であり、カラムとしてＴ
ＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０が使用された。クロマト
グラフィーの条件としては、（Ａ）においては、移動相
１として０．１容積％のトリフルオロ酢酸及び５容積％
のアセトニトリルを含む水溶液、移動相２として０．１
容積％のトリフルオロ酢酸及び５５容積％のアセトニト
リルを含む水溶液を、８３．３分間にて移動相１より移
動相２へと直線濃度勾配により溶出させたものである。
（Ｂ）においては、移動相１として０．１容積％のトリ
フルオロ酢酸及び９７容積％のアセトニトリル、移動相
２として０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５５容積％
のアセトニトリル（以上、残りは水）を、７０分間にて
移動相１より移動相２へと直線濃度勾配により溶出させ
たものである。試料の容量は２０μｌ、分離温度は４０
℃である。図２より明らかなように、本発明の方法によ
れば、各ペプチドがその分離カラムとの疎水的相互作用
に依存した順に溶出され、分離能の点においても従来の
逆相クロマトグラフィーによる方法と比較して優れてい
ることが分かる。
【００３５】本発明の方法又は装置により分離できる対
象試料としては、ペプチド及び／又はタンパク質を１以
上含む試料であればよく、例えば、血清、血漿、尿等の
体液成分や、微生物等によるペプチド、タンパク質等の
製造に使用される溶液、廃液などあらゆる試料を対象と
することができる。
象試料としては、ペプチド及び／又はタンパク質を１以
上含む試料であればよく、例えば、血清、血漿、尿等の
体液成分や、微生物等によるペプチド、タンパク質等の
製造に使用される溶液、廃液などあらゆる試料を対象と
することができる。
【００３６】さらに、本発明の方法によれば、試料中の
ペプチド及び／又はタンパク質がカラムとの疎水性相互
作用に依存して溶出されるため、その分離により、ピー
クの高さや面積を求めることで定量が可能であり、ピー
クの保持時間を求めることで定性も可能である。
ペプチド及び／又はタンパク質がカラムとの疎水性相互
作用に依存して溶出されるため、その分離により、ピー
クの高さや面積を求めることで定量が可能であり、ピー
クの保持時間を求めることで定性も可能である。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、逆相クロマトグラフィ
ーによる方法で保持しないような疎水性の無いあるいは
分離カラム基材との疎水性の差があまり無く分離できな
いような試料中のペプチド及び／又はタンパク質を分離
し、さらに、分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精
製できることが可能となるため、有用である。
ーによる方法で保持しないような疎水性の無いあるいは
分離カラム基材との疎水性の差があまり無く分離できな
いような試料中のペプチド及び／又はタンパク質を分離
し、さらに、分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精
製できることが可能となるため、有用である。
【図１】本発明の一実施態様を示すクロマトグラフィー
装置である。
装置である。
【図２】実施例として示されるクロマトグラムである。
図において、Ｘ軸（横軸）は保持時間（分）を示し、Ｙ
軸（縦軸）は２１５ｎｍにおける吸光度を示す。
図において、Ｘ軸（横軸）は保持時間（分）を示し、Ｙ
軸（縦軸）は２１５ｎｍにおける吸光度を示す。
１：図１において、クロマトグラフィー装置の第１移動
相用の瓶であり、その中に移動相１が入っている。 ２：図１において、クロマトグラフィー装置の第２移動
相用の瓶であり、その中に移動相２が入っている。 ３：図１において、クロマトグラフィー装置の送液ポン
プである。 ４：図１において、クロマトグラフィー装置の試料注入
装置である。 ５：図１において、クロマトグラフィー装置の分離カラ
ムである。 ６：図１において、クロマトグラフィー装置の恒温槽で
ある。 ７：図１において、クロマトグラフィー装置の紫外吸収
検出器である。 ８：図２において示されるペプチド、Ｐｒｏ Ｇｌｙで
ある。 ９：図２において示されるペプチド、Ｌｅｕ Ｇｌｙで
ある。 １０：図２において示されるペプチド、Ｐｈｅ Ｇｌｙ
である。 １１：図２において示されるペプチド、Ｇｌｕ Ｈｉｓ
Ｘａａである。ここで、ＸａａはＰｒｏのカルボキシ
ル基（−ＣＯＯＨ）が−ＣＯＮＨ2となったものであ
る。 １２：図２において示されるペプチド、Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｇｌｙである。 １３：図２において示されるペプチド、Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ａｒｇである。 １４：図２において示されるペプチド、Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｕである。 １５：図２において示されるペプチド、Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇである。
相用の瓶であり、その中に移動相１が入っている。 ２：図１において、クロマトグラフィー装置の第２移動
相用の瓶であり、その中に移動相２が入っている。 ３：図１において、クロマトグラフィー装置の送液ポン
プである。 ４：図１において、クロマトグラフィー装置の試料注入
装置である。 ５：図１において、クロマトグラフィー装置の分離カラ
ムである。 ６：図１において、クロマトグラフィー装置の恒温槽で
ある。 ７：図１において、クロマトグラフィー装置の紫外吸収
検出器である。 ８：図２において示されるペプチド、Ｐｒｏ Ｇｌｙで
ある。 ９：図２において示されるペプチド、Ｌｅｕ Ｇｌｙで
ある。 １０：図２において示されるペプチド、Ｐｈｅ Ｇｌｙ
である。 １１：図２において示されるペプチド、Ｇｌｕ Ｈｉｓ
Ｘａａである。ここで、ＸａａはＰｒｏのカルボキシ
ル基（−ＣＯＯＨ）が−ＣＯＮＨ2となったものであ
る。 １２：図２において示されるペプチド、Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｇｌｙである。 １３：図２において示されるペプチド、Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ａｒｇである。 １４：図２において示されるペプチド、Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｕである。 １５：図２において示されるペプチド、Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇである。
Claims (6)
- 【請求項１】ペプチド及び／又はタンパク質を含有する
試料を順相液体クロマトグラフィーにより分離するにあ
たり、該試料を分離カラムに注入した後、有機溶媒と水
及び／又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミン
を添加されてなる移動相を展開してペプチド及び／又は
タンパク質を分離することを特徴とする分離法。 - 【請求項２】酸がトリフルオロ酢酸であることを特徴と
する請求項１に記載の分離法。 - 【請求項３】請求項１又は請求項２に記載の移動相にお
