JPH11240899A

JPH11240899A - 乳およびその副生物からラクトフェリンを分離、精製する方法

Info

Publication number: JPH11240899A
Application number: JP10057398A
Authority: JP
Inventors: Haruo Negishi; 晴夫根岸; Hideo Otomo; 英生大友; Satoyuki Goto; 聡幸後藤; Tomoko Kanetsugu; 智子兼次
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1998-02-24
Filing date: 1998-02-24
Publication date: 1999-09-07
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: JP2963081B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】 αｓ−カゼイン固定化カラムを用いて、
乳中に含まれるラクトフェリンを、安全、簡便、高純度
に分離する方法に関する。【効果】乳中に含まれるラクトフェリンを安全、簡
便、しかも高純度に分離することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、以下に述べるよう
に、種々の生理作用を示すラクトフェリンを、簡便、高
純度、しかも安全に分離・精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリンは乳、涙、唾液等の外分
泌液中に含まれる、分子量が約８万の鉄結合性糖蛋白質
である。その含量は初乳中に多く、ヒト初乳中で約５〜
１０mg/ml含まれるが、ウシ常乳中では約０．１〜０．
５mg/mlと少ない。特に初乳中に多く含まれることか
ら、乳児の健全な発育を維持する上で、重要な働きを担
っていると考えられている。これを裏付けるように、近
年、in vitro、及びin vivoにおける多くの研究で、ラ
クトフェリンが抗菌作用、過酸化脂質生成抑制作用、鉄
吸収の調節作用、免疫機能調節作用、細胞増殖作用、及
び細菌感染防御作用などの有用な生理作用を有すること
が報告されている。

【０００３】このようにラクトフェリンには多岐にわた
る生理活性が期待されることから、栄養生理学的、並び
に薬理学的に重要な物質である。ラクトフェリンを分離
するための原料としては、牛乳およびチーズ製造時に副
生されるチーズホエイが使用されている。ラクトフェリ
ンは栄養学的に優れ、しかも安全な牛乳原料から分離さ
れているため、安全な天然物由来の原料である。また、
最近では遺伝子組み換えラクトフェリンの利用も研究さ
れている。

【０００４】従来、乳からラクトフェリンを分離、精製
する方法としては、陽イオン交換体を用いる方法（特開
昭６２−１９５２３、特開昭６３−１５２４００）が一
般的である。また、ラクトフェリンと親和性の強い物質
をカラムに固定化し、アフィニティクロマトグラフィー
により分離する方法がある。例えば、ヘパリン（特開昭
６３−２５５２９９）、ラクトフェリンに対するモノク
ロナール抗体（特開昭６１−１４５２００）、硫酸エス
テル化物（特開昭６３−２５５３００）、ＤＮＡ（T. W
illiam Hutchens ら、Biochimica et Biophysica Acta,
999(1989)323-329、及び色素(Mariano Grasselli ら、
Netherlands Milk & Dairy J., 50(1996)551-561）など
をクロマトグラフィー用の支持体に固定化し、ラクトフ
ェリンを含む乳原料と接触させ、吸着したラクトフェリ
ンを０．５〜１．０Ｍの塩化ナトリウムで溶出させる方
法などがある。

【０００５】アフィニティクロマトグラフィーによる方
法は、ラクトフェリンとの特異的吸着反応を用いるた
め、イオン交換クロマトグラフィー法に比べ、煩雑な工
程を経ずに簡便に高純度のものが得られるという利点が
ある。しかし、従来アフィニティカラムに使用されてい
るリガンドとして、ヘパリン、ラクトフェリンに対する
モノクローナル抗体、硫酸エステル化物、ＤＮＡなどが
あるが、何れも大量に入手するのが困難である。また、
固定化した上記物質が脱落してラクトフェリンに混入す
る恐れもあり、食品用途としては、安全性に問題があ
り、更にもう一段の改良が待たれるところであった。

【０００６】このような状況に鑑み、本発明者らは、先
に、牛乳中に含まれるκ−カゼインが、ラクトフェリン
に対して強い親和性を有するという事実を見出し、この
原理を応用して、κ−カゼインをリガンドとしてアフィ
ニティカラムを作製し、乳等に含まれるラクトフェリン
を特異的に分離する方法を開発するのに成功し、既に特
許出願を完了した（特願平９−２０２６５１）。

