JPH11326329A - 前立腺特異的抗原の定量のための免疫学的方法 - Google Patents
前立腺特異的抗原の定量のための免疫学的方法Info
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- JPH11326329A JPH11326329A JP11095261A JP9526199A JPH11326329A JP H11326329 A JPH11326329 A JP H11326329A JP 11095261 A JP11095261 A JP 11095261A JP 9526199 A JP9526199 A JP 9526199A JP H11326329 A JPH11326329 A JP H11326329A
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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Abstract
(57)【要約】
【課題】前立腺特異的抗原の検出のための免疫学的方法
を改良し、単純化させて本分野の欠点の状態をある程度
大きく克服すること。 【解決手段】アミンを含有する求核試薬が添加されたサ
ンプルと、遊離前立腺特異的抗原には特異的に結合する
が、複合体前立腺特異的抗原には結合しない抗体の少な
くとも一つとのインキュベーションによる、前立腺特異
的抗原の定量のための免疫学的方法。
を改良し、単純化させて本分野の欠点の状態をある程度
大きく克服すること。 【解決手段】アミンを含有する求核試薬が添加されたサ
ンプルと、遊離前立腺特異的抗原には特異的に結合する
が、複合体前立腺特異的抗原には結合しない抗体の少な
くとも一つとのインキュベーションによる、前立腺特異
的抗原の定量のための免疫学的方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は前立腺特異的抗原
（ＰＳＡと表記する。）の免疫学的定量方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、サンプルと、遊離ＰＳＡに
は特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合しない抗体
の少なくとも一つとのインキュベーションによる、ＰＳ
Ａの定量のための、遊離ＰＳＡ、総ＰＳＡレベル及びＰ
ＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量のための免疫学的方
法に関する。本方法は、総ＰＳＡ濃度を定量する前に、
アミンを含有する求核試薬をサンプルに添加することを
特徴とする。さらに本発明は、複合体ＰＳＡを含有する
サンプルとアミンを含有する求核試薬とのインキュベー
ションによる、複合体ＰＳＡから遊離ＰＳＡを調製する
方法及び遊離ＰＳＡの生成のためのアミン含有求核試薬
の使用方法に関する。
（ＰＳＡと表記する。）の免疫学的定量方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、サンプルと、遊離ＰＳＡに
は特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合しない抗体
の少なくとも一つとのインキュベーションによる、ＰＳ
Ａの定量のための、遊離ＰＳＡ、総ＰＳＡレベル及びＰ
ＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量のための免疫学的方
法に関する。本方法は、総ＰＳＡ濃度を定量する前に、
アミンを含有する求核試薬をサンプルに添加することを
特徴とする。さらに本発明は、複合体ＰＳＡを含有する
サンプルとアミンを含有する求核試薬とのインキュベー
ションによる、複合体ＰＳＡから遊離ＰＳＡを調製する
方法及び遊離ＰＳＡの生成のためのアミン含有求核試薬
の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】前立腺特異的抗原は、分子量２９ｋＤａ
の糖タンパク質である。この抗原は前立腺上皮細胞内で
作られる、精液の一成分である。ＰＳＡは、中性セリン
プロテアーゼの酵素活性を有する。
の糖タンパク質である。この抗原は前立腺上皮細胞内で
作られる、精液の一成分である。ＰＳＡは、中性セリン
プロテアーゼの酵素活性を有する。
【０００３】ＰＳＡの主な機能は、精子の移動性を妨げ
る（射精に不可欠な成分である）フィブロネクチン並び
にセミノゲリン(Seminogeline)Ｉ及びIIを切断すること
である。これらのタンパク質の加水分解により、ＰＳＡ
は精液塊を溶解し、それにより精子の移動を可能にす
る。
る（射精に不可欠な成分である）フィブロネクチン並び
にセミノゲリン(Seminogeline)Ｉ及びIIを切断すること
である。これらのタンパク質の加水分解により、ＰＳＡ
は精液塊を溶解し、それにより精子の移動を可能にす
る。
【０００４】ＰＳＡの酵素活性は、血清中の種々のイン
ヒビターにより不活性化される。いわゆるセルピン（セ
リンプロテアーゼインヒビター）は、共有結合を形成す
ることによりＰＳＡを不活性化する、最も重要なインヒ
ビターに属する。免疫学的に検出され得るＰＳＡの多く
（６０〜９５％）は、血清中でα１−アンチキモトリプ
シン（ＡＣＴ）と結合しており、これはセルピンに属す
る。
ヒビターにより不活性化される。いわゆるセルピン（セ
リンプロテアーゼインヒビター）は、共有結合を形成す
ることによりＰＳＡを不活性化する、最も重要なインヒ
ビターに属する。免疫学的に検出され得るＰＳＡの多く
（６０〜９５％）は、血清中でα１−アンチキモトリプ
シン（ＡＣＴ）と結合しており、これはセルピンに属す
る。
【０００５】さらに、ＰＳＡは、α１−アンチトリプシ
ン及びプロテインＣインヒビターとも複合体を形成し得
るが、これらはＰＳＡ−ＡＣＴと比較すると、血清中で
は二次的な重要性を持つに過ぎない。
ン及びプロテインＣインヒビターとも複合体を形成し得
るが、これらはＰＳＡ−ＡＣＴと比較すると、血清中で
は二次的な重要性を持つに過ぎない。
【０００６】また、ＰＳＡは異なったタイプのプロテア
ーゼインヒビター、即ち、α２−マクログロブリン（α
２−Ｍ）とも複合体を形成する。血清中の複合体濃度に
関する情報は文献によって異なり、これは複合体の状態
のＰＳＡが免疫学的に非常に扱い難いことによる。血清
には、複合体を形成することができない酵素不活性遊離
ＰＳＡも含まれている。α２−ＭとのＰＳＡ複合体は、
現在までに実施されたいかなる免疫学的な定量において
も記録されていないため、次の「総ＰＳＡ」とは、遊離
ＰＳＡとセルピン複合体ＰＳＡの合計を意味する(J. Cl
in. Ligand Assay, 1995, vol.18, p.186-196)。
ーゼインヒビター、即ち、α２−マクログロブリン（α
２−Ｍ）とも複合体を形成する。血清中の複合体濃度に
関する情報は文献によって異なり、これは複合体の状態
のＰＳＡが免疫学的に非常に扱い難いことによる。血清
には、複合体を形成することができない酵素不活性遊離
ＰＳＡも含まれている。α２−ＭとのＰＳＡ複合体は、
現在までに実施されたいかなる免疫学的な定量において
も記録されていないため、次の「総ＰＳＡ」とは、遊離
ＰＳＡとセルピン複合体ＰＳＡの合計を意味する(J. Cl
in. Ligand Assay, 1995, vol.18, p.186-196)。
【０００７】α１−アンチキモトリプシンは、分子量約
６０ｋＤａの糖タンパク質である。急性相における主な
インヒビターの働きの一つとして、ＡＣＴは炎症の制御
に重要な役割を演じている。ＡＣＴはまた、キモトリプ
シン、カテプシンＧ及び腺性カリクレインｈＫ２とも複
合体を形成する。ヒト血清中でのＡＣＴのモル濃度は、
ＰＳＡのそれよりも１００００倍高い。
