JPS63145960A

JPS63145960A - 標識抗体の非特異的吸着抑制薬

Info

Publication number: JPS63145960A
Application number: JP62082512A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Aoyanagi; 重夫青柳; Miyoko Kusumi; 美代子久住; Akira Matsuyuki; 松行　昭; Nobuo Oshima; 信夫大島
Original assignee: Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1986-06-23
Filing date: 1987-04-03
Publication date: 1988-06-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ａ　産業上の利用分野この発明は、標識抗体の非特異的吸着抑制薬に関するも
のである。

Ｂ　発明の８！要この発明は、固相上で標識抗体と固相抗体とを反応させ
た試薬を免疫学的測定法に使用する場合において、反応
の際に使用する緩衝液に血清を添加して使用することに
より、標識抗体の非特異的吸若抑制を図った標識抗体の
非特異的吸着抑制薬に関するもので免疫学的な測定にお
いて高感度を期待することが可能なものである。

Ｃ従来の技術従来から、上述のような固相を用いる免疫学的測定法に
は、競合法と非競合法があり、競合法の代表例に第１抗
体固相法、非競合法の代表例にサンドイツチ法がある。

Ｄ　発明が解決しようとする問題点例えば、リン酸緩衝液中で標識抗体と抗体被覆固相の免
疫反応を行うと、通常は、その非特異的吸着の程度は０
．４％程度であり、以下の点が問題として挙げられる。

　すなわち、ｌ）測定範囲が狭い２）測定感度が悪い３）日内・日間変動が大きいという事項を挙げることができる固相を用いる免疫学的測定法おいて、その感度を左右す
る主たる要因の１つである標識抗体の固相への非特異的
吸着を如何に抑制し得るかという点において適格な解決
が与えられると、標識抗体の非特異的吸着抑制薬の測定
範囲が拡大し、測定感度が向上し、日内・日間の変動を
減少させることができる。

Ｅ　問題点を解決するための手段この発明は、以上のような状況のなかにあって標識抗体
の固相への非特異的吸着の抑制について種々検討を加え
た結果到達したものであって、固相を使用して免疫学的
測定を行うに当り、免疫グロブリンＧを被覆している固
相上で標識抗体と固相抗体を反応させる際に、ここで使
用する緩衝液に血清を添加したものを用いることを特徴
とする標識抗体の非特異的吸着抑制薬、に関するもので
ある。

Ｆ　　作　　用この発明は、血清から免疫グロブリンＧを精製する操作
と、免疫グロブリンＧ−グルコースオキシダーゼ標準抗
体を調製する操作と、固相をｙｌ！ｉｌ製する操作とを
別途に進め、最終的に固相への非特異的吸Ｒｍの評価を
行う工程とからなるものである。

なお、血清から免疫グロブリンＧを精製する方法として
は、第１図に示した方法により行い、酵素標識抗体の調
製法は、第２図に示した３段階の工程により、また、固
相の調製法は第３図に従って行った。

また、以下の記載においては、それぞれの物質について
略称により説明を行うが、この発明で使用する物質とそ
の略称は、以下の通りである。

◎ｈＣＧβ・・・ヒト胎盤性ゴナドトロピン−β◎ＡＦ
Ｐ・・・α−フェトプロティン ◎ＢＳＡ・・・牛血清アルブミン ◎ＩｇＧ・・・免疫グロブリンＧ ◎ＧＯＤ・・・グルコースオキシダーゼ◎ＰＢ・・・ポ
リスチレンボール ◎ＧＭＢＳ・・・サクシニミジル−４−マレイミドブチ
レイト ◎ＳＡＭＳａ・・・Ｓ−アセチルメルカプトこはく酸◎
ＳＨ−ｒｇＧ・−ＳＡＭＳａで処理を行ったＩｇＧｏＡ液・・・０．１モル／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６）
および５ミリモル／ｕＥＤＴＡ溶ン夜◎Ｂン夜・・・Ｏ
，１ｍｇ／ｍＪｌのＩｇＧと０．１モル／λリン！！２
緩衝？夜（ｐＨ７，５、Ｂン夜）◎Ｃ？ｉ・・・０，０
１モル／℃のリン酸緩衝を夜（ｐＨ５，０）、０．　１
モルフｆｔ食塩水、０．１％ＢＳＡおよびＯ１１％Ｎａ
Ｎ、含有溶ン夜◎Ｄン夜・・・０．１％アジ化ナトリウ
ム、０．２％ＢＳＡ、０．３３７％塩化ナトリウム、０
゜０５６モル／ａリン酸緩衝Ｙ夜酵素標識抗体は、ヤギ抗ＡＦＰ−ＩｇＧ−Ｇ。

