JPH1135484A

JPH1135484A - ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤

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Publication number: JPH1135484A
Application number: JP9191635A
Authority: JP
Inventors: Haruo Sugiyama; 治夫杉山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 1999-02-09
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: ATE478686T1; EP1004319A4; DE69841858D1; AU8243198A; US20060105981A1; EP1004319A1; EP1004319B1; US7696180B2; WO1999003506A1; JP4789095B2

Abstract

(57)【要約】【課題】固形腫瘍の新規な治療剤の提供。【解決手段】ウイルス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対する
発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウイルムス腫瘍遺伝
子（ＷＴ１）に対する発現阻害物質を含んで成る、固形
腫瘍治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルムス(Wilms) 腫瘍は、染色体１１
ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両
対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(C
all KMet al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コー
ド上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1
994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすで
に報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与するこ
とが予想される(D.A.Haberら、前掲）。

【０００３】また、本発明者らは、ＷＴ１が白血病細胞
の増殖に関与している（K. Inoue,et al., Blood, 84
(9) 3071-3079 (1994)）ことから、ＷＴ１に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細胞の増殖
を抑制・阻害することを見い出した（ＰＣＴ特許公開Ｗ
Ｏ９６／３８１７６）。しかしながら、ＷＴ１の発現阻
害物質が固形腫瘍の増殖を抑制・阻害することは知られ
ていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ウイ
ルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対する発現阻害
物質を含んで成る固形腫瘍の治療剤を提供するものであ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＷＴ１に対す
る発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤を提供す
る。ここで、固形腫瘍とは、例えば胃癌、大腸癌、肺
癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺
癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等である。本発明で使用
するＷＴ１に対する発現阻害物質は、ＷＴ１の発現を阻
害するものであれば何でもよく、たとえば、ＷＴ１に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、ＷＴ１に
対して dominant negativeに働くＷＴ１変異遺伝子およ
び変異タンパク質、デコイＤＮＡなどの低分子阻害物
質またはＷＴ１に特異的に結合し転写活性を阻害するペ
プチドなどの低分子阻害物質など挙げられる。本発明で
使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例
えば、ＷＴ１の転写キャッピング部位に対するもの、翻
訳開始領域に対するもの、エクソンに対するものまたは
イントロンに対するものなどのＷＴ１に対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド誘導体である。

【０００６】例えばＷＴ１の転写キャッピング部位を含
む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表
わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０の
センスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表
わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ
鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲ
ＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個
の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合す
ることができるものであれば、断続的または部分的に相
補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から
成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。

【０００７】転写キャッピング部位に対するものとして
は、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -
3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-
３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、
翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡ
ＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例
えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配
列番号：６）などが挙げられる。

【０００８】また、ＷＴ１のコード領域には１０個のエ
クソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含
まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続
するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するもの
あるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列
に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コ
ード領域の配列に対するものである。１例として、第６
エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGT
TGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが
挙げられる。さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖
と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発
明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する
領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ
１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリ
ボザイムのようなものも含まれる。

【０００９】本発明において使用されるアンチセンスオ
リゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおり
であるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低
級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのい
ずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ
（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基であ
る。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、
あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基の
ときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンの
いずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮ
Ａ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒ
は独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低
級アルキル基である。ｎは７−２８である。

【００１０】

【化１】

【００１１】好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌ
クレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば
前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型
のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホス
ホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾
体等が挙げられる（化２参照）。

【００１２】

【化２】

【００１３】これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。化
１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例え
ばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成さ
れる。

【００１４】Ｚが水素であるアンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用
いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた
固相合成法などで得ることができる。例えば、 T.Atkin
son, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Prac
tical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (198
4)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.K
ume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49,21
39 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron
Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Reg
berg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibi
d, 27, 4051 (1986)；

【００１５】B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligonucleoti
de Synthesis： A Practical Approach, ed.M.J.Gait,
IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage and M.H.Ca
ruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981)；
M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Let
t., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.H.Caru
thers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)を参照
のこと。

【００１６】Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエ
ステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリ
ゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール
／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ること
ができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res.,
17, 4769-4782 (1989)) 。Ｘがアルキル基であるアルキ
ルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイ
トを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Te
trahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Ri
ftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。

