JPH11246434A - ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成
分として含有する、ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２
の増加誘導剤。 【効果】 ｂａｘの増加及び／又はｂｃｌ−２の低下が
関与する種々の疾患に対する治療薬となる。具体的に
は、例えば障害を受けた血管内皮細胞のアポトーシスの
進行を抑制することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝実質細胞増殖因
子（ＨＧＦ）を有効成分として含有する、ｂａｘの低下
及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤、あるいはアポトー
シスの進行抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】アポトーシスとは、ネクローシスと形態
学的に異なり、細胞膜と核内構造の変化を伴う急速な細
胞縮小を特徴とする細胞死であり、遺伝子によりプログ
ラムされた能動的過程である。アポトーシスの誘導に対
する特定の細胞の異常な抵抗は、奇形、自己免疫疾患、
あるいは腫瘍等の疾患を引き起こす。一方、アポトーシ
スの促進は、毒素を産生する細菌の感染や虚血−再灌流
障害、あるいは梗塞といった急性疾患に関与していると
言われている（Nature Medicine,Vol.3,No.6,p614-620
(1997)）。アポトーシスの起こる過程は、initiation
（開始）、effector（効果）及びdegradation（分解）
の３つの段階よりなる（Science,Vol.267,p1456-1462
(1995)、FASEB J.,Vol.9,p1277-1287(1995)）。このう
ちinitiationの段階はアポトーシスを誘導する刺激の種
類によって異なっているが、effector及びdegradation
の段階は、多くのアポトーシスにおいて共通している。
このeffectorの段階においてアポトーシスを調節する最
も重要な因子の一つとして、ｂｃｌ−２及びそのファミ
リーが知られている。

【０００３】ｂｃｌ−２遺伝子は、元々ヒト濾胞性Ｂ細
胞リンパ腫付随の t(14;18)(q32;q21)転座点の解析から
単離されたがん遺伝子である（Science,Vol.226,p1097-
1099(1984)）。その後、構造の類似性とｂｃｌ−２タン
パク質に結合する因子の同定を通し、現在までに多数の
ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子が単離されている。このｂ
ｃｌ−２ファミリー遺伝子は構造と機能の観点から、1)
ｂｃｌ−２サブファミリー（bcl-2,bcl-x,bcl-w,mcl-1
などの遺伝子が属する）、2)ｂａｘサブファミリー（ba
x,bad,bakなどの遺伝子が属する）、3)ｂｉｋサブファ
ミリー（bik,bid,bimなどの遺伝子が属する）の３種類
に分類されており、このうちｂｃｌ−２サブファミリー
に属する因子はアポトーシス抑制機能を有しているのに
対し、ｂａｘ及びｂｉｋサブファミリーに属する因子は
アポトーシス促進機能を有していることが知られている
（蛋白質 核酸 酵素 Vol.42,No.10,p1644-1648(199
7)）。これらの因子のうち最も研究が進んでいるのはｂ
ｃｌ−２及びｂａｘである。ｂｃｌ−２はシステインプ
ロテアーゼ（caspase）の活性化を抑制するなどの種々
のアポトーシス抑制作用を有することが知られており
（Nature Medicine,Vol.3,No.6, p614-620(1997)）、ま
たｂａｘに関しては、ｂａｘの過剰発現によりアポトー
シスが促進されることなどが報告されている（Cell,Vo
l.74,p609-619 (1993)）。さらに、これらｂｃｌ−２と
ｂａｘとの関係については、１）ｂｃｌ−２はホモダイ
マーを形成することによりアポトーシス抑制活性を発揮
すること、一方、２）ｂａｘはｂｃｌ−２とヘテロダイ
マーを形成することによりｂｃｌ−２のホモダイマー形
成を阻害してｂｃｌ−２の機能を抑制すること、従って
３）ｂｃｌ−２とｂａｘのバランスによってアポトーシ
スが抑制されたり促進されたりするということが、近年
明らかにされている（Cell,Vol.74,p609-619 (1993)、N
ature Medicine,Vol.3, No.6, p614-620(1997)））。