Ｄ、モルモット抗ｈＣＧ−Ｉ　ｇＧ−ＧＯＤまたはウサ
ギ抗ＡＦＰ−１３Ｇ−ＣＯＤを使用し、また固相は、抗
ＡＦＰ−１ｇＧ被覆ＰＢ、ヤギ抗ＡＦＰ−１ｇＧ？ｆＬ
覆ＰＢまたはモルモット抗ｈＣＧ−ＩｇＧ被覆ＰＢを使
用した。

Ｇ　実施例以下、実施例および比較例を示して、この発明の構成お
よび効果を説明する。

実施例　１正常モルモット血清；Ｄ液の容積比率１；０〜１：２０
と血清の比率を徐々に減少させて、標識抗体の同相への
非特異的吸着を抑制する効果を測定しその結果を第４図
に示したが、比較例１としてＤ液のみを用いて、標識抗
体の固相への非特異的吸着比較試料とした。

このときの具体的な評価手法は、例えば、抗ｈＣＧ−Ｃ
ＯＤ標識抗体画分の、固相への吸着をＡカウント／３０
秒、添加抗ｈＣＧβ−ＩｇＧ−ＧＯＤ標識抗体の場合を
Ｂカウント／３０秒としたときの固相への非特異的吸着
率としては、（Ａ／Ｂ）　Ｘ　１００により求めた。

また、第４図に示したように、実施例においては、正常
モルモット血清＝Ｄ液の比率をに〇〜１：２０と血清の
比率を減少させるにつれて、非特異的吸着の挙動は、０
．００５〜０．０５％と増加の傾向を示したが、比較例
１の緩衝液中の場合では、この値は０，４％であった。

実施例　２体積比で正常モルモット血清：Ｄ液＝１：５の混合物（
以下、Ｅ液と略）と比較とし′ＣＤ液のみを用いて酵素
免疫測定法（以下ＥＩＡと略）を実施し、測定範囲およ
び測定感度を比較し、第５図に示した評価法により評価
を行った。

使用した標識抗体は、モルモット抗ｈＣＧ−１ｇＧ−Ｃ
ＯＤであり、固相抗体はモルモット抗ｈＣＧ−１ｇＧを
使用した。

第６図に示したように、実施例２および比較例２におけ
る測定範囲と感度は、おのおの２．５〜１０１００Ｏ／
ｍｌ、５０〜５００　ｍ　Ｕ　／　ｍ　１と、２．５ｍ
Ｕ／ｍｌおよび５０ｍυ／　ｍ　１であった。

次に、この測定試薬の口内・日間変動についての確認試
験を行ったが、具体的には、実施例のＥ液と比較例のＤ
液を用い、各々、日内変動３点で１０回、日間変動２点
で６回縁り返し、変動係数を求めたものである。

実施例　１０　　１３．５±　　１．１　　７．８　　
　日内２１０１２４．３±６．８５．３ツノ１０　　　　２０７．５±　　１０　、０　　　　４　
、８　　　　　　　／／６　　５７．３±　　３．７　
　６．５　　　日間６１８０．１±６．８３．８ツノ比較例　１０　　５２．３±　１３．２　　２５．３　
　　日内１　　　　　１０　　　　２３０．０±　　３
５．９　　　　１５．６　　　　　　　／７１０　　　
　４５０．０±　　８７．８　　　　１９．５　　　　
　　　／１５　　８５．２±　１１．２　　１３．２　
　　日間６　　　　２５１．５±　　２７．４　　　　
１０．９　　　　　　　ｔｔこの表から、実施例は比較
例より、日内・日間変動が小さいことが明らかになった
。

実施例　３酵素標識抗体としてヤギ抗ＡＦＰ−ｒｇＧ−ＧＯＤを、
また、固相はヤギ抗ＡＦＰ−１ｇＧ被覆ＰＢを、反応液
には０．１％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳＡおよび
Ｄ液を使用した。

