JPH1123574A - 生理活性物質に酵素を結合する方法 - Google Patents
生理活性物質に酵素を結合する方法Info
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- JPH1123574A JPH1123574A JP17571897A JP17571897A JPH1123574A JP H1123574 A JPH1123574 A JP H1123574A JP 17571897 A JP17571897 A JP 17571897A JP 17571897 A JP17571897 A JP 17571897A JP H1123574 A JPH1123574 A JP H1123574A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】バックグランド・ブランクを上昇させず、か
つ、標識酵素の数を多くする酵素標識法を提供する。 【解決手段】酵素を酸化処理して、酵素中の糖鎖の水酸
基をアルデヒド基に変換し、該アルデヒド基を生理活性
物質の遊離のアミノ基と反応させてシッフ塩基を生成さ
せ、次いでシッフ塩基を還元剤にて処理して、第二級ア
ミンを生成させて、該酵素を生理活性物質に結合する方
法において、上記アルデヒド基と上記アミノ基の反応時
の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、かつ、該緩衝液のｐ
Ｈを１０以上とすることを特徴とする生理活性物質に酵
素を結合する方法。
つ、標識酵素の数を多くする酵素標識法を提供する。 【解決手段】酵素を酸化処理して、酵素中の糖鎖の水酸
基をアルデヒド基に変換し、該アルデヒド基を生理活性
物質の遊離のアミノ基と反応させてシッフ塩基を生成さ
せ、次いでシッフ塩基を還元剤にて処理して、第二級ア
ミンを生成させて、該酵素を生理活性物質に結合する方
法において、上記アルデヒド基と上記アミノ基の反応時
の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、かつ、該緩衝液のｐ
Ｈを１０以上とすることを特徴とする生理活性物質に酵
素を結合する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生理活性物質に酵素
を結合する方法に関し、さらに詳細には、生体成分など
の生理活性物質を免疫学的に測定する方法において、使
用する酵素標識抗原または抗体（標識体）の作製方法に
関するものである。
を結合する方法に関し、さらに詳細には、生体成分など
の生理活性物質を免疫学的に測定する方法において、使
用する酵素標識抗原または抗体（標識体）の作製方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体中に存在する微量な生理活性物質を
測定する方法の一つとして、例えば、エンザイムイムノ
アッセイ（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
などの免疫学的測定法があり、これらの方法は臨床検査
における重要な位置を占めている。特に、ＥＩＡは特異
性が高く、放射性物質を使用せずに高感度で測定できる
ために、近年、急速に普及しはじめている。また、最
近、生化学検査と同じ時間で測定が可能になった、固相
に多孔性膜を利用したＥＩＡも開発されている。
測定する方法の一つとして、例えば、エンザイムイムノ
アッセイ（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
などの免疫学的測定法があり、これらの方法は臨床検査
における重要な位置を占めている。特に、ＥＩＡは特異
性が高く、放射性物質を使用せずに高感度で測定できる
ために、近年、急速に普及しはじめている。また、最
近、生化学検査と同じ時間で測定が可能になった、固相
に多孔性膜を利用したＥＩＡも開発されている。
【０００３】イムノアッセイとは、試料中の測定しよう
とする抗原または抗体を、該物質に対して特異的親和性
を有する抗体または抗原と反応させ、該反応の程度を測
定することにより、試料中の抗原または抗体を検出する
方法であり、ＥＩＡとは、酵素標識した抗原または抗体
（標識体）を使用して、抗原−抗体反応により生成した
複合体の酵素活性または未反応の標識体の酵素活性を測
定することにより、試料中の抗原または酵素を検出する
方法である。
とする抗原または抗体を、該物質に対して特異的親和性
を有する抗体または抗原と反応させ、該反応の程度を測
定することにより、試料中の抗原または抗体を検出する
方法であり、ＥＩＡとは、酵素標識した抗原または抗体
（標識体）を使用して、抗原−抗体反応により生成した
複合体の酵素活性または未反応の標識体の酵素活性を測
定することにより、試料中の抗原または酵素を検出する
方法である。
【０００４】ＥＩＡにおいて、抗原または抗体を高感度
に測定するために、酵素標識した抗体または抗原（標識
体）が、測定しようとする抗原または抗体に対して特異
性および親和性が高く、かつ、酵素活性も高いことが必
要である。特に、酵素活性は高感度測定に最も直接的に
関与する要件であり、高い酵素活性を得るためには、酵
素が結合される抗体または抗原（被標識体）１分子当た
り、結合される酵素の数が多いことが望ましい。特に固
相として多孔性膜を利用する短時間ＥＩＡにおいて、特
に要求されるものである。
に測定するために、酵素標識した抗体または抗原（標識
体）が、測定しようとする抗原または抗体に対して特異
性および親和性が高く、かつ、酵素活性も高いことが必
要である。特に、酵素活性は高感度測定に最も直接的に
関与する要件であり、高い酵素活性を得るためには、酵
素が結合される抗体または抗原（被標識体）１分子当た
り、結合される酵素の数が多いことが望ましい。特に固
相として多孔性膜を利用する短時間ＥＩＡにおいて、特
に要求されるものである。
【０００５】このような抗原または抗体（被標識体）１
分子当たり、標識される酵素の数を多くする方法として
は、従来、グルタルアルデビド法、あるいは過ヨウ素酸
法（J.Histochemistry and Cytochemistry 22,1084,197
4 ）などが知られている。これらの方法では、凝集抗体
−酵素接合体の調製においては、抗体または抗体フラグ
メントが凝集コンプレックス内に深く埋没される可能性
があるため、抗原結合目的には大方近接し得ない状態に
とどまる無秩序架橋法よりなる。これら無定型高分子コ
ンプレックスは再現性よく調製することが困難である。
無秩序架橋法による凝集抗体−酵素接合体を利用するイ
ムノアッセイでは、非特異的結合故に常にバックグラン
ド・ブランクが極めて高いという難点があり、また、イ
ムノメトリックアッセイで達成しうる究極的感度は著し
く低下してしまうなどの欠点を有する (特開昭61-73067
号公報、Ishikawaら、Ann.Clim.Biochem.,19巻、 379