６０ｋＤａの糖タンパク質である。急性相における主な
インヒビターの働きの一つとして、ＡＣＴは炎症の制御
に重要な役割を演じている。ＡＣＴはまた、キモトリプ
シン、カテプシンＧ及び腺性カリクレインｈＫ２とも複
合体を形成する。ヒト血清中でのＡＣＴのモル濃度は、
ＰＳＡのそれよりも１００００倍高い。
【０００８】異なるＰＳＡ型の存在により、前立腺ガン
及び良性の疾患の診断のためのヒト血清中のＰＳＡ濃度
の定量条件は、極めて複雑である。この事実は、非常に
多くの治療上の難しさやこのマーカー値のある一定の程
度への低減を引き起こす。このように、ＰＳＡの定量の
ために実際に使用できるアッセイのいくつかは、使用す
る抗体の特異性によって、異なる遊離及び複合体ＰＳＡ
の値を与えることが知られている(Clin. Chem. 1993, v
ol.39/12, p.2483-2491; Urology 1995, vol.45, p.729
-744; Clin. Chem. 1998, vol.44, p.191-192; Clin. C
hem. 1998, vol.44, p.192-193) 。また、正確で均一な
標準化は、(Clin. Chem. 1995 vol.41,p.1273-1282)に
記載の、異なる型の出現により困難である。
及び良性の疾患の診断のためのヒト血清中のＰＳＡ濃度
の定量条件は、極めて複雑である。この事実は、非常に
多くの治療上の難しさやこのマーカー値のある一定の程
度への低減を引き起こす。このように、ＰＳＡの定量の
ために実際に使用できるアッセイのいくつかは、使用す
る抗体の特異性によって、異なる遊離及び複合体ＰＳＡ
の値を与えることが知られている(Clin. Chem. 1993, v
ol.39/12, p.2483-2491; Urology 1995, vol.45, p.729
-744; Clin. Chem. 1998, vol.44, p.191-192; Clin. C
hem. 1998, vol.44, p.192-193) 。また、正確で均一な
標準化は、(Clin. Chem. 1995 vol.41,p.1273-1282)に
記載の、異なる型の出現により困難である。
【０００９】このような総ＰＳＡ濃度は、良性の前立腺
過形成（ＢＰＨ）の出現によっても生じ得るため、前立
腺ガン（ＰＣａ）の指標としてのＰＳＡ血清値の、約１
５ｎｇ／ｍＬまでの濃度の信頼性は、特に疑問の余地が
ある。血清中のＰＳＡ値の単なる定量によって前立腺ガ
ンをスクリーニングすることは、この濃度範囲での特異
性が欠如していることから不可能であり、ＰＣａが存在
するかどうかを発見するためには、さらに部分的に複雑
かつ苦痛を伴う（生検）といった検査を行う必要があ
る。
過形成（ＢＰＨ）の出現によっても生じ得るため、前立
腺ガン（ＰＣａ）の指標としてのＰＳＡ血清値の、約１
５ｎｇ／ｍＬまでの濃度の信頼性は、特に疑問の余地が
ある。血清中のＰＳＡ値の単なる定量によって前立腺ガ
ンをスクリーニングすることは、この濃度範囲での特異
性が欠如していることから不可能であり、ＰＣａが存在
するかどうかを発見するためには、さらに部分的に複雑
かつ苦痛を伴う（生検）といった検査を行う必要があ
る。
【００１０】複合体化ＰＳＡ又は総ＰＳＡに対する遊
離、即ち、非複合性ＰＳＡの比の定量について、ここ数
年来、ある程度までその特異性が改善されてきてた（例
えば、国際公開第92/01936号パンフレットを参照）。し
かしながら、それは、不必要かつさらなる時間と費用の
集中する、より多くの試験を避けるのに必要である特異
値より明らかにまだ下回っている。特異性の改善は、Ｂ
ＰＨの患者血清における、複合体ＰＳＡに対する遊離Ｐ
ＳＡの割合（ＰＳＡフリー／ＰＳＡトータル）の平均
が、ＰＣａ患者血清よりも高いという事実に基づく。
離、即ち、非複合性ＰＳＡの比の定量について、ここ数
年来、ある程度までその特異性が改善されてきてた（例
えば、国際公開第92/01936号パンフレットを参照）。し
かしながら、それは、不必要かつさらなる時間と費用の
集中する、より多くの試験を避けるのに必要である特異
値より明らかにまだ下回っている。特異性の改善は、Ｂ
ＰＨの患者血清における、複合体ＰＳＡに対する遊離Ｐ
ＳＡの割合（ＰＳＡフリー／ＰＳＡトータル）の平均
が、ＰＣａ患者血清よりも高いという事実に基づく。
【００１１】現状においては、ＰＳＡフリー／ＰＳＡト
ータルの比を確立するためには、二つの異なる測定方法
を実施する必要がある。まず第一に、遊離ＰＳＡの濃度
を定量しなければならないことである。遊離ＰＳＡのた
めのこの試験をサンドウィッチ形式で行った場合、二つ
の抗体のうちの少なくとも一つは遊離ＰＳＡに対して特
異的でなければならず、そして複合体ＰＳＡに結合して
はならない。同時に、総ＰＳＡ濃度を第二の別の測定法
で確立しなければならない。この場合においては、サン
ドウィッチ試験に使用される抗体は遊離及び複合体ＰＳ
Ａに結合する。あるいは、ＰＳＡ−ＡＣＴ濃度を測定す
ることにより、総濃度を定量することもできる。国際公
開第92/01936号パンフレットにおいては、ＡＣＴへ特異
的に結合する抗体だけではなく、遊離及び複合体ＰＳＡ
に結合するような抗体を、ＰＳＡ−ＡＣＴ濃度決定のた
めに用いる。
ータルの比を確立するためには、二つの異なる測定方法
を実施する必要がある。まず第一に、遊離ＰＳＡの濃度
を定量しなければならないことである。遊離ＰＳＡのた
めのこの試験をサンドウィッチ形式で行った場合、二つ
の抗体のうちの少なくとも一つは遊離ＰＳＡに対して特
異的でなければならず、そして複合体ＰＳＡに結合して
はならない。同時に、総ＰＳＡ濃度を第二の別の測定法
で確立しなければならない。この場合においては、サン
ドウィッチ試験に使用される抗体は遊離及び複合体ＰＳ
Ａに結合する。あるいは、ＰＳＡ−ＡＣＴ濃度を測定す
ることにより、総濃度を定量することもできる。国際公
開第92/01936号パンフレットにおいては、ＡＣＴへ特異
的に結合する抗体だけではなく、遊離及び複合体ＰＳＡ
に結合するような抗体を、ＰＳＡ−ＡＣＴ濃度決定のた
めに用いる。
【００１２】総ＰＳＡ量は、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測
定値と遊離ＰＳＡの測定値とを加えることによって求め
ることができる。現状における大きな欠点は、異なる特
異性を持つ少なくとも二つの抗体のそれぞれを含む、二
つの異なるテストを行うことである。診断上の適切なパ
ラメータを定量するためのいくつかのテスト手順におい
て、異なる試薬、例えば抗体を使用することは、異なる
メーカーのテストを比べた場合、特にＰＳＡのような複
雑な診断問題を考慮する場合、問題を生じさせる蓋然性
が高い。また、試薬の定量の失敗の蓋然性は、テストシ
ステム及び必要な試薬の数に伴って高くなる。さらに、
多くの異なる一般的にはモノクローナル抗体の供給は非
常な程度の費用と時間の集中的な投下を要する。
定値と遊離ＰＳＡの測定値とを加えることによって求め
ることができる。現状における大きな欠点は、異なる特
異性を持つ少なくとも二つの抗体のそれぞれを含む、二
つの異なるテストを行うことである。診断上の適切なパ
ラメータを定量するためのいくつかのテスト手順におい
て、異なる試薬、例えば抗体を使用することは、異なる
メーカーのテストを比べた場合、特にＰＳＡのような複
雑な診断問題を考慮する場合、問題を生じさせる蓋然性
が高い。また、試薬の定量の失敗の蓋然性は、テストシ
ステム及び必要な試薬の数に伴って高くなる。さらに、
多くの異なる一般的にはモノクローナル抗体の供給は非
常な程度の費用と時間の集中的な投下を要する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ＰＳＡの検出、具体的には遊離ＰＳＡ、総ＰＳ
Ａ濃度及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の検出のため