【０００４】以上のように、ｂｃｌ−２及びｂａｘはア
ポトーシスの抑制及び促進に関わる重要な因子として知
られている。さらにｂｃｌ−２に関しては、主として前
記アポトーシス抑制作用のみならず、一部のネクローシ
ス（低酸素や呼吸阻害により誘導されるもの）を抑制す
ることも示されており（Oncogene,Vol.12,p2045-2050(1
996)）、また細胞周期関連機能として、細胞周期Ｇ０／
Ｇ１期の細胞を蓄積するとも言われている（J.Biol.Che
m., Vol.271, p12695-12698(1996)）。さらにｂｃｌ−
２は、形態形成（分枝形成）を促進するとも言われてい
る（J.Cell Biol.,Vol.129,p1363-1378(1995)）。

【０００５】ところで肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）
は、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見
され、その遺伝子クローニングがなされたタンパ質であ
る（Biochem Biophys Res Commun, Vol.122, p1450 (19
84)、Proc. Natl. Acad. Sci,USA, Vol.83, p6489,(198
6)、FEBS Letter, Vol.22, p311 (1987)、Nature, Vol.
342, p440 (1989)、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Vol.
87, p3200 (1990)）。その後の研究により、ＨＧＦは生
体内で腎、肺、胃、十二指腸、皮膚などの創傷治癒にも
関係していることが明らかとなり、またＨＧＦの受容体
に関しては、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体を
コードしていることが明らかにされている（Science, V
ol.251,p802-804(1991)、 Oncogene, Vol.6,p501-504 (1
991)）。現在ではＨＧＦは、当該受容体を介することに
より、多くの組織修復、器官再生に働く因子であると考
えられている（実験医学 Vol.10,p144-153 (1992)、動
脈硬化 Vol.23,p683-688(1996)）。このように、種々の
生体内機能が解明されつつあるＨＧＦであるが、該ＨＧ
Ｆと前記ｂｃｌ−２あるいはｂａｘとの関係について
は、何ら明らかにされていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＧＦを有
効成分として含有するｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
２の増加誘導剤を提供することを目的とする。本発明の
ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤は、ｂ
ａｘの増加及び／又はｂｃｌ−２の低下が関与する種々
の疾患に対して有効な治療薬となる。さらに本発明は、
ＨＧＦの有するｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増
加誘導作用に基づき、アポトーシスの進行抑制剤を提供
することをも目的とする。本発明のアポトーシス進行抑
制剤は、例えば高血糖あるいは虚血障害を受けた血管内
皮細胞のアポトーシスの進行を抑制することができる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＧＦと
前記ｂｃｌ−２及びｂａｘの関係を明らかにすべく、鋭
意検討を行った。まず、血管内皮細胞に対して高血糖障
害を与えたところ、対照群と比較してｂａｘの強発現及
びｂｃｌ−２の低下が認められた。この高血糖群に対し
てＨＧＦを添加したところ、ＨＧＦはｂａｘを減少し、
ｂｃｌ−２を増加させ、ｂａｘ／ｂｃｌ−２比を減少さ
せるという効果を有することを、本発明者らは初めて見
出した。さらに、前記高血糖群では対照群に比しアポト
ーシス細胞の増加が認められ、アポトーシスの一つの指
標であるDNA fragmentationにおいても有意な増加が認
められたのに対し、この高血糖群にＨＧＦを添加するこ
とにより、前記アポトーシスが有意に抑制されることを
も、本発明者らは明らかにした。

