JPH1132756A - プロリン生産性を有するサーマス属細菌及びプロリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 プロリン生産性を有するサーマス属細菌、及
び、これを用いたプロリンの製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害
が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持するサーマ
ス属細菌、Ｌ−プロリン分解系が破壊されたサーマス属
細菌、又はＬ−プロリンによるフィードバック阻害が解
除されたγ−グルタミルキナーゼを保持し、かつ、Ｌ−
プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌を培地で培
養し、該培養物中にＬ−プロリンを生成蓄積せしめ、該
培養物からＬ−プロリンを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−プロリンの過
剰生産能を有するサーマス属細菌及びこれを用いたＬ−
プロリンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】好熱性細菌の生産する酵素やタンパク質
は一般に高温で安定であり、ｐＨ変化や有機溶媒に対し
ても安定性が高く、診断薬や工業用触媒として応用が進
んでいる。サーマス属細菌、例えばサーマス・サーモフ
ィルス（Thermus thermophilus）は、このような好熱性
細菌のなかでも高度の耐熱性を有する高度好熱菌として
広く研究されているものの１つであり、５０〜８０℃で
生育できるグラム陰性の桿状ユーバクテリウムである。
サーマス属細菌も同様に耐熱性酵素を産生し、工業的に
有用な耐熱性酵素を産生するものも少なくない。例え
ば、ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）に用い
られるTaqポリメラーゼやTthポリメラーゼのように日常
的に用いられているものもあり、酵素の安定性、持続性
を利用したアミノ酸等の有用物質の発酵生産にも応用が
期待される。

【０００３】サーマス属細菌の生産する酵素のほとんど
はそれ自身で熱安定性を示す上、常温での安定性も優れ
ていることが知られている。サーマス属細菌もしくは、
サーマス属細菌の酵素を物質生産に用いることで、高温
条件下において反応速度を向上させることができ、発酵
中の冷却コストを節減することも可能になると考えられ
ている。

【０００４】ところで、アミノ酸の１種であるＬ−プロ
リン（以下、単に「プロリン」ともいう）の製造は、現
在コリネホルム細菌による発酵生産が主流となっている
が、発酵中に培地の温度が上昇し、発酵に必要な酵素が
失活したり生産菌が死滅したりするために、発酵中に培
地を冷却することが必要となっている。そこで、サーマ
ス属細菌を利用して高温でのプロリンの発酵生産が可能
になれば、培地の冷却が不要となり、省力化することが
できる。また、代謝中間体を原料とする酵素法によるプ
ロリン合成に、サーマス属細菌由来の酵素を利用すれ
ば、酵素の安定性及び持続性により生産性が向上すると
考えられる。

【０００５】プロリン生合成経路は大腸菌（エシェリヒ
ア・コリ(Escherichia coli)）及びセラチア・マルセッ
センス（Serratia marcescens）では知られており、次
のとおりである。まずＬ−グルタミン酸がリン酸化によ
り活性化され、グルタミルリン酸となり、続いてグルタ
ミン酸セミアルデヒドに変換される。グルタミン酸セミ
アルデヒドは自発的に環状化してΔ¹−ピロリン−５−
カルボン酸（P5C)となり、さらにプロリンに変換され
る。腸内細菌では、この反応には３つの酵素、すなわち
γ−グルタミルキナーゼ（proB遺伝子産物）、γ−グル
タミルリン酸レダクターゼ（proA遺伝子産物）、Δ¹−
ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（proC遺伝子産
物）が関与している。これらのうち、proB及びproAはオ
ペロン（proBA）を構成していることが大腸菌では知ら
れている(Deutch, A.H. et al.(1984)Nucleic Acid Re
s. 12, 6337-6355、Oomori, K. et al.(1991) J. Gen.
Microbiol. 137, 509-517）。

【０００６】また、プロリン過剰生産株が分離されてい
る大腸菌やセラチア（Serratia）属細菌では、プロリン
生合成系の第一段階の酵素であるγ−グルタミルキナー
ゼだけが、プロリンによってフィードバック阻害を受け
ることが報告されている。さらに、大腸菌では菌体外の
プロリンを取り込む活性を有するプロリンパーミアーゼ
およびプロリン酸化酵素であるプロリンデヒドロゲナー
ゼを有しており、プロリンを分解する反応経路（以下
「プロリン分解系」という）が存在することが報告され
ている。

【０００７】これに対し、サーマス属細菌でも、プロリ
ン合成経路は一部明らかにされており、サーマス・サー
モフィルスに由来するγ−グルタミルキナーゼおよびγ
−グルタミルリン酸レダクターゼをコードするＤＮＡ配
列は、本発明者によって既に明らかにされている（特開
平7-298883号公報）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、サー
マス属細菌においてもプロリン合成経路について一部明
らかとなっており、プロリン生産に応用することへの道
が開かれているが、プロリン生合成系の調節やプロリン
分解系の存在については明らかではなく、プロリン高生
産株を得るには、課題が残されていた。

【０００９】本発明は、上記現状に鑑みてなされたもの
であり、プロリン生産性を有するサーマス属細菌、及
び、これを用いたプロリンの製造方法を提供することを
課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、サーマス属細菌
のプロリン生合成経路において、γ−グルタミルキナー
ゼがプロリンによるフィードバック阻害を受けているこ
とを見出し、さらにプロリン分解系が存在することを見
出した。そして、前記フィードバック阻害が解除された
γ−グルタミルキナーゼを保持し、さらにプロリン分解
系が破壊されたサーマス属細菌を創製することに成功
し、本発明を完成させるに至った。

【００１１】すなわち本発明は、Ｌ−プロリンによるフ
ィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼ
を保持するサーマス属細菌である。本発明はまた、Ｌ−
プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌を提供す
る。本発明はさらに、Ｌ−プロリンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持し、
かつ、Ｌ−プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌
を提供する。

【００１２】また本発明は、前記のいずれかに記載のサ
ーマス属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−プロリ
ンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−プロリンを採取
することを特徴とするＬ−プロリンの製造法を提供す
る。

【００１３】さらに本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に
示すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１２
５番目のＡｌａ残基がＡｌａ残基以外のアミノ酸残基に
変化したアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−プロリンによ
るフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナ
ーゼ活性を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１２
５番目のＡｌａ残基がＡｌａ残基以外のアミノ酸残基に
変化したアミノ酸配列を有し、さらに、１２５番目のア
ミノ酸残基以外の位置における１若しくは数個のアミノ
酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミ
ノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−プロリンによるフィードバ
ック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼ活性を有
するタンパク質。