【０００７】更に本発明者らは、ラクトフェリンと牛乳
中に含まれる個々の蛋白質成分との相互作用の強さを詳
細に調べたところ、全く予期せざることに、ラクトフェ
リンはκ−カゼインよりもαｓ−カゼインとの間に、よ
り一層強い相互作用があるという興味深い事実を発見す
るに至った。この様な経緯から、先に出願したκ−カゼ
インに比べαｓ−カゼインをリガンドとして用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーの方がラクトフェリンを分
離する方法として好ましいとの着想を得た。以上から、
今回αｓ−カゼインを固定化したアフィニティクロマト
グラフィーを考案し、ラクトフェリンを分離精製する方
法を発明した。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、数多くの生理作用を有するラクトフェ
リンを安全にしかも簡便、効率的に分離及び／又は精製
する方法を開発する目的でなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、αｓ−カゼインを固定化したアフィニティクロマ
トグラフィーによる方法は、本発明者らが先に出願した
κ−カゼインを固定化したアフィニティクロマトグラフ
ィーによる方法よりも、ラクトフェリンとの吸着が強い
ことが明らかとなった。

【００１０】次にこの事実を詳細に説明する。乳中の主
要タンパク質として、αｓ−カゼイン（αｓ−ＣＮ）、
β−カゼイン（β−ＣＮ）、κ−カゼイン（κ−Ｃ
Ｎ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、及びα−ラ
クトアルブミン（α−Ｌａ）があるが、これらをそれぞ
れ固定化したカラムを作製し、ラクトフェリンとの相互
作用の強さを調べた。その結果、何れの固定化カラムに
対してもラクトフェリンは吸着した。それぞれの固定化
カラムに吸着したラクトフェリンを溶出するのに必要な
塩濃度は、αｓ−ＣＮ＞κ−ＣＮ、β−ＣＮ、β−Ｌｇ
＞α−Ｌａの順に高いことが分かった。このことから、
αｓ−カゼインは、他の乳蛋白質に比べて、ラクトフェ
リンとの相互作用が強いことが明らかになった。実験の
詳細は後記する実施例において述べる。

【００１１】αｓ−カゼインはκ−カゼイン同様に、牛
乳中に存在する成分であり、従来使用されてきたヘパリ
ン、モノクロナール抗体などに比べ、極めて安全で、価
格的にも安いという利点がある。αｓ−カゼインは単一
成分ではなく、構成するポリペプチド鎖に基づいて、α
ｓ₁−カゼインとαｓ₂−カゼインとに区別される。この
内、αｓ₁−カゼインは牛乳１０００ml中に１２〜１５
ｇ、カゼインの約４５％を占める主要成分である。一
方、αｓ₂−カゼインは牛乳１０００ml中に３〜４ｇ、
カゼインの約１０％を占める。本発明でいうαｓ−カゼ
インは、αｓ₁−カゼインとαｓ₂−カゼインのどちらか
一方、又は双方を含む成分を示すが、いずれも固定化に
用いるリガンドとして有効である。

【００１２】上記した有用新知見に基づき、更に研究の
結果完成されたものであって、本発明は、αｓ−カゼイ
ンを用いることにより、乳、液、唾液などの外分泌液、
微生物や細胞の培養物、遺伝子組み換え培養液、こ（れ
ら）の濃縮液、抽出液、等に含まれる生理学的に重要な
ラクトフェリンを高純度に、しかも簡便に分離／精製す
る方法に関するものである。以下、本発明について詳述
する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、αｓ−カゼインに対し
てラクトフェリンが特異的、選択的に親和性を有すると
いう本発明者らがはじめて発見した新しい原理に基づく
ものであって、ラクトフェリン含有原料をαｓ−カゼイ
ンで処理し、両者を特異的に結合せしめた後、ラクトフ
ェリンを分離するものである。

