JPH06507173A - 骨誘導性タンパク混合物および精製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 骨誘導性タ゛／バク混合物および精製法発朋、り野 本発明（ゴ、一般に、乍ｊの成長を誘導または促進するごとに有用なタンパク質 （即ち、骨誘導性９：／バク質）ならびに、無機質除去Ｉ〜か骨の抽出物からそ のようなタンパク質を精２だするために用いる方法に関する。より具体的には、 本発明は、眉誘導タンパク質を精製するために好まＬ７＜は組み合わせで使用さ れろ限外ろ過性、アニオン交換法、カチオン交換法および逆相旨速液体りＤ７ト グラフ、イー（ＨＰＬＣ）法に関する。

欠呵ｐ肯Ｊ、 骨は多くのタンパク質を含み、そのいくつかは省の成長を誘導または促進する。

組換えＤＮＡ技術または自然に発生するタンパク質の精製によって特定の骨誘導 性タンパク質を製造することに多大な研究が当てられてきた。このようなタンパ ク質およびそれらを得るための多様な方法は、数多くの特許の主題である。しか し、ｉＴ用な骨誘導性タンパク質の経済的で大規模な工業的量産に対１７ては、 はとんど研究がなされていない。

カリフォルニア州バロアルトのコラーゲン（Ｃｏｌｌａにｅｎ）社は、骨誘導性 タンパク質に閏する多数の特許の譲受人である。１９８４年２Ｊ］２８Ｂに発行 されたセイデインらによる米国特許第４，４３４，０９４号は、カチオン交換ク ロマトグラフィ・−を利用して、骨形成因子を部分的に精製し、３０キロドルト ン（ｋＤ）未満の分子量を有する非繊維状のタンパク質を無機質除去した骨抽出 物から単離する方法を示している。

部分的に精製されたｌ０＝３０ｋＤの骨誘導因子と、無機質除去した骨からの抽 出、ゲルろ過および、逆相高速液体クロマトグラフィー　（ＨＰＬＣ）を含むこ とができる、カルボキシルメチルセルロースカラムでのカチオン交換クロマトグ ラフィーをはじめとする精製法とか、１９８６年１２月９日に発行されたセイデ インらによる米国特、゛（第４，６２７．９８２−′＋に記載されている。

また、セイディンらによる１、：ｊラーゲン社に譲渡された１９８８年９月２７ 目に発行の米国特許第４，７７４，２２８号は、竹の中に見られる２種の２６ｋ Ｄタンパク質を記載１〜ている。これらのタンパク質は、ＴＧＢ−β検定で活性 を有するものであり、セ・イブインの０９４　ｈ＋　’Ｗｆ　ｉｉＴに教示され た方法に似てはいるが、逆相ＨＰ　Ｉ−Ｃまたは酢酸−原本ゲル電気泳動を含み 、精製されたタンパク質が軟骨形成活性（骨形成に関連するといわれでいる）を 示すところの方法によって精製される。１９８９年９月５［１に発行されたナタ ンらによる米国特許第４，８６３，７３２号は、骨形成性因子、例ズばＰイブ、 イ＞、の゛９８２号特許に記載のものをアテロペプチドコラーゲンと合わせ、３ を沈（、よ−）でさらに精製したものの注入性に液（１′関する。他の特許、例 えば１９８８年１２月６Ｅｌに発ｔ−７されたワルラスらによる米国特ｒイ第４ ，７８９，６６３号お上で月９８９年１月３［」に発行されたビッツエらによる 第４，７９５，４６７号は、アテロペプチドコラ−ゲン物質の混合物に関する、 ンージャルＲユリストは、骨誘導剤の分野の多数の特許に名をあげた発明者７・ ある、　１．９１１！年１０月１３［コに発行された、ユリストによる米国特許 第４，２９４，７５３号は、・胃形態発生タンパク質（ＢＭＰ）を得るための方 法であって、無機質除去しまた骨を中性塩で処理し、て８ｔコラーゲンをゼラチ ンに変換し、ＢＭＰを可溶化剤で抽出１〜、次いで透析によって可溶性化剤およ び塩を除去してＢＭＰを沈殿させることによる方法を記載している。溶液からの タンパク質の沈殿は選択性が高くない−とが認められている。１．０００−、− １００．０００の範囲の分子量を有するＥＭＰが、１９８４年６月１９［１に発 行されたユリストによる米国特許第４，４５５，２５６号の主題である。　１９ ８６年１０月２８Ｅ］に発行されたユリストによる米国特許第４，６１９，９８ ９号は、ヒトおよびウシ利動物のＢＭＰ紹成組成よび因子をさらに精製、単離す るための、追加的な透析および共沈の段階を含む改良された方法を開示している 。１９８８年８Ｆ１２　Ｂに発行されたユリストによる米国特許第４，７６１， ４７１号は、前述の方法によ・）で得られる、活性の１７．５ｋＤ　（ヒト）ま たは１ｇ、５ｋＤ　（ウシ科動物）ＢＭＰ因子ならびに約１４．２２．２４およ び３４ｋＤの分子・量奈ａする、骨形成を促進はするが誘導はＩ７ないＢＭＰ関 連タンパク質を含有する実質的に純粋なりＭＰ組成物を含む生成物に関Ｉ７てい る。

１９８９年ＩＯ月３１出こ発行さハたワングらによる米国特許第４，８７７．８ ６４号は、組換え遺伝子技術によって製造する、”とができる、特定のベブプ′ Ｉパ配列を特徴とする約２８ｋＤ・・−３叶りの２１．、３−３、−ｐびウシ科 動物の骨誘導性因ｆ・を開示し、でいろ。

１９８９年２月１４８に発行されたセンにＪ、る米国特許第４，８０４，７４４ 号ｉＪ、約２２＝２４ｋＤの分子量を有する主要な骨形成性タンパクｔ（Ｐ、） を示１〜ｒ：いる７この特許はまた、Ｐ、なしでは非骨形成性であくμ゛／バク 質Ｐ、およびＰＡを示■２、さらには、無機質除去１−ｆニー労組１哉からＰ、 を単離（ξ）ための、抽出、透析、ゲルろ過および）（Ｐ　Ｌ　Ｃの段階をＳむ 方法を示ｉ−テ、’いる。

明らかに、胃誘導的活性の高いタンパク質の混合物を得る、ニアとが望ましいで あろう７そのようなタコ、・バク質を効率的かつ効果的に一■−タ的規模で製造 することができるならば、有益であろう。まブー、その４−うなタンパク質を、 その製造を給入：限にＬながらもその劣化を最小限にするような方法で製造する ことができるならば、有益であろう。また、処理条イ１の！」・さな２：動を訂 容１．うる方法においで比較的周知のユニット操作を利用してそのようなタンパ ク質を製造することかできるならば、有益であろう。また、所望の混合物４・得 るために、まず個々の特定のタンパク質を得で、それらを混合し直すことへ・・ Ｉ〜に、タンパク質の混合物を直接的に製造する、−とができるならば、有益で あろう。