ヤギ抗ＡＦＰ−１ｇＧ−ＧＯＤ酵紫標識抗体および固相
調製法は第１．２および３図に示した通りである。

前の例と同様にしてヤギ抗ＡＦＰ−ＩｇＧ−ＣＯＤ標識
抗体のヤギ抗ＡＦＰ−ＩｇＧ被覆ＰＢへの非特異的吸着
について調査を行ったところ、第９図に示す結果を得た
。

この場合、実施例の条件下では、非特異的吸着が０．０
６６％であったのに対して、比較例では０．２９〜０．
６６％と著しく高い値を示すものであった。

また、抗体としては、ＡＦＰに限らずヤギ由来ＩｇＧな
らば同様の結果を得ることが可能であることを確認した
。

なお、比較例については、ウサギ（比較例２）、ヤギ（
同、３）、クマ（同、４）およびＤ液（同、５）を使用
したものである。

実施例　４実施例２と同様に実施例３の試薬についてＥＴＡを実施
し、測定範囲および感度について比較した。

比較例５として、Ｄ液を使用したケースについても合せ
て同じようなＥＩＡを行い比較したが、第１０図に示し
たように実施例３の試薬の測定範囲は、１０〜１０００
　ｎ　ｇ／ｍ　１．検出感度は１０　ｎ　ｇ／　ｍ　１
であったのに対して比較例５では測定範囲５０〜１１０
００ｎ／ｍｌ、検出感度５゜ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｉであフ
た。

次に、この測定試薬の日内・日間変動についての確認試
験を前の場合と同じように行ったが、次の表の結果を得
た。

実施例　１０４８±　　　４．５　　９．３　　　日内
３　　　　　１０　　　　２００±　　　　１０．８　
　　　　５．４　　　　　　　）１１０　　　　７１０
±　　　　２２．０　　　　　３．１　　　　　　　）
）６１３０±　　　８．３　　６．４　　　日間６　　
　５００±　　　　２３　、５　　　　　４　、７　　
　　　　　／／比較例　１０６２±　　１０．９　　１
７．５　　　日内５　　　　　１０　　　　３７３±　
　　　６２　、７　　　　１６　、８　　　　　　　）
１１０　　　　８９０±　　　　８９．９　　　　１０
．１　　　　　　　／／６１３３±　　２６．７　　２
０．１　　　日間６　　　５８０±　　　　８０．６　
　　　１３．９　　　　　　　／／実施例　５酵素標識抗体としてモルモット抗ｈｃＧ−ＩｇＧ−Ｇｏ
Ｄを、また、固相はモルモット抗ｈｃＧ−ＩｇＧ被ｉＰ
Ｂを、反応液には０．１％アジ化ナトリウム、０．２％
ＢＳＡおよびＤ液を使用した。

この実施例においては、正常モルモット血清＝Ｄ液＝１
：５の比率とし、比較例としてウサギ（比較例６）、ヤ
ギ（同、７）、ウマ（同、８）およびＤ液のみ（同、９
）について前の場合と同様に固相への非特異的吸着につ
いて検討し第１１図の結果を得た。

この実施例の場合では、０．０２２％という値であるの
に対して、比較例６〜９では０．０７〜０．３％という
極めて大きな結果となった。

モルモット抗ｈｃＧ−Ｉ　ｇＧ−ＧＯＤのモルモット抗
ｈｃＧ−ＩｇＧ被ｉＰＢに対する非特異的吸着は、反応
液にモルモット血清を添加することにより抑制すること
ができることが明らかとなった。

実施例６前の実施例と同様に実施例５の試薬と比較例９のＤ液に
ついて同じようにＥＩＡを実施しその測定範囲と感度を
比較したが、その挙動を第１２図に示した。

この図から明らかなように実施例５の試薬のｔｉｔ！１
定範囲は、１〜１０００　ｍ　Ｕ　／　ｍ　１　、検出
感度は１ｍ１Ｉ／ｍ＋であ一１亡−ノ１くト１−ｔ６イ
５＋ＩＱａ）４Ｂイト１つ乙寸測定範囲５０〜１０００
　ｍ　Ｕ　／　ｍ　１　、検出感度は５０　ｍ　Ｕ　／
　ｍ　ｌであった。