の免疫学的方法を改良し、単純化させて本分野の欠点の
状態をある程度大きく克服することにある。
目的は、ＰＳＡの検出、具体的には遊離ＰＳＡ、総ＰＳ
Ａ濃度及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の検出のため
の免疫学的方法を改良し、単純化させて本分野の欠点の
状態をある程度大きく克服することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１）アミンを含有する求核試薬が添加されたサンプル
と、遊離ＰＳＡには特異的に結合するが、複合体ＰＳＡ
には結合しない抗体の少なくとも一つとのインキュベー
ションによる、ＰＳＡの定量のための免疫学的方法、
（２）アミンを含有する求核試薬が総ＰＳＡ濃度の定量
前に添加されたサンプルと、遊離ＰＳＡには特異的に結
合するが、複合体ＰＳＡには結合しない抗体の少なくと
も一つとのインキュベーションによる、遊離ＰＳＡ、Ｐ
ＳＡの総濃度及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量
のための免疫学的方法、（３）アミノアルコールを用い
て遊離ＰＳＡを生成する方法、（４）複合体ＰＳＡを含
有するサンプルとアミノアルコールとのインキュベーシ
ョンによる、複合体ＰＳＡから遊離ＰＳＡを調製する方
法、（５）前記（４）記載の方法により得られ得る遊離
ＰＳＡを、ＰＳＡの定量のための標準として使用する方
法、（６）前記（４）記載の方法により得られ得る遊離
ＰＳＡを非免疫学的検査のために使用する方法、（７）
ＰＳＡの検出のための免疫学的方法においてアミン含有
求核試薬を使用する方法、（８）ＰＳＡの検出のための
免疫アッセイに使用するための、アミン含有求核試薬を
含有する試薬、に関するものである。
（１）アミンを含有する求核試薬が添加されたサンプル
と、遊離ＰＳＡには特異的に結合するが、複合体ＰＳＡ
には結合しない抗体の少なくとも一つとのインキュベー
ションによる、ＰＳＡの定量のための免疫学的方法、
（２）アミンを含有する求核試薬が総ＰＳＡ濃度の定量
前に添加されたサンプルと、遊離ＰＳＡには特異的に結
合するが、複合体ＰＳＡには結合しない抗体の少なくと
も一つとのインキュベーションによる、遊離ＰＳＡ、Ｐ
ＳＡの総濃度及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量
のための免疫学的方法、（３）アミノアルコールを用い
て遊離ＰＳＡを生成する方法、（４）複合体ＰＳＡを含
有するサンプルとアミノアルコールとのインキュベーシ
ョンによる、複合体ＰＳＡから遊離ＰＳＡを調製する方
法、（５）前記（４）記載の方法により得られ得る遊離
ＰＳＡを、ＰＳＡの定量のための標準として使用する方
法、（６）前記（４）記載の方法により得られ得る遊離
ＰＳＡを非免疫学的検査のために使用する方法、（７）
ＰＳＡの検出のための免疫学的方法においてアミン含有
求核試薬を使用する方法、（８）ＰＳＡの検出のための
免疫アッセイに使用するための、アミン含有求核試薬を
含有する試薬、に関するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、サンプルと、遊離ＰＳ
Ａには特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合しない
抗体の少なくとも一つとのインキュベーションによるＰ
ＳＡの定量のための改良された免疫学的方法により果た
され、総ＰＳＡ濃度の定量前にサンプルにアミン含有求
核試薬を添加する。この手順は、遊離ＰＳＡ、総ＰＳ
Ａ、及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量に好まし
く用いられる。
Ａには特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合しない
抗体の少なくとも一つとのインキュベーションによるＰ
ＳＡの定量のための改良された免疫学的方法により果た
され、総ＰＳＡ濃度の定量前にサンプルにアミン含有求
核試薬を添加する。この手順は、遊離ＰＳＡ、総ＰＳ
Ａ、及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃度の定量に好まし
く用いられる。
【００１６】ＰＳＡとセルピン、特にＡＣＴとの複合体
は安定しており、厳しい温度やｐＨ状況にも抵抗性があ
る(Urology 1995, vol.45, p.729-744) 。驚くべきこと
には、ＰＳＡ−セルピン複合体は、アミン含有求核試薬
の添加によって切断され得ることが示されている。
は安定しており、厳しい温度やｐＨ状況にも抵抗性があ
る(Urology 1995, vol.45, p.729-744) 。驚くべきこと
には、ＰＳＡ−セルピン複合体は、アミン含有求核試薬
の添加によって切断され得ることが示されている。
【００１７】ＨＰＬＣ分析から、得られたＰＳＡは安定
であることが示されている。驚くべきことに、このこと
は、血清の存在下での場合でも同様である、即ち、新し
い複合体は形成されない。このことは、切断前の総ＰＳ
Ａ値に対応する、切断条件下でのインキュベーションの
後の遊離ＰＳＡ値により認識され得る。プロテアーゼイ
ンヒビターであるα１−アンチキモトリプシン及びα２
−マクログロブリンが大過剰存在することによって血清
中の遊離ＰＳＡは確かに再複合化することから、この結
果は驚くべきことである。これは、少なくとも、追加的
なＰＳＡがヒト血清サンプルに添加される場合である(S
cand. J. Clin. Invest. 1995 vol.55,p.15-22; The Pr
ostate 1995, vol.27, p.166-175)。
であることが示されている。驚くべきことに、このこと
は、血清の存在下での場合でも同様である、即ち、新し
い複合体は形成されない。このことは、切断前の総ＰＳ
Ａ値に対応する、切断条件下でのインキュベーションの
後の遊離ＰＳＡ値により認識され得る。プロテアーゼイ
ンヒビターであるα１−アンチキモトリプシン及びα２
−マクログロブリンが大過剰存在することによって血清
中の遊離ＰＳＡは確かに再複合化することから、この結
果は驚くべきことである。これは、少なくとも、追加的
なＰＳＡがヒト血清サンプルに添加される場合である(S
cand. J. Clin. Invest. 1995 vol.55,p.15-22; The Pr
ostate 1995, vol.27, p.166-175)。
【００１８】ＰＳＡ−セルピン複合体（特にＰＳＡ−Ａ
ＣＴ複合体）の切断は事実上不可逆なので、非処理サン
プル中の遊離ＰＳＡ濃度を定量する可能性はある。これ
は、遊離ＰＳＡには特異的に結合するが複合体ＰＳＡに
は結合しない抗体の少なくとも一つを用いるサンドウィ
ッチ免疫アッセイにより好適に行われる。アミン含有求
核試薬を、セルピン−複合化ＰＳＡ（主にＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ）の切断と、前もって複合体化したＰＳＡの放出を導
く同一のサンプルに並行して添加する。続いて、遊離Ｐ
ＳＡの濃度を同じ測定手順にて、即ち、同じ抗体を用い
て定量する。得られた値は総ＰＳＡ濃度に対応する。当
該技術分野における類義語である「ＰＳＡの総濃度」、
「総ＰＳＡ」、「ＰＳＡの総レベル」及び「ＰＳＡトー
タル」はすべて遊離ＰＳＡとセルピンと複合体化したＰ
ＳＡとの量を意味する。
ＣＴ複合体）の切断は事実上不可逆なので、非処理サン
プル中の遊離ＰＳＡ濃度を定量する可能性はある。これ
は、遊離ＰＳＡには特異的に結合するが複合体ＰＳＡに
は結合しない抗体の少なくとも一つを用いるサンドウィ
ッチ免疫アッセイにより好適に行われる。アミン含有求