【００１７】ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体
は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stei
n, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (198
8)) あるいはテトラエチルチウラムジスルフィドを用
いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and
B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008
(1991)) 。Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエ
ート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイト
に変換しイオウを作用させることにより固相合成法によ
り得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Che
m.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。

【００１８】Ｘが一級アミンあるいは二級アミンである
ホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホ
スホネートを一級あるいは二級アミンで処理することに
より固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.a
l. Nucleic Acids Res., 16,4831-4839 (1988))。ある
いは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキ
サイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.a
l., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。

【００１９】Ｚが水酸基であるアンチセンスオリゴリボ
ヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシ
リボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水
酸基があるためその保護を行わなければならない点でき
わめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適
宜選択することによって合成することができる（微生物
学基礎講座８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共
著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、
共立出版株式会社発行参照）。

【００２０】精製および純度確認は、高速液体クロマト
グラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うこ
とができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionizati
on Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mas
s Spectrometryで行うことができる。本発明のＷＴ１に
対する発現阻害物質は、genomic DNA からmatureなmRNA
に至るいかなる段階においても作用し、その発現を抑制
することによって固形腫瘍細胞の増殖を阻害すると考え
られる。従って、本願発明の発現阻害物質は固形腫瘍の
治療のために有効であると期待される。

【００２１】本発明の発現阻害物質は、それらに対して
不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤などの
外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形
剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化
剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソ
ームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍
結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調
製することができる。

【００２２】本発明の発現阻害物質は患者の患部に直接
適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に
患部に到達し得るように患者に適応させる。さらに持続
性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いるこ
ともできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、
リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれら
の誘導体が挙げられる。

【００２３】本発明の発現阻害物質の投与量は、患者の
状態、年齢、性別、体重などに応じて適宜調整し好まし
い量を用いることができる。また、その投与方法は、患
者の状態、薬剤形態などに応じ、経口投与、筋肉内投
与、腹腔内投与、胸腔内投与、髄腔内投与、腫瘍内投
与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直
腸投与などの種々の投与方法から適宜好ましい方法を用
いることができる。以下本発明を実施例において詳しく
説明する。

【００２４】

【実施例】合成例１．以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオ
チド（配列番号：１〜８）およびランダム配列（Ｒａｎ
ｄ）を、自動合成装置（Applied Biosystems) を用いて
合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、エ
タノール沈澱を３回行い、そしてリン酸緩衝液に懸濁し
た。合成したオリゴヌクレオチドは次の通りである。な
お、ランダム配列（Ｒａｎｄ）は、塩基１８個の配列で
理論上４の１８乗種類の配列の混合物となっている。

【００２５】配列番号：１転写キャッピング部位のセ
ンス配列（ＳＥ１）配列番号：２転写キャッピング部位のアンチセンス配
列（ＡＳ１）配列番号：３転写キャッピング部位のセンス配列配列番号：４転写キャッピング部位のアンチセンス配
列配列番号：５翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ２）配列番号：６翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ
２）配列番号：７エクソン６のセンス配列配列番号：８エクソン６のアンチセンス配列

【００２６】実施例１．ＷＴ１発現陽性の胃癌ＡＺ５２
１株の細胞を５×１０⁴ 個／ml、１００μｌ／ウエルの
量で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種し
た。オリゴヌクレオチドＡＳ１又は対照ＳＥ１もしくは
ｒａｎｄを、３連のウエルに、最終濃度が１００μｇ／
mlとなるように添加した。２時間のインキュベーション
の後、各ウエルに最終濃度が１０％となるようにＦＣＳ
を添加した。２４時間毎に、前記の量の半分のオリゴヌ
クレオチドを培養物に添加した。

【００２７】９６時間培養した後、色素排除法により生
存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを
含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照
培養物の細胞数を１００％とした。この結果を図１に示
す。この図から明らかな通り、本発明のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドＡＳ１は、対応するセンスオリゴヌク
レオチドＳＥ１に比べて強く細胞の増殖を阻害した。

【００２８】実施例２．実施例１と同様の実験を行った
が、オリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、又はｒ
ａｎｄを２００μｇ／ml濃度で添加した。図２から明ら
かな通り、ランダム配列（ｒａｎｄ）は胃癌細胞の増殖
をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌク
レオチドＡＳ１及びＡＳ２は胃癌細胞の増殖を阻害し
た。