【００１４】尚、本発明が適用されるサーマス属細菌と
しては、サーマス・サーモフィルス、サーマス・アクア
ティカス（T.aquaticus）、サーマス・フラバス（T.fla
vus）、サーマス・カルドフィラス（T.caldophilus）、
サーマス・ルーバー（T.ruber）等が挙げられる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のサーマス属細菌の第一の形態は、プロリンによ
るフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナ
ーゼを保持するサーマス属細菌である。本発明者は、大
腸菌やセラチア属細菌と同様に、サーマス・サーモフィ
ルスにおいてもγ−グルタミルキナーゼがプロリンによ
ってフィードバック阻害を受けることを見出し、このフ
ィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼ
を保持するサーマス属細菌を創製することに成功した。
プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グ
ルタミルキナーゼを保持するサーマス属細菌は、サーマ
ス属に属するプロリン生産菌の育種の材料として利用す
ることができる。

【００１６】プロリンによるフィードバック阻害が解除
されたγ−グルタミルキナーゼを保持するサーマス属細
菌は、例えば、プロリンによるフィードバック阻害が解
除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮＡを
細胞内に導入することによって得られる。また、サーマ
ス属細菌を、紫外線照射処理またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の変異剤による
処理など、通常微生物の人為突然変異を起こさせる方法
により処理し、デヒドロプロリン等のプロリンアナログ
に耐性を示す株を選択することによっても、取得され得
る。

【００１７】プロリンによるフィードバック阻害が解除
されたγ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮＡ（以
下、「変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子という」
は、サーマス属細菌野生株から単離したγ−グルタミル
キナーゼをコードするＤＮＡ（以下、「野生型γ−グル
タミルキナーゼ遺伝子」という）に、このＤＮＡによっ
てコードされるγ−グルタミルキナーゼのプロリンによ
るフィードバック阻害が解除されるような変異を導入す
ることによって、得られる。

【００１８】野生型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子は、
サーマス属細菌の遺伝子ライブラリーから、サーマス属
細菌のプロリン要求性変異株のプロリン要求性の回復を
指標として、プロリン生合成系遺伝子を保持するクロー
ンを選択することにより得られる。この方法は、特開平
7-298883号公報に詳細に記載されている。こうして得ら
れるサーマス・サーモフィルスの野生型γ−グルタミル
キナーゼ遺伝子の塩基配列及びこれによってコードされ
るγ−グルタミルキナーゼのアミノ酸配列を、配列表の
配列番号１に示す。また、このアミノ酸配列のみを配列
番号２に示す。尚、サーマス・サーモフィルスのγ−グ
ルタミルキナーゼ遺伝子（proB遺伝子）は、γ−グルタ
ミルリン酸レダクターゼ遺伝子（proA遺伝子）等ととも
にオペロンを形成しており、因みにproA遺伝子のコード
領域は、配列番号１において塩基番号１４９５〜２８２
９である。

【００１９】また、上記のように、γ−グルタミルリン
酸レダクターゼのアミノ酸配列及びこれをコードする塩
基配列は明らかにされているので、この配列を基に作製
したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションによって、サーマス属細菌の遺伝子ライブラ
リーから、γ−グルタミルキナーゼ遺伝子を得ることが
できる。また、γ−グルタミルキナーゼ遺伝子は、上記
塩基配列を基に作製したオリグヌクレオチドプライマー
を用い、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）によ
りサーマス属細菌の染色体ＤＮＡから増幅することによ
っても得られる。

【００２０】変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子は、
上記のようにして得られる野生型γ−グルタミルキナー
ゼ遺伝子に、これがコードするγ−グルタミルキナーゼ
のプロリンによるフィードバック阻害が解除されるよう
な変異を導入することによって得られる。このような変
異としては、γ−グルタミルキナーゼのＮ末端から１２
５番目のＡｌａ残基がＡｌａ残基以外の他のアミノ酸残
基に置換される変異が挙げられる。Ａｌａ残基以外のア
ミノ酸残基としては、１２５番目のＡｌａ残基をそのア
ミノ酸残基に置換したときに、γ−グルタミルキナーゼ
の活性が保持され、かつ、プロリンによるフィードバッ
ク阻害が解除されるものであれば特に制限されないが、
好ましくはＶａｌ残基が挙げられる。より具体的には、
配列番号１に示す塩基配列において、１２５番目のコド
ン（塩基番号７４０〜７４２）GCCを、他のアミノ酸残
基をコードするコドン、好ましくはＶａｌをコードする
コドン（GTT、GTC、GTA又はGTG）に置換すればよい。

【００２１】プロリン生産株が分離されている大腸菌及
びセラチア・マルセッセンス（S. marcescens）では、
変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子の塩基配列が知ら
れている（Oomori, K. et al., J. Gen. Microbiol. 13
8, 693-699(1992)）。大腸菌、セラチア・マルセッセン
ス及びサーマス・サーモフィルスのγ−グルタミルキナ
ーゼのアミノ酸配列の一部と、大腸菌及びセラチア・マ
ルセッセンスの変異型γ−グルタミルキナーゼの変異の
様式を図１に示す。大腸菌の変異型γ−グルタミルキナ
ーゼでは１０７番目のＡｓｐ残基がＡｓｎ残基に置換さ
れている。セラチア・マルセッセンスの変異型γ−グル
タミルキナーゼでは１１７番目のＡｌａ残基がＶａｌ残
基に置換されている。これらのアミノ酸残基は、サーマ
ス・サーモフィルスのγ−グルタミルキナーゼでは、そ
れぞれ１１５番目のＡｓｐ残基及び１２５番目のＡｌａ
残基に相当する（図１参照）。