光男ｐ概叉 本発明は、好ましくはウシ科動物の骨からの精製によって骨誘導性因子を得るた めの方法ど、その結果として得られる生成物とな包含する、骨誘導性因子のタン パク質を精製する方法の一実施態様は、好まＩ２＜は約ｐＨ８〜約ｐＨ９のｐＨ を有し、好＊Ｌ＜）ｉ約１，９００　μｍｈｏｇ　（１，９ｘｌＯ−’Ｓ）未満 の導電率を有する無機質除去した骨抽出物溶液に対してアニオン交換クロマトグ ラフィーを実施することからなる。好ましくは約１０，２６０μａ＋ｈｏｓ　（ １，０２６ｘｌＯ−”Ｓ）〜約１１，２００μｍｈｏｓ　（１，＋２０　Ｘｌ０ −”Ｓ）の導電率を有する溶離剤により、アニオン交換樹脂からタンパク質を溶 離させる。溶離したタンパク質の溶液を、好ましくは、約ｐＨ４，４〜約ｐ　Ｈ ５，０（７）　ｐ　Ｈおよび好ましくは約１７，９００μｍｈａｇ　（１，７９ Ｘ１０ＩＳ）　−１９，２００μｍｈｏｓ　（１，９２ＸｌＯ−”Ｓ）の導電率 に調節し、カチオン交換樹脂に装填する。タンパク質は、好まシくハ約３９．＋ ００ｕｍｈｏｓ　（３，９１ｘｌＯ−”Ｓ）　〜約８２゜７００μｍｈｏｓ　（ ８，２７ｘｌＯ−”Ｓ）の導電率を有する溶離剤により、カチオン交換樹脂がら 溶離される。８２，７００μｍｈｏｓを超える導電率値をうまく利用することも できるが、より高い値をもってすると、ＨＰＬＣの前の透析により長い時間を要 するであろう。カチオン交換樹脂から溶離させたタンパク質を逆相ＨＰＬＣカラ ムに装填する。好ましくは約３３容量％〜３７容量％の範囲の上昇するアセトニ トリル濃度勾配を有する溶離剤により、ＨＰＬＣカラムからタンパク質を溶離さ せて、高められた骨誘導的活性を有する精製されたタンパク質混合物を得る。

本発明のさらなる実施態様においては、アニオン交換樹脂は強陽性であり、第四 アミン官能基を有するものである。本発明のもう一つの実施態様においては、カ チオン交換樹脂は強陰性であり、スルホン酸官能基を有するものである。本発明 はまた、炭化水素で改質されたシリカ、好ましくはＶＹＤＡＣ”　（分離群（Ｔ ｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ）　）　Ｃ＋ａカラムであるＨＰＬＣ 充填材の使用を含む。

本発明はまた、上述の方法によって得られる骨誘導性因子を含む。骨誘導性因ｐ の一実施態様においては、この因子は、図１に示すドデシル硫酸ナトリウム・ポ リアクリルアミドゲル電気体動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分布を示す多数のタンパク 質の混合物である。本発明のもう−っの実施態様は、好ましいアミノ酸組成、す なわち酸性アミノ酸［ＡＳＰ　（＋ＡＳＮ）およびＧＬＵ　（＋ＧＬＮ）］約２ ３４モル％；ヒドロキシアミノ酸（ＳＥＲ＋Ｔ）（Ｒ）約１３．５モル％；脂肪 族アミノ酸（ＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯｌＭＥＴ、ＶＡＬ、ＩＬＥおよびＬＥＵ） 約４０θモル％：芳香族アミノ酸（ＴＹＲおよびＰＨＥ）約６．８モル％ならび に塩基性アミノ酸（ＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳ）約１６．６モル％を有するタ ンパク質の混合物である。ＴＲＰ、ＣＹＳおよびｃＹｓは測定せず、モル％の計 算には入れていない。

本発明の好ましい実施態様によると、無機質除去した雪粒子を、グアニジン塩酸 塩を用いるタンパク質抽出に付す。抽出物溶液をろ過し、二段階限外ろ適法に付 す。第一の限外ろ過段階においては、好ましくは、１００ｋＤの公称分子量分画 （ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過膜を使用する。残留液を捨て、ろ液を、好ましく は約１０ｋＤの公称ＭＷＣＯを有する限外ろ過膜を使用する第二の限外ろ過段階 に付す。次に、残留液を透析ろ過に付してグアニジンに代えて尿素を用いる０次 に、タンパク質含有尿素溶液を、連続イオン交換クロマトグラフィー、すなわち 、まずアニオン交換クロマトグラフィー、続いてカチオン交換クロマトグラフィ ーに付す。上述した方法においては、骨誘導的活性のタンパク質を溶液中に保持 することが有利である。好ましくは、上記の方法によって製造した骨誘導性タン パク質を次にＨＰＬＣに付す。

本発明の利点は、工業的量産規模に容易に拡大することができる方法が得られる ということである。さらなる利点は、精製段階の間、タンパク質が溶液中に保持 されるということである。もう一つの利点は、製造過程の間、タンパク質がほと んど劣化を示さないということである。もう−〇の利点は、所望により、得られ たタンパク質混合物を、別々の方法によって製造されたタンパク質と混合し直す 二となしに、直接的に使用しうるということである。

Ｋ画ρ飼巣な説皿 図１は、本発明の方法によって得られる骨誘導的活性のタンパク質混合物の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥを還元および未還元の両形態で示すものである。

図２は、実施例に用いる「Ｘ線評点」を得るために用いられるＸ線基準を示すも のである。

聚匹ｑ洋綽な訳皿 本発明によれば、骨誘導性因子を骨から精製する方法が与えられ、かつ、骨誘導 性因ｒ−が得られる。

本発明の一実施態様においては、骨誘導タンパク質を精製する方法は、限外ろ過 段階と、アニオン交換クロマトグラフィ一段階と、カチオン交換クロマトグラフ ィ一段階とを含む。本発明の他の実施態様はＨＰＬＣ精製段階を含む。

−ド発明のもう一つの側面は、骨誘導性タンパク質混合物である。一実施態様に おいては、この混合物は数種類のタンパク質を含むものである。これを、還元お よび未還元状態の骨誘導性因子−の５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す図１に示す。本発明 のもう一つの実施態様はまた、アミノ酸組成、すなわちＡＳＰ　（＋ＡＳＮ）お よびＧＬＵ　（＋ＧＬＮ）約２０７〜約２６１（好ましくは約２３４）モル％； ＳＥＲおよびＴＨＲ約１１３〜約１５７（好ましくは約１３５）モル％；ＡＬＡ 、ＧＬＹ、ＰＲＯ１ＶＡＬ、ＭＥＴ、ＩＬＥおよびＬＥＵ約３７６〜約４２．４ 　（好まシくハ約４０．０）　モ＃％、ＴＹＲおよびＰＨＥ約５８〜約７９　（ 好ましくは約６８）モル％ならびにＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳ約１３．３〜約 １９．９　（好ましくは約１６６）モル％を有する骨誘導的活性のタンパク質混 合物を含む、さらなる実施態様は、説明Ｉ７た精製法の各実施態様から得られる 骨誘導性因子を含む。

こ二に使用する「骨誘導性因子」とは、組織学的評価による決定では、骨芽細胞 、破骨細胞および竹状基質を伴う骨の新たな形成を示す、骨誘導的に活性である １種またはそれ以上のタンパク質を含む組成物をいう。例えば、骨誘導的活性は 、試験すべき物質を付着させるところの支持体を使用する試験によって実証する 二とができる。付着物質を有する支持体を試験動物に皮下埋植する。この埋植片 を後で取り出し、骨芽細胞、破骨細胞および竹状基質を含む骨形成の存在につい て顕微鏡で調べる。

本方法に好ましい出発原料は、タンパク質抽出に備えて骨を粉砕、洗浄および無 機質除去によって前処理し、骨タンパク質を抽出し、抽出したタンパク質を多数 の精製段階によって濃縮することを含むことが好ましい多段階手順によって得ら れる。本方法の出発原料の好ましい源は、哺乳類の骨である。その入手の簡便性 および低廉さのため、通常はウシ科動物の骨を使用する。しかし、他の哺乳類の 骨を適宜に使用して本発明を実施することもできる。骨は、当該技術において公 知である慣例的な手段、例えば粉砕および洗浄により、骨タンパク質の抽出に備 えて前処理する。通常、骨を粉砕して連続的により微細な粒子にし、洗剤溶液に 浸漬して骨身外の物質を除去する。好ましくは、骨を、４ｍｍ未満、好ましくは 約１ｍｍ〜約４ｍｍの大きさの粒子に粉砕し、粉砕の合間に洗剤溶液に浸漬し、 浮選タンク中ですすいで軟組織を除去する。

次に、洗浄した粉砕骨を酸で無機質除去する。骨を適当な酸に浸漬し、これを好 ましくは室温で撹拌してもよい。酸浸漬溶液のｐＨは、通常ｐＨ１，３以下に維 持する。希釈ＨＣＩ溶液（例えば約０．６　Ｍ〜約１．２　Ｍ）が骨の無機質除 去に効果的であることがわかった。あるいはまた、他の適当な酸、例えばギ酸を 使用することもできる。無機質除去の間の過剰な発泡を防ぐために、オクチルア ルコールまたは他の脱泡剤が有用である。