次に、この測定試薬の日内・日間変動についての確認を
行い次の結果を得た。

ｈ　ｃ　Ｇ　（ｍｒＵ／ｍｕ）測定　平均値子　標準　変動　　　変動＠、　　　　　
　　　（ｊｌｉ差　係数（％）　卦実施例　１０３３±
　　　２．９　　８．９　　　日内６　　　　　１０　
　　　１０８±　　　　　５　、４　　　　　５　、０
　　　　　　　／／１０　　　　５２０±　　　　１８
　、７　　　　　３　、６　　　　　　　／／６　８０
±　　　６．２　　７．７　　　日間６　　　４６０±
　　　　１８．４　　　　４．０　　　　　　　／／比
較例　１０４３±　　　６．８　　１５．８　　　日内
９　　　　　１０　　　　２１Ｓ±　　　　３０．１　
　　　１４．０　　　　　　　／／１０　　　　４８８
±　　　　５５．１　　　　１１．３　　　　　　１）
６　　７６±　　１４．６　　１９．２　　　日間６　
　　５１０±　　　　６８．３　　　　１３．４　　　
　　　　／／実施例　７酵素標識抗体としてウサギ抗ＡＦＰ−１ｇＧ−ＧＯＤを
、固相としてヤギ抗ＡＦＰ−■ｇＧ被覆ＰＢを、また、
反応液として０．１％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳ
Ａ、Ｄ液、を使用して固相への非特異的吸着について調
査を行った。

前例と同様に正常モルモット血清：Ｄ液＝１＝５の実施
例の条件に対して、正常ウサギ血清＝Ｄ液−１：５（比較例１０）正常ヤギ
血清＝　Ｄ液−１：５（比較例１１）正常ウマ血清；　
Ｄ液＝１：５（比較例１２）Ｄ液のみ　　　　　　　　
　　（比較例１３）として検討を行ったところ、第１３
図の挙動を得た。

この図の挙動から明らかなように、実施例では非特異的
吸着率は、０．００６％でありたのに対し、比較例の場
合では０．０１０〜０．２５％と著しく高いものであっ
た。

また、抗体としては、ＡＦＰに限ることなく、ウサギ由
来のＩｇＧならば同様の結果を期待することできる。

実施例　８実施例７およびその比較例で使用した測定試薬を用いて
、ＥＩＡを実施しその測定範囲および感度の比較を行い
、第１４図に示したような挙動を得た。

この結果から実施例７の場合の試薬の測定範囲は、１〜
１０００　ｎ　ｇ　／　ｍ　１　、５度はｌｎｇ／ｍｌ
であるのに対して比較例１３の場合には測定範囲５０〜
１０００　ｎ　ｇ　／　ｍ　１、その検出感度は５０　
ｎ　ｇ　／　ｍ　１であった。

次に前述の実施例の場合におけると同様に、実施例７、
比較例１４の測定試薬の口内・日間変動についての確認
試験を行ったところ、次の表の結果を得た。

Ａ　Ｆ　Ｐ　（ｎｇ／ｆｆ１Ｊ２）測定　平均値上標準変動　　変動Ｌ　　　　　　偏差　係数（豹−卦実施例　１０．　　１５±　　　１．２　　７．８　　
　日内７　　　　　１０　　　　１２３±　　　　　３
　、８　　　　３　、１　　　　　　　ｔｔｌｏ　　　
　　５０６±　　　　１４．７　　　　２．９　　　　
　　　））６　　９８±　　　６．５　　６．６　　　
日間６　　　６２７±　　　　１８．８　　　　３．０
　　　　　　　／／比較例　１０６０±　　　９．４　
　１５．６　　　日内１４　　　　　１０　　　　１５
１±　　　　１８．９　　　　１１．２　　　　　　　
））１０　　　　６１５±　　　　６０　、３　　　　
　９　、８　　　　　　　／／６　　１４１±　　１８
．８　　１３．３　　　日間６　　　７０８±　　　　
６１．６　　　　８．７　　　　　　　ｔｔ実施例　８酵素標識抗体としてウサギ抗ｈｃＧ−ＩｇＧ−ＧＯＤを
、固相はウサギ抗ｈｃＧ−ＩｇＧ被覆ＰＢ、反応液は０
．１％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳＡおよびＤ液を
使用し、酵素標識抗体を含むＤ液中に添加する血清につ
いて検討した。