核試薬を、セルピン−複合化ＰＳＡ（主にＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ）の切断と、前もって複合体化したＰＳＡの放出を導
く同一のサンプルに並行して添加する。続いて、遊離Ｐ
ＳＡの濃度を同じ測定手順にて、即ち、同じ抗体を用い
て定量する。得られた値は総ＰＳＡ濃度に対応する。当
該技術分野における類義語である「ＰＳＡの総濃度」、
「総ＰＳＡ」、「ＰＳＡの総レベル」及び「ＰＳＡトー
タル」はすべて遊離ＰＳＡとセルピンと複合体化したＰ
ＳＡとの量を意味する。
【００１９】遊離ＰＳＡの濃度を総ＰＳＡの濃度で割る
ことによって、有益な比であるＰＳＡフリー／ＰＳＡト
ータルを得る。ＰＳＡトータルの値からＰＳＡフリーの
値を引くことによって、セルピンと複合体化したＰＳＡ
濃度も定量することができ、さらにＰＳＡフリー／ＰＳ
Ａセルピン複合体の比や、ＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔの比を定量することもできる。
ことによって、有益な比であるＰＳＡフリー／ＰＳＡト
ータルを得る。ＰＳＡトータルの値からＰＳＡフリーの
値を引くことによって、セルピンと複合体化したＰＳＡ
濃度も定量することができ、さらにＰＳＡフリー／ＰＳ
Ａセルピン複合体の比や、ＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔの比を定量することもできる。
【００２０】ある程度の蓋然性をもって、この比はＢＰ
Ｈ又はＰＣａの出現を示す。この比が高くなるほど、良
性疾患の出現の蓋然性が高くなる。
Ｈ又はＰＣａの出現を示す。この比が高くなるほど、良
性疾患の出現の蓋然性が高くなる。
【００２１】本発明による、遊離ＰＳＡと総ＰＳＡ濃度
の定量のための方法の好ましい手順には、次の工程が含
まれる。 ａ）サンプルの一部と、遊離ＰＳＡには特異的に結合す
るが複合体ＰＳＡには結合しない抗体の少なくとも一つ
とのインキュベーション工程、 ｂ）遊離ＰＳＡの濃度を定量する工程、 ｃ）サンプルの一部と、アミン含有求核試薬とのインキ
ュベーション工程、 ｄ）工程ｃ）由来のサンプルと、工程ａ）による抗体と
のインキュベーション工程、 ｅ）工程ｂ）によるサンプル中の総ＰＳＡ濃度を定量す
る工程、及び ｆ）総ＰＳＡ濃度に対する遊離ＰＳＡの比を、工程ｂ）
とｅ）由来の値を用いて定量する工程。
の定量のための方法の好ましい手順には、次の工程が含
まれる。 ａ）サンプルの一部と、遊離ＰＳＡには特異的に結合す
るが複合体ＰＳＡには結合しない抗体の少なくとも一つ
とのインキュベーション工程、 ｂ）遊離ＰＳＡの濃度を定量する工程、 ｃ）サンプルの一部と、アミン含有求核試薬とのインキ
ュベーション工程、 ｄ）工程ｃ）由来のサンプルと、工程ａ）による抗体と
のインキュベーション工程、 ｅ）工程ｂ）によるサンプル中の総ＰＳＡ濃度を定量す
る工程、及び ｆ）総ＰＳＡ濃度に対する遊離ＰＳＡの比を、工程ｂ）
とｅ）由来の値を用いて定量する工程。
【００２２】ＰＳＡフリー／ＰＳＡ−セルピン複合体の
比と、ＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣＴの比を確立しよう
とする場合、次のことを行う必要がある：工程ｆ）とし
て、総ＰＳＡ濃度から、工程ｂ）由来の遊離ＰＳＡ濃度
を差し引き、そして工程ｇ）として、工程ｂ）による遊
離ＰＳＡとＰＳＡ−セルピン複合体の値との比を、そし
て工程ｆ）由来のＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣＴ値をそ
れぞれ求める。
比と、ＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣＴの比を確立しよう
とする場合、次のことを行う必要がある：工程ｆ）とし
て、総ＰＳＡ濃度から、工程ｂ）由来の遊離ＰＳＡ濃度
を差し引き、そして工程ｇ）として、工程ｂ）による遊
離ＰＳＡとＰＳＡ−セルピン複合体の値との比を、そし
て工程ｆ）由来のＰＳＡフリー／ＰＳＡ−ＡＣＴ値をそ
れぞれ求める。
【００２３】方法を成功させるためには、本発明による
切断により得られる遊離ＰＳＡが免疫学的に反応性を有
することが不可欠である。このことは、抗体に認識され
るエピトープが、アミン含有求核試薬による切断の後で
あっても完全に保存されていることを意味する。本発明
による方法の重要な利点は、遊離及び総ＰＳＡの定量の
ためには同じ抗体、即ち同じ特異性を有する抗体が使用
できることである。したがって、本分野の方法の状態に
おいて求められている、異なる特異性を有する、時間と
費用を集中的に投下しなければならない抗体の開発を避
けることができる。使用される異なる抗体の数が多くな
るほど、サンプル成分との非特異的相互作用のリスクが
高まる。
切断により得られる遊離ＰＳＡが免疫学的に反応性を有
することが不可欠である。このことは、抗体に認識され
るエピトープが、アミン含有求核試薬による切断の後で
あっても完全に保存されていることを意味する。本発明
による方法の重要な利点は、遊離及び総ＰＳＡの定量の
ためには同じ抗体、即ち同じ特異性を有する抗体が使用
できることである。したがって、本分野の方法の状態に
おいて求められている、異なる特異性を有する、時間と
費用を集中的に投下しなければならない抗体の開発を避
けることができる。使用される異なる抗体の数が多くな
るほど、サンプル成分との非特異的相互作用のリスクが
高まる。
【００２４】本発明の方法においては、通常はわずか二
つの異なる抗体を使用するため、これらの相互作用を本
分野の状態と比較して顕著に低減することができる。
つの異なる抗体を使用するため、これらの相互作用を本
分野の状態と比較して顕著に低減することができる。
【００２５】不均一及び均一テスト手順は、本発明の方
法のためには好ましいテストフォーマットである。通常
の不均一サンドウィッチアッセイは特に有利であること
が分かっている。ここで、分析対象物（われわれのケー
スではＰＳＡ抗原、そして現状においてはＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ複合体）を、固相に結合した結合相手と標識された結
合相手（ここでは抗体）との間にサンドウィッチのよう
に固定する。標識は当業者に公知の手法により検出され
る。使用できる標識としては、酵素、ルミネセンス物
質、ジゴキシゲニン等のハプテン、蛍光及び放射性物質
である。プラスチック試験管、マイクロタイタープレー
ト、ラテックス粒子又は磁性ビーズは、例えば、固相と
して使用することができる。表面がストレプトアビジン
又はアビジンでコートされたものが好適に使用できる。
抗体は吸着によって直接的に、又は、好ましくは間接的
に固相に結合することができる。間接的な結合の場合、
ビオチンと結合した抗体はストレプトアビジン又はアビ
ジンでコートされた固相に結合する。
法のためには好ましいテストフォーマットである。通常
の不均一サンドウィッチアッセイは特に有利であること
が分かっている。ここで、分析対象物（われわれのケー
スではＰＳＡ抗原、そして現状においてはＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ複合体）を、固相に結合した結合相手と標識された結
合相手（ここでは抗体）との間にサンドウィッチのよう
に固定する。標識は当業者に公知の手法により検出され
る。使用できる標識としては、酵素、ルミネセンス物
質、ジゴキシゲニン等のハプテン、蛍光及び放射性物質
である。プラスチック試験管、マイクロタイタープレー
ト、ラテックス粒子又は磁性ビーズは、例えば、固相と
して使用することができる。表面がストレプトアビジン
又はアビジンでコートされたものが好適に使用できる。
抗体は吸着によって直接的に、又は、好ましくは間接的
に固相に結合することができる。間接的な結合の場合、
ビオチンと結合した抗体はストレプトアビジン又はアビ