骨は、はぼ完全に無機質除去されるまで、十分な時間酸に浸漬しておく。Ｘ線分 析を利用して、無機質除去の程度を評価してもよい。あるいはまた、経験によっ て標準的な手法を開発して、無機質除去に要する時間を決定することもできる。

通常は、少なくとも７時間を要する。次に、無機質除去した骨をすすいで酸を除 去する。通常、骨は、−夜またはすすぎ排液のｐＨがｐＨ４以上に達するまで水 ですすぐ。当業者であれば理解することができるように、代わりの洗浄および無 機質除去方法を使用してもよい。

タンパク質は、タンパク質変性剤、例えばグアニジニウムイオンおよび／または 尿素を使用して、無機質除去した骨から抽出する。好ましくは、抽出は、２０℃ 未満、より好ましくは１５℃未満の温度で実施する。他の適当な変性剤を同様に 使用しうろことが注目されよう、グアニジン塩酸塩はイオンであり、タンパク質 を溶液中に保持するための可溶化剤としても機能するため、好ましい変性剤であ る。

任意には、抽出の間にカオトロープを加えて、抽出したタンパク質の溶解性を改 善することができる。適当なカオトロープには、塩化カルシウム（ＣａＣ１＊） 、塩化マグネシウム（Ｍｇ　Ｃ１ｍ　）および塩化セシウム（ＣｅＣＬ）がある 。

タンパク質は、当該技術において、通常使用される手段により、無機質除去した 骨から抽出することができる。例えば、フィルタプレス中、タンパク質変性剤を 無機質除去した骨の中に汲み入れて、回収される変性剤中にタンパク質を抽出す ることができる。適当な低温を提供するために、変性剤を無機質除去した骨の中 に汲み込むとき、それを初めに低い温度、好ましくは約り℃〜約４℃に冷却する ことができる。変性剤の温度は、抽出過程の間に上昇させることができる。

普通、実質的にすべての非コラーゲン質の骨タンパク質が無機質除去した骨から 除去されるまで抽出を続ける。通常の抽出は約４８時間を要する。好ましくは。

抽出溶液を中性ｐＨ付近に維持する。

変性剤溶液中に抽出したタンパク質を、一連の精製段階によって分離する。第一 の限外ろ過性が、所定の望みの範囲の分子量を有する望みのタンパク質を選択し て、さらなる処理に備える。好ましくは、第一段階として、１００ｋＤの公称分 子量分画（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過膜、例えば、　［セントラセット（Ｃｅ ｎｔｒａｓｅｔｔｅ月（フィルトン社）の商品名のもとで販売されているプレー ト＆フレーム型接線流ろ過ユニットを使用する。ろ過は、好ましくは、加圧下に 、通常は約５０ｐａｉのろ過圧で実施する。タンパク質濃度は抽出の完結性によ って変化する。

第一の限外ろ過段階に続き、好ましくはさらに低い分子量のタンパク質を除く１ ０ｋＤの公称分子量分画の膜を介する第二の限外ろ過段階によってろ液を濃縮す る。

第二の限外ろ過は、所望の範囲内の分子量を有するタンパク質混合物（「ろ過し たタンパク質濃縮物」）とともに、残留液を生じさせる。

好ましい実施態様においては、その後のイオン交換クロマトグラフィーに備えて 、ろ過したタンパク質濃縮物をイオン変性剤溶液から非イオン変性剤溶液、例え ば尿素に移す。イオン変性剤、例えばグアニジン塩酸塩は、所望のタンパク質を 選択的に結合するイオン交換樹脂の能力を損なうため、その後のイオン交換精製 段階に使用するには非イオン変性剤が好ましい。好ましくは、タンパク質変性剤 溶液は、トリス［ヒドロキシメチルコアミノメタン（以下「トリス」という）で 緩衝し、約ｐ　Ｈ８，５のｐＨに滴定した約２Ｍ〜約６Ｍの尿素溶液である。

イオン変性剤から非イオン変性剤へのタンパク質の移行は、透析ろ過または透析 を使用して実施することができる。透析ろ過は、適当な接線流限外ろ過ユニット 、例えばセントラセット７″（フィルトン）限外ろ過ユニットを使用して実施す る。透析ろ過または透析の使用により、溶液からタンパク質を沈殿させることな しに、ろ過したタンパク質濃縮物を適当な変性剤に移すことができる。この手法 は、その後の精製を簡素化し、またはタンパク質を沈殿させるならば生じるおそ れのある損失を防ぐため、有利である。この手法を工業的量産規模で使用しうる ということもまた有利である。

本発明は、抽出した骨タンパク質の溶液を精製して、骨誘導的活性のタンパク質 混合物を生じさせるためのアニオン交換法を含む。アニオン交換法の好ましい実 施態様においては、好ましい出発原料を得るための上述した方法を使用して出発 原料を前処理する。アニオン交換法は、以下に説明する追加的な精製法とあわせ て利用する。

イオン交換クロマトグラフィー、すなわちアニオン交換およびカチオン交換クロ マトグラフィーにおいては、特定のイオン交換樹脂をめる特定のタンパク質の親 和力は、タンパク質溶液のイオン強度およびｐＨに依存する。溶液のイオン強度 は、その導電率によって測定することができる。あるいはまた、溶液のイオン強 度は、特定の対イオン濃度に換算して測定することもできる。ここに使用する「 対イオン濃度」とは、イオン交換樹脂上の結合場所をめてタンパク質と競合する 溶液中のイオンのモル濃度をいう。

本発明にしたがって骨タンパク質溶液をアニオン交換カラムに装填する前に、骨 タンパク質溶液の導電率を調節して所望のタンパク質を選択的に樹脂に結合させ る。本アニオン交換法においては、対イオン濃度の変動により、骨タンパク質溶 液の導電率を、約１，９００　μｍｈｏｓ　（１，９Ｘｌ０−’Ｓ）未満、より 好しくは約１，０８０μｍｈｏｓ　（１，０８Ｘ１０−’Ｓ）　〜約１，９００ 　μｍｈｏｓ　（１，９ｘｌＯ−’Ｓ）に調節する。好ましい実施態様において は、対イオンはＣＩ−であり、約０．１３５　Ｍ未満のＮ　ａ　Ｃ１濃度で存在 する６ 適当な導電率を有する、アニオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液を アニオン交換カラムに装填する。本アニオン交換法においては、アニオン交換カ ラムは、強陽性のアニオン交換樹脂を有するものである。強陽性のアニオン交換 樹脂を用いる本アニオン交換法は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を精製する ことに効果的であることがわかった。ここに使用する強陽性のアニオン交換樹脂 とは、強陽性の官能基、例えば第四アミン官能基を有する樹脂をいう。第四アミ ン官能基を有する好ましい樹脂は、　［Ｑ−セファロース（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏ ｓｅ）」”　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）の商品名のもとで販売 されている。しかし、同様に塩基性の官能基を有する他の樹脂もまた適当である 。

アニオン交換樹脂への結合の選択性に影響するさらなる要因は、アニオン交換カ ラムに装填される骨タンパク質溶液およびアニオン交換溶離剤のｐＨである。

１↑タンパク質溶液および溶離剤のｐＨは、骨タンパク質溶液からの望みのタン パク質がカラムを通過するときにそれに樹脂を結合させ、タンパク質の所望の溶 離を可能にするのに効果的なｐＨである。一般に、約ｐＨ８〜ｐＨ９のｐＨがこ の方法に効果的である。好ましくは、タンパク質溶液および溶離剤のｐＨを約ｐ Ｈ８５に調節する。

アニオン交換カラムを通過する骨タンパク質溶液の線速度は、必要とされる回収 パラメータによって決まる。通常、処理を低速で実施して所望のタンパク質のほ ぼ完全な吸収を可能にして、タンパク質の損失が最小限になるようにする。しか し、線速度はそれより大きくてもよいが、タンパク質損失を支えうろことを認識 すべきである。