【００２９】実施例３．実施例１と同様の実験を行った
が、オリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、又はｒ
ａｎｄを４００μｇ／mlの濃度で添加した。図３から明
らかな通り、ランダム配列（ｒａｎｄ）に比べて、本発
明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１又はＡＳ２
は胃癌細胞の増殖を阻害した。なお、実施例１〜３の結
果から明らかなごとく本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチドの胃癌細胞増殖阻害効果は濃度依存的であっ
た。

【００３０】実施例４．実施例１と同様の実験を行った
が、固形腫瘍細胞として肺癌ＯＳ３株の細胞を用い、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、
又は対照ランダム配列（ｒａｎｄ）を２００μｇ／mlの
量で用いた。図４から明らかな通り、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドＡＳ１及びＡＳ２は対照ランダ
ム配列（ｒａｎｄ）に比べて強い肺癌細胞増殖阻害効果
を示した。

【００３１】実施例５．実施例５と同様の実験を行った
が、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１を４００μ
ｇ／ml、又は対照としてＳＥ１もしくはｒａｎｄを４０
０μｇ／ml使用した。図５から明らかな通り、本発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１はその他の対照
オリゴヌクレオチドに比べて、肺癌細胞増殖阻害効果を
示した。なお、実施例４及び５の比較から、本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの肺癌細胞増殖阻害効果
が濃度依存的であることが明らかである。

【００３２】実施例６．実施例１と同様の実験を行った
が、固形腫瘍細胞として、卵巣癌ＴＹＫｎｕ株の細胞を
用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１を４００
μｇ／ml、又は対照オリゴヌクレオチドＳＥ１もしくは
ｒａｎｄを４００μｇ／ml用いた。図６から明らかな通
り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１
は、その他の対照オリゴヌクレオチドに比べて顕著な卵
巣癌細胞増殖阻害効果を示した。

【００３３】参考例１実施例と同様の実験を行ったが、被験細胞として、ＷＴ
１発現陰性の肺アデノカルシノーマ細胞系ＷＴＡＳＰ
Ｃ１４を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１
もしくはＡＳ２を４００μｇ／ml又は対照オリゴヌクレ
オチドｒａｎｄを４００μｇ／ml用いた。図７から明ら
かな通り、ＷＴ１発現陰性の細胞に対しては、本発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドは有意な増殖阻害効果
を示さなかった。

【００３４】実施例７．表２記載の各種の腫瘍細胞株か
らＲＮＡを抽出し、下記のＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＷＴ
１ｍＲＮＡの発現量を定量した。表２に白血病細胞株Ｋ
５６２におけるＷＴ１の発現量を１．０として各種腫瘍
細胞株でのＷＴ１の発現量を相対的に示した。各細胞株
より通常の方法〔例えば acid-guanidine-phenol-chlor
oform method：Anal. Biochem., 162, 156 (1987)〕に
従い総ＲＮＡを抽出し、ジエチルピロカーボネート処理
水に溶解して、吸光度２６０nmにて光学的に定量化し
た。

【００３５】１μｇの総ＲＮＡを含むジエチルピロカー
ボネート処理水１５．５μｌを、６５℃で５分間加熱
し、６００Ｕの逆転写酵素（Moloney murine leukemia
virusreverse transcriptase ：GIBCO-BRL ）、５００m
mol／１の各デオキシヌクレオチドトリフォスフェート
（dNTP：Pharmacia)、７５０ngのオリゴｄＴプライマー
及び４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Boehringer Mannheim
）を含むＲＴ緩衝液（５０mmol／１トリスＨＣｌ（pH
８．３）；７０mmol／１ＫＣｌ；３mmol／１ＭｇＣ
ｌ₂；１０mmol／１ジチオスレイトール）の１４．５μ
ｌと混合した。