【００１４】したがって、本発明を実施するには、αｓ
−カゼインを担体に固定化しておき、これにラクトフェ
リン含有原料を接触せしめてラクトフェリンを特異的に
αｓ−カゼインに吸着させた後、次いで吸着させたラク
トフェリンを溶出せしめるいわば工業的な方法、あるい
は、αｓ−カゼインを担体に固定化することなく遊離状
態にしておき、これにラクトフェリン含有原料を接触せ
しめてラクトフェリンとの結合体ないし複合体を形成せ
しめ、これを取り出した後に両者を分離するいわば化学
的ないし生物学的方法のいずれもが利用可能である。

【００１５】αｓ−カゼインの固定化は、従来より行わ
れている酵素、各種蛋白質、微生物の担体への固定化技
術が適宜利用可能である。すなわち、無機又は有機、天
然又は合成、高分子又は低分子、生物系又は非生物系等
各種担体を用い、共有結合法、イオン結合法、物理的吸
着法等による従来既知の固定化技術が適宜利用可能であ
る。

【００１６】例えば担体としては、アガロース、セルロ
ース、デキストラン、セファロース、セファデックス等
の多糖類（誘導体）、ポリアクリルアミドゲル、ポリス
チレン等の合成高分子物質、（多孔質）ガラス、（多孔
質）セラミックス、活性炭、シリカゲル、アルミナ、粘
土鉱物等の無機ないしセラミックス系物質が適宜利用さ
れる。

【００１７】これらの担体は、そのまま、あるいは臭化
シアン、水素化シアノホウ素等で処理したり、架橋剤や
縮合試薬で処理したりして、常法にしたがってαｓ−カ
ゼインとの固定化を更に推進せしめてもよい。

【００１８】本発明を実施するには、先ず、このように
して固定化したαｓ−カゼインとラクトフェリン含有原
料とを接触せしめるのであるが、ラクトフェリン含有原
料としては、乳、脱脂乳のほか、ホエイ等の乳副生物等
ヒトを含む哺乳類の乳類；涙、唾液等の各種外分泌液；
細胞や微生物の培養液、遺伝子組み換え培養液；これら
の抽出液や濃縮液等、ラクトフェリンを含有する物質が
すべて包含される。

【００１９】αｓ−カゼインとラクトフェリンの接触時
において、ｐＨは２．５〜８．５、好ましくは３．０〜
８．０とするのがよく、イオン強度は０．３以下、好ま
しくは０．２以下とするのがよい。

【００２０】次いで吸着されたラクトフェリンを塩類溶
液で溶出するが、その際塩類溶液としては、イオン強度
が０．３〜１．６、好ましくは０．４〜１．５とするの
がよい。溶出した後、電気透析等の常法にしたがって脱
塩を行い、ラクトフェリンを得る。

【００２１】吸着ラクトフェリンの溶出に用いられる塩
類溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、塩化マグネシウム、及びこれらの１種又は
それ以上の混合物から選ばれた塩類の溶液が使用され
る。以下、本発明の実施例について述べる。

【００２２】

【実施例１】αｓ−カゼインの固定化：市販のアクチゲ
ル１０ml（アガロースゲル、ステロジェン・バイオセパ
レーション社製）を脱イオン交換水で十分洗浄し、濾過
した後、αｓ−カゼイン２０mgを１０mMリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）３mlに溶かし、この混合物に水素化シア
ノホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ₃）１３０mgを添加
し、αｓ−カゼイン固定化アクチゲルを得た。

【００２３】ウシラクトフェリンの分離、精製：上記の
手順で調製したαｓ−カゼイン固定化アガロースゲルを
直径１cm、長さ１０cmのカラムに充填し、１０mMリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。このカラムに、ウ
シラクトフェリン（シグマ社）（１mg/ml）１mlを通液
し、１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄
した。次いで０．５ＭＮａＣｌ２０mlを通液してカ
ラムに吸着しているウシラクトフェリンを溶出した。

【００２４】

【実施例２】実施例１で調製したαｓ−カゼイン固定化
アガロースカラム（直径１cm×長さ１０cm）に、ヒトラ
クトフェリン（シグマ社）（１mg/ml）１mlを通液し、
１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し
た。次いで０．５ＭＮａＣｌ２０mlを通液してカラム
に吸着しているウシラクトフェリンを溶出した。