【０００８】従ってＨＧＦは、障害を受けた細胞の如き
ｂａｘの増加及び／又はｂｃｌ−２の低下の生じた細胞
に対してｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加をも
たらすことにより、アポトーシス抑制作用を発揮してい
ると考えられる。先に記載したようにｂｃｌ−２及びｂ
ａｘは、アポトーシスの３つの段階（initiation、effe
ctor及びdegradation）のうち、effectorの段階におい
てアポトーシスを調節している重要な因子である。従っ
てＨＧＦは、ｂｃｌ−２及びｂａｘへの作用を通して
“effector”というアポトーシスの中間段階を抑制して
いることから、アポトーシスの進行を抑制する進行抑制
剤として使用することができる。本発明は以上のような
知見に基づいてなされたものであり、従って本発明は、
ＨＧＦを有効成分として含有するｂａｘの低下及び／又
はｂｃｌ−２の増加誘導剤、あるいはＨＧＦを有効成分
とするアポトーシス進行抑制剤に関するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明で使用されるＨＧＦは公知
物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたも
のであれば、種々の方法で調製されたものを用いること
ができ、また既に市販されている製品（例えば、東洋紡
Code No.HGF-101等）を使用してもよい。ＨＧＦの製造
法としては、例えば、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や
株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該Ｈ
ＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法に
よりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み
込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形
質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得る
ことができる（例えば Nature, Vol.342, p440 (198
9)、特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. C
ommun. Vol.163, p967 (1989)など参照）。上記の宿主
細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用
いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は
動物細胞などを用いることができる。このようにして得
られたＨＧＦは、天然型ＨＧＦと実質的に同じ作用を有
する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、ま
た同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていても
よい。

【００１０】本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
２の増加誘導剤は、例えば障害を受けた細胞あるいは組
織のようにｂａｘの増加及び／又はｂｃｌ−２の低下が
生じている細胞あるいは組織に対して、ｂａｘの低下及
び／又はｂｃｌ−２の増加を誘導することができる。従
って本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加
誘導剤は、ｂａｘの増加及び／又はｂｃｌ−２の低下が
関与する種々の疾患に対して有効な治療薬となる。先に
記載したように、ｂｃｌ−２は主としてアポトーシス抑
制作用を、またｂａｘはアポトーシス促進作用を有する
因子である。さらにｂｃｌ−２に関しては、アポトーシ
ス抑制作用のみならず、一部のネクローシス（低酸素や
呼吸阻害により誘導されるもの）を抑制することも示さ
れており（Oncogene,Vol.12,p2045-2050 (1996)）、ま
た細胞周期関連機能として、細胞周期Ｇ０／Ｇ１期の細
胞を蓄積すると言われている（J.Biol.Chem., Vol.271,
p12695-12698(1996)）。また形態形成（分枝形成）を
促進するとも言われている（J.Cell Biol.,Vol.129,p13
63-1378(1995)）。またｂｃｌ−２は、例えばNature Me
dicine,Vol.3, No.6,p614-620(1997)の表２に挙げられ
ているような生物学的な作用を有することにより、多彩
なアポトーシス抑制作用や細胞の保護、恒常性の維持に
関与する作用を有することが知られている。従って本発
明のＨＧＦを有効成分とするｂａｘの低下及び／又はｂ
ｃｌ−２の増加誘導剤は、ｂｃｌ−２の産生促進やｂａ
ｘの産生抑制を通して、アポトーシスの進行抑制剤、一
部のネクローシスの進行抑制剤、あるいは形態形成の促
進剤などに使用することができる。

【００１１】本発明において前記アポトーシス進行抑制
剤とは、前記ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加
誘導作用に基づくものであり、ｂｃｌ−２及びｂａｘの
存在比を調節することによりアポトーシスのeffector段
階に作用して、アポトーシスの進行を抑制する働きを有
するものである。

【００１２】本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
２の増加誘導剤、あるいはアポトーシス進行抑制剤は、
具体的には高血糖による血管内皮障害、さらには虚血に
よる血管内皮障害に対して有効であるため、糖尿病性内
皮障害などの治療薬として使用することができる。また
本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導
剤、あるいはアポトーシス進行抑制剤は、例えば以下の
ような疾患に対しても使用することができる。すなわ
ち、過度のアポトーシスが関与している疾患としてPro
c.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.94, p12736-12737 (1997)
の表１には、腫瘍（黒色腫、肝癌など）、肝不全のよう
な肝疾患、骨髄異形成症候群、潰瘍性大腸炎、橋本病な
どの疾患が挙げられており、本発明のアポトーシス進行
抑制剤を、これらの疾患に対して使用することができ
る。また、腎移植の際に拒絶反応を示した症例の生検サ
ンプルにおいて、ｂｃｌ−２の発現が低下し、ｂａｘの
発現が増強していたという報告がなされており（別冊・
医学のあゆみ、腎とアポトーシス、p97-100(1997)）、本
発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導
剤、あるいはアポトーシス進行抑制剤を、この移植腎拒
否のような臓器移植拒否反応に対しても、使用すること
が可能である。さらにｂｃｌ−２に関しては、ｂｃｌ−
２欠損マウスにおいて嚢胞腎様の腎臓の形成異常や神経
細胞の減少などの症状が見られており（蛋白質核酸酵
素、Vol.42,p1644-1648(1997)、本発明のｂａｘの低下
及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤、あるいはアポトー
シス進行抑制剤を、多発性嚢胞腎、あるいはアルツハイ
マー病などを含む脳・神経変性疾患、虚血性脳障害など
に対して使用することも可能である。