【００２２】後記実施例１に示すように、サーマス・サ
ーモフィルスのγ−グルタミルキナーゼに、大腸菌の変
異型γ−グルタミルキナーゼに相当する変異（１１５番
目のＡｓｐ残基をＡｓｎ残基に置換する変異）、セラチ
ア・マルセッセンスの変異型γ−グルタミルキナーゼの
変異に相当する変異（１２５番目のＡｌａ残基をＶａｌ
残基に置換する変異）、又はこれらの両方の変異を導入
し、得られた変異遺伝子でサーマス・サーモフィルス野
生株を形質転換した。その結果、セラチア・マルセッセ
ンスの変異型γ−グルタミルキナーゼの変異と同様の変
異を導入した場合のみ、形質転換体はデヒドロプロリン
耐性を示した。

【００２３】サーマス属細菌の野生型γ−グルタミルキ
ナーゼ遺伝子に、１２５番目のＡｌａ残基のコドンを他
のアミノ酸残基のコドンに置換する変異を導入するの
は、例えば、１２５番目のコドンの前後の配列を含み、
かつ、意図する変異を含むオリゴヌクレオチドを作製
し、これをプライマーとするＰＣＲ法によって行うこと
ができる。このようなオリゴヌクレオチドとしては、配
列番号３〜８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドが挙げられる。得られたＰＣＲ産物を、野生型γ−グ
ルタミルキナーゼ遺伝子の前記ＰＣＲ産物に相当する部
位と置換するか、あるいはＰＣＲ産物を用いたリコンビ
ナントＰＣＲを行うことによって、変異を有するγ−グ
ルタミルキナーゼ遺伝子が得られる。

【００２４】また変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子
は、オーバーラッピング・イクステンション法（Overla
pping Extension法、Ho.,S.N.,Hunt,H.D.,Horton,R,M.,
Pullen,J.K. and Pease,L.R.,Gene,77,51-59(1989)）、
部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. i
n Enzymol.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et.al.,Met
h. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法により、野
生型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子に意図する変異を導
入することによっても得られる。

【００２５】本発明のγ−グルタミルキナーゼ遺伝子に
は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１２５番目のＡ
ｌａ残基が他のアミノ酸残基に変化したアミノ酸配列を
有するタンパク質をコードするＤＮＡの他に、さらに、
１２５番目のアミノ酸残基以外の位置における１若しく
は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列を有するものであっても、Ｌ−
プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グ
ルタミルキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡは、例えば、配列
番号２に記載のアミノ酸配列の１２５番目のＡｌａ残基
が他のアミノ酸残基に変化したアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡを保持する微生物を変異処
理し、得られる変異株から、配列番号１に示す塩基配列
において塩基番号３６８〜１４９８で表される塩基配列
の少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによ
って、取得され得る。

【００２６】上記の「ストリンジェントな条件」とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相
同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有
するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が
低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは
温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−
３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲
で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当
する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００２７】また、１２５番目のアミノ酸残基以外の位
置における１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むγ−グルタミルキナー
ゼをコードするＤＮＡは、部位特異的変異法によって、
特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、不可又
は逆位を起こすように塩基配列を改変することによって
得られる。

【００２８】上記のようにして得られるＤＮＡのうち、
Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ
−グルタミルキナーゼ活性を有し、かつ、１２５番目の
アミノ酸残基以外の部位において変異が生じたγ−グル
タミルキナーゼをコードするものを選択することによっ
て、変異を導入することができる位置、又は変異が生じ
た位置を決定することができる。導入される変異の位置
は、γ−グルタミルキナーゼ活性に実質的に影響のない
限り、特に制限されない。また、導入される変異の数
は、タンパク質の立体構造における変異されるアミノ酸
の位置や種類によっても異なり、γ−グルタミルキナー
ゼ活性に実質的に影響のない限り、特に制限されない
が、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個である。

【００２９】上記のようにして得られる変異型γ−グル
タミルキナーゼ遺伝子をサーマス属細菌に導入すれば、
プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グ
ルタミルキナーゼを保持するサーマス属細菌が得られ
る。変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子をサーマス属
細菌に導入する方法としては、変異型γ−グルタミルキ
ナーゼ遺伝子を、サーマス属細菌の染色体ＤＮＡ内に組
み込むことにより形質転換する方法が挙げられる。ま
た、サーマス属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに
該遺伝子を挿入し、得られる組換えベクターでサーマス
属細菌、好ましくは野生型γ−グルタミルキナーゼを保
持しないサーマス属細菌を形質転換してもよい。

【００３０】ベクターとしては、プラスミドベクターが
好ましく、例えば、pYK134（T. Hoshino, et al., J. F
erment. Bioeng., 76, 276-279(1993)）等が挙げられ
る。変異型γ−グルタミルキナーゼ遺伝子がプロモータ
ーを含んでいる場合には、そのまま用いることができる
が、サーマス属細菌で効率よく機能するプロモーターを
使用してもよい。このようなプロモーターは、H. Mased
a, et al., FEMS Microbilo. Lett., 128, 127-134(199
5)に記載されている。本発明により得られた変異型γ−
グルタミルキナーゼ遺伝子をサーマス属細菌または他の
微生物に導入し、該遺伝子を発現させれば、熱安定性を
有する変異型γ−グルタミルキナーゼが得られる。この
ような変異型γ−グルタミルキナーゼは、代謝中間体を
原料とする酵素法によるプロリン合成に好適に用いるこ
とができる。

【００３１】本発明のサーマス属細菌の第二の形態は、
プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌である。サ
ーマス属細菌は、プロリンを唯一の窒素源（Ｎ源）とす
る最小培地で生育でき、プロリン資化能を有している。
したがって、サーマス属細菌も、プロリンを細胞内に取
り込み、プロリンを分解する分解系を有していると考え
られた。そこで、プロリン生産菌を育種するためには、
プロリン分解系を破壊することが有効であると考え、実
施例に示すように、プロリンによるフィードバック阻害
が解除されたサーマス属細菌からプロリン資化能欠損株
を選択したところ、選択された株の中からプロリンを菌
体外に生産する株が得られた。

【００３２】プロリン分解系の破壊としては、プロリン
を分解する初発段階を触媒すると考えられるプロリンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子に変異を起こさせ、活性のあるプ
ロリンデヒドロゲナーゼを発現させないようにすること
が好ましいと考えられる。このようなプロリン分解系が
破壊されたサーマス属細菌は、まず、サーマス属細菌か
らプロリン資化能欠損株を取得し、得られた株の中から
プロリン要求株を指標としてプロリンを菌体外に生産す
る株を選択することによって得られる。