【００２５】

【実施例３】実施例１と同様に、αｓ−カゼイン（αｓ
−ＣＮ）、β−カゼイン（β−ＣＮ）、κ−カゼイン
（κ−ＣＮ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、及
びα−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）を、それぞれ２０
mg固定化したカラムを作製した。これらのカラムにウシ
ラクトフェリン（シグマ社）（１mg/ml）１mlを通液し
た。１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄
した。次いでＮａＣｌ濃度を０Ｍから２．０Ｍまで直線
的に上昇させ、カラムに吸着しているラクトフェリンを
溶出した。最初にα−Ｌａ固定化カラムに吸着したラク
トフェリンが溶出し、次にκ−ＣＮ、β−ＣＮ、及びβ
−Ｌｇ固定化カラムに吸着したラクトフェリンが溶出し
た。最後に、αｓ−ＣＮ固定化カラムに吸着したラクト
フェリンが溶出した。この結果から、溶出に必要な塩濃
度は、αｓ−ＣＮ＞κ−ＣＮ、β−ＣＮ、β−Ｌｇ＞α
−Ｌａの順に高いことが分かった。すなわち、αｓ−カ
ゼインはκ−カゼインよりも、ラクトフェリンとの相互
作用が強いことが明らかになった。

【００２６】図面は、上述の各種乳蛋白質固定化アフィ
ニティクロマトグラフィーによるウシラクトフェリンの
分離クロマトグラムを示し、図１は、溶出したカラムナ
ンバーと吸光度（Ａ₂₈₀）、ＮａＣｌ濃度との関係を示
す。

【００２７】

【実施例４】αｓ−カゼイン固定化カラム（直径１cm×
長さ１０cm）は、実施例１と同様な手順で調製した。乳
タンパク質共存下において、αｓ−カゼイン固定化カラ
ムに対するラクトフェリンの特異的吸着性を確認するた
めに、ホエイ中の主要タンパク質である牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）（０．７mg）、免疫グロブリン（１．４m
g）、α−ラクトアルブミン（２．８mg）、及びβ−ラ
クトグロブリン（７．０mg）をホエイ中の濃度と同レベ
ルに溶解し、この中にウシラクトフェリン１．０mgを添
加した。

【００２８】このようにして調製したホエイのモデル溶
液の全量（２ml）を、上記のαｓ−カゼイン固定化カラ
ムに通液し、１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラ
ムを洗浄した。次いで１．０ＭＮａＣｌ２０mlを通
液してカラムに吸着しているウシラクトフェリンを溶出
した。溶出したウシラクトフェリン量をＥＬＩＳＡで分
析したところ、約０．９５mgのウシラクトフェリンが回
収されたことから、ウシラクトフェリンの回収率は９６
％であることを確認した。回収したウシラクトフェリン
の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）図より、９５％以上と測定された。

【００２９】図面は、αｓ−カゼイン固定化アフィニテ
ィクロマトグラフィーによるウシラクトフェリンの分離
を示し、図２は溶出したカラムナンバーと吸光度（Ａ
₂₈₀）との関係を示し、図３は上記ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）図を示す。

【００３０】

【実施例５】各種乳白質の固定化；αｓ−カゼイン（α
ｓ−ＣＮ）、β−カゼイン（β−ＣＮ）、κ−カゼイン
（κ−ＣＮ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、及
び、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）を固定化したカ
ラムは、実施例３と同様な手順で調製した。

【００３１】未加熱酸ホエイの調製：生乳１０００mlを
４０℃に加温後、１０，０００ｇ、２０分間遠心分離を
行った。クリーム部を除去後、脱脂乳を調製した。脱脂
乳をｐＨ４．６に調製してカゼインを沈殿させ、１０，
０００ｇ、２０分間遠心分離後、沈殿した酸カゼインを
除去した。得られた酸ホエイのｐＨを１ＮＮａＯＨで
ｐＨ７．０に調整した。