ジンでコートされた固相に結合する。
【００２６】ＰＳＡは競合的手法によっても検出するこ
とができる。このケースにおいては、固相結合複合体
は、固相に直接的には結合していない結合相手が標識さ
れている、互いに特異的な二つの結合相手によって作ら
れる。分析対象物である抗原又は抗体は−テストに必要
なものに依存して−その濃度によって複合体から標識さ
れた結合相手を追い出す。液相から固相を分離した後、
これらの相の一つにおいて標識を検出する。競合テスト
手法によるＰＳＡテストに関しては、結合相手が結合し
た固相は、例えば、遊離ＰＳＡに特異的な抗体であろ
う。次いで、もう一方の結合相手は標識された遊離ＰＳ
Ａであろう。その後、標識された遊離ＰＳＡは遊離ＰＳ
Ａの濃度に依存して、サンプル中の遊離ＰＳＡにより追
い出される。
とができる。このケースにおいては、固相結合複合体
は、固相に直接的には結合していない結合相手が標識さ
れている、互いに特異的な二つの結合相手によって作ら
れる。分析対象物である抗原又は抗体は−テストに必要
なものに依存して−その濃度によって複合体から標識さ
れた結合相手を追い出す。液相から固相を分離した後、
これらの相の一つにおいて標識を検出する。競合テスト
手法によるＰＳＡテストに関しては、結合相手が結合し
た固相は、例えば、遊離ＰＳＡに特異的な抗体であろ
う。次いで、もう一方の結合相手は標識された遊離ＰＳ
Ａであろう。その後、標識された遊離ＰＳＡは遊離ＰＳ
Ａの濃度に依存して、サンプル中の遊離ＰＳＡにより追
い出される。
【００２７】分析対象物の検出だけでなく、既述のテス
トフォーマットとその手法は、実例の実施例としてのみ
記載している。この方法は当業者に公知であり、ここで
の更なる説明を要しない。
トフォーマットとその手法は、実例の実施例としてのみ
記載している。この方法は当業者に公知であり、ここで
の更なる説明を要しない。
【００２８】すべてのテストフォーマットにおいて、遊
離ＰＳＡには特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合
しない抗体の少なくとも一つを用いる必要がある。抗体
はモノクローナル又はポリクローナルの何れも可能であ
る。しかしながら、好ましい抗体としてはモノクローナ
ルである。抗体全体及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａ
ｂ）’2 等の抗体断片を用いることができる。重要なこ
とは、遊離ＰＳＡに特異的な抗体を意味する遊離ＰＳＡ
特異性は非複合化ＰＳＡとのみ反応するかもしれないこ
とである。複合体ＰＳＡとの交差反応性は全く起こって
はならないか、又はテストの結果を歪めない程の無視で
きる程度のみ起こっても良い。追加の抗体が必要である
場合、インタクトのモノクローナル若しくはポリクロー
ナル抗体又はそれらの断片として使用することもでき
る。これらの追加の抗体に要求されることは、遊離ＰＳ
Ａを認識しなければならないことである。しかしなが
ら、複合体ＰＳＡとの交差反応は必須ではない。
離ＰＳＡには特異的に結合するが複合体ＰＳＡには結合
しない抗体の少なくとも一つを用いる必要がある。抗体
はモノクローナル又はポリクローナルの何れも可能であ
る。しかしながら、好ましい抗体としてはモノクローナ
ルである。抗体全体及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａ
ｂ）’2 等の抗体断片を用いることができる。重要なこ
とは、遊離ＰＳＡに特異的な抗体を意味する遊離ＰＳＡ
特異性は非複合化ＰＳＡとのみ反応するかもしれないこ
とである。複合体ＰＳＡとの交差反応性は全く起こって
はならないか、又はテストの結果を歪めない程の無視で
きる程度のみ起こっても良い。追加の抗体が必要である
場合、インタクトのモノクローナル若しくはポリクロー
ナル抗体又はそれらの断片として使用することもでき
る。これらの追加の抗体に要求されることは、遊離ＰＳ
Ａを認識しなければならないことである。しかしなが
ら、複合体ＰＳＡとの交差反応は必須ではない。
【００２９】本発明によれば、当業者に公知の、生物性
の液体のすべてをサンプルとして使用することができ
る。全血、血清、血漿、精液、尿等の体液を、サンプル
として好ましく用いることができる。
の液体のすべてをサンプルとして使用することができ
る。全血、血清、血漿、精液、尿等の体液を、サンプル
として好ましく用いることができる。
【００３０】本発明によれば、アミン含有求核試薬はＰ
ＳＡ−セルピン複合体の切断に用いられる。好ましく
は、エタノールアミン及びジエタノールアミン等のアミ
ノアルコールに属するものである。エタノールアミンは
特に好ましく使用される。複合体として存在するＰＳＡ
を含むあらゆるサンプルに対して、アミン含有求核試薬
を添加することにより、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が分割さ
れる。０．０５〜２Ｍの試薬濃度が好ましいことが明ら
かにされた。より好ましくは、０．１〜１Ｍの濃度で使
用される。サンプルの好ましいｐＨは９〜１１の間であ
る。アミン含有求核試薬を含む、上記のように処理され
るサンプルのインキュベーション時間は重要ではない。
温度は１０〜４０℃の間であり、２０〜３０℃の間が好
ましく、２５℃が特に好ましいことが明らかになった。
一般的に、インキュベーションには数時間を要する。切
断により形成される遊離ＰＳＡは安定しているので、２
４時間以上のインキュベーション時間が本発明の方法に
可能である。それゆえに、本発明の別の主題は、上記の
条件下での、複合体ＰＳＡを含むサンプルと、アミン含
有求核試薬とのインキュベーションによる遊離ＰＳＡの
調製方法である。その後、得られた遊離ＰＳＡは、例え
ば、別の診断用又は科学用の構造物又は機能調査のため
に使用され得る。
ＳＡ−セルピン複合体の切断に用いられる。好ましく
は、エタノールアミン及びジエタノールアミン等のアミ
ノアルコールに属するものである。エタノールアミンは
特に好ましく使用される。複合体として存在するＰＳＡ
を含むあらゆるサンプルに対して、アミン含有求核試薬
を添加することにより、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が分割さ
れる。０．０５〜２Ｍの試薬濃度が好ましいことが明ら
かにされた。より好ましくは、０．１〜１Ｍの濃度で使
用される。サンプルの好ましいｐＨは９〜１１の間であ
る。アミン含有求核試薬を含む、上記のように処理され
るサンプルのインキュベーション時間は重要ではない。
温度は１０〜４０℃の間であり、２０〜３０℃の間が好
ましく、２５℃が特に好ましいことが明らかになった。
一般的に、インキュベーションには数時間を要する。切
断により形成される遊離ＰＳＡは安定しているので、２
４時間以上のインキュベーション時間が本発明の方法に
可能である。それゆえに、本発明の別の主題は、上記の
条件下での、複合体ＰＳＡを含むサンプルと、アミン含
有求核試薬とのインキュベーションによる遊離ＰＳＡの
調製方法である。その後、得られた遊離ＰＳＡは、例え
ば、別の診断用又は科学用の構造物又は機能調査のため
に使用され得る。
【００３１】したがって、本発明のさらなる主題は、本
発明に従う方法によって生成する遊離ＰＳＡを非免疫学
的検査、例えばマススペクトロメトリー等のために使用
する方法である。
発明に従う方法によって生成する遊離ＰＳＡを非免疫学
的検査、例えばマススペクトロメトリー等のために使用
する方法である。
【００３２】本発明のさらなる主題は、遊離ＰＳＡの生
成のためのアミン含有求核試薬、好ましくはアミノアル
コール、特に好ましくはエタノールアミンの使用であ
る。
成のためのアミン含有求核試薬、好ましくはアミノアル
コール、特に好ましくはエタノールアミンの使用であ
る。
【００３３】上記方法に従って生成したＰＳＡも、本発