【００３６】混合物を３７℃で９０分間インキュベート
し、７０℃で２０分間加熱後、使用時まで−２０℃にて
保存した。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perk
in Elmer-Cetus）にて、９４℃、１分の変性、６４℃、
１分（βアクチン：６０℃、１分）のプライマーアニー
リング（annealing ）及び、７２℃、２分の鎖延長（ch
ain elongation）の条件で繰り返しサイクルを行ない、
ＰＣＲ産物（第１ラウンドＰＣＲ）を得た。該ＰＣＲ産
物のデンシトメーター単位（後記）が５００未満の場合
には、第１ラウンドＰＣＲ産物の２．５μｌを含む反応
液にて、ネステッド内方プライマーによる第２ラウンド
ＰＣＲを行なった。

【００３７】得られたＰＣＲ産物を、文献〔J. Immuno
l., 147, 4307, (1991)〕記載の方法に準じて以下の通
り定量した。即ち、２０ngの総ＲＮＡからのＰＣＲ産物
を、０．０５μｇ／mlのエチジュームブロマイドを含む
１．３％アガロースゲルに分離し、ポラロイドフィルム
（Polaroid 665 film, Polaroid Corp. ）にて撮影し
た。ネガフィルムを、２５℃、５分間にて現像し、デン
シトメーター（CS-9000 ：島津）にて検定して「デンシ
トメーター単位」として得た。尚、上記においてＲＮＡ
不含の場合のＰＣＲ産物を用いた結果を陰性コントロー
ルとした。また、上記において使用したプライマーは表
１に示す通りである。

【００３８】

【表１】

【００３９】尚、内部コントロールとしたβアクチンの
プライマーとしては、文献〔Proc.Natl. Acad. Sci. US
A., 82, 6133, (1985)〕に記載のものを使用した。こ
れら各プライマーは全て常法に従い化学合成した。ＲＴ
−ＰＣＲへのＲＮＡ使用量と各サンプルにおけるＲＮＡ
分解の相違を標準化するために、ＷＴ１遺伝子の結果
（デンシトメーター単位）をβアクチンのそれで除し、
これをＷＴ１遺伝子発現レベルとした。結果を表２に示
す。

【００４０】

【表２】

【００４１】上記の結果、種々の固形腫瘍由来の培養株
においてＷＴ１遺伝子が発現していることが確認され
た。以上の通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは固形腫瘍細胞の増殖の阻害のために有効であり、
従って新規な固形腫瘍治療剤として期待される。

【００４２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CCCACCGCAT TCGACCCT 18

【００４３】配列番号：２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGGGTCGAAT GCGGTGGG 18

【００４４】配列番号：３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CCGGCCCCTC TTATTTGA 18

【００４５】配列番号：４配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TCAAATAAGA GGGGCCGG 18

【００４６】配列番号：５配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CAGCAAATGG GCTCCGAC 18

【００４７】配列番号：６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GTCGGAGCCC ATTTGCTG 18

【００４８】配列番号：７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGCGATAACC ACACAACG 18

【００４９】配列番号：８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CGTTGTGTGG TTATCGCT 18