【００３３】プロリン資化能欠損株は、サーマス属細菌
を紫外線照射処理またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）等の変異剤による処理など、
通常微生物の変異を起こさせる方法により処理し、硫酸
アンモニウムを唯一のＮ源とする最小培地及びプロリン
を唯一のＮ源とする最小培地にレプリカし、前者では生
育可能であるが、後者では生育できない株を選択するこ
とによって取得することができる。また、プロリンを菌
体外に生産する株は、サーマス属細菌のプロリン要求株
を最小培地上に塗布しておき、この培地上に候補株の培
養液をスポットし、周囲のプロリン要求株の生育を指標
として選択することができる。

【００３４】本発明のサーマス属細菌の第三の形態は、
プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グ
ルタミルキナーゼを保持し、かつ、プロリン分解系が破
壊されたサーマス属細菌である。このようなサーマス属
細菌は、本発明の第一の形態のサーマス属細菌から、上
記と同様にしてプロリン分解系が破壊された株を選択す
ることによって得られる。本発明の第三の形態のサーマ
ス属細菌は、菌体外にプロリンを生産する。

【００３５】本発明のサーマス属細菌において、γ−グ
ルタミルキナーゼ遺伝子及びγ−グルタミルリン酸レダ
クターゼ遺伝子を増強することによって、一層プロリン
生産性を向上させることができると期待される。

【００３６】＜４＞本発明のプロリンの製造方法 上記のようにして得られるプロリン生産性を有するサー
マス属細菌を培地で培養し、該培養物中にプロリンを生
成蓄積せしめ、該培養物からプロリンを採取することに
よりプロリンを製造することができる。

【００３７】本発明の製造法におけるプロリン生産性を
有するサーマス属細菌の培養および培養液からのプロリ
ンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によ
るアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使
用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有
し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適
当量含有するするものであれば、合成培地でも天然培地
でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロー
スをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられ
る。また使用する微生物の資化性によってはエタノール
やグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。
窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の
各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合
物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の
天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐
酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられ
る。

【００３８】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は５０〜８２
℃で、好ましくは６５〜７５℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常６〜８の範囲であり、６．６〜７．５の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
に目的とするプロリンが蓄積する。

【００３９】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするプロリンを採取、精製
することが出来る。

【００４０】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００４１】

【実施例１】Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が
解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持するサーマス
属細菌の創製 ＜１＞γ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮＡ断片
の単離 （１）サーマス サーモフィルス プロリン要求性変異
株の作製 サーマス サーモフィルスＨＢ２７を親株として、N−
メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）に
よる変異処理を行った。ＨＢ２７株を、表１の組成を有
するＴＭ培地（Koyama, Y., Hoshino, T., Tomizuka,
N., Furukawa, K. (1986) J. Bacteriol. 166, 338-34
0）を用いて７０℃で３時間培養し、菌体を２０ｍＭ カ
リウム−リン酸緩衝液（pH6.5）で洗浄した後、ＮＴＧ
液（ＮＴＧを４０μg/mLとなるように同緩衝液に溶解し
たもの）に懸濁し、７０℃で３０分処理した。こうして
ＮＴＧ処理した菌体を、0.85% NaCl，１０ｍＭ ナトリ
ウム−リン酸緩衝液で洗浄後、ＴＭ培地で一夜培養して
変異を固定した。

【００４２】

【表１】

【００４３】上記のようにして変異処理を行ったサーマ
ス サーモフィルスＨＢ２７をプロリン４０ｍｇ／Ｌを
含む最小培地プレート（Koyama, Y., Hoshino, T., Tom
izuka, N., Furukawa, K. (1986) J. Bacteriol. 166,
338-340）に生育させ、生じたコロニーをプロリンを含
まない最小培地プレートにレプリカし、プロリン存在下
でのみ生育できるコロニーを選択した。最小培地の組成
は下表のとおりである。

【００４４】

【表２】 990mLの溶液Ａ、10mLの溶液Ｂ、0.1mLの溶液Ｃを滅菌後混合する 溶液Ｃはミリポアフィルター濾過で滅菌

【００４５】こうして得られたプロリン要求性変異株４
株（各々TH103、TH104、TH105及びTH106と命名された）
について、Δ¹−ピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）
５０ｍｇ／Ｌを含む最小培地プレート上での生育を調べ
た結果、２株（TH103及びTH105）は生育し、他の２株
（TH104及びTH106）は生育できなかった。この結果か
ら、TH104及びTH106は、Ｐ５Ｃからプロリンへの還元を
触媒するΔ¹−ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ
に関する変異株であり、TH103及びTH105は、Ｐ５Ｃより
も上流のプロリン生合成系における酵素に関する変異株
であると推定された。

【００４６】（２）サーマス サーモフィルスＨＢ２７
の遺伝子ライブラリーの作製 サーマス サーモフィルスＨＢ２７の全ＤＮＡを、Sait
oらの方法（Saito, H.and Miura, K. (1963) Biochem.
Biophys. Acta 72, 619-629）で調製し、制限酵素MboI
で部分消化した。消化断片を０．８％アガロースゲル電
気泳動により分離し、１〜５kbの大きさの断片をＧＥＮ
ＥＣＬＥＡＮII（フナコシ（株）製）を用いて回収し
た。これらを、BamHIで切断し末端を脱リン酸化したベ
クタープラスミドpUC19に連結して組換えプラスミドを
作製し、この組換えプラスミドを用いて大腸菌JM109の
形質転換を行った。

【００４７】１０，０００株以上の形質転換株を、アン
ピシリン ５０ｍｇ／Ｌ、イソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（IPTG）４０ｍｇ／Ｌ及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド ４０ｍｇ／Ｌを含むＨプレート（１Ｌ中にト
リプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ８ｇ及び寒天１２ｇを含
む）に生育させ、菌体をかき取り０．８５％食塩水に懸
濁させ、−３０℃で保存した。