アニオン交換法は、結合したタンパク質の所望の部分を溶離剤によってカラム樹 脂から選択的に脱着させることをさらに含む。脱着される結合タンパク質の部分 は、溶離剤溶液の導電率によって決まる。タンパク質は、骨誘導的活性のタンパ ク質混合物を得るのに十分な導電率を有する溶液により、本発明のアニオン交換 カラムから溶離させる。好ましくは、溶離剤は、約１０，２６０μ＋ｅｈｏａ　 （１，０２６Ｘ１０−”Ｓ）　〜約１１，２００μｍｈｏｓ’　（１，１２０ｘ ｌＯ−”Ｓ）の導電率を有するものである。より高い導電率を用いてもよいが、 それは、後の精製段階で除去しなければならないかもしれない、より多量の物質 の脱着を招く。

本発明のアニオン交換溶離剤は、通常は、適当な導電率を得るのに適当な塩漬度 を有するタンパク質変性剤溶液である。好ましい溶離剤は、塩化ナトリウムを含 むトリス塩基で緩衝した６Ｍの尿素である。塩化ナトリウム（ＮａＣ１）は、溶 離剤中に適当な導電率を生じさせる対イオン濃度を提供するのに効果的である。

好ましい実施態様においては、溶離剤は、約０１０Ｍ〜約０．１６Ｍ、より好ま しくは約０．１０５　Ｍ〜約０．１４５　Ｍの対イオン濃度のＮａＣ１で前処理 する。他の適当な塩を、適当な導電率を提供するのに十分な対イオン濃度で使用 してもよい。

本発明は、溶液中の骨誘導タンパク質から骨誘導性因子をさらに精製するための 、上述したアニオン交換法および以下に記すＨＰＬＣ処理と組み合わせて使用す ることが有利であるカチオン交換クロマトグラフィー法をさらに含む。

アニオン交換法に関連して上述したように、骨タンパク質溶液の導電率を制御し て、カチオン交換樹脂に対するタンパク質の選択的結合をもたらす。骨タンパク 質溶液を本発明のカチオン交換カラムに装填する前に、骨タンパク質溶液の導電 率を調節して、カチオン交換樹脂をタンパク質の所望の部分に選択的に結合させ るのに効果的なものにする。本カチオン交換法においては、骨タンパク質溶液の 導電率は、好ましくは約１７，９００ｕ＋＋＋ｈｏｓ　（１，７９ｘｌＯ”Ｓ） 　〜約１９，２００μｍｈｏｓ（１，９２Ｘ１０−”Ｓ）である。塩化ナトリウ ムまたは他の適当な塩を使用１−で、導電率を適当なレベルに調節することがで きる。好ましい実施態様においては、骨タンパク質溶液の対イオン濃度は、約０ ．１２５　ＭのＮａＣ１〜約０．３０ＭのＮａＣ１、より好ましくは約０２３Ｍ 〜約０．２７ＭのＮ　ａ　Ｃｌである。

適当な導電率分有する、カチオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液を カチオン交換カラムに装填する。本カチオン交換法においては、強陰性のカチオ ン交換樹脂が骨誘導的活性のタンパク質の混合物を精製するのに効果的であるこ とがわかった。ここに使用する強陰性カチオン交換樹脂とは、強陰性の官能基、 例えばスルホン酸官能基を有する樹脂をいう、スルホン酸官能基を有する好まし い樹脂は、　［Ｓ−セファローズＪＴＭ　（ファーマシア社）の商品名のもとで 販売されている。しかし、同様に酸性の官能基を有する他の樹脂もまた適当であ る。

カチオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液のｐＨは、所望のタンパク 質を樹脂に結合させるのに効果的なｐＨに調節する０本方法においては、約ｐＨ ４，４〜約ｐＨ５，０のｐＨを使用することが好ましい、好ましくは、タンパク 質溶液のｐＨを約ｐＨ４，８に調節する。

カチオン交換カラムを通過する骨タンパク質溶液の線速度は、上記のアニオン交 換と同様に、必要とされる回収パラメータによって決まる。速度は、一般に、タ ンパク質の損失を最小限にしながら、望みのタンパク質のほぼ完全な吸着を可能 にするのに十分なほど低いものである。

カチオン交換法は、結合したタンパク質の所望の部分をカラム樹脂から選択的に 脱着させることを含む、タンパク質は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を生じ させるのに適当な導電率を有する溶離剤により、カチオン交換カラムから溶離さ せる１本カチオン交換法の場合、溶離剤の導電率は、好ましくは３９，１００μ ｍｈａｍ（３，９１ＸＩＯ−”Ｓ）　〜約８２，７００μｍｈｏｓ　（１１，２ ７ｘｌｏ−”Ｓ）またはそれ以上である。

一般に、本方法の溶離剤は、適当なタンパク質変性剤、例えば尿素と、所望の導 電率を達成するのに適当な塩濃度とを有する溶液である。好ましい実施態様にお いては、溶離剤は、約０．６ＭのＮａＣ１〜約１．５　ＭのＮ　ａ　Ｃ１、より 好ましくは約１．３　Ｍ〜約１．５　ＭのＮａＣ１の対イオン濃度によって前処 理して適当な導電率を得る。

本発明は、骨誘導活性のタンパク質混合物を得るために上述したアニオンおよび カチオン交換法と合わせて利用してもよい逆相ＨＰＬＣ法をさらに含む。本発明 のＨＰＬＣ精製法精製−ては、骨タンパク質溶液を逆相ＨＰＬＣカラムに装填す る。このカラムはポリマー（すなわちポリスチレン）であってもよいし、シリカ ベースのものであってもよい、好ましくは、ＨＰＬＣカラムは炭化水素で改質さ れたシリカである。好ましくは、シリカ樹脂はＣ４〜Ｃ工、炭化水素鎖の添加に よって改質されたものであり、より好ましくは、ＨＦ’ＬＣカラムはＶＹＤＡＣ ”（分離群）Ｃ１ｍカラムである。

逆相カラムに装填すべき骨タンパク質溶液は、トリフルオロ酢酸または他の適当 な溶媒（例えば、ヘプタフルオロ酪酸またはリン酸）の溶液であることができる 。好ましくは、トリフルオロ酢酸を約０．０５容量％〜約０．１５容量％、より 好ましくは約０．１容量％の濃度で有するトリフルオロ酢酸溶液を使用する。

骨誘導活性のタンパク質は、所望のタンパク質を得るのに適当な有機溶媒／水の 混合物により、ＨＰＬＣカラムから溶離させる。ＨＰＬＣ法において好ましい溶 離剤はアセトニトリル溶液である。好ましい溶離剤は、通常、溶離の間に約３０ 容量％から約４０容量％に、より好ましくは約３３容量％から約３７容量％に変 動するアセトニトリル濃度を有する。好ましい実施態様においては、溶離剤中の アセトニトリル濃度は、アセトニトリルの所望の最高濃度に達するまで、毎分的 ０．３０容量％〜約０．４０容量％の増分で増加させる。タンパク質は、当該技 術において公知の手段により、ＨＰＬＣ法の溶離剤から回収することができる。

本発明のさらなる実施態様は、適当な担体に付着され、皮下埋植されたときに約 ３マイクログラムで骨誘導的活性を示す、上述したＨＰＬＣ法がらのタンパク質 生成物である。本発明の一実施態様においては、骨誘導性因子は、図１に示すゲ ル分離分布を示す骨誘導的活性のタンパク質混合物である。このゲル分離分布は 、５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して実施したものである。第一の列は、既知の分子量 の基準について５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施することによって得られた分子量目盛り である。第二の列は、２−メルカプトエタノールで還元された本発明によるタン パク質混合物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分布を示す。第三の列は、本発明によるタンパ ク質の未還元混合物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分布を示す。図１に示す５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分布を提供するタンパク質の混合物は高い骨誘導的活性を有することがわかっ たが、実施例に実証するように、図１に示すものとわずかに異なる５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ分布を有するタンパク質の混合物もまた効果的であると推測される６したが って、図１の還元または未還元状態の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分布において検出される ほぼすべてのタンパク質重からなる分布を有するタンパク質の混合物は、本発明 の範囲にあるとみなされる。