【００３２】上述で調製した酸ホエイを１０mlずつ採取
し、αｓ−ＣＮ、κ−ＣＮ、β−ＣＮ、β−Ｌｇ、及び
α−Ｌａの固定化カラムに通液した。実施例３と同様な
手順で、１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを
洗浄後、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから２．０Ｍまで直線的に
上昇させ、カラムに吸着しているラクトフェリンを溶出
した。各固定化カラムから溶出したラクトフェリンの含
量をＥＬＩＳＡ法で定量した。表１（上記各蛋白質を固
定化したアフィニティクロマトグラフィーを用いて、酸
ホエイから回収したウシラクトフェリンの吸着量及び回
収率を示す）に示したように、カラムから溶出して回収
したラクトフェリン含量は、αｓ−カゼインが最も多
く、次に、κ−カゼインとβ−ラクトグロブリンは同程
度、その次はβ−カゼインであった。α−ラクトアルブ
ミン固定化カラムでは、ラクトフェリンの回収性は極め
て低かった。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【実施例６】αｓ−カゼイン固定化カラム（直径１cm×
長さ１０cm）は、実施例１と同様な手順で調製した。ヒ
ト初乳から脂肪を分離した脱脂乳において、塩酸でｐＨ
４．６に調整することにより、カゼインを等電点沈殿さ
せて、ホエイ画分を得た。上清液のｐＨを水酸化ナトリ
ウムでｐＨ７．０に調整した。このようにして調製した
ヒト初乳ホエイ５mlをαｓ−カゼイン固定化カラムに通
液した。１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを
洗浄後、１．０ＭＮａＣｌ２０mlを通液してカラム
に吸着している成分を溶出した。この成分をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した
ところ、ヒトラクトフェリンであることが確認できた。
回収されたヒトラクトフェリンの純度は、９５％以上で
あった。

【００３５】

【実施例７】αｓ−カゼイン固定化カラム（直径１cm×
長さ１０cm）は、実施例１と同様な手順で調製した。ゴ
ーダチーズ製造過程で得られるチーズホエイ１０mlをα
ｓ−カゼイン固定化カラムに通液した。１０mMリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、１．０ＭＮａ
Ｃｌ３０mlを通液してカラムに吸着している成分を溶
出した。この成分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）で分析したところ、ウシラクトフェ
リンであることが確認できた。回収されたウシラクトフ
ェリンの純度は９５％以上であった。

【００３６】

【発明の効果】乳等ラクトフェリン含有原料中に含まれ
るラクトフェリンを安全、簡便、しかも高純度に分離及
び／又は抽出することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】カラムナンバーと溶出したウシラクトフェリン
の吸光度（Ａ₂₈₀）、及び溶出液中のＮａＣｌ濃度との
関係を示す。

【図２】カラムナンバーと溶出したウシラクトフェリン
の吸光度（Ａ₂₈₀）の関係を示す。

【図３】回収したウシラクトフェリンの純度を示す電気
泳動図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成１１年５月３１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者兼次智子東京都東村山市栄町１−21−３明治乳業株式会社栄養科学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 αｓ−カゼインに、ラクトフェリン含有
原料を接触させてラクトフェリンを吸着させ、次いで吸
着させたラクトフェリンを溶出すること、を特徴とする
ラクトフェリン含有原料からラクトフェリンを分離、精
製する方法。
【請求項２】 αｓ−カゼインを固定化した担体を用
い、アフィニティクロマトグラフィーによりラクトフェ
リン分離、精製すること、を特徴とする請求項１に記載
の方法。
【請求項３】ラクトフェリン含有原料が、乳、脱脂
乳、ホエイ、涙、唾液、細胞培養物、微生物培養物、濃
縮液、抽出液から選ばれる少なくともひとつであるこ
と、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】 αｓ−カゼインとラクトフェリンとの接
触時のｐＨが、３．０〜８．０であること、を特徴とす
る請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】 αｓ−カゼインとラクトフェリンとの接
触時のイオン強度が、０．３以下であること、を特徴と
する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】吸着ラクトフェリンをイオン強度が０．
４〜１．５の塩類溶液で溶出した後、電気透析等で脱塩
すること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項７】上記溶出に用いる塩類溶液が、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、及びこれらの混合物から選ばれた塩類の溶液であ
ること、を特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に
記載の方法。