明の標準として用いることができる。かかる標準は、Ｐ
ＳＡの定量検出のための免疫アッセイにおける校正曲線
の確立のために用いることができる。
明の標準として用いることができる。かかる標準は、Ｐ
ＳＡの定量検出のための免疫アッセイにおける校正曲線
の確立のために用いることができる。
【００３４】さらに本発明の主題は、ＰＳＡの定量検出
のための免疫学的方法においてアミン含有求核試薬を使
用する方法である。エタノールアミンが好ましく用いら
れる。
のための免疫学的方法においてアミン含有求核試薬を使
用する方法である。エタノールアミンが好ましく用いら
れる。
【００３５】さらに本発明の主題は、ＰＳＡの検出のた
めの免疫アッセイに使用するための、アミン含有求核試
薬の少なくとも一つ、好ましくはエタノールアミン、並
びに緩衝液、塩及び界面活性剤等の当業者に公知の成分
を含む試薬である。
めの免疫アッセイに使用するための、アミン含有求核試
薬の少なくとも一つ、好ましくはエタノールアミン、並
びに緩衝液、塩及び界面活性剤等の当業者に公知の成分
を含む試薬である。
【００３６】本発明は、さらに以下の実施例により説明
される。
される。
【００３７】
【実施例】実施例１：アミン含有求核試薬によるＰＳＡ
−ＡＣＴの切断 ＰＳＡフリー（凍結乾燥物）及びＰＳＡ−ＡＣＴは市販
品を用い、それぞれ、アメリカ合衆国、カリフォルニア
州サンディエゴのスクリップスラボラトリーズのカタロ
グ番号Ｐ０７１４、Ｐ０６２４である。両凍結乾燥物を
それぞれ二回蒸留水で再懸濁し、終濃度１ｍｇ／ｍＬと
した。ドイツ国のベーリンガーマンハイムゲーエムベー
ハーのＰＢＳ緩衝液（識別番号２９５８６８６）を切断
緩衝液として用いた。４０μＬの切断緩衝液に２μｇの
ＰＳＡ−ＡＣＴが含まれているものを切断用調製品とし
た。サンプルを含有するＰＳＡ−ＡＣＴの切断のため
に、表１に記載の被験アミン含有求核試薬をサンプルに
添加し、２５℃でインキュベーションを行った。インキ
ュベーション終了後、次の条件でのＨＰＬＣによりサン
プルを分離した。
−ＡＣＴの切断 ＰＳＡフリー（凍結乾燥物）及びＰＳＡ−ＡＣＴは市販
品を用い、それぞれ、アメリカ合衆国、カリフォルニア
州サンディエゴのスクリップスラボラトリーズのカタロ
グ番号Ｐ０７１４、Ｐ０６２４である。両凍結乾燥物を
それぞれ二回蒸留水で再懸濁し、終濃度１ｍｇ／ｍＬと
した。ドイツ国のベーリンガーマンハイムゲーエムベー
ハーのＰＢＳ緩衝液（識別番号２９５８６８６）を切断
緩衝液として用いた。４０μＬの切断緩衝液に２μｇの
ＰＳＡ−ＡＣＴが含まれているものを切断用調製品とし
た。サンプルを含有するＰＳＡ−ＡＣＴの切断のため
に、表１に記載の被験アミン含有求核試薬をサンプルに
添加し、２５℃でインキュベーションを行った。インキ
ュベーション終了後、次の条件でのＨＰＬＣによりサン
プルを分離した。
【００３８】カラム：逆相カラム Poros R 1/H 、
２．１×３０ｍｍ 溶離緩衝液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸 溶離緩衝液Ｂ：０．０８５％トリフルオロ酢酸含有アセ
トニトリル／水（７０／３０）溶液 勾配：０〜２分間は２０％緩衝液Ｂ含有緩衝液Ａ、１１
分間かけて緩衝液Ｂの濃度を直線勾配で１００％にまで
上昇、２分間は１００％緩衝液Ｂ。
２．１×３０ｍｍ 溶離緩衝液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸 溶離緩衝液Ｂ：０．０８５％トリフルオロ酢酸含有アセ
トニトリル／水（７０／３０）溶液 勾配：０〜２分間は２０％緩衝液Ｂ含有緩衝液Ａ、１１
分間かけて緩衝液Ｂの濃度を直線勾配で１００％にまで
上昇、２分間は１００％緩衝液Ｂ。
【００３９】使用した基質の切断効率を表１に示す。表
１は、２５℃における、異なるアミン含有求核試薬の切
断効率を示す。
１は、２５℃における、異なるアミン含有求核試薬の切
断効率を示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】エタノールアミンを用いた場合が切断効率
が最も高いことが明らかになった。図１と図２は、ＰＳ
Ａ−ＡＣＴ切断例のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図で
ある。
が最も高いことが明らかになった。図１と図２は、ＰＳ
Ａ−ＡＣＴ切断例のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図で
ある。
【００４２】実施例２：終濃度０．１Ｍのエタノールア
ミンによる、悪性及び良性血清中のＰＳＡ−ＡＣＴの切
断 ドイツ国のベーリンガーマンハイムゲーエムベーハーの
Enzymun-Test（登録商標）ＰＳＡ（識別番号第１５５５
３３２号）に付属の説明書に記載された手順に従って、
ＰＳＡトータルの検出を行った。ドイツ国のベーリンガ
ーマンハイムゲーエムベーハーのEnzymun-Test（登録商
標）遊離ＰＳＡ（識別番号第１７７６４４４号）に付属
の説明書に記載された手順に従って、ＰＳＡフリーの検
出を行った。両テストは使用した抗体の特異性がわずか
に異なっているだけであった。遊離ＰＳＡの検出に関す
る限り、抗体の少なくとも一つは遊離ＰＳＡに特異的で
なければならず、そしてそれゆえに、その抗体は、ＰＳ
Ａトータルの検出においては、複合体ＰＳＡだけでなく
遊離ＰＳＡも認識される必要があるのにも関わらず、複
合体ＰＳＡには結合してはならないのである。しかしな
がら、明確な理由としては、実施手順において、すべて
の抗体がいわゆる「抗ＰＳＡ抗体」だからである。
ミンによる、悪性及び良性血清中のＰＳＡ−ＡＣＴの切
断 ドイツ国のベーリンガーマンハイムゲーエムベーハーの
Enzymun-Test（登録商標）ＰＳＡ（識別番号第１５５５
３３２号）に付属の説明書に記載された手順に従って、
ＰＳＡトータルの検出を行った。ドイツ国のベーリンガ
ーマンハイムゲーエムベーハーのEnzymun-Test（登録商
標）遊離ＰＳＡ（識別番号第１７７６４４４号）に付属
の説明書に記載された手順に従って、ＰＳＡフリーの検
出を行った。両テストは使用した抗体の特異性がわずか
に異なっているだけであった。遊離ＰＳＡの検出に関す
る限り、抗体の少なくとも一つは遊離ＰＳＡに特異的で
なければならず、そしてそれゆえに、その抗体は、ＰＳ
Ａトータルの検出においては、複合体ＰＳＡだけでなく
遊離ＰＳＡも認識される必要があるのにも関わらず、複
合体ＰＳＡには結合してはならないのである。しかしな
がら、明確な理由としては、実施手順において、すべて
の抗体がいわゆる「抗ＰＳＡ抗体」だからである。
【００４３】両方法におけるテストの原則は、ストレプ
トアビジン技術に基づくワンステップサンドウィッチＥ
ＬＩＳＡ法を用いることである。ビオチン化抗ＰＳＡ抗
体とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識された抗ＰＳＡ
抗体とを含有するインキュベーション溶液とともに、サ
ンプルを、ストレプトアビジンでコートしたプラスチッ
ク試験管に満たした。インキュベーション中に、ビオチ
ン化抗体は固相に結合した。サンプル中に存在するＰＳ
Ａはビオチン化抗体に結合した。ＰＯＤで標識した抗体
は、ビオチン化抗体に結合したＰＳＡに結合した。固相
に結合したサンドウィッチ複合体は、洗浄工程後の指示
反応によって検出された。このためには、ＡＢＴＳ（登
録商標）（２，２’−アジノ−ジ−〔３−エチル−ベン
ズチアゾリンスルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩）
を含む基質色素溶液及び過酸化水素を調製品に添加し
た。ペルオキシダーゼの酵素活性によって、ＰＯＤ標識
化抗体の量に依存して光度計で検出され得る色素を確立
した。
トアビジン技術に基づくワンステップサンドウィッチＥ