本発明の更に別の実施態様は、加水分解を受けたときに、アミノ酸組成、すなわ ちＡＳＰ　（＋ＡＳＮ）およびＧＬｔＪ　（＋ＧＬＮ）約２３４モル％；　ＳＥ ＲおよびＴＨＲ約１３．５モ＃％；ＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯ，ＭＥＴ、ＶＡＬ、 ＩＬＥおよびＬ　Ｅ　ｔＪ約４００モル％；ＴＹＲおよびＰＨＥ約６８モル％な らびにＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳ約１６．６モル％を有する骨誘導的活性のタ ンパク質混合物を含む。

上述の方法のいずれかまたは他の方法によって誘導される骨誘導的活性のタンパ ク質混合物は、多様な配送系を利用して、骨成長が望まれるところの場所に送る ことができる。一つの配送系は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を付着させた コラーゲン支持体である。本発明の更なる実施態様は、皮膚誘導または併誘導の コラーゲンを使用する配送系である。

亙施画 実施例１ ウシ科動物の皮質骨の断片（４７ｋｇ）を、２５．６および４ｍｖａ孔径の連続 するスクリーンに通１−で粉砕した６軟組織および脂質の除去を容易にするため 、粉砕するごとに、洗剤溶液を含むη選タンクに入れて骨の粒子を洗浄した。１ ．２　Ｍの１−ＩＣ１溶液６０ガロンとともに室温で７５時間撹拌することによ り、粉砕した骨（２５，９５ｋｇ）を無機質除去した。また、発泡を防ぐために 、オクタツール４０＋ｎｌを加えた。

ｌ・リス塩基でｐＨ７，４に緩衝した４Ｍのグアニジン塩酸塩約６０リツトルを 用い、無機質除−Ｌ１〜だ雪粒子の充填床の中に溶液を連続的に循環させること により、骨誘導的活性のタンパク質を抽出ｌまた。グアニジンを、抽出の間、ま ず約４℃に冷却し、この抽出において、４９５時間後に抽出物溶液５９リツトル を捕集した。

抽出物溶液を、５μ誼のカプセルフィルタに通してろ過し、次に、１００ｋＤの 公称分子量分画（ＭＷＣＯ）を有する２５平方フイートのフィルトロンオメガ（ Ｆｉｌｔｒａｎ　Ｏｍｅｇａ）　”接線流限外ろ過膜を使用して、７００　ｍ　 ｌの容量に濃縮した。残留液を捨て、１００ｋＤ未滴のＭＷのろ液を、１０ｋＤ の公称ＭＷＣＯを有する２５平方フイートのフィルトロンオメガ１限外ろ過膜上 で、１．１リツトルの容量に濃縮した。

次に、ＨＣＩでｐＨ８，５に調節した２０ｍ１ｌＩのトリスおよび６Ｍの尿素３ ０リツトルを使用して、同じ１０ｋＤのＭＷＣＯの膜で溶液を透析ろ過した。残 留液９５０ｍ１はタンパク質約１９．２７ｇを含んでいた。ろ液は廃棄した。

残留液を、ＨＣＩでｐＨ８，５に′ｔＩ４節した２０ｍＭのトリスおよび６Ｍの 尿素（導電率＝９１０　μｍｈｏａ　；９．１　ｘｌＯ−’Ｓ）で平衡化したＱ −七７７　ｍ−ズｔｍ　（７７−マシア社）アニオン交換カラム（直径２５．２ ｃｍ＋Ｘ　１６．５ｃｍ、床容量二８３リットル）に装填した。試料の適用に続 き、約２空隙容積分の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。

ｐＨ８，５に調節した２０ｍＭのトリスおよび６Ｍの尿Ｓ（導電率＝　１０，７ ４０μｍｈｏｓ　：１．０７４　ｘｌＯ−”Ｓ）に０．１２５　ＭのＮａＣ１約 １２リツトルを適用することにより、骨誘導的活性のタンパク質をカラムから溶 離させた。　１１！Ｊッ１−ル中約３．９４ｇのタンパク質をカラム溶出液中に 回収した。

Ｑ−セファローズ？Ｗ（ファーマシア社）アニオン交換クロマトグラフィーから の溶出液を氷酢酸でｐ　Ｈ４，８に調節し、固形Ｎ’　ａ　Ｃ１を加えることに よって導電率を１８，２００ＩＬｍｈｏｓ　（１，８２ｘ　１０−”Ｓ）に増大 させた。次に、試料を、ｐＨ４，５に調節した２０ｍＭの酢酸すトリウムおよび ６Ｍの尿素中の０２５ＭのＮ　ａ　Ｃ１で平衡化したＳ−セファローズｔｗ　（ ファーマシア社）カチオン交換カラム（直径１１．３ｃ＋ｓＸ　１６゜５ＣＩｌ ｌ、床容量−１６５リソＹ・ル）に装填１−だ、試料の適用に続き、約２空隙容 積分の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。ｐＨ４，５に調節した２０ｍＭの酢酸ナ トリウムおよび６Ｍの尿素（導電率＝７９，５００ｐｗｒｈｏｓ　：　７．９５ ｘ　１０−”Ｓ）に、１．５ＭのＮ　ａ　Ｃ１約１７リツトルを適用することに より、骨誘導的活性のタンパク質を溶離させた。

１．２リッ１−ル中約２２０．８ｍにのタンパク質をカラム溶出液中に回収した 。

低分子量種を除くため、６ｋＤの分子量分画の中空繊維束（スペクトラムインダ ストリイズ社から入手）を使用して、カチオン交換溶出液を、冷気（４℃）中、 脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥させた。これを１０％（容量比）酢酸に再 溶解させ、凍結乾燥させ、１０＋＋＋ｋｌのＨＣＩに再び溶解させた。１．２お よび０．４５μｍのフィルタに通して連続的にろ過したのち、タンパク質混合物 を室温で１８〜２４時間放置し、凍結乾燥させた。

ここに概説した一連の段階により、骨誘導的活性のタンパク質を溶液中に保持し た。どの段階にもプロテアーゼ阻害剤は使用せず、タンパク質の劣化は見られな かった。カチオン交換クロマトグラフィーならびに塩および緩衝液の除去に続き 、この手順で単離したタンパク質３５μｇを適当な担体および基質と合わせ、ラ ットに皮下埋植すると、骨形成が再現的に誘発された。

実施例２ Ｓ−セファローズ？ｌｌ　（ファーマシア社）カチオン交換クロマトグラフィー からの凍結乾燥試料を、水性０．１容量％トリフルオロ酢酸／３０容量％アセト ニトリルの混合物６ｍｌに溶解させ、５７％Ａ、４３％Ｂ　（Ａは水中０１容量 ％のトリフルオロ酢酸であり、Ｂは水中７０容量％のアセトニトリル、０．１容 量％のトリフルオロ酢酸である）で平衡化した前処理用ＶＹＤＡＣＴＭ　（ザ・ セパレーション・グループ社）Ｃｔ・幅広孔ＨＰＬＣカラムに適用した。浅い勾 配の増大するＢを使用しながら、骨誘導的活性のタンパク質を試料の他の成分か ら分離した。ＨＰＬＣからの溶出液を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動および生体内バイオアッセイ（生物検定）によって特性解析した。４７容量％ のＢと５２容量％のＢとの間（アセトニトリル３３容量％〜３７容量％）で骨誘 導的活性のタンパク質が溶出することがわかった。この範囲の溶媒組成で溶出す るタンパク質を凍結乾燥させ、１０ｍＭのＨＣＩに溶解させた。骨誘導的活性の タンパク質の収量は１６．４５　ｍｇであった。