【００４８】（３）TH103及びTH105のプロリン要求性変
異を相補する大腸菌形質転換株のライブラリーからのス
クリーニング 上記で得られた遺伝子ライブラリーの一部を氷上で解凍
し、希釈してアンピシリン ５０ｍｇ／Ｌを含むＨプレ
ートにまき、３７℃で一昼夜培養した。得られたコロニ
ーを最小培地プレートにレプリカし、このレプリカプレ
ートに前記＜１＞で得られたサーマス サーモフィルス
TH103あるいはTH105の新鮮な培養物を広げ、７０℃で
２日間培養した。寒天培地上においても供与菌（大腸菌
形質転換株）から受容菌（TH103あるいはTH105）への組
換えプラスミドの移行、さらには相同組換えが起こるの
で、遺伝子ライブラリー中の形質転換株がサーマス サ
ーモフィルスのプロリン要求性変異に関わる領域を有す
るＤＮＡ断片を保持しているならば、TH103あるいはTH1
05は前記供与菌のコロニーの位置で生育できるようにな
る。

【００４９】こうしてTH103が生育した位置に対応する
大腸菌形質転換株を、Ｈプレートのコロニーから回収し
た。

【００５０】（４）γ−グルタミルキナーゼをコードす
る遺伝子の単離 上記で得られた形質転換株から組換えプラスミドを、ア
ルカリ溶解法（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Man
iatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboraroty M
anual, second edition, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, ColdSpring Harbor, NY）により調製した。T
H103のプロリン要求性を相補する組換えプラスミドは、
同時にTH105のプロリン要求性をも相補できることがわ
かり、このプラスミドはpUC-pro3,5⁺と命名された。

【００５１】pUC-pro3,5⁺から挿入断片を取り出し、適
当な制限酵素で切断し、pUC19の対応する制限酵素部位
に挿入してクローン化した。こうして得られたサブクロ
ーン断片のヌクレオチド配列を、Taqポリメラーゼ及び
色素標識プライマーを用いた配列決定キット（Taq Dye
Primer Cycle Sequencing Kit：アプライドバイオシス
テムズ社より購入）及び自動配列決定装置（アプライド
バイオシステムズ社：model 373A）を用い、キットに添
付の説明書に準じて決定した。

【００５２】pUC-pro3,5⁺中の挿入断片の塩基配列、及
びこの塩基配列に含まれる第一のＯＲＦによってコード
されるアミノ酸配列を、配列表配列番号１に示す。ま
た、前記アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。第一の
ＯＲＦがγ−グルタミルキナーゼをコードすることも特
開平7-298883号公報の実施例に記載されている方法によ
って確認された。

【００５３】＜２＞Ｌ−プロリンによるフィードバック
阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードする
ＤＮＡの作製 上記で得られたプラスミドpUC-pro3,5⁺を鋳型とし、合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによっ
て、γ−グルタミルキナーゼ遺伝子に変異を導入した。

【００５４】まず、表３に示すプライマーを用いて、変
異が導入された４つのＤＮＡ断片を作製した（図２参
照）。ＤＮＡ断片Ａ及びＣにはγ−グルタミルキナーゼ
のＮ末端から１１５番目のＡｓｐ残基をＡｓｎ残基に置
換する変異（以下、「変異１」という）が、ＤＮＡ断片
Ｂ及びＤには１２５番目のＡｌａ残基をＶａｌ残基に置
換する変異（以下、「変異２」という）が導入されてい
る。

【００５５】

【表３】

【００５６】次に、プライマーPROB_F6、PROB_R2、及び
上記で得られた増幅ＤＮＡ断片を用いたリコンビナント
ＰＣＲにより、変異が導入されたγ−グルタミルキナー
ゼ遺伝子（proB）を含むＤＮＡ断片を作製した。すなわ
ち、ＤＮＡ断片Ａ及びＣを用いて変異１が導入されたpr
oB断片を、ＤＮＡ断片Ｂ及びＤを用いて変異２が導入さ
れたproB断片を、ＤＮＡ断片Ｂ及びＣを用いて変異１及
び変異２が導入されたproB断片を、それぞれ作製した。

【００５７】上記のようにして得られた３種類の変異型
proB遺伝子を含むＤＮＡ断片をそれぞれ用いて染色体と
の相同組換えを誘導し、サーマス サーモフィルス HB2
7野生株を形質転換した。得られた形質転換体を１ｍＭ
のデヒドロプロリンを含む最小培地に塗布して７０℃で
培養し、デヒドロプロリン耐性株の分離を試みた。その
結果、１２５番目のＡｌａ残基がＶａｌ残基に置換され
たproB遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いた場合のみ、デヒ
ドロプロリン耐性の形質転換株が得られた。なお、デヒ
ドロプロリン耐性は、特公昭57-2231号公報でプロリン
生産性が向上したブレビバクテリウム属細菌の選択指標
として用いられている。しかし、デヒドロプロリン耐性
が、サーマス属細菌においてもプロリン生産性が向上し
た株の選択指標となることはこれまで知られておらず、
本発明者が本発明を完成する課程で見いだしたものであ
る。野生型のサーマス属細菌は、１ｍＭのデヒドロプロ
リンを含む培地中で生育できないが、同培地中で生育す
る変異株にはプロリン生産性の向上がみられるものがあ
る。

【００５８】こうして得られたデヒドロプロリン耐性株
から８株を無作為に選択し、１ｍＭのデヒドロプロリン
を含む最小培地中で、デヒドロプロリンを含まない培地
中と同様に生育することを確認した。また、各形質転換
株から全ＤＮＡを調製し、制限酵素SphIで消化し、２〜
４ｋｂのSphI断片を含むＤＮＡライブラリーを各形質転
換株について作製した。そして、proB遺伝子をプローブ
としたハイブリダイゼーション法により、各ライブラリ
ーから、proB遺伝子を含むＤＮＡ断片（約３．０ｋｂ）
をサブクローニングし、塩基配列を決定した結果、いず
れの株にも意図した通りの変異が導入されていることを
確認した。

【００５９】

【実施例２】プロリン分解系が破壊されたサーマス属細
菌の創製 実施例１で得られたデヒドロプロリン耐性株のうち、TH
401株と命名された１株を用いて、プロリン分解系が破
壊された変異株の分離を行った。TH401株に、紫外線殺
菌灯（１５Ｗ）を用いて５０ｃｍの距離から３分間ＵＶ
を照射し、完全培地上に塗布し、７０℃で培養してコロ
ニーを形成させた。これらのコロニのうち８２１７個の
コロニーを、硫酸アンモニウムを唯一のＮ源とする最小
培地及びプロリンを唯一のＮ源とする最小培地にレプリ
カし、前者では生育可能であるが、後者では生育できな
いプロリン資化能欠損株を７株分離した。

【００６０】上記のプロリン資化能欠損株について、プ
ロリンを菌体外に生産しているか否かを、次のようにし
て調べた。サーマス・サーモフィルスのプロリン要求株
TH104株を最小培地上に塗布しておき、この培地上に一
晩液体培養した各プロリン資化能欠損株の培養液をスポ
ットし、７０℃で約２日間培養した。その結果、一株
（TH4017株）の周囲だけに、プロリン要求株の生育が認
められた。このことから、TH4017株はプロリンを菌体外
に生産していることが明らかとなった。なお、TH4017株
は、サーマス・サーモフィルス AJ13343と命名され、１
９９７年７月２日に、通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１６３００が付与されている。

【００６１】

【発明の効果】プロリンによるフィードバック阻害が解
除されたγ−グルタミルキナーゼを保持するサーマス属
細菌及びプロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌
は、サーマス属に属するプロリン生産菌の育種の材料と
して利用することができる。

【００６２】また、プロリンによるフィードバック阻害
が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持し、かつ、
プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌は、プロリ
ンの生産に用いることができる。

【００６３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3632 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サーマス サーモフィルス 株名：ＨＢ２７ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：368..1498 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GATCGTGCAC ATGCTCCTCA AGAACCACCC CCGGGTCACC ACGGAAAGCC AAGGGGAGGG 60 AGAGGAGCGG CACGTGGTGG TCTACCCCAG GCGCGAGGCC CAAGGCTGAG GGCCCGAGGC 120 CATGCCGGAG GCCCCGGGGG ATACGCCGCT CGCCCTGGAC CTGCTCCGCC GCCTGAGGCG 180 GGCCCTCGGC GCCGCCGGGC TTCCCGAGCT CGAGGCCTGG GACCTCCTCG CCGCGGCCAC 240 GGGCTGGCCC CGAAAGGCCC TATATGGCCG CCTCACCTCC CCCCTGCCCC AAGAGGCCCT 300 TGACCGGGCC GAGGCGCTCC TCAAGCGGCG CCTCCAGGGC TACCCCCTCC AGTACCTGGT 360 GGGGGAG GTG GAG TTC TTC GGC CTG CCC CTG CGG GTG GAG GAA GGG GTC 409 Val Glu Phe Phe Gly Leu Pro Leu Arg Val Glu Glu Gly Val 1 5 10 CTC ATC CCC CGC CCC GAA ACG GAA GGG CTG GTG GAG CTC GCC CTA GGC 457 Leu Ile Pro Arg Pro Glu Thr Glu Gly Leu Val Glu Leu Ala Leu Gly 15 20 25 30 CTC CCC CTG CCC CCC GCC CCC CGG ATC GCC CGC CAG GTG GCC GCC CTG 505 Leu Pro Leu Pro Pro Ala Pro Arg Ile Ala Arg Gln Val Ala Ala Leu 35 40 45 AGG GAG GAA GGC CGG GAG GTG GTC CTC GTC TCC TCG GGG GCG GTG GCG 553 Arg Glu Glu Gly Arg Glu Val Val Leu Val Ser Ser Gly Ala Val Ala 50 55 60 GCG GGA ATG CGA CGG CTC GGG CTA AAG GAG CGC CCC AAG GAC ATG CCC 601 Ala Gly Met Arg Arg Leu Gly Leu Lys Glu Arg Pro Lys Asp Met Pro 65 70 75 AAG AAG CAG GCC CTC GCC GCC CTC GGC CAG CCC CTC CTC ATG GCC TTC 649 Lys Lys Gln Ala Leu Ala Ala Leu Gly Gln Pro Leu Leu Met Ala Phe 80 85 90 TGG CAA GAG GCC TTT GCC CCC TTC GGC CTT CCC GTG GCC CAG GTC CTC 697 Trp Gln Glu Ala Phe Ala Pro Phe Gly Leu Pro Val Ala Gln Val Leu 95 100 105 110 CTC ACC GCC GAG GAC CTC TCC TCC AGG AGC CGC TAC CTG AAC GCC AAG 745 Leu Thr Ala Glu Asp Leu Ser Ser Arg Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Lys 115 120 125 GCC ACC TTG CGG GCT CTT CTG GAC CTG GGG GCC ATA CCC GTG ATC AAC 793 Ala Thr Leu Arg Ala Leu Leu Asp Leu Gly Ala Ile Pro Val Ile Asn 130 135 140 GAA AAC GAC ACC GTG GCC TTT GAG GAG ATC CGC TTT GGG GAC AAC GAC 841 Glu Asn Asp Thr Val Ala Phe Glu Glu Ile Arg Phe Gly Asp Asn Asp 145 150 155 CAG CTC TCC GCC CGG GTG GCG GCC CTG GTG GAG GCG GGC CTC CTC GCC 889 Gln Leu Ser Ala Arg Val Ala Ala Leu Val Glu Ala Gly Leu Leu Ala 160 165 170 CTC CTC TCC GAT GTG GAC GCC CTC TAC GAG GAG GAC CCC AAG AAA AAC 937 Leu Leu Ser Asp Val Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Pro Lys Lys Asn 175 180 185 190 CCC CAG GCC CGC CCC ATC CCC GAG GTG GAG TCC GTG GAG GCG GTT TTG 985 Pro Gln Ala Arg Pro Ile Pro Glu Val Glu Ser Val Glu Ala Val Leu 195 200 205 GCC CAC GCC GGG GAG GAA AAC CCG CTA GGA AGC GGG GGG ATG AAG AGC 1033 Ala His Ala Gly Glu Glu Asn Pro Leu Gly Ser Gly Gly Met Lys Ser 210 215 220 AAG CTC CTC GCC GCC CGC ATC GCC GGT AGG GTG GGG ATC CCC ACC CTG 1081 Lys Leu Leu Ala Ala Arg Ile Ala Gly Arg Val Gly Ile Pro Thr Leu 225 230 235 CTT CTC CCC GGG AAG CGG CCA GGG GTC CTC CTC CAA GCC CTC TCC GGG 1129 Leu Leu Pro Gly Lys Arg Pro Gly Val Leu Leu Gln Ala Leu Ser Gly 240 245 250 