ＬＩＳＡ法を用いることである。ビオチン化抗ＰＳＡ抗
体とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識された抗ＰＳＡ
抗体とを含有するインキュベーション溶液とともに、サ
ンプルを、ストレプトアビジンでコートしたプラスチッ
ク試験管に満たした。インキュベーション中に、ビオチ
ン化抗体は固相に結合した。サンプル中に存在するＰＳ
Ａはビオチン化抗体に結合した。ＰＯＤで標識した抗体
は、ビオチン化抗体に結合したＰＳＡに結合した。固相
に結合したサンドウィッチ複合体は、洗浄工程後の指示
反応によって検出された。このためには、ＡＢＴＳ（登
録商標）（２，２’−アジノ−ジ−〔３−エチル−ベン
ズチアゾリンスルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩）
を含む基質色素溶液及び過酸化水素を調製品に添加し
た。ペルオキシダーゼの酵素活性によって、ＰＯＤ標識
化抗体の量に依存して光度計で検出され得る色素を確立
した。
【００４４】次の測定は、一連のヒト血清サンプルを用
いて行われた。まず、サンプルの前処理を行うことな
く、本分野の方法の状態によって得られた最初の調製品
中のＰＳＡフリーの濃度を定量した。これと並行して、
本分野の方法の状態によって得られたＰＳＡトータルの
濃度を定量した。このことは、検出のためには、遊離型
及び複合体型のＰＳＡを結合する抗体を用いることを意
味する。三番目の調製品においては、本発明の方法によ
ってサンプルとエタノールアミンとを混合し（終濃度：
０．１Ｍ）、２５℃で２４時間インキュベーションを行
った後にＰＳＡフリーの濃度を定量した。悪性及び良性
血清の結果を表２及び表３に示す。表２及び表３は、本
発明の方法によって切断した後のＰＳＡフリーの値と、
本分野の方法の状態によるＰＳＡトータルの値との比較
を示す。表２は悪性血清の値である。
いて行われた。まず、サンプルの前処理を行うことな
く、本分野の方法の状態によって得られた最初の調製品
中のＰＳＡフリーの濃度を定量した。これと並行して、
本分野の方法の状態によって得られたＰＳＡトータルの
濃度を定量した。このことは、検出のためには、遊離型
及び複合体型のＰＳＡを結合する抗体を用いることを意
味する。三番目の調製品においては、本発明の方法によ
ってサンプルとエタノールアミンとを混合し（終濃度：
０．１Ｍ）、２５℃で２４時間インキュベーションを行
った後にＰＳＡフリーの濃度を定量した。悪性及び良性
血清の結果を表２及び表３に示す。表２及び表３は、本
発明の方法によって切断した後のＰＳＡフリーの値と、
本分野の方法の状態によるＰＳＡトータルの値との比較
を示す。表２は悪性血清の値である。
【００４５】
【表２】
【００４６】表３は、良性血清の値である。
【００４７】
【表３】
【００４８】驚くべきことに、ＰＳＡトータルの濃度
は、ＰＳＡ−セルピン複合体を本発明に従って切断した
後に定量された遊離ＰＳＡの濃度に対応することが明ら
かにされる。それぞれの相関係数が０．９８を超えるこ
とから、（切断０時間目のＰＳＡフリー）／（切断０時
間目のＰＳＡトータル）の比と、（切断０時間目のＰＳ
Ａフリー）／（切断２４時間目のＰＳＡフリー）の比と
の間には良好な対応関係があることが分かる。このこと
は、本発明に従った方法の助けを借りて、遊離ＰＳＡと
のみ特異的に結合する一つの抗体を含む一組の抗体を用
いる手法は、（ＰＳＡトータル濃度からＰＳＡフリー濃
度を差し引いて求められる）ＰＳＡ−セルピン複合体だ
けでなく、ＰＳＡフリーとＰＳＡトータルとを定量する
のには十分であることを示している。さらに、悪性前立
腺疾患と良性前立腺疾患との識別に必要な（ＰＳＡフリ
ー）／（ＰＳＡトータル）の有益な比を、高い信頼性を
もって定量することができる。
は、ＰＳＡ−セルピン複合体を本発明に従って切断した
後に定量された遊離ＰＳＡの濃度に対応することが明ら
かにされる。それぞれの相関係数が０．９８を超えるこ
とから、（切断０時間目のＰＳＡフリー）／（切断０時
間目のＰＳＡトータル）の比と、（切断０時間目のＰＳ
Ａフリー）／（切断２４時間目のＰＳＡフリー）の比と
の間には良好な対応関係があることが分かる。このこと
は、本発明に従った方法の助けを借りて、遊離ＰＳＡと
のみ特異的に結合する一つの抗体を含む一組の抗体を用
いる手法は、（ＰＳＡトータル濃度からＰＳＡフリー濃
度を差し引いて求められる）ＰＳＡ−セルピン複合体だ
けでなく、ＰＳＡフリーとＰＳＡトータルとを定量する
のには十分であることを示している。さらに、悪性前立
腺疾患と良性前立腺疾患との識別に必要な（ＰＳＡフリ
ー）／（ＰＳＡトータル）の有益な比を、高い信頼性を
もって定量することができる。
【００４９】
【発明の効果】本発明の方法は、より単純化されたＰＳ
Ａの定量方法を提供する。それにより、高い信頼性を有
する悪性前立腺疾患と良性前立腺疾患との識別が可能と
なる。
Ａの定量方法を提供する。それにより、高い信頼性を有
する悪性前立腺疾患と良性前立腺疾患との識別が可能と
なる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、エタノールアミンを用いて切断を行う
前の、ＰＢＳ緩衝液中のＰＳＡ−ＡＣＴのＨＰＬＣクロ
マトグラムを示す図である。ここで、ＰＳＡ−ＡＣＴ
は、０．１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０中、２５℃
で０時間の時点のものである。ＰＳＡ−ＡＣＴの保持時
間は11.32 分である。
前の、ＰＢＳ緩衝液中のＰＳＡ−ＡＣＴのＨＰＬＣクロ
マトグラムを示す図である。ここで、ＰＳＡ−ＡＣＴ
は、０．１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０中、２５℃
で０時間の時点のものである。ＰＳＡ−ＡＣＴの保持時
間は11.32 分である。
【図２】図２は、エタノールアミンを用いてＰＳＡとＡ
ＣＴに切断を行った後のＰＳＡ−ＡＣＴのＨＰＬＣクロ
マトグラムを示す図である。ここで、ＰＳＡ−ＡＣＴ
は、０．１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０中、２５℃
で６０時間の時点のものである。ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ及びＡＣＴの保持時間はそれぞれ9.53分、11.33分及
び11.48 分である。
ＣＴに切断を行った後のＰＳＡ−ＡＣＴのＨＰＬＣクロ
マトグラムを示す図である。ここで、ＰＳＡ−ＡＣＴ
は、０．１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０中、２５℃
で６０時間の時点のものである。ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ及びＡＣＴの保持時間はそれぞれ9.53分、11.33分及
び11.48 分である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨハン ペーター アメリカ合衆国 ノース キャロライナ 27709 リサーチ トライアングル パー ク ビルディング 101 ルーム エフ011 ナショナル インスティチュート オブ エンヴァイロンメンタル ヘルス内
Claims (10)
- 【請求項１】 アミンを含有する求核試薬が添加された
サンプルと、遊離前立腺特異的抗原には特異的に結合す
るが、複合体前立腺特異的抗原には結合しない抗体の少
なくとも一つとのインキュベーションによる、前立腺特
異的抗原（ＰＳＡと表記する。）の定量のための免疫学
的方法。 - 【請求項２】 アミンを含有する求核試薬が総ＰＳＡ濃
度の定量前に添加されたサンプルと、遊離ＰＳＡには特
異的に結合するが、複合体ＰＳＡには結合しない抗体の