このタンパク質混合物３５μにを適当な担体または基質に付着させ、皮下埋植す ると、骨形成が誘発された。

実施例３ 多数の特徴的なタンパク質の帯が骨誘導的活性のプールの中に存在している。

これらは、１５重量％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に基づくと 、１４ｋＤ〜６８ｋＤの見かけ分子量の範囲にある。２−メルカプトエタノール での還元の前後のタンパク質の帯状化パターンの例を図１に示す。

実施例４ 分取用ＨＰＬＣからの骨誘導活性プールからのアリコツト（部分標本）を、６Ｍ のＨＣＩ蒸気中、１１０℃で２０時間、アルゴン雰囲気下で加水分解した。加水 分解した試料をフェニルインチオシアネートで誘導体化して、ＰＴＣ−アミノ酸 誘導体を形成し、また、システムゴールド（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ）　ソフト ウェアを備えたベックマン３３８勾配システムを使用する逆相ＨＰＬＣによって 分析した。３回のアミノ酸分析を平均して、表１．に示す組成を立証した。

表１゜ 実施例５　（精製された骨誘導性因子および部分的に精製された骨誘導性因子の 骨誘導的活性の評価）十分な址の精製されたタイプエ原線維状つシ科動物鍵コラ ーゲンを酢酸の１容量％水溶液に加えて４重量％分散液を調製した。室温で一夜 放置したのち、粘性の分散液を、直径８ｍｍＸ厚さ３ｗ１Ｉ１１のマルチキャビ ティー型デルリン？Ｉｌｌ　（デュポン社）成型ディスクの中に配置した。コラ ーゲン分散液の型を一５０℃で凍結させ、約１８時間凍結乾燥させて、１個６． ０±１ｍｇの重さのコラーゲンスポンジのディスクを製造した。骨誘導的活性の 生体内生物学的評価の際に、これらのディスクを、骨誘導性因子を加えるための 支持体と１−て利用した。

（精製された骨誘導性因子） Ｉ　Ｘ　１０−”Ｍの塩酸溶液に、十分な量の精製された骨誘導性因子を加えて 、ＨＣｌの１ｍｌあたりタンパク質３５．１００および３５０μＫを含む試験溶 液を調製した。

上記３種の試験の１００μｌアリコツトを各試験用量について４個のコラーゲン スポンジディスクに加えた。溶液をコラーゲンスポンジディスクの中に３０分間 浸漬させて、そこでディスクを一５０℃で凍結させ、約１８時間凍結乾燥させた 。これらの精製された骨誘導性因子含有コラーゲンスポンジディスクを、レツデ イによって記載された方法（その全体を本明細書に引用例として含める、ウィリ アム・ベック編集、ボーン・アンド・ミネラルリサーチ（Ｂｏｎｅ　＆　Ｍｉｎ ｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第３巻第２章、レッディ、　Ａ、　Ｈ，、ｒ局所 的および系統的要因による骨分化の規則」（エルセピア・パブリッシャーズＢ、 　Ｖ、、　１９８５）　）に似たやり方で、以下に説明するように、４匹のラッ トに皮下埋植した。

体重的５０〜ｉｏｏ　Ｋの雌のロングエバンスラットの腹側胸郭区域の皮膚に小 さな（約６　ｍＩＩ＋）の切開を施した。鈍い切開により、皮膚の下にポケット 状部を設けた。

精製された骨誘導的活性のタンパク質を含む、すでに調製したコラーゲンスポン ジディスクのうちの１個をこのポケット状部に挿入し、切開をテブデツク（Ｔｅ ｖｄｅｋ）ＩＩ”　（エチコン社）５−０縫合糸で閉じた。他二つの精製された 骨誘導的活性のタンパク質用駄グループ試料の一つ′３１）を各動物に同様に埋 植１−た、埋植Ｊくれる。Ｊシトゲ−１・スボ゛・ジデ、イスクＬＪ、ｌＩ四５ ｉ（７虻（パ、ｌけの距離を隙ｌ１．た。２１［１後、ラッ１−を二酸化炭素Ｃ 窒息、死、５せ、試験物質を取り出した□外植の際、紹織試ネ１＝を秤琵：Ｌ、 　７０％エタ７）・−ル中に定着さぜた。定着させてから少なくとも４時間を経 たのち、外植組線を、？、イクｔ：ｌ−Ｒ型Ｘ線キャビネットを使用するＸ線に （＝ｔ　した（２ＯｋｅＶ　Ｘ線、ボラ）（ｙ−（ドタイブ５３７４　ルム、暴 昨時間２０秒）７、雇白１−７たツタクリル酸グリ」−ルを・使用１１１．外植 組織試′４１＋斧埋め込み（王の全体を本明細島に引用例ど＋、、、　−ｃ　Ｂ める、ブ０ッ、７、Ｍ、Ｈ，、ｉ、）Ｌ、、７ｆ〜、Ｐし７グ」−１よびＭ　カ ー＋７）「メタクリル酸グリコール埋込技術１、ラボラトリーメダイシ゛／　、 　Ｘ３（５）　：襄９８２年ｐｐ、　２９０−２９８を蓼照）、４１４の厚さに １．ｉＩＪ断し１、トルイジンブルー０＊たは硝酸銀、緋いて−、マトギシリン およびエオシンで染色し、骨形成およびイノ灰化した組織の増殖に１）い（組織 学的に評価した。軟骨内の骨形成（！Ａ栢片の買置測定、Ｘ線評価および組織学 的評価により−で判断する）を容易に実証することができた。結果を以下のｈ２ ゜にまとめる。

表２゜ （部分的に精製された骨誘導性因子） 、′−れらの同じ手法を利用し、で、部分的に特製された骨誘導情因−ｆ′物質 を評価した、カチオり交抄クロマ［・グラクイ−ののち、ＨＰ　１．、、　Ｃ精 製の前に召・られたタンパク質試料を、Ｉ　Ｘ　１０−”Ｍの塩酸に、ＨＣｌ１ ｍ１．％たり３５０．１００および３　、５００μｇの濃度で溶解させた。１− 記３種の試験溶液の１００μｍアリコツトを、実施、される各試験に・′〕い′ １：４個のコラーゲンスポンジディスク（こ加えた。溶製・を二１ラーゲンスボ 一・ジブ。イスクの中に３０分間浸漬させた。次に、ディス〃を一５０℃で凍結 させ、約１８時間凍結乾燥さ什だ。部分的に精製された骨誘導性因子を含むこれ らのディスクをラットに皮下埋植した。２１日後、組織を外植し、−１二述の手 法に１って評価した。結果な以下の表３．にまとめる。

表３、 表２、と表３．とρ比較することによって理解されうるＪ−うに、精製された骨 誘導性因子は、部分的に精製された骨誘導性因子・よりも低い用量で、より大き な骨誘導性因子を・提供する。この理由のため、精製された骨誘導性因子が好ま しい。

表４゜ 皮［・埋植片パイ月７゛ンセイ試ネ（の評点特性本発明の種々の実施態様を詳細 に説明してきたが、これらの実施態様の変形および応用が当業者にとって可能で あることは明らかである０例えば、骨誘導性因子は、種々の用途、例えば歯周疾 患の治療および顔面の修復ならびに他の骨および関節の障害の治療に使用するこ とができる。しかし、このような変形および応用は、以下の請求の範囲に述べる 本発明の真髄および範囲に該当するということを明確に理解しなければならない 。