【００５０】配列番号：９配列の長さ：１２７２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGGTATCCTC GACCAGGGCC ACAGGCAGTG CTCGGCGGAG TGGCTCCAGG AGTTACCCGC 60 TCCCTGCCGG GCTTCGTATC CAAACCCTCC CCTTCACCCC TCCTCCCCAA ACTGGGCGCC 120 AGGATGCTCC GGCCGGAATA TACGCAGGCT TTGGGCGTTT GCCAAGGGTT TTCTTCCCTC 180 CTAAACTAGC CGCTGTTTTC CCGGCTTAAC CGTAGAAGAA TTAGATATTC CTCACTGGAA 240 AGGGAAACTA AGTGCTGCTG ACTCCAATTT TAGGTAGGCG GCAACCGCCT TCCGCCTGGC 300 GCAAACCTCA CCAAGTAAAC AACTACTAGC CGATCGAAAT ACGCCCGGCT TATAACTGGT 360 GCAACTCCCG GCCACCCAAC TGAGGGACGT TCGCTTTCAG TCCCGACCTC TGGAACCCAC 420 AAAGGGCCAC CTCTTTCCCC AGTGACCCCA AGATCATGGC CACTCCCCTA CCCGACAGTT 480 CTAGAGCAAG AGCCAGACTC AAGGGTGCAA AGCAAGGGTA TACGCTTCTT TGAAGCTTGA 540 CTGAGTTCTT TCTGCGCTTT CCTGAAGTTC CCGCCCTCTT GGAGCCTACC TGCCCCTCCC 600 TCCAAACCAC TCTTTTAGAT TAACAACCCC ATCTCTACTC CCACCGCATT CGACCCTGCC 660 CGGACTCACT GCTACTGAAC GGACTCTCCA GTGAGACGAG GCTCCCACAC TGGCGAAGGC 720 AAGAAGGGGA GGTGGGGGGA GGGTTGTGCC ACACCGGCCA GCTGAGAGCG CGTGTTGGGT 780 TGAAGAGGAG GGTGTCTCCG AGAGGGACGC TCCCTCGGAC CCGCCCTCAC CCCAGCTGCG 840 AGGGCGCCCC CAAGGAGCAG CGCGCGCTGC CTGGCCGGGC TTGGGCTGCT GAGTGAATGG 900 AGCGGCCGAG CCTCCTGGCT CCTCCTCTTC CCCGCGCCGC CGGCCCCTCT TATTTGAGCT 960 TTGGGAAGCT GAGGGCAGCC AGGCAGCTGG GGTAAGGAGT TCAAGGCAGC GCCCACACCC 1020 GGGGGCTCTC CGCAACCCGA CCGCCTGTCG CTCCCCCACT TCCCGCCCTC CCTCCCACCT 1080 ACTCATTCAC CCACCCACCC ACCCAGAGCC GGGACGGCAG CCCAGGCGCC CGGGCCCCGC 1140 CGTCTCCTCG CCGCGATCCT GGACTTCCTC TTGCTGCAGG ACCCGGCTTC CACGTGTGTC 1200 CCGGAGCCGG CGTCTCAGCA CACGCTCCGC TCCGGGCCTG GGTGCCTACA GCAGCCAGAG 1260 CAGCAGGGAG TC 1272

【００５１】配列番号：１０配列の長さ：４５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン１の一部分配列 TCTGAGCCTC AGCAAATGGG CTCCGACGTG CGGGACCTGA ACGCGCTGCT GCCCGCCGTC 60 CCCTCCCTGG GTGGCGGCGG CGGCTGTGCC CTGCCTGTGA GCGGCGCGGC GCAGTGGGCG 120 CCGGTGCTGG ACTTTGCGCC CCCGGGCGCT TCGGCTTACG GGTCGTTGGG CGGCCCCGCG 180 CCGCCACCGG CTCCGCCGCC ACCCCCGCCG CCGCCGCCTC ACTCCTTCAT CAAACAGGAG 240 CCGAGCTGGG GCGGCGCGGA GCCGCACGAG GAGCAGTGCC TGAGCGCCTT CACTGTCCAC 300 TTTTCCGGCC AGTTCACTGG CACAGCCGGA GCCTGTCGCT ACGGGCCCTT CGGTCCTCCT 360 CCGCCCAGCC AGGCGTCATC CGGCCAGGCC AGGATGTTTC CTAACGCGCC CTACCTGCCC 420 AGCTGCCTCG AGAGCCAGCC CGCTATTCGC AATCAGG 457

【００５２】配列番号：１１配列の長さ：１２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン２配列 GTTACAGCAC GGTCACCTTC GACGGGACGC CCAGCTACGG TCACACGCCC TCGCACCATG 60 CGGCGCAGTT CCCCAACCAC TCATTCAAGC ATGAGGATCC CATGGGCCAG CAGGGCTCGC 120 TGG 123

【００５３】配列番号：１２配列の長さ：１０３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン３配列 GTGAGCAGCA GTACTCGGTG CCGCCCCCGG TCTATGGCTG CCACACCCCC ACCGACAGCT 60 GCACCGGCAG CCAGGCTTTG CTGCTGAGGA CGCCCTACAG CAG 103

【００５４】配列番号：１３配列の長さ：７８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン４配列 TGACAATTTA TACCAAATGA CATCCCAGCT TGAATGCATG ACCTGGAATC AGATGAACTT 60 AGGAGCCACC TTAAAGGG 78

【００５５】配列番号：１４配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン５配列 AGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A 51