【００１３】本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
２の増加誘導剤、あるいはアポトーシス進行抑制剤は、
種々の製剤形態（例えば液剤、固形剤、カプセル剤等）
をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又
はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経
口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することが
でき、例えばＨＧＦを適切な溶剤（例えば滅菌水、緩衝
液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過
して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより
調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量として
は、通常0.0002〜0.2（W/V%）程度、好ましくは0.001〜
0.1(W/V%)程度に調整される。

【００１４】製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添
加される。安定化剤としては、例えばアルブミン、グロ
ブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコー
ス、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール
などが挙げられる。さらに本発明の製剤は、製剤化に必
要な添加物、例えば賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、
当張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は
凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存す
るのが好ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水
などを加え、再溶解して使用される。

【００１５】本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
２の増加誘導剤、あるいはアポトーシス進行抑制剤は、
その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得
る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋
肉内などに投与することができる。その投与量は、患者
の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常
ＨＧＦとして0.05mg〜500mg、好ましくは1mg〜100mgで
あり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが
適当である。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定される
ものではない。

【００１７】実験材料及び方法細胞培養 ヒト血管内皮細胞をクラボー（株）より購入して用い
た。細胞は、１０％ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／
ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含
むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃にて水蒸気に満たされ
た９５％空気−５％二酸化炭素の条件下にて培養し、２
日に１度培地の交換を行った。高血糖条件での培養 上記血管内皮細胞を約１０⁶cells/wellの密度で９６穴
プレートまたは１２穴プレートに播種し、１０％ウシ血
清を加えたＥＧＭ培地にて増殖させた。６日間培養後、
5mM（対照）あるいは25mM（高血糖）の D-グルコースを
含むＥＧＭ培地に交換し、100ng/mlＨＧＦ存在下あるい
は非存在下で３日間培養した。これら４種類の細胞を用
いて、以下の核染色、DNA断片化の検出及びウェスタン
ブロットを実施した。

【００１８】核染色によるアポトーシス細胞の検出 １５ｃｍプレートを用いて、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
存在下あるいは非存在下で３日間培養した血管内皮細胞
に対し、ヘキスト染色によりクロマチンの凝縮などを観
察した。DNA断片化の検出 １２穴プレートを用いて、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ存
在下あるいは非存在下で３日間培養した血管内皮細胞よ
り、ＤＮＡのフラグメンテーションをＥＬＩＳＡ法にて
測定した（ベーリンガー社）。

【００１９】ウェスタンブロット法によるｂｃｌ−２お
よびｂａｘ蛋白の検出 ウェスタンブロット法による蛋白の検出は、既報の方法
（村松編、増補版ラボマニュアル遺伝子工学、丸善、１
９９０年）に従って行った。１５ｃｍプレートを用い
て、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ存在下あるいは非存在下
で３日間培養した血管内皮細胞より常法により蛋白質を
調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にメンブレン（アマシャム
社）に転写し、抗ｂｃｌ−２抗体または抗ｂａｘ抗体
（サンタクルーズ社）を用いたウェスタンブロット法に
よる染色を行った。その後ｂｃｌ−２蛋白及びｂａｘ蛋
白の発現量を、島津デンシトメトリーを用いた画像解析
により定量化した。材料 ＨＧＦは組換え型ヒトＨＧＦを用いた。