GCC CCC CTG GGC ACC TAC TTC CAC GCG CGG CGG CGC TAC CGG GGG GAA 1177 Ala Pro Leu Gly Thr Tyr Phe His Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Gly Glu 255 260 265 270 AAG GCC TGG CTT TTT GGC CTC CTC CGC CCC AAG GGG GAG CTC GTC CTG 1225 Lys Ala Trp Leu Phe Gly Leu Leu Arg Pro Lys Gly Glu Leu Val Leu 275 280 285 GAC CGG GGG GCG GTG CGG GCC TTA AAG GAG CGG GGA GCA AGC CTG CTT 1273 Asp Arg Gly Ala Val Arg Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Leu 290 295 300 CCC GCC GGG GTT AAG GAG GTG CGG GGG AGG TTC TCC CGG GGC GAG GCG 1321 Pro Ala Gly Val Lys Glu Val Arg Gly Arg Phe Ser Arg Gly Glu Ala 305 310 315 GTC CGC CTC CTC TCG GAG GAG GGC GAG GAG GTG GGG GTG GGG CTC GCC 1369 Val Arg Leu Leu Ser Glu Glu Gly Glu Glu Val Gly Val Gly Leu Ala 320 325 330 AAC TAC GCC TCG GAG GAG ATC GCC CGC ATC AAG GGG CGG CGG AGC GCG 1417 Asn Tyr Ala Ser Glu Glu Ile Ala Arg Ile Lys Gly Arg Arg Ser Ala 335 340 345 350 GAG ATT GAG GCC GTC CTG GGC TAC CGC TAC ACC GAG GAG GTG GTC CAC 1465 Glu Ile Glu Ala Val Leu Gly Tyr Arg Tyr Thr Glu Glu Val Val His 355 360 365 CGG GAC CAC CTC GCC TTG AAG GAG GAG GCA TGACGGCAAC AAGCCTTTGG 1515 Arg Asp His Leu Ala Leu Lys Glu Glu Ala 370 375 GAACTGGCGG AGCGCGCGCG CAAGAGGCTT TCCGAGATCG CGAAGGGGAA CCGGGACCGG 1575 GCCCTTCTCG CCATGGCGGA CCTCCTCGAG GCCCGCTGGG AAGAGGTCCT GAGGGCCAAC 1635 CGGGAAGACC TGGAGGAGGC GGAAAGAACG GGGCTTCCCA AGGCCAAGCT GGACCGGCTG 1695 GCCCTAAAGG AGAAGGACCT CAAGACCCTC ACGGAGGGCC TGAGGCAGAT CGCCCGCCTC 1755 CCCGACCCCC TGGGGCGGAT AGAGGGCCTG GCCAAGCGGC CGAACGGCCT GAGGGTGGGC 1815 AGGATGCGGG TGCCCCTGGG CCTCATTGGC TTCATCTACG AGGCGAGGCC CGGGGCCACG 1875 GTGGAGGCGG TCTCCGTGGC CCTGAAGGCA GGGAACGCCA TGCTCCTCAG GGGGGGAAAG 1935 GAGGCCTTCC GCTCCAACCG GGCCCTGGTG GCCCTCTGGC ACGAGGCCCT GGAAGAGGCG 1995 GGCCTTCCCG AGGAGGCGGT CACCCTCGTC CCCACCACCG ACCGGGAGGC CGTCTTGGAG 2055 ATGTGCCGCC TGGAGCTTTT GGACCTCCTC ATCCCGAGGG GGGGAGAGGA GCTCATAAGG 2115 CTCGTGCAAC AGGAGGCCCG GGTTCCCGTC CTCGCCCACG CCAAGGGGGT GAACCACCTC 2175 TACGTGGACG AGAAGGCGGA CCTCTCCATG GCCCTCCGCC TCGCCCTAAA CGGCAAGACC 2235 CAGCGCCCCG CGGTGTGCAA CGCCCTCGAG GCCGTCCTGG TGCACGAGAA GGTGGCGGAG 2295 GCCTTCCTCC CCAGGCTGGA AAAGGCCATG CGGGAAAAAG GGGTGGAGCT CAGGGCCTGC 2355 CCTCGGGCCC TTCCCCTCCT CAAAGAGGCG GTCCCCGCCC GGGAGGACGA GTGGGACCGG 2415 GAGTACCTGG ACCTCGTCCT CAGGGTCAAG GTGGTCTCGG GGCTGGAAGA GGCCCTCGCC 2475 CACATCGCCC GCTACGGCTC CCGCCACACC GAGGCCATCT GCACCGAGGA CCCCAAGGCG 2535 GCTTGGCGCT TCCTGGAGGA GGTGGACGCG AGCCTGGTCC TCTGGAACGC CTCCACCCGC 2595 TTCAACGACG GGTTTGAGCT GGGGCTTGGG GCGGAGATCG GCATCAGCAC CTCCAAGCTC 2655 CACCCTACGG CCCCATGGGG CCCCTGGAGC TCACCACCCT CAAGTGGGTG GCCCTGGGGG 2715 AGGGGCAGGA GCGCACGTGA GGCCGGAAGA CCCCGTGGCC CGGGCCTGGG CCCTCATGGA 2775 GGAAGGTCGC TTCAAGGAAG TGGAAGCCCT CCTCCAGGGG GAACCTTCGC CTGAGGCCCG 2835 CTTCGCCCTG GGGTACGCCC TCGCCTTCCA GGGAAGGCAT GCGGAGGCCC TGGCCCTCTA 2895 CCGGGGGCTC TACGAGGAGA CGGGAAGCCA CCGGGCCGTC CACCAGGTGG GGATGGTCCT 2955 CCGCATGGCG GGCAGGCTGG AGGAGGCCCT GGCCGTCTTT GAAGAGGAGG CCCGCCTCCT 3015 TCCCCCTGAC CCCCTGGCCC GCTCCACCAA CCTCTACGAG AGGGGCTACA CCTGGCTCCT 3075 CCTCGGGGAA GAGGAGGCGA GCCTGGCCTT TCTTCAGGCA AGCCTGACCG AGGCGGAGGC 3135 TTCCTCTGAC CCCCTGGCCC AAGCCTGTGC CCACCGGGGG CTTTTGGAAT GGCACCTCCG 3195 CTTCGGTCTA ACGGAGGAGG CCCAAAGGCA CAAGGAGGCC GCCATCCGCC TCTTCCTGGA 3255 GGCGGGGGAC CGCAAGGGTG CGGAAGAGGT GGAAGGCCTT GCTTAGGCGT TTCTACCGCC 3315 TCTACCAGGA GGCCCACGTC CCCTTCTTCG CCGCGGCCCT CGCCTACTAC GCCCTCCTCT 3375 CCCTCATGCC CCTCCTCTTC CTCCTGGTGG GCCTCTTCGG CTTCCTCCTC TCGGGAAACC 3435 CCGCCCTGAG GAACGAGGTG TTCCAGGCCC TCACCGAGCT CACCCTGGCC CTCTTCCCCG 3495 CCCGCCCCGA GATGGCCCAA AGCCTCCTAG ACTTCCTCAC CCGGGGCGCC TTCCCCCTGA 3555 CCTTGGGGAG CGGCCTCCTC CTCCTCTGGT CGGGAAGCAA CTTCTTCGCC GCCCTGAGCT 3615 ACGCCCTGGG CCTGATC 3632