【００５６】配列番号：１５配列の長さ：９７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン６配列 CCACAGCACA GGGTACGAGA GCGATAACCA CACAACGCCC ATCCTCTGCG GAGCCCAATA 60 CAGAATACAC ACGCACGGTG TCTTCAGAGG CATTCAG 97

【００５７】配列番号：１６配列の長さ：１５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン７配列 GATGTGCGAC GTGTGCCTGG AGTAGCCCCG ACTCTTGTAC GGTCGGCATC TGAGACCAGT 60 GAGAAACGCC CCTTCATGTG TGCTTACCCA GGCTGCAATA AGAGATATTT TAAGCTGTCC 120 CACTTACAGA TGCACAGCAG GAAGCACACT G 151

【００５８】配列番号：１７配列の長さ：９０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン８配列 GTGAGAAACC ATACCAGTGT GACTTCAAGG ACTGTGAACG AAGGTTTTCT CGTTCAGACC 60 AGCTCAAAAG ACACCAAAGG AGACATACAG 90

【００５９】配列番号：１８配列の長さ：９３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン９配列 GTGTGAAACC ATTCCAGTGT AAAACTTGTC AGCGAAAGTT CTCCCGGTCC GACCACCTGA 60 AGACCCACAC CAGGACTCAT ACAGGTAAAA CAA 93

【００６０】配列番号：１９配列の長さ：１５８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン１０の一部分配列 GTGAAAAGCC CTTCAGCTGT CGGTGGCCAA GTTGTCAGAA AAAGTTTGCC CGGTCAGATG 60 AATTAGTCCG CCATCACAAC ATGCATCAGA GAAACATGAC CAAACTCCAG CTGGCGCTTT 120 GAGGGGTCTC CCTCGGGGAC CGTTCAGTGT CCCAGGCA 158

【００６１】配列番号：２０配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGCATCTGAG ACCAGTGAGA A 21

【００６２】配列番号：２１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAGAGTCAGA CTTGAAAGCA GT 22

【００６３】配列番号：２２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCTGTCCCAC TTACAGATGC A 21

【００６４】配列番号：２３配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TCAAAGCGCC AGCTGGAGTT T 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対す
る１００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示
すグラフである。

【図２】図２は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対す
る２００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示
すグラフである。

【図３】図３は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対す
る４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示
すグラフである。

【図４】図４は、肺癌ＯＳ３株の細胞の増殖に対する２
００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグ
ラフである。

【図５】図５は、肺癌ＯＳ３株の細胞の増殖に対する４
００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグ
ラフである。

【図６】図６は、卵巣癌ＴＹＫｎｕ株の細胞の増殖に対
する４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を
示すグラフである。

【図７】図７は、ＷＴ１発現陰性の肺アデノカルシノー
マ細胞系、ＷＴＡＳＰＣ１４の細胞の増殖に対する４
００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対す
る発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤。
【請求項２】前記発現阻害物質がアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド誘導体である請求項１に記載の固形腫瘍治
療剤。
【請求項３】前記発現阻害物質がＷＴ１変異遺伝子で
ある請求項１に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項４】前記発現阻害物質がＷＴ１変異タンパク
質である請求項１に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項５】前記発現阻害物質が低分子物質である請
求項１に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項６】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体がウイルムス腫瘍遺伝子の転写キャッピング部位の
連続する少なくとも９個のヌクレオチドに対するアンチ
センスオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の固
形腫瘍治療剤。
【請求項７】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG-３′（配列番号：２）又は５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-３′（配列番号：４）を有する、請求項６に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項８】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、ウイルムス腫瘍遺伝子の翻訳開始領域の連続す
る少なくとも９個のヌクレオチドに対するアンチセンス
オリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の固形腫瘍
治療剤。
【請求項９】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド
が、次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６）を有する、請求項８に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項１０】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体が、ウイルムス腫瘍遺伝子のエクソン中の連続す
る少なくとも９個のヌクレオチドに対応するアンチセン
スオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の固形腫
瘍治療剤。
【請求項１１】前記エクソンが第６エクソンである、
請求項１０に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項１２】前記アンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体が、次の塩基配列：５′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）を有する、請求項１１に記載の固形腫瘍治療剤。
【請求項１３】前記固形腫瘍が胃癌、大腸癌、肺癌、
乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子
宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌である、請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載の固形腫瘍治療剤。