占 ′　６６− 諷＝ＯＩ２３４ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成５年１０月 ２２日−ｍｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約２０．７〜約２６．１モルパーセントの酸性アミノ酸、約１１．３〜約１ ５．７モルパーセントのヒドロキシアミノ酸、約３７．６〜約４２．４モルパー セントの脂肪族アミノ酸、約５．８〜約７．９モルパーセントの芳香族アミノ酸 、及び、約１３．３〜約１９．９モルパーセントの塩基性アミノ酸からなるアミ ノ酸組成物を備えてなる骨誘導性因子。 ２．前記アミノ酸の総モル量に基づいて、約２０．７〜約２６．１モルパーセン トのＡＳＰ（＋ＡＳＮ）及びＧＬＵ（＋ＧＬＮ）、約１１．３〜約１５．７モル パーセントのＳＥＲ及びＴＨＲ、約３７．６〜約４２．４モルパーセントのＡＬ Ａ，ＧＬＹ，ＰＲＯ，ＭＥＴ，ＶＡＬ，ＩＬＥ及びＬＥＵ、約５．８〜約７．９ モルパーセントのＴＹＲ及びＰＨＥ、並びに、約１３．３〜約１９．９モルパー セントのＨＩＳ，ＡＲＧ及びＬＹＳからなるアミノ酸組成物を、加水分解の際に 備えてなる請求項１に記載の骨誘導性因子。 ３．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられたと きに、図１に示すほぼ全てのタンパク質帯を備える還元または未還元ゲルプロフ ィールとなる請求項１に記載の骨誘導性因子。 ４．表１に示すアミノ酸モル百分率を有する請求項１に記載の骨誘導性因子。 ５．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられたと きに、図１に示すほぼ全てのタンパク質帯を備える還元または未還元ゲルプロフ ィールとなる骨誘導性因子。 ６．前記アミノ酸の総モル量に基づいて、約２０．７〜約２６．１モルパーセン トのＡＳＰ（＋ＡＳＮ）及びＧＬＵ（＋ＧＬＮ）、約１１．３〜約１５．７モル パーセントのＳＥＲ及びＴＨＲ、約３７．６〜約４２．４モルパーセントのＱＡ ＬＡ，ＧＬＹ，ＰＲＯ，ＭＥＴ，ＶＡＬ，ＩＬＥ及びＬＥＵ、約５．８〜約７． ９モルパーセントのＴＹＲ及びＰＨＥ、並びに、約１３．３〜約１９．９モルパ ーセントのＨＩＳ，ＡＲＧ及びＬＹＳからなるアミノ酸組成物を、加水分解の際 に備えてなる請求項５に記載の骨誘導性因子。 ７．表１に示すアミノ酸モル百分率を有する請求項５に記載の骨誘導性因子。 ８．脱無機化された骨抽出物を含有する第１の溶液から骨誘導活性タンパク質を 精製する方法であって、 （ａ）前記第１の溶液に限外ろ過を施し、所望範囲の分子量を有するタンパク質 を含有する第２の溶液を得る工程と、 （ｂ）前記第２の溶液をアニオン交換樹脂に装填する工程と、（ｃ）第１の溶離 剤で前記アニオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶 出液を得る工程と、 （ｄ）前記アニオン交換された分取溶出液をカチオン交換樹脂に装填する工程と 、（ｅ）第２の溶離剤で前記カチオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、カチオ ン交換された分取溶出液を得る工程と、を備えてなる方法。 ９．前記カチオン交換された分取液からのタンパク質の第３の溶液を逆相ＨＰＬ Ｃカラムに装填する工程を更に備えてなる請求項８に記載の精製方法。 １０．前記限外ろ過は、 （ｉ）約１００ｋＤの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた接線流限外ろ 過に前記第１の溶液がかけられる第１の限外ろ適工程と、（ｉｉ）そのろ液を前 記第１の限外ろ過工程から、約１０ｋＤの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を 用いた第２の接線流限外ろ過工程にかけ、保持物をこの第２の限外ろ過工程から 更なる工程にかけることと、を備えてなる請求項８に記載の精製方法。 １１．前記アニオン交換樹脂への装填に先だって、前記限外ろ過工程から得られ た前記第２の溶液の導電率、必要に応じ、約１，９００μｍｈｏ（１．９×１０ −９Ｓ）未満の導電率に調節される請求項８に記載の精製方法。 １２．前記第１の溶離剤は、約１０，２６０μｍｈｏ（１．０２６×１０−２Ｓ ）から約１１，２００μｍｈｏ（１．１２０×１０−２Ｓ）の範囲の導電率を有 する請求項８に記載の精製方法。 １３．前記カチオン交換樹脂への装填に先だって、前記アニオン交換された分取 溶出液は、必要に応じ、約１７，９００μｍｈｏ（１．７９×１０−２Ｓ）から 約１９，２００μｍｈｏ（１．９２×１０−２Ｓ）の範囲の導電率に調節される 請求項８に記載の精製方法。 １４．前記第２の溶離剤は、約３９，１００μｍｈｏ（３．９１×１０−２Ｓ） から約８２，７００μｍｈｏ（８．２７×１０−２Ｓ）以上の範囲の導電率を有 する請求項８に記載の精製方法。 １５．約３０容量％から約４０容量％の範囲にわたり増大するアセトニトリル濃 度勾配を有する第３の溶離剤で、前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質を溶離し、 骨誘導活性タンパク質を備えた精製混合物を骨る工程を更に備えてなる請求項９ に記載の精製方法。 １６．前記第３の溶離剤の増大するアセトニトリル濃度勾配は、約３３容量％か ら約３７容量％へ増大する請求項１５に記載の精製方法。 １７．前記アニオン交換樹脂は、第４級アミン官能基を備えている請求項８に記 載の精製方法。 １８．前記アニオン交換樹脂は、Ｑ−セファロースＴＭを備えている請求項８に 記載の精製方法。 １９．前記カチオン交換樹脂は、スルホン酸基を備えている請求項８に記載の精 製方法。 ２０．前記カチオン交換樹脂は、Ｓ−セファロースＴＭを備えている請求項８に 記載の精製方法。 ２１．前記ＨＰＬＣカラムは、プラスチック充填剤または炭化水素修飾されたシ リカ充填剤を備えてなる請求項９に記載の精製方法。 ２２．前記シリカは、Ｃ４〜Ｃ１０の炭化水素付加によって修飾されてなる請求 項２１に記載の精製方法。 ２３．前記ＨＰＬＣカラムは、ＶＹＤＡＣＴＭ（ザ・セパレーション・グループ 社）のＣ４，Ｃ９またはＣ１０素材からなる群から選択される充填物質を備えて なる請求項９に記載の精製方法。 ２４．前記第２の溶液を前記アニオン交換樹脂に装填する工程に先だって、前記 第２の溶液のｐＨは、約ｐＨ８〜約ｐＨ９である請求項８に記載の精製方法。 ２５．前記アニオン交換分取溶出液を前記カチオン交換樹脂に装填する工程に先 だって、前記アニオン交換分取溶出液のｐＨは、約ｐＨ４．４〜約ｐＨ５．０で ある請求項８に記載の精製方法。 ２６．前記第２の溶液、前記アニオン交換分取溶出液及び前記カチオン交換分取 溶出液は、溶液中のタンパク質を保持するに十分な量の尿素を備えてなる請求項 ８に記載の精製方法。 ２７．前記アニオン交換樹脂への装填先だって、前記第２の溶液は、約０．１３ ５ＭのＮａＣｌ未満の対イオン濃度を有してなる請求項８に記載の精製方法。 ２８．前記第１の溶出液は、約０．２３ＭのＮａＣｌから約０．２７ＭのＮａＣ ｌの範囲の対イオン濃度を有してなる請求項８に記載の精製方法。 ２９．前記第２の溶出液は、約０．６ＭのＮａＣｌから約１．５ＭのＮａＣｌの 範囲の対イオン濃度を有してなる請求項８に記載の精製方法。 ３０．前記第３の溶出液は、約０．０５容量％〜約０．１５容量％のトリフルオ ロ酢酸を備えてなる請求項９に記載の精製方法。 ３１．前記第３の溶出液におけるアセトニトリル濃度は、約３３容量％から、毎 分約０．３０容量％〜約０．４０容量％の増加量で、前記濃度が約３７容量％の アセトニトリルとなるまで増大される請求項９に記載の精製方法。 ３２．脱無機化された骨抽出物を含有する前記第１の溶液は、２０℃未満の温度 でグアニジンを用い、清浄な、粉砕され、脱無機化された骨粒子からタンパク質 を抽出することにより準備される請求項８に記載の精製方法。 ３３．