少なくとも一つとのインキュベーションによる、遊離Ｐ
ＳＡ、ＰＳＡの総濃度及びＰＳＡ−セルピン複合体の濃
度の定量のための免疫学的方法。 - 【請求項３】 アミンを含有する求核試薬としてアミノ
アルコールを添加する請求項１又は２記載の免疫学的方
法。 - 【請求項４】 アミンを含有する求核試薬としてエタノ
ールアミンを添加する請求項３記載の免疫学的方法。 - 【請求項５】 アミノアルコールを用いて遊離ＰＳＡを
生成する方法。 - 【請求項６】 複合体ＰＳＡを含有するサンプルとアミ
ノアルコールとのインキュベーションによる、複合体Ｐ
ＳＡから遊離ＰＳＡを調製する方法。 - 【請求項７】 請求項６記載の方法により得られ得る遊
離ＰＳＡを、ＰＳＡの定量のための標準として使用する
方法。 - 【請求項８】 請求項６記載の方法により得られ得る遊
離ＰＳＡを非免疫学的検査のために使用する方法。 - 【請求項９】 ＰＳＡの検出のための免疫学的方法にお
いてアミン含有求核試薬を使用する方法。 - 【請求項１０】 ＰＳＡの検出のための免疫アッセイに
使用するための、アミン含有求核試薬を含有する試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19814915:8 | 1998-04-03 | ||
| DE19814915A DE19814915A1 (de) | 1998-04-03 | 1998-04-03 | Immunologisches Verfahren zur Bestimmung von PSA |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11326329A true JPH11326329A (ja) | 1999-11-26 |
Family
ID=7863448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11095261A Pending JPH11326329A (ja) | 1998-04-03 | 1999-04-01 | 前立腺特異的抗原の定量のための免疫学的方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6361955B1 (ja) |
| EP (1) | EP0947832A1 (ja) |
| JP (1) | JPH11326329A (ja) |
| CA (1) | CA2267060A1 (ja) |
| DE (1) | DE19814915A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014097556A (ja) * | 2012-11-15 | 2014-05-29 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 取付加工機および加工方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10230893A1 (de) * | 2002-06-26 | 2004-01-15 | Dr. Fischer Ag | Verfahren zur Eigenschaftsbestimmung und/oder Klassifikation von zirkulierenden Macrophagen und/oder peripheren blutmononuclearen Zellen sowie Analyseanordnung zur Durchführung des Verfahrens |
| US7771660B2 (en) * | 2004-05-04 | 2010-08-10 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Electrophoretic interactive spectral methods and devices for the detection and/or characterization of biological particles |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9002480D0 (sv) * | 1990-07-23 | 1990-07-23 | Hans Lilja | Assay of free and complexed prostate-specific antigen |
| EP0635575A1 (en) * | 1993-07-22 | 1995-01-25 | Wallac Oy | Monoclonal antibodies against epitopes found in free but not in alpha-1-antichmotrypsin complexed prostate specific antigen |
| US5710007A (en) * | 1995-09-29 | 1998-01-20 | Luderer; Albert A. | Methods for diagnosing prostatic adenocarcinoma |
| EP0789032A2 (en) * | 1996-02-01 | 1997-08-13 | Bayer Corporation | Method for preparing a monoclonal antibody that provides an equimolar response to free and complexed analyte in a monoclonal/polyclonal sandwich immunoassay |
| AU4086397A (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-26 | Centocor Inc. | Monoclonal antibodies specific for prostate specific antigen and methods of detecting prostate specific antigen |
-
1998
- 1998-04-03 DE DE19814915A patent/DE19814915A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-03-26 EP EP99106302A patent/EP0947832A1/de not_active Withdrawn
- 1999-03-29 CA CA002267060A patent/CA2267060A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-01 JP JP11095261A patent/JPH11326329A/ja active Pending
- 1999-04-01 US US09/283,955 patent/US6361955B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014097556A (ja) * | 2012-11-15 | 2014-05-29 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 取付加工機および加工方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0947832A1 (de) | 1999-10-06 |
| US6361955B1 (en) | 2002-03-26 |
| CA2267060A1 (en) | 1999-10-03 |
| DE19814915A1 (de) | 1999-10-07 |
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