【００６４】配列番号：２ 配列の長さ：376 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Val Glu Phe Phe Gly Leu Pro Leu Arg Val Glu Glu Gly Val Leu Ile 1 5 10 15 Pro Arg Pro Glu Thr Glu Gly Leu Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Pro 20 25 30 Leu Pro Pro Ala Pro Arg Ile Ala Arg Gln Val Ala Ala Leu Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Arg Glu Val Val Leu Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly 50 55 60 Met Arg Arg Leu Gly Leu Lys Glu Arg Pro Lys Asp Met Pro Lys Lys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ala Ala Leu Gly Gln Pro Leu Leu Met Ala Phe Trp Gln 85 90 95 Glu Ala Phe Ala Pro Phe Gly Leu Pro Val Ala Gln Val Leu Leu Thr 100 105 110 Ala Glu Asp Leu Ser Ser Arg Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Lys Ala Thr 115 120 125 Leu Arg Ala Leu Leu Asp Leu Gly Ala Ile Pro Val Ile Asn Glu Asn 130 135 140 Asp Thr Val Ala Phe Glu Glu Ile Arg Phe Gly Asp Asn Asp Gln Leu 145 150 155 160 Ser Ala Arg Val Ala Ala Leu Val Glu Ala Gly Leu Leu Ala Leu Leu 165 170 175 Ser Asp Val Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Pro Lys Lys Asn Pro Gln 180 185 190 Ala Arg Pro Ile Pro Glu Val Glu Ser Val Glu Ala Val Leu Ala His 195 200 205 Ala Gly Glu Glu Asn Pro Leu Gly Ser Gly Gly Met Lys Ser Lys Leu 210 215 220 Leu Ala Ala Arg Ile Ala Gly Arg Val Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu 225 230 235 240 Pro Gly Lys Arg Pro Gly Val Leu Leu Gln Ala Leu Ser Gly Ala Pro 245 250 255 Leu Gly Thr Tyr Phe His Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Gly Glu Lys Ala 260 265 270 Trp Leu Phe Gly Leu Leu Arg Pro Lys Gly Glu Leu Val Leu Asp Arg 275 280 285 Gly Ala Val Arg Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Leu Pro Ala 290 295 300 Gly Val Lys Glu Val Arg Gly Arg Phe Ser Arg Gly Glu Ala Val Arg 305 310 315 320 Leu Leu Ser Glu Glu Gly Glu Glu Val Gly Val Gly Leu Ala Asn Tyr 325 330 335 Ala Ser Glu Glu Ile Ala Arg Ile Lys Gly Arg Arg Ser Ala Glu Ile 340 345 350 Glu Ala Val Leu Gly Tyr Arg Tyr Thr Glu Glu Val Val His Arg Asp 355 360 365 His Leu Ala Leu Lys Glu Glu Ala 370 375

【００６５】配列番号：３ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：NO 配列 GGGAATTCCC GAGGCCATGC CGGAGGC 27

【００６６】配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列 GAGGTTCTCG GCGGTGAGGA GGAC 24

【００６７】配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列 CTTGACGTTC AGGTAGCGGC TCCT 24

【００６８】配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：NO 配列 GTCCTCCTCA CCGCCGAGAA CCTC 24

【００６９】配列番号：７ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列 GAAGCTTTCA TGCCTCCTCC TTCAAGGC 28

【００７０】配列番号：８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：NO 配列 AGGAGCCGCT ACCTGAACGT CAAG 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌、セラチア・マルセッセンス、及びサ
ーマス・サーモフィルスのγ−グルタミルキナーゼの部
分アミノ酸配列の比較を示す図。矢印は、公知のプロリ
ンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミ
ルキナーゼの変異を示す。また、配列の左端及び右端に
添付されている数字は、各酵素のＮ末端からのアミノ酸
番号を示す。

【図２】 実施例１においてＰＣＲ法によりγ−グルタ
ミルキナーゼ遺伝子に変異を導入する工程を示す図。
Ｄ、Ｎ、Ａ及びＶは、それぞれＡｓｐ残基、Ａｓｎ残
基、Ａｌａ残基及びＶａｌ残基を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害
   が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持するサーマ
   ス属細菌。
2. 【請求項２】 Ｌ−プロリン分解系が破壊されたサーマ
   ス属細菌。
3. 【請求項３】 Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害
   が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持し、かつ、
   Ｌ−プロリン分解系が破壊されたサーマス属細菌。
4. 【請求項４】 Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害
   が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮ
   Ａが細胞内に導入されたことにより、Ｌ−プロリンによ
   るフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナ
   ーゼを保持することを特徴とする請求項１〜３のいずれ
   か一項に記載のサーマス属細菌。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のサ
   ーマス属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−プロリ
   ンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−プロリンを採取
   することを特徴とするＬ−プロリンの製造法。
6. 【請求項６】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１２
   ５番目のＡｌａ残基がＡｌａ残基以外のアミノ酸残基に
   変化したアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−プロリンによ
   るフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナ
   ーゼ活性を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１２
   ５番目のＡｌａ残基がＡｌａ残基以外のアミノ酸残基に
   変化したアミノ酸配列を有し、さらに、１２５番目のア
   ミノ酸残基以外の位置における１若しくは数個のアミノ
   酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミ
   ノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−プロリンによるフィードバ
   ック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼ活性を有
   するタンパク質。