透析ろ過または透析プロセスにおいて、グアニジンの代わりに尿素が置換 される請求項３２に記載の精製方法。 ３４．約２０．７〜約２６．１モルパーセントのＡＳＰ（＋ＡＳＮ）及びＧＬＵ （＋ＧＬＮ）、約１１．３〜約１５．７モルパーセントのＳＥＲ及びＴＨＲ、約 ３７．６〜約４２．４モルパーセントのＡＬＡ，ＧＬＹ，ＰＲＯ，ＭＥＴ，ＶＡ Ｌ，ＩＬＥ及びＬＥＵ、約５．８〜約７．９モルパーセントのＴＹＲ及びＰＨＥ 、並びに、約１３．３〜約１９．９モルパーセントのＨＩＳ，ＡＲＧ及びＬＹＳ からなるアミノ酸組成物を、加水分解の際に備えてなる骨誘導性因子が製造され る方法であって、前記モル百分率は特定のアミノ酸の総モル量に基づいてなる請 求項８に記載の精製方法。 ３５．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた ときに、図１に示すほぼ全てのタンパク質帯を備える還元または未還元ゲルプロ フィールとなるタンパク混合物が製造される請求項８に記載の精製方法。 ３６．骨誘導活性タンパク質を精製する方法であって、（ａ）骨を粉砕、洗浄す ると共に、浮選によって軟組織を除去する工程を含む工程．と、 （ｂ）酸を用いて、前記粉砕され洗浄された骨粒子を脱無機化する工程と、（ｃ ）低温でグアニジンを用い、洗浄、粉砕、脱無機化された骨粒子からタンパク質 を抽出し、前記タンパク質の低下を防止して第１の溶液を得る工程と、（ｄ）約 １００ｋＤの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた第１の接線流限外ろ過 工程と、ろ液を保持することとを備えた限外ろ適プロセスに、前記第１の溶液を かけると共に、約１０ｋＤの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いて保持物 を保持する第２の接線流限外ろ過に、前記ろ液をかける工程と、（ｅ）約１０ｋ Ｄの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた限外ろ過工程に引き続くことに より、前記保持物において前記グアニジンに代えて尿素を置換する一方、保持物 において失われたグアニジンを構成尿素で置き換えて尿素抽出溶液を得る工程と 、 （ｆ）約０．１３５Ｍ未満のＮａＣｌ濃度を得るために前記尿素抽出溶液にＮａ Ｃｌを添加し、第４級アミン基を有する積極アニオン交換樹脂に前記尿素抽出溶 液を装填する工程と、 （ｇ）約０．２３Ｍ〜約０．２７ＭのＮａＣｌ濃度を有する第１の溶離剤で前記 積極アニオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶出液 を得る工程と、 （ｈ）前記アニオン交換された分取溶出液のｐＨを約ｐＨ４．８に調節する工程 と、 （ｉ）約０．２３Ｍ〜約０．２７ＭのＮａＣｌ濃度を得るために前記アニオン交 換分取溶出液にＮａＣｌを添加し、スルホン酸基を有する消極カチオン交換樹脂 に前記アニオン交換分取溶出液を装填する工程と、（ｊ）約０．６Ｍ〜約１．５ ＭのＮａＣｌ濃度を有する第２の溶離剤で前記消極カチオン交換樹脂からタンパ ク質を溶離し、カチオン交換された分取溶出液を得る工程と、 （ｋ）前記カチオン交換分取溶出液を透析して、低分子量種を除去する工程と、 （ｌ）前記カチオン交換分取液からのタンパク質を含む第２の溶液を、炭化水素 修飾されたシリカ充填物質を備える逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程と、（ｍ ）約ｐＨ２未満のｐＨと、約３３容量％から約３７容量％までに増大する可変ア セトニトリル濃度と、約０，０５容量％〜約０．１５容量％のトリフルオロ酢酸 濃度とを有する第３の溶解剤で、前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質を溶離する 工程と、を備えた方法。 ３７．前記アニオン交換樹脂は、Ｑ−セファロースＴＭである請求項３６に記載 の精製方法。 ３８．前記カチオン交換樹脂は、Ｓ−セファロースＴＭである請求項３６に記載 の精製方法。 ３９．前記第１の溶液、前記アニオン交換分取溶出液及び前記カチオン交換分取 溶出液の各々は、溶液中のタンパク質を保持するに十分な量の尿素を備えてなる 請求項３６に記載の精製方法。 ４０．前記アミノ酸の総モル量に基づいて、約２０．７〜約２６．１モルパーセ ントのＡＳＰ（＋ＡＳＮ）及びＧＬＵ（＋ＧＬＮ）、約１１．３〜約１５．７モ ルパーセントのＳＥＲ及びＴＨＲ、約３７．６〜約４２．４モルパーセントのＡ ＬＡ，ＧＬＹ，ＰＲＯ，ＭＥＴ，ＶＡＬ，ＩＬＥ及びＬＥＵ、約５．８〜約７． ９モルパーセントのＴＹＲ及びＰＨＥ、並びに、約１３．３〜約１９．９モルパ ーセントのＨＩＳ，ＡＲＧ及びＬＹＳからなるアミノ酸組成物を、加水分解の際 に備えてなる骨誘導性因子が製造される請求項３６に記載の精製方法。 ４１．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた ときに、図１に示すほぼ全てのタンパク質帯を備える還元または未還元ゲルプロ フィールとなるタンパク混合物が製造される請求項３６に記載の精製方法。 ４２．（ａ）脱無機化された骨抽出物を含む溶液に限外ろ過を施す工程と、（ｂ ）前記溶液をアニオン交換樹脂に装填する工程と、（ｃ）前記アニオン交換樹脂 からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶出液を得る工程と、 （ｄ）前記アニオン交換された分取溶出液を消極カチオン交換樹脂に装填する工 程と、 （ｅ）前記カチオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、カチオン交換された分取 溶出液を得る工程と、を備えてなる方法によって製造された骨誘導性因子。 ４３．前記方法は、カチオン交換された分取液からのタンパク質の溶液を逆相Ｈ ＰＬＣカラムに装填する工程を更に備えてなる請求項４２に記載の骨誘導性因子 。 ４４．適当な担体に沈積され皮下埋植された際に約３マイクログラムで、骨誘導 活性を示す請求項４３に記載の骨誘導性因子。 ４５．（ａ）約１０ｋＤの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた第１の限 外ろ過工程と、ろ液を保持することと、約１０ｋＤの公称分子量分画を有する限 外ろ過膜を用いて保持物を保持する第２の限外ろ過工程に前記ろ液をかける工程 とを備えた限外ろ過に、脱無機化された骨抽出物を含有する溶液をかける工程と 、（ｂ）約ｐＨ８．５のｐＨを有する前記保持物を、第４級アミン基を有するア ニオン交換樹脂に装填し、前記溶液が約０．１３５Ｍ未満のＮａＣｌ濃度を有す ることとなる工程と、 （ｃ）約０．２３Ｍ〜約０．２７ＭのＮａＣｌ濃度を有する溶離剤で前記アニオ ン交換樹脂からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶出液を得る工程 と、 （ｄ）前記アニオン交換された分取溶出液のｐＨを約ｐＨ４．８に調節する工程 と、 （ｅ）スルホン酸基を有するカチオン交換樹脂に、約０．２３Ｍ〜約０．２７Ｍ のＮａＣｌ濃度を有する前記アニオン交換分取溶出液を装填する工程と、（ｆ） 約０．６Ｍ〜約１．５ＭのＮａＣｌ濃度を有する溶離剤で前記カチオン交換樹脂 からタンパク質を溶離し、カチオン交換された分取溶出液を得る工程と、（ｇ） 前記カチオン交換分取溶出液を透析して、低分子量種を除去する工程と、（ｈ） 前記カチオン交換分取液からのタンパク質を、炭化水素修飾されたシリカ充填物 質を備える逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程と、（ｉ）約ｐＨ２未満のｐＨと 、約３３容量％〜約３７容量％のアセトニトリル濃度と、約０．１容量％〜約０ ．１５容量％のトリフルオロ酢酸濃度とを有する溶離剤で、前記ＨＰＬＣカラム からタンパク質を溶離する工程と、を備えてなる方法によって製造された骨誘導 性因子。