【００２０】統計解析 すべての値は、平均値±標準誤差にて現した。すべての
実験は最低３回繰り返した。多重比較における有意差検
定には、ダンカンの検定を用いた。危険率５％以下を統
計上有意と考えた。

【００２１】試験例１高血糖培養による血管内皮細胞のアポトーシスに対する
ＨＧＦの効果 高血糖条件下(25mM D-グルコース)で血管内細胞を培養
することにより、対照(5mM D-グルコース)に比し、核染
色によるアポトーシス細胞の増加を認めた。さらに、DN
A断片化においても有意な増加を認めた（図１）。高血
糖条件下(25mM D-グルコース)にＨＧＦ添加することに
より、高血糖によるDNA断片化の増加が有意に抑制され
た（図１）。以上より、高血糖培養による血管内皮細胞
のアポトーシスをＨＧＦが有意に抑制することが明らか
となった。

【００２２】試験例２血管内皮細胞におけるｂｃｌ−２およびｂａｘ蛋白の発
現に対するＨＧＦの効果 ウェスタンブロット法によるｂｃｌ−２およびｂａｘ蛋
白の発現量の検出結果を図２及び図３にそれぞれ示し
た。またｂａｘ／ｂｃｌ−２比を図４に示した。高血糖
培養により、対照と比較してアポトーシス抑制因子ｂｃ
ｌ−２蛋白の発現量の低下が認められたが、ＨＧＦの添
加により該ｂｃｌ−２蛋白の発現量が有意に増加した
（図２）。また高血糖培養により、対照に比較してｂａ
ｘ蛋白の発現量は顕著に増加したが、ＨＧＦの添加によ
り該ｂａｘ蛋白の発現は有意に抑制された（図３）。ま
た高血糖培養により、血管内皮細胞におけるｂａｘ／ｂ
ｃｌ−２比は有意に増加し、ＨＧＦはその増加を有意に
抑制した（図４）。以上より、高血糖における血管内皮
細胞のアポトーシスには、ｂａｘの増加及びｂｃｌ−２
の低下によるｂａｘ／ｂｃｌ−２比の増加が関与するこ
とが分かった。また、ＨＧＦはｂａｘの増加を抑制し、
かつｂｃｌ−２を増加させることにより、ｂａｘ／ｂｃ
ｌ−２比を低下させ、アポトーシス進行抑制作用を示す
ことが明らかになった。

【００２３】製剤例１ 生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール
１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無
菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結
乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。

【００２４】製剤例２ ０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１０
０ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００
ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイア
ルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結
乾燥製剤を得た。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、ＨＧＦを有効成分として
含有する、ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘
導剤、あるいはその一態様としてアポトーシス進行抑制
剤が提供される。本発明のｂａｘの低下及び／又はｂｃ
ｌ−２の増加誘導剤は、ｂａｘの増加及び／又はｂｃｌ
−２の低下が関与する種々の疾患に対して有効に作用す
る。具体的には、例えば障害を受けた血管内皮細胞のア
ポトーシスの進行を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、高血糖条件下での血管内皮細胞におけ
るＤＮＡ断片化に対するＨＧＦの作用を示すグラフであ
る。図中、縦軸は、吸光度を示す。

【図２】図２は、高血糖条件下での血管内皮細胞におけ
るｂｃｌ−２蛋白発現量に対するＨＧＦの作用を示した
グラフである。図中、縦軸は、orbitatory unitsを示
す。

【図３】図３は、高血糖条件下での血管内皮細胞におけ
るｂａｘ蛋白発現量に対するＨＧＦの作用を示したグラ
フである。図中、縦軸は、orbitatory unitsを示す。

【図４】図４は、高血糖条件下での血管内皮細胞におけ
るｂａｘ／ｂｃｌ−２比を示したグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効
   成分として含有する、ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−
   ２の増加誘導剤。
2. 【請求項２】 ＨＧＦを有効成分として含有する、ア
   ポトーシス進行抑制剤。
3. 【請求項３】 血管内皮細胞に対する、請求項１記載
   のｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤、あ
   るいは請求項２記載のアポトーシス進行抑制剤。