頁、(1982)参照〕。
分子当たり、標識される酵素の数を多くする方法として
は、従来、グルタルアルデビド法、あるいは過ヨウ素酸
法（J.Histochemistry and Cytochemistry 22,1084,197
4 ）などが知られている。これらの方法では、凝集抗体
−酵素接合体の調製においては、抗体または抗体フラグ
メントが凝集コンプレックス内に深く埋没される可能性
があるため、抗原結合目的には大方近接し得ない状態に
とどまる無秩序架橋法よりなる。これら無定型高分子コ
ンプレックスは再現性よく調製することが困難である。
無秩序架橋法による凝集抗体−酵素接合体を利用するイ
ムノアッセイでは、非特異的結合故に常にバックグラン
ド・ブランクが極めて高いという難点があり、また、イ
ムノメトリックアッセイで達成しうる究極的感度は著し
く低下してしまうなどの欠点を有する (特開昭61-73067
号公報、Ishikawaら、Ann.Clim.Biochem.,19巻、 379
頁、(1982)参照〕。
【０００６】また別に、予め重合させた酵素で標識した
標識体（特開昭61-73067号公報）も知られている。しか
しながら、これらの数多くの酵素を被標識体に結合させ
る方法は、調製時のコントロールが難しく、常に同一数
の酵素を標識させる方法を確立することが困難であっ
た。さらに、標識酵素の数が多すぎると非特異的結合が
多く、測定感度が得られないという欠点もあった。
標識体（特開昭61-73067号公報）も知られている。しか
しながら、これらの数多くの酵素を被標識体に結合させ
る方法は、調製時のコントロールが難しく、常に同一数
の酵素を標識させる方法を確立することが困難であっ
た。さらに、標識酵素の数が多すぎると非特異的結合が
多く、測定感度が得られないという欠点もあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】生理活性物質に酵素を
結合する過ヨウ素酸法は、数多くの酵素を被標識体に結
合させることが可能であり、過ヨウ素酸濃度を高くすれ
ば、結合比率が多くなり、高分子量の標識体を作製する
ことが公知である(J.Histochemistry and Cytochemistr
y 22,1084,1974) 。しかし、バックグランド・ブランク
が高くなりやすい欠点を有する。バックグランドとは、
その測定系において、測定対象物質の濃度が０のときの
測定値をいう。
結合する過ヨウ素酸法は、数多くの酵素を被標識体に結
合させることが可能であり、過ヨウ素酸濃度を高くすれ
ば、結合比率が多くなり、高分子量の標識体を作製する
ことが公知である(J.Histochemistry and Cytochemistr
y 22,1084,1974) 。しかし、バックグランド・ブランク
が高くなりやすい欠点を有する。バックグランドとは、
その測定系において、測定対象物質の濃度が０のときの
測定値をいう。
【０００８】
【課題を解決するため手段】本発明者らは、バックグラ
ンド・ブランクを上昇させず、かつ、標識酵素の数を多
くする方法を鋭意研究した結果、過ヨウ素酸で酵素の糖
鎖を酸化させる際、過ヨウ素酸処理の温度および濃度を
一定に保ち、特に、糖鎖を酸化した酵素と生理活性物質
を結合するために、処理した低分子物質の除去とｐＨ調
整のために、透析する際の緩衝液の透析液濃度とｐＨを
選択することにより、酵素の標識効率が格段に向上する
ことを見いだし、本発明に到達した。
ンド・ブランクを上昇させず、かつ、標識酵素の数を多
くする方法を鋭意研究した結果、過ヨウ素酸で酵素の糖
鎖を酸化させる際、過ヨウ素酸処理の温度および濃度を
一定に保ち、特に、糖鎖を酸化した酵素と生理活性物質
を結合するために、処理した低分子物質の除去とｐＨ調
整のために、透析する際の緩衝液の透析液濃度とｐＨを
選択することにより、酵素の標識効率が格段に向上する
ことを見いだし、本発明に到達した。
【０００９】すなわち、本発明は酵素を酸化処理して、
酵素中の糖鎖の水酸基をアルデヒド基に変換し、該アル
デヒド基を生理活性物質の遊離のアミノ基と反応させて
シッフ塩基を生成させ、次いでシッフ塩基を還元剤にて
処理して、第二級アミンを生成させて、該酵素を生理活
性物質に結合する方法において、上記アルデヒド基と上
記アミノ基の反応時の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、
かつ、該緩衝液のｐＨを１０以上とすることを特徴とす
る生理活性物質に酵素を結合する方法である。
酵素中の糖鎖の水酸基をアルデヒド基に変換し、該アル
デヒド基を生理活性物質の遊離のアミノ基と反応させて
シッフ塩基を生成させ、次いでシッフ塩基を還元剤にて
処理して、第二級アミンを生成させて、該酵素を生理活
性物質に結合する方法において、上記アルデヒド基と上
記アミノ基の反応時の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、
かつ、該緩衝液のｐＨを１０以上とすることを特徴とす
る生理活性物質に酵素を結合する方法である。
【００１０】
【発明の実施態様】本発明において、使用する酵素とし
ては、糖鎖を含むペルオキシダーゼ（西洋わさび由来の
ペルオキシダーゼ、以下、ＨＲＰと略すこともある）、
グルコースオキシダーゼ等が挙げられるが、これらのも
のに限定されるものでは無い。
ては、糖鎖を含むペルオキシダーゼ（西洋わさび由来の
ペルオキシダーゼ、以下、ＨＲＰと略すこともある）、
グルコースオキシダーゼ等が挙げられるが、これらのも
のに限定されるものでは無い。
【００１１】本発明において、使用する生理活性物質と
しては、各種ポリクローナル抗体、モノクロナール抗体
またはそれらの断片など、またはこれらの抗原などが挙
げられる。特に好ましくはモノクローナル抗体である。
抗体および抗原としては、それぞれ、検出しようとする
対象によって選択される。例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、Ｃ
Ｋ−ＭＢ、ＨＢｓ−Ａｇ、ＨＢｓ−Ａｂ、ヒトＩｇＧ、
ＩｇＥなどが例示される。
しては、各種ポリクローナル抗体、モノクロナール抗体
またはそれらの断片など、またはこれらの抗原などが挙
げられる。特に好ましくはモノクローナル抗体である。
抗体および抗原としては、それぞれ、検出しようとする
対象によって選択される。例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、Ｃ
Ｋ−ＭＢ、ＨＢｓ−Ａｇ、ＨＢｓ−Ａｂ、ヒトＩｇＧ、
ＩｇＥなどが例示される。
【００１２】本発明では、酵素を酸化処理して、酵素中
の糖鎖の水酸基をアルデヒド基に変換する。使用する酸
化剤としては、過ヨウ素酸を使用する。これらの濃度
は、０．０４〜０．１６Ｍである。また、緩衝液として
は、通常、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）を使用
する。
の糖鎖の水酸基をアルデヒド基に変換する。使用する酸
化剤としては、過ヨウ素酸を使用する。これらの濃度
は、０．０４〜０．１６Ｍである。また、緩衝液として
は、通常、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）を使用
する。
【００１３】本発明では、上記アルデヒド基と上記アミ
ノ基の反応時の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、かつ、
該緩衝液のｐＨを１０以上とすることが必要である。緩
衝剤濃度が５０ｍＭ未満であると、酵素と生理活性物質
の結合比率が不安定であり、常に一定の比率の結合体が
できない欠点がある。また、ｐＨが１０未満であると、
結合比率が従来と大差がないものとなっていまう。さら
に、濃度およびｐＨのいずれか一方が欠けても、好まし
い酵素−生理活性物質結合体にはならない。
ノ基の反応時の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、かつ、
該緩衝液のｐＨを１０以上とすることが必要である。緩
衝剤濃度が５０ｍＭ未満であると、酵素と生理活性物質
の結合比率が不安定であり、常に一定の比率の結合体が
できない欠点がある。また、ｐＨが１０未満であると、
結合比率が従来と大差がないものとなっていまう。さら
に、濃度およびｐＨのいずれか一方が欠けても、好まし
い酵素−生理活性物質結合体にはならない。
【００１４】本発明では、酵素の自己縮合を防止するた
めに、酵素自体のフリーのアミノ基をブロックする試薬
として、例えば、１−フルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼン・エタノール溶液などを使用する。また、本発明で
は、停止液としてエチレングリコール水溶液、グリセリ
ンなどを使用する。
めに、酵素自体のフリーのアミノ基をブロックする試薬
として、例えば、１−フルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼン・エタノール溶液などを使用する。また、本発明で
は、停止液としてエチレングリコール水溶液、グリセリ
ンなどを使用する。
【００１５】具体的な一例としては、西洋ワサビ由来の
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を３００ｍＭ重炭酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ８．１）に溶解し、該溶液に１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼン・エタノール溶液を添加
し、２０℃で１時間反応させる。次いで、該反応溶液を
遮光し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水溶液を加え、２０℃
で３０分間反応させる。
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を３００ｍＭ重炭酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ８．１）に溶解し、該溶液に１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼン・エタノール溶液を添加
し、２０℃で１時間反応させる。次いで、該反応溶液を
遮光し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水溶液を加え、２０℃
で３０分間反応させる。
【００１６】本発明では、該アルデヒド基を生理活性物
質の遊離のアミノ基と反応させてシッフ塩基を生成させ
る。該反応は、一般的に、０．０１Ｍ炭酸ソーダ緩衝
液、ｐＨ９．５で、室温、２〜３時間、反応させる。
質の遊離のアミノ基と反応させてシッフ塩基を生成させ
る。該反応は、一般的に、０．０１Ｍ炭酸ソーダ緩衝
液、ｐＨ９．５で、室温、２〜３時間、反応させる。
【００１７】本発明では、次いでシッフ塩基を還元剤に
て処理して、第二級アミンを生成させて、該酵素を生理
活性物質に結合する。還元剤としては、水素化硼素ナト
リウムなどが例示される。これらの濃度は、直接、固体
を数ｍｇ（約５ｍｇ程度）を加え、３０〜４０分間、室
温で反応させるか、または、４℃、一夜反応させること
によって処理を行うものである。また、固形を添加直前
に溶解調整したものでは、純水に約４ｍｇ／ｍｌ濃度と
したものを０．１〜０．２ｍｌ加え、４℃、２時間反応
を行うものである。
て処理して、第二級アミンを生成させて、該酵素を生理
活性物質に結合する。還元剤としては、水素化硼素ナト
リウムなどが例示される。これらの濃度は、直接、固体
を数ｍｇ（約５ｍｇ程度）を加え、３０〜４０分間、室
温で反応させるか、または、４℃、一夜反応させること
によって処理を行うものである。また、固形を添加直前
に溶解調整したものでは、純水に約４ｍｇ／ｍｌ濃度と
したものを０．１〜０．２ｍｌ加え、４℃、２時間反応
を行うものである。
【００１８】酵素が結合した、これらの生理活性物質
は、通常、最終工程にて、ゲルクロマトグラフィにより
反応液より分離精製される。例えば、セファデックスＧ
２００やウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）等が使用
される。
は、通常、最終工程にて、ゲルクロマトグラフィにより
反応液より分離精製される。例えば、セファデックスＧ
２００やウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）等が使用
される。
【００１９】生理活性物質に結合した酵素の活性を測定
するには、一般的な酵素活性方法が適用できる。
するには、一般的な酵素活性方法が適用できる。
【００２０】本発明の一実施態様では、ペルオキシダー
ゼを過ヨウ素酸で酸化処理して、酵素中の糖鎖の水酸基
をアルデヒド基に変換し、該アルデヒド基を生理活性物
質の遊離のアミノ基と、緩衝剤濃度が５０ｍＭ以上、か
つ、該緩衝液のｐＨを１０以上である緩衝液中で反応さ
せてシッフ塩基を生成させ、次いでシッフ塩基を水素化
硼素ナトリウムにて処理して、第二級アミンを生成させ
て、該酵素を生理活性物質に結合する。
ゼを過ヨウ素酸で酸化処理して、酵素中の糖鎖の水酸基
をアルデヒド基に変換し、該アルデヒド基を生理活性物
質の遊離のアミノ基と、緩衝剤濃度が５０ｍＭ以上、か
つ、該緩衝液のｐＨを１０以上である緩衝液中で反応さ
せてシッフ塩基を生成させ、次いでシッフ塩基を水素化
硼素ナトリウムにて処理して、第二級アミンを生成させ
て、該酵素を生理活性物質に結合する。
【００２１】本発明の別な実施態様では、酵素と生理活
性物質を別々に透析し、その後、両透析液をそのまま混
合し、生理活性物質の遊離アミノ基と酵素の糖鎖由来の
アルデヒド基を塩基性下でシッフ塩基を生成させる。本
発明では透析用緩衝液の濃度を従来は１０ｍＭであると
ころ、５０ｍＭ以上の濃度とし、かつ、従来はｐＨ９．
５のところ、ｐＨ１０以上に保つことにより、生理活性
物質１分子当たりの酵素結合量を平均２個以上、通常、
３個程度、結合することができ、しかも安定的に結合す
ることができる。
性物質を別々に透析し、その後、両透析液をそのまま混
合し、生理活性物質の遊離アミノ基と酵素の糖鎖由来の
アルデヒド基を塩基性下でシッフ塩基を生成させる。本
発明では透析用緩衝液の濃度を従来は１０ｍＭであると
ころ、５０ｍＭ以上の濃度とし、かつ、従来はｐＨ９．
５のところ、ｐＨ１０以上に保つことにより、生理活性
物質１分子当たりの酵素結合量を平均２個以上、通常、
３個程度、結合することができ、しかも安定的に結合す
ることができる。
【００２２】本発明の酵素を結合した生理活性物質は、
生体成分を検出する免疫学的方法において標識物質とし
て、有効に利用される。免疫学的方法としては、たとえ
ば、固相を使用するサンドイッチ測定法、競合法などが
あり、固相としては多孔質膜、ポリスチレンビーズ、９
６穴プレートなどがあり、標識である酵素を測定する方
法としては、それぞれの酵素測定法に従う。
生体成分を検出する免疫学的方法において標識物質とし
て、有効に利用される。免疫学的方法としては、たとえ
ば、固相を使用するサンドイッチ測定法、競合法などが
あり、固相としては多孔質膜、ポリスチレンビーズ、９
６穴プレートなどがあり、標識である酵素を測定する方
法としては、それぞれの酵素測定法に従う。
【００２３】本発明の酵素標識体は、特に固相に対する
標識抗体の非特異的結合が少なく、酵素によるシグナル
が多いため高感度測定が可能になる。例えば、本発明に
よる酵素標識抗体は免疫測定分析に広く用いることが可
能で、そのような免疫測定法としては、ホルモン、ペプ
チド、腫瘍マーカー、各種肝炎ウィルス、各種生体物質
等の測定が可能で、例えば、ＣＥＡ，ＡＦＰ，ＴＳＨを
測定対象として挙げることができる。また、組織切片の
免疫染色用の酵素標識抗体としての使用などにも利用は
可能である。
標識抗体の非特異的結合が少なく、酵素によるシグナル
が多いため高感度測定が可能になる。例えば、本発明に
よる酵素標識抗体は免疫測定分析に広く用いることが可
能で、そのような免疫測定法としては、ホルモン、ペプ
チド、腫瘍マーカー、各種肝炎ウィルス、各種生体物質
等の測定が可能で、例えば、ＣＥＡ，ＡＦＰ，ＴＳＨを
測定対象として挙げることができる。また、組織切片の
免疫染色用の酵素標識抗体としての使用などにも利用は
可能である。
【００２４】
【実施例】次に、参考例および実施例を用いて、本発明
を詳細に説明する。実施例中、分離精製された生理活性
物質へのペルオシダーゼ結合数は、通常、２８０ｎｍと
４０３ｎｍの吸光度測定より、次式に従って算出した。
を詳細に説明する。実施例中、分離精製された生理活性
物質へのペルオシダーゼ結合数は、通常、２８０ｎｍと
４０３ｎｍの吸光度測定より、次式に従って算出した。
【００２５】
【数１】 ここで、ε(403,HRP) ＝２．１ ＲＺ(HRP) ＝３．０ ε(280,IgG) ＝１．４の数値を使用すると、以下の式に
要約される。
要約される。
【００２６】
【数２】
【００２７】また、測定感度（Ｓ／Ｎ比）は、Ｓ、即
ち、シグナルはそれぞれの測定項目のある濃度でのシグ
ナルを示し、Ｎは、ノイズであるので、その測定項目の
バックグランドである。即ち、Ｓ／Ｎ比は大きいほど測
定感度が高いことを示す。
ち、シグナルはそれぞれの測定項目のある濃度でのシグ
ナルを示し、Ｎは、ノイズであるので、その測定項目の
バックグランドである。即ち、Ｓ／Ｎ比は大きいほど測
定感度が高いことを示す。
【００２８】参考例１ 従来のＨＲＰ架橋法 西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを
０．３Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）１．０ｍ
Ｌに溶解し、該溶液に１％の１−フルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼン・エタノール溶液０．１ｍＬを添加し、
２０℃で１時間反応させた。次いで、該反応溶液を遮光
し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水溶液１．０ｍＬを加え、
２０℃で３０分間反応させた。さらに、該反応液に０．
１６Ｍエチレングリコール水溶液を１．０ｍＬ加え、１
時間ゆっくり攪拌した。これにより、過剰のＮａＩＯ4
による酸化を停止させた。次いで、１０ｍＭの炭酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ９．５に対して透析膜を使用して、上
記酸化されたアルデヒド化ペルオキシダーゼ液を４℃に
て一夜透析した（J.Histochemistry and Cytochemistry
22,1084,1974 参照）。
０．３Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）１．０ｍ
Ｌに溶解し、該溶液に１％の１−フルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼン・エタノール溶液０．１ｍＬを添加し、
２０℃で１時間反応させた。次いで、該反応溶液を遮光
し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水溶液１．０ｍＬを加え、
２０℃で３０分間反応させた。さらに、該反応液に０．
１６Ｍエチレングリコール水溶液を１．０ｍＬ加え、１
時間ゆっくり攪拌した。これにより、過剰のＮａＩＯ4
による酸化を停止させた。次いで、１０ｍＭの炭酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ９．５に対して透析膜を使用して、上
記酸化されたアルデヒド化ペルオキシダーゼ液を４℃に
て一夜透析した（J.Histochemistry and Cytochemistry
22,1084,1974 参照）。
【００２９】一方、結合させる被標識体として、ＣＥＡ
抗体、ＡＦＰ抗体またはＣＫ−ＭＭ抗体各５ｍｇを同じ
１０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対し
て透析膜を使用して、４℃にて、一夜透析した。透析終
了後、得られた抗体（被標識体）を上記したアルデヒド
化ペルオキシダーゼ５ｍｇと２０℃で３時間混和し、シ
ッフ塩基を生成した。さらに、５ｍｇの固形の水素化硼
素ナトリウムを加えて、３０分攪拌し、シッフ塩基を還
元して、安定な第２級アミンを得た。その後、０．０１
Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２（以下、ＰＢＳと略
す）に対して、第２級アミンを４℃にて一夜透析した。
透析後、セファデックスＧ２００カラムクロマトグラフ
ィーに上記透析物をアブライして、未反応ＨＲＰとＨＲ
Ｐ標識抗体を分離し、精製ＨＲＰ標識体を得た。
抗体、ＡＦＰ抗体またはＣＫ−ＭＭ抗体各５ｍｇを同じ
１０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対し
て透析膜を使用して、４℃にて、一夜透析した。透析終
了後、得られた抗体（被標識体）を上記したアルデヒド
化ペルオキシダーゼ５ｍｇと２０℃で３時間混和し、シ
ッフ塩基を生成した。さらに、５ｍｇの固形の水素化硼
素ナトリウムを加えて、３０分攪拌し、シッフ塩基を還
元して、安定な第２級アミンを得た。その後、０．０１
Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２（以下、ＰＢＳと略
す）に対して、第２級アミンを４℃にて一夜透析した。
透析後、セファデックスＧ２００カラムクロマトグラフ
ィーに上記透析物をアブライして、未反応ＨＲＰとＨＲ
Ｐ標識抗体を分離し、精製ＨＲＰ標識体を得た。
【００３０】実施例１ 参考例１と同様にして、西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム溶液
（ｐＨ８．１）１．０ｍＬに溶解し、該溶液に１％の１
−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン・エタノール溶
液０．１ｍＬを添加し、２０℃で１時間反応させた。次
いで、該反応溶液を遮光し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水
溶液１．０ｍＬを加え、２０℃で３０分間反応させた。
さらに、該反応液に０．１６Ｍエチレングリコール水溶
液を１．０ｍＬ加え、１時間ゆっくり攪拌した。これに
より、過剰のＮａＩＯ4 による酸化を停止させた。さら
に、アルデヒド化ペルオキシダーゼを１００ｍＭ炭酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ１０．０に対して透析膜を用いて、
４℃にて、一夜透析を行った。
ーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム溶液
（ｐＨ８．１）１．０ｍＬに溶解し、該溶液に１％の１
−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン・エタノール溶
液０．１ｍＬを添加し、２０℃で１時間反応させた。次
いで、該反応溶液を遮光し、０．０５ＭのＮａＩＯ4 水
溶液１．０ｍＬを加え、２０℃で３０分間反応させた。
さらに、該反応液に０．１６Ｍエチレングリコール水溶
液を１．０ｍＬ加え、１時間ゆっくり攪拌した。これに
より、過剰のＮａＩＯ4 による酸化を停止させた。さら
に、アルデヒド化ペルオキシダーゼを１００ｍＭ炭酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ１０．０に対して透析膜を用いて、
４℃にて、一夜透析を行った。
【００３１】同時に、別に準備した透析膜を用いて、被
標識体である抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（ＯＹ
Ｍｅｄｉｘ社製）５ｍｇを１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ１０．０に対して、４℃にて、一夜透析を行っ
た。翌日、両者を２０℃、３時間混和し、シッフ塩基を
作製した。次いで、参考例１と同様にして、５ｍｇの固
形水素化硼素ナトリウムを加えて、３０分攪拌し、シッ
フ塩基を還元させた。還元終了後、ペルオキシダーゼ標
識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を０．０１Ｍリン酸緩衝
生理食塩水に対して透析した。透析終了後、セファデッ
クスＧ２００カラムクロマトグラフィーに透析物をアブ
ライして、未反応ＨＲＰとＨＲＰ標識抗ヒトＣＥＡモノ
クローナル抗体（標識体）を分離して、精製ＨＲＰ標識
抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体を得た。
標識体である抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（ＯＹ
Ｍｅｄｉｘ社製）５ｍｇを１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ１０．０に対して、４℃にて、一夜透析を行っ
た。翌日、両者を２０℃、３時間混和し、シッフ塩基を
作製した。次いで、参考例１と同様にして、５ｍｇの固
形水素化硼素ナトリウムを加えて、３０分攪拌し、シッ
フ塩基を還元させた。還元終了後、ペルオキシダーゼ標
識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を０．０１Ｍリン酸緩衝
生理食塩水に対して透析した。透析終了後、セファデッ
クスＧ２００カラムクロマトグラフィーに透析物をアブ
ライして、未反応ＨＲＰとＨＲＰ標識抗ヒトＣＥＡモノ
クローナル抗体（標識体）を分離して、精製ＨＲＰ標識
抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体を得た。
【００３２】得られたモノクローナル抗体を用いて、参
考例２に記載する測定系で試料中のヒトＣＥＡを測定し
た。比較のために、比較例１で作製したＨＲＰ標識ヒト
ＣＥＡ抗体を同様に用いた。２８０ｎｍと４０３ｎｍの
吸光度をそれぞれ測定し、上記式に当てはめて算出した
酵素結合比の結果を下記表１に示す。また、測定感度
（Ｓ／Ｎ比）を示す。
考例２に記載する測定系で試料中のヒトＣＥＡを測定し
た。比較のために、比較例１で作製したＨＲＰ標識ヒト
ＣＥＡ抗体を同様に用いた。２８０ｎｍと４０３ｎｍの
吸光度をそれぞれ測定し、上記式に当てはめて算出した
酵素結合比の結果を下記表１に示す。また、測定感度
（Ｓ／Ｎ比）を示す。
【００３３】参考例２ 実際のヒトＣＥＡ測定系 抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（ＯＹ Ｍｅｄｉｘ社
製クローン５９０９）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１０μｇ／ｍＬの濃度になるように調
製した抗体液を、９６穴マイクロタイタープレート（コ
ースター社製）に１００μＬずつ分注し、室温にて、３
時間放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝−生理食塩水（ｐＨ
７．２）液で洗浄した。その後、１％牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略す）を含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ７．２）１００μＬで１時間浸漬し、ブロ
ック処理を行って固相とした。
製クローン５９０９）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１０μｇ／ｍＬの濃度になるように調
製した抗体液を、９６穴マイクロタイタープレート（コ
ースター社製）に１００μＬずつ分注し、室温にて、３
時間放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝−生理食塩水（ｐＨ
７．２）液で洗浄した。その後、１％牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略す）を含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ７．２）１００μＬで１時間浸漬し、ブロ
ック処理を行って固相とした。
【００３４】ヒトＣＥＡを含む標準液を１００μＬを調
整した９６穴マイクロタイタープレートに加えて、室温
で１時間反応させた。次いで０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩水で洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＣＥＡモノクロ
ーナル抗体（ＯＹ Ｍｅｄｉｘ社製クローン５９０５）
１００μＬを加えて、１時間反応させ、０．０１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで、過
酸化水素を含む０．３ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テト
ラメチルベンチジン溶液１００μＬを加え、３０分間反
応させた。次いで、分光光度計にて６６０ｎｍの吸光度
を測定し、標準曲線を作成した。その際に、ＣＥＡ８０
ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度が同一になる濃度でのＣＥＡ
０ｎｇ／ｍＬ（即ちバックグランドのレベル）を参考例
１と比較検討した。
整した９６穴マイクロタイタープレートに加えて、室温
で１時間反応させた。次いで０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩水で洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＣＥＡモノクロ
ーナル抗体（ＯＹ Ｍｅｄｉｘ社製クローン５９０５）
１００μＬを加えて、１時間反応させ、０．０１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで、過
酸化水素を含む０．３ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テト
ラメチルベンチジン溶液１００μＬを加え、３０分間反
応させた。次いで、分光光度計にて６６０ｎｍの吸光度
を測定し、標準曲線を作成した。その際に、ＣＥＡ８０
ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度が同一になる濃度でのＣＥＡ
０ｎｇ／ｍＬ（即ちバックグランドのレベル）を参考例
１と比較検討した。
【００３５】
【表１】
【００３６】表１から明らかなように、本発明のペルオ
キシダーゼ標識ヒトＣＥＡ抗体を使用すると、従来の標
識抗体に比べて、酵素結合比率が高く、測定感度が高い
ことが明らかである。
キシダーゼ標識ヒトＣＥＡ抗体を使用すると、従来の標
識抗体に比べて、酵素結合比率が高く、測定感度が高い
ことが明らかである。
【００３７】実施例２ 実施例１の抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を使用し
て、実施例１と同様な操作で、ＨＲＰ標識ヒトＡＦＰ抗
体を作製した。得られた抗体を用いて、参考例３に記載
する測定系でヒトＡＦＰを測定した。比較のために、比
較例１で作製したＨＲＰ標識ヒトＡＦＰ抗体を用いた。
また、２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度をそれぞれ測定
し、式に当てはめて算出した酵素結合比の結果を下記表
２に示す。
て、実施例１と同様な操作で、ＨＲＰ標識ヒトＡＦＰ抗
体を作製した。得られた抗体を用いて、参考例３に記載
する測定系でヒトＡＦＰを測定した。比較のために、比
較例１で作製したＨＲＰ標識ヒトＡＦＰ抗体を用いた。
また、２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度をそれぞれ測定
し、式に当てはめて算出した酵素結合比の結果を下記表
２に示す。
【００３８】参考例３ 実際のヒトＡＦＰ測定系 抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（藤沢薬品（株）社製
クローン４７−５）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１０μｇ／ｍＬの濃度になるように調
整した抗体液を９６穴マイクロタイタープレート（コー
スター社製）に１００μＬずつ分注し、室温にて、３時
間放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、
１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）を含むリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）１００μＬで１時間浸
漬し、ブロック処理を行い、固相とした。
クローン４７−５）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１０μｇ／ｍＬの濃度になるように調
整した抗体液を９６穴マイクロタイタープレート（コー
スター社製）に１００μＬずつ分注し、室温にて、３時
間放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、
１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）を含むリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）１００μＬで１時間浸
漬し、ブロック処理を行い、固相とした。
【００３９】ヒトＡＦＰを含む標準液を調製したマイク
ロタイターに１００μＬ加えて、室温で１時間反応させ
た。０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で
洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗
体（藤沢薬品（株）社製クローン２０−７）１００μＬ
を加えて１時間反応させ、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食
塩水（ｐＨ７．２）で洗浄し、過酸化水素を含む０．３
ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テトラメチルベンチヂン溶
液１００ｕＬ加え３０分間反応させた。分光光度計にて
６６０ｎｍにて吸光度を測定し、標準曲線を作成した。
その際に、ＡＦＰ１００ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度が同
一になる濃度でのＡＦＰ０ｎｇ／ｍＬ（即ちバックグラ
ンドのレベル）を比較検討した。
ロタイターに１００μＬ加えて、室温で１時間反応させ
た。０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で
洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗
体（藤沢薬品（株）社製クローン２０−７）１００μＬ
を加えて１時間反応させ、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食
塩水（ｐＨ７．２）で洗浄し、過酸化水素を含む０．３
ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テトラメチルベンチヂン溶
液１００ｕＬ加え３０分間反応させた。分光光度計にて
６６０ｎｍにて吸光度を測定し、標準曲線を作成した。
その際に、ＡＦＰ１００ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度が同
一になる濃度でのＡＦＰ０ｎｇ／ｍＬ（即ちバックグラ
ンドのレベル）を比較検討した。
【００４０】
【表２】
【００４１】実施例３ 抗ヒトＣＫ−ＭＭモノクローナル抗体を使用して、実施
例１と同様な操作で、ＨＲＰ標識ヒトＣＫ−ＭＭ抗体を
作製した。得られた抗体を用いて、参考例４に記載する
測定系でヒトＣＫ−ＭＢを測定した。比較のために、比
較例１で作製したＨＲＰ標識ヒトＣＫ−ＭＭ抗体を用い
た。また、２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度をそれぞれ
測定し、式に当てはめて算出した酵素結合比の結果を下
記表２に示す。
例１と同様な操作で、ＨＲＰ標識ヒトＣＫ−ＭＭ抗体を
作製した。得られた抗体を用いて、参考例４に記載する
測定系でヒトＣＫ−ＭＢを測定した。比較のために、比
較例１で作製したＨＲＰ標識ヒトＣＫ−ＭＭ抗体を用い
た。また、２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度をそれぞれ
測定し、式に当てはめて算出した酵素結合比の結果を下
記表２に示す。
【００４２】参考例４ 実際のヒトＣＫ−ＭＢ測定系 抗ヒトＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ（株）
社製クローン１０−Ｆ）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．５）に１０ｕｇ／ｍＬの濃度になるように
調整した抗体液を９６穴マイクロタイタープレート（コ
ースター社製）に１００μＬずつ分注し、室温、３時間
放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）で洗浄後、１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略
す）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）１００
μＬで１時間浸漬し、ブロック処理を行って固相とし
た。
社製クローン１０−Ｆ）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．５）に１０ｕｇ／ｍＬの濃度になるように
調整した抗体液を９６穴マイクロタイタープレート（コ
ースター社製）に１００μＬずつ分注し、室温、３時間
放置後、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）で洗浄後、１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略
す）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）１００
μＬで１時間浸漬し、ブロック処理を行って固相とし
た。
【００４３】ヒトＣＫ−ＭＢを含む標準液を調製したマ
イクロタイターに１００μＬ加えて、室温で１時間反応
させた。０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）で洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＣＫ−ＭＭモノク
ローナル抗体（Ｄａｋｏ（株）社製クローン９Ｆ）１０
０μＬを加えて１時間反応させ、リン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで過酸化水素を含む０．
３ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テトラメチルベンチヂン
溶液１００μＬ加え、３０分間反応させた。分光光度計
にて６６０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成し
た。その際にＣＫ−ＭＢ４０ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度
が同一になる濃度でのＣＫ−ＭＢ０ｎｇ／ｍＬ（即ちバ
ックグランドのレベル）を比較検討した。
イクロタイターに１００μＬ加えて、室温で１時間反応
させた。０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）で洗浄後、精製ＨＲＰ標識抗ヒトＣＫ−ＭＭモノク
ローナル抗体（Ｄａｋｏ（株）社製クローン９Ｆ）１０
０μＬを加えて１時間反応させ、リン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで過酸化水素を含む０．
３ｇ／Ｌの３，３’，５，５’テトラメチルベンチヂン
溶液１００μＬ加え、３０分間反応させた。分光光度計
にて６６０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成し
た。その際にＣＫ−ＭＢ４０ｎｇ／ｍＬ濃度での吸光度
が同一になる濃度でのＣＫ−ＭＢ０ｎｇ／ｍＬ（即ちバ
ックグランドのレベル）を比較検討した。
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例５ 実施例１で作製したペルオキシダーゼ標識ヒトＣＥＡ抗
体を用いて、多孔性膜を固相担体として用いる免疫測定
試薬，イムノフローラ・ＣＥＡ（東洋紡績製）の標識抗
体として使用した。比較のために、従来法で作製した標
識抗体（参考例１）を用いて測定感度の比較を行った。
測定に使用する試薬は、キット添付のブロック液、希釈
液、洗浄液、発色液を用いた。標準液の１００ｎｇ／ｍ
Ｌと０ｎｇ／ｍＬでの測定感度（Ｓ／Ｎ）を求めたとこ
ろ、本発明の酵素標識抗体では、３００であり、従来法
では、約１０であった。以上の結果より明らかなように
本発明方法は、多孔性膜を固相とする短時間測定法にお
いて顕著な効果を発揮するものである。
体を用いて、多孔性膜を固相担体として用いる免疫測定
試薬，イムノフローラ・ＣＥＡ（東洋紡績製）の標識抗
体として使用した。比較のために、従来法で作製した標
識抗体（参考例１）を用いて測定感度の比較を行った。
測定に使用する試薬は、キット添付のブロック液、希釈
液、洗浄液、発色液を用いた。標準液の１００ｎｇ／ｍ
Ｌと０ｎｇ／ｍＬでの測定感度（Ｓ／Ｎ）を求めたとこ
ろ、本発明の酵素標識抗体では、３００であり、従来法
では、約１０であった。以上の結果より明らかなように
本発明方法は、多孔性膜を固相とする短時間測定法にお
いて顕著な効果を発揮するものである。
【００４６】
【発明の効果】本発明法によって作製した標識体は、高
濃度の過ヨウ素酸で酵素の糖鎖を開裂させる必要がな
く、アルデヒド化の比率が少ないため、標識体の固相へ
の非特異的結合も少なく、即ち、バックグランド・ブラ
ンクが小さくなるため、高感度な測定が可能になり、こ
のものを使用して、免疫学的測定方法、免疫学的測定キ
ットに供することができるようになった。本発明による
酵素標識生理活性物質、特に酵素標識抗体は糖鎖の開裂
が少なく、かつ、結合している酵素量が多いため、固相
に対する標識抗体の非特異的結合が少なく、酵素による
シグナルが多いため高感度測定が可能になった。
濃度の過ヨウ素酸で酵素の糖鎖を開裂させる必要がな
く、アルデヒド化の比率が少ないため、標識体の固相へ
の非特異的結合も少なく、即ち、バックグランド・ブラ
ンクが小さくなるため、高感度な測定が可能になり、こ
のものを使用して、免疫学的測定方法、免疫学的測定キ
ットに供することができるようになった。本発明による
酵素標識生理活性物質、特に酵素標識抗体は糖鎖の開裂
が少なく、かつ、結合している酵素量が多いため、固相
に対する標識抗体の非特異的結合が少なく、酵素による
シグナルが多いため高感度測定が可能になった。
Claims (6)
- 【請求項１】 酵素を酸化処理して、酵素中の糖鎖の水
酸基をアルデヒド基に変換し、該アルデヒド基を生理活
性物質の遊離のアミノ基と反応させてシッフ塩基を生成
させ、次いでシッフ塩基を還元剤にて処理して、第二級
アミンを生成させて、該酵素を生理活性物質に結合する
方法において、上記アルデヒド基と上記アミノ基の反応
時の緩衝剤濃度を５０ｍＭ以上とし、かつ、該緩衝液の
ｐＨを１０以上とすることを特徴とする生理活性物質に
酵素を結合する方法。 - 【請求項２】 酵素がペルオキシダーゼまたはグルコー
スオキシダーゼである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 生理活性物質がポリクローナル抗体、モ
ノクロナール抗体またはそれらの断片である請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 酸化剤が過ヨウ素酸である請求項１記載
の方法。 - 【請求項５】 還元剤が水素化硼素ナトリウムである請
求項１記載の方法。 - 【請求項６】 緩衝剤が、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナ
トリウム、塩酸−炭酸ナトリウムまたはグッド緩衝剤で
ある請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17571897A JPH1123574A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 生理活性物質に酵素を結合する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17571897A JPH1123574A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 生理活性物質に酵素を結合する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1123574A true JPH1123574A (ja) | 1999-01-29 |
Family
ID=16001034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17571897A Pending JPH1123574A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | 生理活性物質に酵素を結合する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1123574A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102645531A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-22 | 上海蓝怡科技有限公司 | 碱性磷酸酶标记抗体的方法 |
| CN110865183A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-03-06 | 润方(长春)生物科技有限公司 | 一种利用磁珠制备hrp标记抗体的方法 |
-
1997
- 1997-07-01 JP JP17571897A patent/JPH1123574A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102645531A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-22 | 上海蓝怡科技有限公司 | 碱性磷酸酶标记抗体的方法 |
| CN102645531B (zh) * | 2012-04-06 | 2014-05-28 | 上海蓝怡科技有限公司 | 碱性磷酸酶标记抗体的方法 |
| CN110865183A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-03-06 | 润方(长春)生物科技有限公司 | 一种利用磁珠制备hrp标记抗体的方法 |
| CN110865183B (zh) * | 2019-11-25 | 2022-11-18 | 润方(长春)生物科技有限公司 | 一种利用磁珠制备hrp标记抗体的方法 |
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