比較として次の組合せについても合せて検討した。

比較例１５・・・正常モルモット血清：Ｄ液＝１：５比
較例１６・・・正常ヤギ血清：Ｄ？＆＝１：５比較例１
７・・・正常ウマ血？ｊ！ｔ　：　Ｄ液＝１：５比較例
１８・・・Ｄ液のみ先ず、ウサギ抗ｈｃＧ−１ｇＧ−ＧＯＤの固相への非特
異的吸着について検討したところ、はぼ７Ｑ１１図の挙
動に近似する結果を得た。

この場合、実施例では、非特異的吸着の程度が０．０４
５％であるのに対して、比較例の場合では０．１５〜０
．５５％と高い値を示していた。

さらにまた、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど
を用いて行フても同様の結果を得ることができた。

実力色例　１０前述の実施例９と比較例１８で使用した試薬を用いＥＩ
Ａを実施して、その測定範囲と感度についての確認を行
った。

’ｆ、ｚ図の挙動に近似する結果が得られ、実施例１０
の場合では、測定範囲は５〜１０００ｍ１Ｕ　／　ｍ　
１　、感度が５０〜１０００　ｍ　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　１
であるのに対して、比較例１８では、それぞれ、５ｍ１
Ｕ／ｍ、１，５０ｍ１Ｕ／ｍｌであった。

この測定試薬について、日内・日間変動の確認試験を行
ったところ、つぎの結果となった。

ｈ　ｃ　Ｇ　（ｍＩｔｌ／ｍｕ）測定　平均値上　標準　変動　　　変動し　　　　　　
偏差　係数（＊）　　卦実施例　　１０５２±　　　３
．４　　６．５　　　日内１０　　　　１０　　　２５
０±　　　　１８　、３　　　　７　、３　　　　　　
／／１０　　　４２０±　　　　１２　、６　　　　３
　、　Ｏｎ６　　７５±　　　３．０　　４．０　　　
日間６　　３２０±　　　　１８　、６　　　　５　、
８　　　　　　／／比較例　１０４９±　　１０．０　
　２０．５　　　日内１８　　　　１０　　　２３２±
　　　　４２．５　　　１８．３　　　　　　）１１０
　　　４８０±　　　　７３．９　　　１５．４　　　
　　　ｎ６　　８２±　　２０．７　　２５．２　　　
日間６　　３４５±　　　　６７．６　　　１９．６　
　　　　　／／また、この発明では、リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６゜３）のみ記したが、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５〜
ａ、Ｏ）、　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５〜６．０）でも
、同様の結果を得ることができた。

Ｈ発明の効果この発明は、紐ｊ！７液に血清を添加したものを使用し
て、免疫グロブリンＧを被覆している固相上で標識抗体
と固相抗体を反応させていることから、標識抗体の非特
異的吸着を抑制することが可能となったのみならず、測
定範囲、測定感度および日内・日間変動も改善された測
定試薬とし得る効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清からの免疫グロブリンＧ精製法を示した工
程図、第２図は標識抗体の調製法を示した工程図、第３
図は固相の調製法を示した工程図、第４図は非特異的吸
着の程度を示したグラフ、第５図は非特異的吸看測定の
手順を示した工程図、第６図は測定範囲と感度を示した
グラフ、第９．１１および１３図は非特異的吸着の程度
を示したグラフ、第１０．１２および１４図は測定範囲
および測定感度を測定したグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）固相を使用して免疫学的測定を行うに当って免疫
グロブリンＧを被覆している固相上で標識抗体と固相抗
体を反応させる際に、ここで使用する緩衝液に血清を添
加したものを用いることを特徴とする標識抗体の非特異
的吸着抑制薬。
（２）ウサギ由来、ヤギ由来、モルモット由来の抗体ま
たはこれらの混合物からなる抗体を標識抗体とする特許
請求の範囲第１項に記載の標識抗体の非特異的吸着抑制
薬。
（３）免疫グロブリンＧ−グルコースオキシダーゼ標識
抗体を使用する特許請求の範囲第１項に記載の標識抗体
の非特異的吸着抑制薬。