いて、酸が移動相全量の０．０１〜２０容積％含まれる
ことを特徴とする分離法。 - 【請求項４】有機溶媒がアセトニトリルであり、かつそ
の濃度が移動相全量の６０容積％以上含まれることを特
徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分離法。 - 【請求項５】分離カラムが、アミノ基、水酸基、アミド
基、カルボキシル基及びスルホン酸基からなる群より選
ばれる１以上の官能基を有する基材より構成されること
を特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分離法。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の分離法を
用いることを特徴とする装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17194997A JP3780638B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | 分離法及びこれを用いた装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17194997A JP3780638B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | 分離法及びこれを用いた装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1123558A true JPH1123558A (ja) | 1999-01-29 |
| JP3780638B2 JP3780638B2 (ja) | 2006-05-31 |
Family
ID=15932787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17194997A Expired - Fee Related JP3780638B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | 分離法及びこれを用いた装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3780638B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042350A2 (en) | 2002-10-30 | 2004-05-21 | Merck & Co., Inc. | Using amines or amino acids as mobile phase modifiers in chromatography |
| CN113994205A (zh) * | 2019-06-07 | 2022-01-28 | 沃特世科技公司 | 使用金属螯合剂作为流动相添加剂改善基于rplc的肽图分析色谱性能 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5992349A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析法 |
| JPS63127156A (ja) * | 1986-11-17 | 1988-05-31 | Tosoh Corp | 充填剤およびその製法 |
| JPH06507173A (ja) * | 1991-04-22 | 1994-08-11 | ズルツァー バイオロジクス インコーポレイテッド | 骨誘導性タンパク混合物および精製法 |
| JPH06298672A (ja) * | 1993-04-16 | 1994-10-25 | Sumika Bunseki Center:Kk | キラリティ識別剤およびクロマトグラフィー用分離剤 |
-
1997
- 1997-06-27 JP JP17194997A patent/JP3780638B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5992349A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析法 |
| JPS63127156A (ja) * | 1986-11-17 | 1988-05-31 | Tosoh Corp | 充填剤およびその製法 |
| JPH06507173A (ja) * | 1991-04-22 | 1994-08-11 | ズルツァー バイオロジクス インコーポレイテッド | 骨誘導性タンパク混合物および精製法 |
| JPH06298672A (ja) * | 1993-04-16 | 1994-10-25 | Sumika Bunseki Center:Kk | キラリティ識別剤およびクロマトグラフィー用分離剤 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042350A2 (en) | 2002-10-30 | 2004-05-21 | Merck & Co., Inc. | Using amines or amino acids as mobile phase modifiers in chromatography |
| WO2004042350A3 (en) * | 2002-10-30 | 2004-07-15 | Merck & Co Inc | Using amines or amino acids as mobile phase modifiers in chromatography |
| JP2006504786A (ja) * | 2002-10-30 | 2006-02-09 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | クロマトグラフィーにおける移動相改質剤としてのアミンまたはアミノ酸の使用 |
| US7241866B2 (en) | 2002-10-30 | 2007-07-10 | Merck & Co., Inc. | Using amines or amino acids as mobile phase modifiers in chromatography |
| CN113994205A (zh) * | 2019-06-07 | 2022-01-28 | 沃特世科技公司 | 使用金属螯合剂作为流动相添加剂改善基于rplc的肽图分析色谱性能 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3780638B2 (ja) | 2006-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yoshida | Peptide separation by hydrophilic-interaction chromatography: a review | |
| Mant et al. | High performance liquid chromatography of peptides and proteins | |
| Bidlingmeyer et al. | Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization | |
| Liu et al. | Physically adsorbed chiral stationary phase of avidin on monolithic silica column for capillary electrochromatography and capillary liquid chromatography | |
| US4377482A (en) | Mobile phase for liquid chromatography | |
| JP3444900B2 (ja) | 液体クロマトグラフィ及びカラム充填剤 | |
| Jadaun et al. | HPLC for Peptides and Proteins: Principles, Methods and Applications. | |
| Račaityt et al. | Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger | |
| JPWO1998044344A1 (ja) | 液体クロマトグラフィ及びカラム充填剤 | |
| Zhao et al. | Preparation of a weak anion exchange/hydrophobic interaction dual‐function mixed‐mode chromatography stationary phase for protein separation using click chemistry | |
| Hearn | Peptide analysis by rapid, orthogonal technologies with high separation selectivities and sensitivities | |
| US20050042772A1 (en) | Removal of proteins from a sample | |
| Sottrup-Jensen et al. | Analysis of amino acid phenylthiohydantoins by high-performance liquid chromatography using gradient elution with ethanol | |
| Mant et al. | Reversed‐phase HPLC of peptides: Assessing column and solvent selectivity on standard, polar‐embedded and polar endcapped columns | |
| JP3780638B2 (ja) | 分離法及びこれを用いた装置 | |
| Harada et al. | Isolation of bacitracins A and F by high-speed counter-current chromatography | |
| Wittmann-Liebold et al. | Microsequencing of Peptides and Proteins with 4-N, N-Dimethylaminoazobenzene-4′-isothiocyanate | |
| Rissler | Sample preparation, high-performance liquid chromatographic separation and determination of substance P-related peptides | |
| Lee et al. | Influence of the mobile phase on salmon calcitonin analysis by reversed-phase liquid chromatography | |
| Moritz et al. | Purification of proteins and peptides for sequence analysis using microcolumn liquid chromatography | |
| Smith et al. | Application of packed column supercritical fluid chromatography to the analysis of barbiturates | |
| Takeuchi et al. | Micro high-performance liquid chromatography of 5-dimethylaminonaphthalenesulphonyl-amino acids | |
| Zou et al. | Perfusion immunoaffinity chromatography and its application in analysis and purification of biomolecules | |
| Stroink et al. | Development of an on-line size exclusion chromatographic—reversed-phase liquid chromatographic two-dimensional system for the quantitative determination of peptides with concentration prior to reversed-phase liquid chromatographic separation | |
| Godtfredsen et al. | On the analysis of phenylthiohydantoin amino acids by high performance liquid chromatography |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040428 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20060131 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060214 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060227 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100317 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100317 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110317 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110317 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120317 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130317 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130317 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140317 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |