JPH1135603A - 新規ヘパリン、ヘパリン結合担体及びフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法 - Google Patents

新規ヘパリン、ヘパリン結合担体及びフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法

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JPH1135603A
JPH1135603A JP21271497A JP21271497A JPH1135603A JP H1135603 A JPH1135603 A JP H1135603A JP 21271497 A JP21271497 A JP 21271497A JP 21271497 A JP21271497 A JP 21271497A JP H1135603 A JPH1135603 A JP H1135603A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 特定のヘパリン結合担体を用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィーで極めて簡便な手法によりフル
クトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼを分離・精
製する方法を提供し、更にその為の該酵素にたいする親
和性を有する特定構造のヘパリン及びヘパリン結合担体
を提供するものである。 【解決手段】本発明の要旨は、ヘパリン骨格中のグルコ
サミン残基の５０％以上が６−Ｏ−硫酸基を有し、且つ
Ｎ−硫酸基を有する該残基は多くても１０％であるヘパ
リンが担体に結合しているヘパリン結合担体、該ヘパリ
ン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー
によりフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ
酵素の含有物から、当該酵素を分離する方法、並びにヘ
パリン骨格中のグルコサミン残基の５０％以上が６−Ｏ
−硫酸基を有し、且つＮ−硫酸基を有する該残基は多く
ても１０％である当該酵素に対する親和性を有するヘパ
リンに存する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパリンが結合し
た担体及び該ヘパリン結合担体を使用したアフィニティ
ークロマトグラフィーにより、フルクトース−１，６−
ビスリン酸アルドラーゼの含有物から当該酵素を分離す
る方法に関するものであり、さらに、当該酵素に特異的
な親和性を有するヘパリンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリンは、ウロン酸残基とグルコサミ
ン残基から成る二糖単位の連なったヘパリン骨格を有
し、そのウロン酸残基の２位水酸基並びにグルコサミン
残基の２位アミノ基及び６位水酸基が様々な程度に硫酸
化されているグリコサミノグリカンの一種である。この
物質は一般にアンチトロンビンIII結合部位を有し（FEB
SLett.(1980)117, 203-206）、ATIIIとの結合の結果と
してトロンビン活性を阻害して抗凝固活性を発現するた
め、古くから透析治療薬等の成果を向上させるための医
薬品として盛んに用いられてきた。また、ヘパリンがリ
ポプロテインリパーゼと相互作用すること（J. Biol. C
hem.(1981)256, 12893-12898）、塩基性繊維芽細胞増殖
因子と親和性を有すること（J. Cell Biol.(1990)111,
1651-1659）など、様々な生理活性因子と相互作用する
ことが明らかになってきた。
【０００３】上記のようにヘパリンは様々な物質と親和
性を有することから、ヘパリンと生理活性物質の結合に
関与する構造の解明が着目されつつあり、またATIII結
合部位に由来する抗凝固作用を低減させた上で、生理活
性因子との相互作用を増強させることを目的として、ヘ
パリンポリマーの脱硫酸化を中心とした化学修飾が盛ん
に行われている（J. Carbohydr.Chem.(1993)12, 507-52
1；Carbohydr. Res.,193, 165-172(1989)；Carbohydr.
Res.46,87-95(1976)；Can. J. Chem.,67, 1449(1989)；
米国特許第5,296,471号）。また、ヘパリンを硫酸化及
び脱硫酸化等の手法を用いて修飾することによりヘパリ
ン誘導体が創作されているが、そのヘパリン誘導体の中
には生理活性物質と親和性を有するものがあるので、生
理活性物質と親和性を有したり、あるいは生理活性物質
の活性を制御し得るヘパリン誘導体の探索が行われてい
る。
【０００４】一方、進行性筋ジストロフィー、急性肝
炎、心筋梗塞、悪性腫瘍の診断上有用な酵素であるフル
クトース−１,６−ビスリン酸アルドラーゼ(EC 4.1.2.1
3)は、これまで筋肉、肝臓、心臓、腎臓、および脳など
から得られた粗抽出物から、硫安沈殿、リン酸セルロー
スカラムクロマトグラフィー、DEAEセルロースカラムク
ロマトグラフィーさらには結晶化法等の手法を複雑に組
み合わせることにより単離・精製されたもの（Methods
Enzymol.(1975)42, 240-249）が供給されてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】フルクトース−１，６
−ビスリン酸アルドラーゼは上述の各種疾患の診断上有
用であり、単離された状態で必要とされているにもかか
わらず、当該酵素を得る手段は複雑なカラムワークが必
須であった。しかし、前記カラムワークによって得られ
る酵素は非常に微量であり、大量の当該酵素を得るため
には簡略化された効率のよい精製方法が必要とされてい
た。本発明は、特定の担体を用いるアフィニティークロ
マトグラフィーによる極めて簡便な手法で当該酵素を分
離・精製する方法を提供し、更にその為の該酵素にたい
する親和性を有する特定構造のヘパリン及びヘパリン結
合担体を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヘパリン
骨格（ウロン酸とグルコサミンの繰り返し構造）を有す
るグリコサミノグリカンが様々な生理活性物質と親和性
を有することに注目し、フルクトース−１，６−ビスリ
ン酸アルドラーゼが特定の構造を有するヘパリンに親和
性が高く、当該ヘパリンが結合した担体を使用するアフ
ィニティクロマトグラフィーにより、上記酵素の含有物
から該酵素のみを高純度に分離・精製することができる
ことを見出し本発明を完成した。すなわち、５０％以上
のグルコサミンの６位の水酸基が硫酸化されたヘパリン
は上記酵素との高い親和性を有しているので、このよう
なヘパリンを結合したヘパリン結合担体を用いて、上記
酵素の含有物から酵素を単離、精製する過程でアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーを行えば前記酵素を効
率的に、且つ高純度で分離・精製し得るのである。そし
て、上記アフィニティ担体に結合するヘパリンとして
は、６位の水酸基が硫酸化されたグルコサミンが５０％
以上で、しかも２位のアミノ基に硫酸基が結合したグル
コサミン残基が多くても１０％であり、更にヘパリン中
のウロン酸残基の５０％以上が２−Ｏ−硫酸基を有しな
いヘパリンが最も効率よく前記酵素を分離・精製するこ
とを可能にするのである。
【０００７】本発明の第１の要旨は、ヘパリン骨格中の
グルコサミン残基の５０％以上が６−Ｏ−硫酸基を有す
るヘパリンが担体に結合しているヘパリン結合担体であ
り、第２の要旨は、フルクトース−１，６−ビスリン酸
アルドラーゼの含有物から、本発明のヘパリン結合担体
を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより当該
酵素を分離する方法であり、第３の要旨は、ヘパリン骨
格中のグルコサミン残基の５０％以上が６−Ｏ−硫酸基
を有し、且つＮ−硫酸基を有する該残基は多くても１０
％であるヘパリンに存する。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳説
する。本発明のヘパリン結合担体は５０％以上のグルコ
サミン残基の６位が硫酸化しているヘパリン、特に、５
０％以上のグルコサミン残基の６位が硫酸化し、さらに
２位にＮ−硫酸基を有するグルコサミン残基は多くても
１０％であるヘパリンが担体に結合しているものであ
る。本発明の結合担体における担体としては、特に限定
はされず、不溶性担体、水溶性高分子担体が使用され
る。不溶性担体としては、クロマトグラフィー用担体と
して使用されている不溶性天然高分子及びその活性化物
のような担体が好ましい。例えばアミノアガロース、ア
ミノヘキシルアガロース及び臭化シアン活性化アガロー
ス等が挙げられ、アミノアガロースが最も好ましいが特
に限定はされない。これらの担体としては、セファロー
ス、バイオゲル等の商品名で市販されているものから適
宜選ぶこともできる。水溶性高分子担体としては、ポリ
エチレングリコール等が用いられる。
【０００９】本発明において上記担体に結合するヘパリ
ンとしては、その平均分子量は特に限定されないが、通
常８，０００〜１３，０００Ｄａ、好ましくは９，００
０〜１１，０００Ｄａである。又、その好ましい構造と
しては、ヘパリン骨格中５０％以上のグルコサミン残基
の６位の水酸基が硫酸化されており、しかも２位にＮ−
硫酸基を有するグルコサミン残基は多くても１０％であ
ることを特徴とする。このようなヘパリンとしては、グ
リコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロ
マトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析によ
り得られる下記構造式で表される二糖体組成において
（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に規定する物性を有
することを特徴とするヘパリンが最も好ましい。 （ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨ
Ｓ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）
Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、ΔＤｉＨ
Ｓ−６Ｓのモル％が５０％以上である。（但し、ΔＤｉ
ＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1、
Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3 -であることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄ
ｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ3 -で
あり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ
（Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2及び
Ｒ3がＳＯ3 -であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ−６
Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3 -であり、Ｒ2及びＲ3が
Ｈであることを意味する。） （ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａであ
る。
【００１０】
【化１】
【００１１】更に好ましいヘパリンは、上記（ａ）及び
（ｂ）の規定に加えて、二糖体組成においてΔＤｉＨＳ
−ＮＳのモル％が３％以下であることを満たすものであ
る（但し、ΔＤｉＨＳ−ＮＳは、上記式中においてＲ1
及びＲ3がＨでありＲ2がＳＯ3 -であることを意味す
る。）。本発明のヘパリン結合担体としては、これらの
最適ヘパリンをアミノアガロースに結合させたものが最
も好ましい。本発明の上記特定の構造を有するヘパリン
は、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼに
対し親和性を有するものである。ここで、親和性とは、
後述の試験例４に示すフルクトース−１，６−ビスリン
酸アルドラーゼの活性測定法により測定し、その比活性
が少なくとも１．０であることを意味する。
【００１２】本発明における上記ヘパリンの二糖体組成
は、後述する実施例に記載の二糖分析法による測定値か
ら算出したものであり、また分子量は実施例に記載の分
子量測定法による測定値である。二糖体組成は試験法１
に記載の酵素消化による二糖分析により得られる特定が
可能な構造をもつ不飽和二糖の量［ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、
ΔＤｉＨＳ−６Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ、ΔＤｉＨＳ−ｄ
ｉ（６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ、ΔＤ
ｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ
（Ｕ，６，Ｎ）Ｓのモル％の合計］を１００％として、
上記特定の構造をもつ二糖の割合を示したものであり、
当該数値は酵素消化前のヘパリンの構成糖における硫酸
化の位置を反映するものである。なお、本願明細書にお
いて、二糖体組成の表記は、下記を意味する。
【００１３】
【表１】 表 − １ 不飽和二糖 構造式の置換基 Ｒ1 Ｒ2 Ｒ3 ΔDiHS-OS Ｈ ＣＯＣＨ3 Ｈ ΔDiHS-6S ＳＯ3 - ＣＯＣＨ3 Ｈ ΔDiHS-NS Ｈ ＳＯ3 - Ｈ ΔDiHS-US Ｈ ＣＯＣＨ3 ＳＯ3 - ΔDiHS-di(6,N)S ＳＯ3 - ＳＯ3 - Ｈ ΔDiHS-di(U,N)S Ｈ ＳＯ3 - ＳＯ3 - ΔDiHS-di(U,6)S ＳＯ3 - ＣＯＣＨ3 ＳＯ3 - ΔDiHS-tri(U,6,N)S ＳＯ3 - ＳＯ3 - ＳＯ3 -
【００１４】本明細書中における略号の示す構造は以下
の通り表記されることもある。 ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ、Δ
ＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ（６
Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃ（ＮＳ）、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ：ΔＨｅｘＡ１（ＵＳ）
→４ＧｌｃＮＡｃ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ：Δ
ＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ（６,Ｎ−ｄｉ）Ｓ、ΔＤ
ｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ１（２Ｓ）→４
ＧｌｃＮＡｃ（ＮＳ）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）
Ｓ：ΔＨｅｘＡ１（２Ｓ）→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、
ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ１
（２Ｓ）→４ＧｌｃＮＡｃ（６,Ｎ−ｄｉＳ） 上記式中、ΔＨｅｘＡは不飽和ウロン酸、ＧｌｃＮＡｃ
はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、括弧内は硫酸基の
結合位置を示す。
【００１５】本発明ヘパリン結合担体に結合するヘパリ
ンの製造方法としては、市販のヘパリン中のグルコサミ
ンの６位の水酸基を硫酸化することによって得ることが
可能であるが、上述の最も好ましいヘパリンは、市販の
ヘパリンを公知の完全脱硫酸化法により脱硫酸化した後
にグルコサミンのアミノ基をアセチル化した後、特公平
６−９９４８５に記載の方法等によりグルコサミンの６
位の水酸基を選択的に硫酸化することによって得ること
が可能である。グルコサミンの６位の水酸基が選択的に
硫酸化されたヘパリンを、以下選択的６−Ｏ−硫酸化ヘ
パリンと記載する。
【００１６】最適ヘパリンの具体的製造法としては、例
えば以下の方法が挙げられる。５００ｍｇのヘパリン
（ブタ小腸由来：ＳＰＬ社製）を１０ｍｌの蒸留水に溶
解後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０
Ｂカラム（φ2 x 15cm）に吸着させ、溶出液の酸性画分
を回収し、ピリジンを添加してｐＨを５．０〜７．５、
好ましくは６．０〜７．０に調整する。この溶液を凍結
乾燥することにより、ヘパリンピリジニウム塩を得る。
得られたヘパリンピリジニウム塩５００ｍｇに対し、例
えば５ｍｌのメタノール、３０ｍｌのジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）及び１５ｍｌの１，４−ジオキサンを
添加してヘパリンピリジニウム塩を完全に溶解し、この
溶液を、Ogamoらの方法（Carbohydr. Res.,193, 165-17
2(1989)）に従って、８０〜９５℃にて２０時間以上、
好ましくは４０時間以上、より好ましくは６０〜７５時
間加熱することによりヘパリンの完全脱硫酸化を行う。
脱硫酸反応終了後、１００〜２００ｍｌの氷冷蒸留水を
添加し、反応混液のｐＨをＮａＯＨを添加することによ
り８〜１１、好ましくは９〜１０に調整する。次いで、
反応混液を蒸留水に対して２０時間以上透析した後、透
析内液を凍結乾燥処理し、完全脱硫酸化ヘパリンを黄色
パウダーとして回収できる。
【００１７】次いで、Danishefskyらの方法（Arch. Bio
chem. Biophys.,90, 114-121(1960)）に従い、完全脱硫
酸化ヘパリンのグルコサミンのＮ−アセチル化反応を行
う。例えば、４００ｍｇの完全脱硫酸化ヘパリンを６０
ｍｌの５０ｍＭの炭酸ナトリウムを含む１０％メタノー
ルに溶解した後、酢酸を適量添加して溶液のｐＨを６以
上、好ましくは７〜８の間に調整する。次いで、反応混
液を氷冷しながら、よく撹拌する。次の１時間の間に３
００〜５００μｌの無水酢酸を５〜８回添加し、そのた
びごとに低下した反応混液のｐＨを、飽和炭酸ナトリウ
ムを含む１０％メタノールを適量添加することにより、
７〜８の間に調整する。反応終了後、１００〜１５０ｍ
ｌの蒸留水を添加し、蒸留水に対して４８時間以上、好
ましくは７２時間程度透析する。透析内液を凍結乾燥す
ることにより 完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリン
を得ることができる。
【００１８】次いで、４００ｍｇの完全脱硫酸化／Ｎ−
アセチル化ヘパリンを１０ｍｌ程度の蒸留水に溶解した
後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ
カラム（φ２×１５ｃｍ）に通塔し、溶出液の酸性画分
を回収し、１０％トリブチルアミンエタノール溶液を添
加してｐＨを４．５〜７．０、好ましくは５．５〜６．
５に調整する。この溶液を凍結乾燥することにより得ら
れる完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリントリブチル
アンモニウム塩を、Takanoらの方法（Biosci.Biotech.
Biochem.,56, 1413-1416(1992)）に従い、５〜１０ｍｌ
のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して氷冷した
後、１０〜１５ｍｌの４．６ｍｌジクロロヘキシルカル
ボジイミド（ＤＣＣ）を含むＤＭＦを添加する。さらに
撹拌した後、４〜５ｍｌの１．２ｍｍｏｌ硫酸を含むＤ
ＭＦを添加し、氷冷条件下にて１０〜２０分間撹拌を続
けて反応を進行させる。反応終了後、反応混液全量を５
０〜１００ｇの氷中に投入し、直ちに炭酸水素ナトリウ
ムで中和してｐＨを６．５〜７．５に調整する。次い
で、この反応混液を蒸留水に対して透析した後、ガラス
繊維濾紙、メンブレンフィルター（４．５μｍ）の順に
通して、ジシクロヘキシル尿素の塩を除去した後、凍結
乾燥処理を施すことにより選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリ
ンを合成することができる。
【００１９】本発明においてヘパリンの担体への結合方
法は特に限定はされないが、共有結合が好ましく、ヘパ
リンの還元末端部に存在しうるアルデヒド基と担体が共
有結合していることが結合力が強く、アフィニティー担
体として最も好ましい。上記のようにして得た選択的６
−Ｏ−硫酸化ヘパリンを担体に結合することにより本発
明ヘパリン結合担体とすることができる。選択的６−Ｏ
−硫酸化ヘパリンの種々の官能基と活性化クロマトグラ
フィー用坦体（アミノ基等の官能基を導入した誘導体）
の官能基とのカップリング反応を利用して選択的６−Ｏ
−硫酸化ヘパリンの坦体への固定化を行うことができ
る。一般には、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中の
還元末端部に存在しうるアルデヒド基を担体とのカップ
リング反応に使用することが好ましく、この場合は、担
体としてアミノ基を有する不溶性担体（例えば、アミノ
ヘキシルアガロース又はアミノアガロース）を使用す
る。又、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中のカルボ
キシル基を担体とのカップリング反応に使用する場合
は、担体として上記と同様のアミノ基を有する担体を使
用し、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中の遊離のア
ミノ基を担体とのカップリング反応に使用する場合は臭
化シアン活性化アガロースの担体を使用する。アミノア
ガロースの担体がヘパリンと最も結合し易いため好まし
い。
【００２０】選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンと担体とを
結合させる方法としては以下の方法が挙げられる。選択
的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン中の還元末端部に存在しうる
アルデヒド基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合
する方法としては、シッフ塩基を形成した後、NaB(CN)H
3等の還元剤を作用させ、アルキルアミノ架橋を生成さ
せる。この方法としては、例えば公知の一般的な方法で
行うことが可能であり、Sakaiらの方法（J. Chromatog
r.,400, 123(1987)）等が挙げられる。また、選択的６
−Ｏ−硫酸化ヘパリン中ウロン酸残基中のカルボキシル
基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合する方法と
しては、該カルボキシル基を１−エチル−３−(３−ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）等の
カルボジイミド試薬により活性化して酸アミド結合(-CO
NH-)の架橋を生成させる方法である。しかし、選択的６
−Ｏ−硫酸化ヘパリンの立体構造上、担体としてより結
合力が強いと考えられる前者の結合方法が好ましい。
【００２１】選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンが結合した
ヘパリン結合担体中に未反応（遊離）のアミノ基が残存
すると、非特異的な相互作用を引き起こし、特にアフィ
ニティークロマトグラフィーの担体として使用した際に
特異的な結合が起こらず、不特定物質を結合するため好
ましくない。従って、ヘパリン結合担体中の未反応の残
存アミノ基は以下の方法によりアセチル化して不活化す
ることが好ましい。すなわち例えば、上記で調製したヘ
パリン結合担体を５ｍｌの０．２Ｍ 酢酸ナトリウム溶
液に懸濁させ、２．５ｍｌの無水酢酸を添加して氷冷条
件下にて２０〜４０分間、次いで室温にて２０〜４０分
間反応させることによってアミノ基をアセチル化し不活
化することが可能である。ヘパリンの固定化（場合によ
り、更にアセチル化反応後）したヘパリン結合担体は、
水洗して完全に脱塩することが好ましい。また、Bitter
&Muirの方法（Anal. Biochem.,4, 330-334(1962)）に従
ってカルボキシル基の定量を行い、単位重量あたりのア
ガロースゲルに固定化された選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパ
リンの重量を見積ることにより、ヘパリンの固定化量を
確認することが可能である。
【００２２】本発明の不溶性担体にヘパリンが結合した
結合担体は、カラムに充填して酵素含有物と接触させ、
非吸着画分と分離するのに使用出来、またバッチ法で酵
素含有物と接触後、濾過、遠心分離等により分離するこ
ともできる。また、水溶性高分子担体とヘパリンとの結
合担体は、酵素含有物と接触させた後、分子ふるい等の
方法で分離することができる。
【００２３】本発明のフルクトース−１，６−ビスリン
酸アルドラーゼを分離・精製する方法は、上記本発明ヘ
パリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフ
ィーにより、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルド
ラーゼの含有物から当該酵素を分離・精製する方法であ
る。本発明方法においては、本発明ヘパリン結合担体を
使用したアフィニティークロマトグラフィーを用いる方
法であれば、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルド
ラーゼを分離・精製する為に、常法に従い付随的に行わ
れる予備処理等の他の処理操作は特に制限されない。本
発明の好ましい態様として、例えば、当該酵素の素材原
料をホモジナイズして得られた液状物をコンドロイチン
ポリ硫酸固定化アフィニティークロマトグラフィーを行
って分画し、その吸着画分の流出物を本発明ヘパリン結
合担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
り分画し、その吸着画分から上記酵素を分離・取得する
方法が挙げられる。
【００２４】本発明方法におけるアフィニティークロマ
トグラフィーは、本発明のヘパリン結合担体を充填した
カラムを使用し、それ以外の操作は常法に従っておこな
われ、その特異的吸着画分を溶離剤（例えば、ＮａＣ
ｌ、ＫＣｌなどのアルカリ金属塩水溶液）で処理するこ
とにより、酵素を含有した溶出物を得ることが出来る。
更に、この溶出物をゲル濾過クロマトグラフィー、限外
濾過等の分子ふるいを行って、より高純度の酵素を得る
ことができる。
【００２５】本発明方法においてフルクトース−１，６
−ビスリン酸アルドラーゼを分離・精製するための素材
原料は、上記酵素が発現している組織であれば限定はさ
れないが、哺乳動物類由来の組織が好ましい。組織とし
ては、好ましくは筋肉、肝臓、心臓、腎臓及び脳などが
挙げられ、その中でも脳が好ましく、特に大脳が好まし
い。これらの組織を、通常、緩衝液中でホモジナイズ
し、遠心分離したものを酵素源として用いる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り本実施例によ
り限定されることはない。なお、実施例における各試験
法は、以下の通りである。
【００２７】試験法１ ［酵素消化による二糖分析］ヘパリンの硫酸基の位置の
分析は、次のようにして行った。すなわち、それぞれの
硫酸化多糖を酵素消化し、生成した不飽和二糖（前記構
造式：化１）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で分析した（新生化学実験講座３、糖質II（東京化
学同人刊、１９９１）、４９−６２頁に記載の「２・８
グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組み合わせ
た構造解析」参照）。各不飽和二糖のピーク面積を計算
して、全面積に対するピーク面積をパーセントとして表
した。
【００２８】（１）ヘパリンの完全脱硫酸化６−Ｏ−硫
酸化処理によって生成したヘパリンの分解酵素による消
化 新生化学実験講座３、糖質II ５４−５９頁に記載の方
法により、ヘパリン１．０ｍｇを２ｍＭ酢酸カルシウム
を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液２２
０μｌに溶解して、２０ｍＵのヘパリチナーゼ、２０ｍ
ＵのヘパリチナーゼＩ及びＩＩを加えて、３７℃、２時
間反応させた。
【００２９】（２）ＨＰＬＣによる分析 ヘパリンの分解酵素による消化を行った後の溶液２０μ
ｌを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分
析した。イオン交換カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社、Ｃａｒｂ
ｏＰａｃ ＰＡ−１カラム φ４．０ｍｍ×２５０ｍ
ｍ）を使用し、２３２ｎｍでの吸光度を測定した。流速
１ｍｌ／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系
（５０ｍＭ→２．５Ｍ）を用いる方法に準拠した（Kari
ya, et al.,Comp.Biochem.Physiol.,103B,473,(199
2)）。
【００３０】試験法２ ［分子量測定］ヘパリンの３％溶液１０μｌをＨＰＬＣ
によるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫｇｅｌ−
（Ｇ４０００＋Ｇ３０００＋Ｇ２５００）ＰＷＸ（東ソ
ー、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、溶離液に０．２Ｍ
塩化ナトリウムを使用して、１．０ｍｌ／分の流速で展
開した。ヘパリンの検出には、示差屈折計（島津製作
所、ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。平均分子量はヘパリンの
分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda et al.,Bioc
hem. Biophys. Res. Comm.,220 ,108-112(1996)）。標
準ヘパリンの分子量の測定は光散乱法を用いて行った
（Nagasawa et al., J.Biochem.,81 ,989-993(197
7)）。
【００３１】試験例３ ［ＮＭＲ分析］13Ｃ−ＮＭＲは、ＧＥ社製ＱＥ３００型
ＮＭＲスペクトロメーターを用い、１００％Ｄ2Ｏ置換
を行った試料につき１０％濃度のＤ2Ｏ溶液を調製した
うえ、ＴＰＳを０ｐｐｍとした時のケミカルシフトが５
１．６６ｐｐｍのメタノールを内部標準とし、測定温度
８０℃、パルス幅６０°、積算回数９０，０００回の条
件にて実施した。
【００３２】試験例４ ［フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ活性
測定］Herbert G. Lebherz and William J. Rutterらの
方法( Methods Enzymol.,42,249 - 258(1975)）に準
じ、下記の如く活性測定を行った。すなわち、試薬とし
て次の５種類のものを調製した。 ０．１Ｍ グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ ７．
５）、 ５０ｍＭ フルクトース−１，６−ビスリン酸ナトリ
ウム溶液、 ０．１Ｍ フルクトース−１−リン酸ジモノシクロヘ
キシルアンモニウム溶液、 １０ｍｇ／ｍｌ濃度のグ
リセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオース
リン酸イソメラーゼ複合体溶液、 ＮＡＤＨ。
【００３３】４ｍｇのＮＡＤＨ、５０μｌのグリセロー
ル−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イ
ソメラーゼ複合体溶液、１ｍｌのフルクトース１，６−
ビスリン酸ナトリウム溶液および１ｍｌのフルクトース
−１−リン酸ジモノシクロヘキシルアンモニウム溶液を
含む０．１Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ ７．５）
の２０ｍｌに対し、５〜５０μｌのフルクトース−１、
６−ビスリン酸アルドラーゼを含む測定検体を添加する
ことにより反応を開始させた。単位時間あたりの３４０
ｎｍの吸光度の減少量につき、２５℃の温度条件下で測
定した。３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数が
６．２２×１０6ｃｍ2・ｍｏｌ なので、吸光度の変化
が１２．４４から６．２２への減少であった場合、それ
ぞれ１μｍｏｌのフルクトース−１、６−ビスリン酸あ
るいは１μｍｏｌのフルクトース−１−リン酸が開裂し
たとし、これに基づき、様々な試料における開裂量を算
出した。フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラー
ゼの単位（活性；ｕｎｉｔ）は、上記の反応系において
２５℃にて１μｍｏｌの基質を１分間で開裂する酵素量
を１ｕｎｉｔと定義した。比活性は、１ｍｇのタンパク
質あたりのｕｎｉｔ数として定義した。
【００３４】実施例１ 選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン
の合成 ５００ｍｇのヘパリン（ブタ小腸由来；ＳＰＬ社製）を
１０ｍｌの蒸留水に溶解した後、蒸留水で平衡化したア
ンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ２×１５ｃｍ）
に通塔し、溶出液を３ｍｌごとに分画した。最終的に得
られた５０本の各画分のｐＨを測定した後、酸性画分を
集め ピリジンを添加してｐＨを６．５に調整した。こ
の溶液を凍結乾燥することによりヘパリンピリジニウム
塩を約５１０ｍｇ得た。完全脱硫酸化反応を行うため
に、このうちの５００ｍｇに対し、５ｍｌのメタノー
ル、３０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、お
よび１５ｍｌの1,4-ジオキサンを添加してヘパリンピリ
ジニウム塩を完全に溶解した後、Ogamoらの方法（Carbo
hydr. Res.,193, 165-172(1989)）に従って、この反応
混液を９０℃にて７２時間加熱した。脱硫酸化反応終了
後、１５０ｍｌの氷冷蒸留水を添加し、反応混液のｐＨ
を、１Ｎの水酸化ナトリウムを添加することにより９．
５に調整した。次いで、反応混液を蒸留水に対して２４
時間透析した後、透析内液を凍結乾燥処理に付した。そ
の結果、４３０ｍｇの完全脱硫酸化ヘパリンを黄色パウ
ダーとして回収した。
【００３５】次いで、Danishefskyらの方法（Arch. Bio
chem. Biophys.,90, 114-121(1960)）に従い、Ｎ−アセ
チル化反応を行った。すなわち、４００ｍｇの完全脱硫
酸化ヘパリンを、６０ｍｌの５０ｍＭ 炭酸ナトリウム
を含む１０％ メタノールに溶解した後、酢酸を適量添
加して溶液のｐＨを７〜８の間に調整した。次いで、反
応混液を氷冷水槽中にて冷却しながら、よく撹拌を続け
た。次の１時間の間に４００μｌの無水酢酸を６〜７回
添加し、そのたびごとに低下した反応混液のｐＨを、飽
和炭酸ナトリウムを含む１０％ メタノールを適量添加
することにより、７〜８の間に調整した。反応終了後、
１２０ｍｌの蒸留水を添加し、蒸留水に対して７２時間
透析した。透析内液を凍結乾燥することにより４１０ｍ
ｇの完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリンを得た。
【００３６】次いで、４００ｍｇの完全脱硫酸化／Ｎ−
アセチル化ヘパリンを１０ｍｌの蒸留水に溶解した後、
蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラ
ム（φ２×１５cm）に通塔し、溶出液を３ｍｌごとに分
画した。最終的に得られた５０本の各画分のｐＨを測定
した後、酸性画分を集め１０％トリブチルアミンエタノ
ール溶液を添加してｐＨを５．５に調整した。この溶液
を凍結乾燥することにより完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル
化ヘパリントリブチルアンモニウム塩を４３０ｍｇ得
た。このものを Takanoらの方法（Biosci. Biotech. Bi
ochem.,56, 1413-1416(1992)）に従い、８ｍｌのジメチ
ルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解して０℃に冷却した後、
４．６ｍｌのジクロロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)
を含む１２ｍｌのＤＭＦを添加した。さらによく撹拌し
た後、４．４ｍｌの１．２ｍｍｏｌ硫酸を含むＤＭＦを
添加し、０℃にて１５分間撹拌を続けて反応を進行させ
た。
【００３７】反応終了後、反応混液全体を８０ｇの氷中
に投入し、直ちに炭酸水素ナトリウムで中和してｐＨを
７．０に調整した。次いで、この反応混液を蒸留水に対
して透析した後、ガラス繊維濾紙、メンブレンフィルタ
ー（４．５μｍ）の順に通して、ジシクロヘキシル尿素
の塩を除去した。最終的に、凍結乾燥処理を施し、選択
的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを４５０ｍｇ合成した。この
選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを光散乱法により分子量
を測定すると、未処理のヘパリンの１．３７×１０4Ｄ
ａに対し、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンは０．９７×
１０4Ｄａであった。これらのゲルろ過ＨＰＬＣによる
溶出パターンは（図１）の通りであり、未処理ヘパリン
の溶出時間は３３．５分（ａ）、選択的６−Ｏ−硫酸化
ヘパリンの溶出時間は３５．１分（ｂ）であった。ま
た、これらの物質の二糖分析を行った（図２）。この溶
出パターンから二糖体組成を算出した（表−２）。
【００３８】
【表２】 表−２ ΔＤｉＨＳ− OS NS 6S US (6,N)S (U,N)S (U,6)S (U,6,N)S Hep 4 2 4 2 12 7 1 68 6-O-S Hep 10 0 57 23 0 0 10 0 注 Hep：未処理ヘパリン 6-O-S Hep：選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン
【００３９】また、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを13
Ｃ−ＮＭＲにより分析した（図３）。その結果、二糖体
組成同様、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンは従来のヘパ
リンでは得られなかった、グルコサミン残基にＮ−硫酸
基が存在せず、６−Ｏ−硫酸を多く有するヘパリンであ
ることが明らかになった。また、当該ヘパリンをアフィ
ニティークロマトグラフィーの担体に結合する場合、特
異的な結合を有するヘパリンはΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ
（Ｕ，６，Ｎ）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ及びΔ
ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓのモル％はそれぞれ全て３
％以下であることが好ましい。
【００４０】実施例２ 選択的6-O-硫酸化ヘパリンをリ
ガンドとするヘパリン結合坦体の調製 Sakaiらの方法（J. Chromatogr.,400, 123(1987)）に従
い、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン２００ｍｇを５ｍｌ
の２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）に溶解した。次い
で、５ｇのアミノアガロースゲル粉末を懸濁し、１５ｍ
ｇのＮａＢ（ＣＮ）Ｈ3を添加して十分撹拌しながら室
温にて２４時間反応を進行させた。反応終了後、カップ
リング産物を含有したゲルを濾過した。さらに、水洗処
理を２〜３回施すことにより、完全に脱塩した。
【００４１】未反応（遊離）のアミノ基が残存すると、
非特異的な相互作用を引き起こす可能性があるので、残
存アミノ基はアセチル化して不活化することにした。す
なわち、調製した選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン固定化
アガロースゲルを ５ｍｌの０．２Ｍ 酢酸ナトリウム溶
液に懸濁させ、２．５ｍｌの無水酢酸を添加して０℃に
て３０分、次いで室温にて３０分間反応させた。反応終
了後、生成したゲルを水洗して完全に脱塩した。Bitter
& Muirの方法（Anal. Biochem.,4, 330-334(1962)）に
従い、カルボキシル基の定量を行うことにより、単位重
量あたりのアガロースゲルに固定化された選択的６−Ｏ
−硫酸化ヘパリンの重量を見積もった。その結果、従来
報告されている最大結合量に匹敵する、ゲル湿重量１ｇ
あたり、約１０ｍｇの選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの
固定化が確認されたため、遊離のアミノ基は存在しない
ことが確認された。
【００４２】実施例３ 選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン
結合坦体を用いたフルクトース−１，６ービスリン酸ア
ルドラーゼの精製 ９ｇのウシ大脳に対し、０℃に冷却した８０ｍｌの１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ
７．４緩衝液)を添加し、大脳組織を冷却した。次い
で、大脳組織を取り出し、剃刀を用いて細片化した後、
再度０℃に冷却した上記緩衝液を２倍量（V/W）添加
し、グラスホモジナイザー中でホモジナイズした。この
ように調製したホモジネイトを適量の遠沈管に入れ、０
℃にて１００，０００×ｇの加速度の下、６０分間の遠
心分離を行った。遠心終了後、上澄液（粗抽出液）を用
いさらに精製を進めた。
【００４３】上記粗抽出液をコンドロイチンポリ硫酸固
定化アガロースアフィニティーカラム（φ２×２０ｃ
ｍ）を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液で平衡化した。このアフィ
ニティーカラムに粗抽出液を全量をアプライした後、６
０ｍｌの １ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液で洗浄し、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール及び１０％グ
リセロールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）緩衝液１００ｍｌにより吸着画分を溶出させ
た。この吸着画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, U.
K., J. Biol. Chem., 252, 1102-1106(1977)）により多
数のバンドを示した。
【００４４】次いで、上記実施例２で調製したヘパリン
結合担体を充填したカラム（φ１×１０ｃｍ）を１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール、１０
％グリセロールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ７．４）緩衝液で平衡化した。このアフィニティー
カラムに、コンドロイチンポリ硫酸固定化アガロースア
フィニティーカラムクロマトグラフィー吸着画分のうち
４０ｍｌをアプライした後、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
ｍＭ メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝
液８０ｍｌで洗浄した。特異的吸着画分につき、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５ｍＭメルカプトエタノール及び１０
％グリセロールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ７．４）緩衝液１５ｍｌおよび１．５Ｍ 塩化ナト
リウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエ
タノール及び１０％グリセロールを含む１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液１５ｍｌの２種溶
出液による塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（０〜１．
５Ｍ）を用いて溶出した。なお、検出は２２０ｎｍの吸
光度により行い、その溶出パターンを図４に示した。塩
化ナトリウムの直線的濃度勾配においてシングルピーク
が出現したので、この画分を分取してＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付したところ、分子量約４０ｋＤａのシングルバンド
が観察された。また、この画分はフルクトース−１、６
−ビスリン酸アルドラーゼ活性を有していた。
【００４５】実施例４ フルクトース−１、６−ビスリ
ン酸アルドラーゼのアイソフォーム 次いで、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液で十分平衡化したＭｏｎ
ｏＱカラム（商品名：ファルマシア社製）を装着したＨ
ＰＬＣに、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンアフィニティ
ークロマトグラフィーの特異的吸着画分をアプライし、
１５ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液で洗浄した。吸着画分
につき、７．５ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液並びに７．
５ｍｌの０．５Ｍ 塩化ナトリウム及び１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）
緩衝液の２種溶出液による塩化ナトリウムの直線的濃度
勾配（０〜０．５Ｍ）を用いて溶出を試みた。なお、検
出は２２０ｎｍの吸光度により行い、その溶出パターン
を図５に示す。
【００４６】塩化ナトリウムの直線的濃度勾配の開始直
前にブロードなピークが１本（Fr.1)、塩化ナトリウム
の直線的濃度勾配においてシャープなピークが４本（F
r.2〜Fr.5)出現した。得られた５種画分につき、Superd
ex G-200を装着したＨＰＬＣによりゲル濾過分析と分取
を行い純度の検定ならびに最終精製を行ったところ、図
６に示すようにいずれの画分も約１３分の保持時間にシ
ャープなピークが検出され（２２０ｎｍの吸光度による
検出）、すべての画分ともきわめて高純度に精製されて
いることが判明した。Fr.1〜Fr.5の収量は、それぞれ
２．７ｍｇ、１６．５ｍｇ、７．１ｍｇ、５．４ｍｇ、
７．７ｍｇであった。なお、実施例５に示すように、こ
れら５種画分のフルクトース−１、６−ビスリン酸アル
ドラーゼ活性を測定したところ、全ての画分が高い活性
を有した。
【００４７】これら５種画分につき、さらに Davidの方
法（Ann. N. Y. Acad. Sci.,121,404(1964)）に従って
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。その結果、Fr.1、F
r.2、Fr.3、Fr.4 および Fr.5 の順に移動度が大きくな
ることから、マイナスの帯電はFr.1＜Fr.2＜Fr.3＜Fr.4
＜Fr.5 の順に大きいことが判明した。したがって、Fr.
1〜Fr.5 はフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラ
ーゼのアイソフォームであると考えられる。脳に存在す
るフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼは等
電点の高いＡおよび等電点の低いＣの２種サブユニット
の４量体であり、Ａ4、Ａ3Ｃ、Ａ2Ｃ2、ＡＣ3、Ｃ4 の
５種アイソフォームが存在することが報告されている
（Methods Enzymol.,42, 240-249(1975)）。ＡとＣは分
子量はほとんど変わらない。Fr.1、2、3、4、および 5
は、それぞれＡ4、Ａ3Ｃ、Ａ2Ｃ2、ＡＣ3、Ｃ4に相当す
ると考えられる。
【００４８】実施例５ フルクトース−１、６−ビスリ
ン酸アルドラーゼの活性測定 実施例３で得た選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを結合し
たヘパリン結合坦体への特異的吸着画分、実施例４にお
いてＭｏｎｏＱカラムによるイオン交換で分画されたF
r.1〜5の各画分及びSuperdex G-200 により精製後の分
画Fr.1〜5のフルクトース−１、６−ビスリン酸アルド
ラーゼの活性測定を行った。その結果、選択的６−Ｏ−
硫酸化ヘパリン結合アフィニティーカラムの特異的吸着
画分の全活性および比活性は １４２．６５および１．
４８であった。又、ＭｏｎｏＱカラムからの画分Fr.1の
活性および比活性は２．９２および２．１７、Fr.2の活
性および比活性は３２．４２および５．０、Fr.3の活性
および比活性は４０．９８および１３．５、Fr.4の活性
および比活性は２５．１９および８．８、Fr.5の活性お
よび比活性は１６．１１および４．６であった（表−
３）。尚、表−３中のＭｏｎｏＱカラム及びSuperdex
columnの全活性及び比活性はそれぞれFr.1〜5の活性の
合計及び各Fr.の活性の平均を表す。
【００４９】
【表３】 表−３ 精製工程 全活性 全タンハ゜ク質量(mg) 比活性 回収率(%) (unit/mg- タンハ゜ク質) Crude extract 176.0 2670 0.07 100 6-O-S Hep column 142.7 96.4 1.48 81 MonoQ column 118.1 17.3 6.81 67 Superdex colimn 96.3 11.5 8.38 55 Clude extract：粗抽出液 6-O-S Hep column：ヘパリン結合担体を使用したカラム特異的吸着画分 MonoQ column：ＭｏｎｏＱ吸着画分 Superdex column：Superdex G-200 HPLC後の精製物
【００５０】
【発明の効果】本発明により、進行性筋ジストロフィー
等の各種疾患の診断に有用なフルクトース−１，６−ビ
スリン酸アルドラーゼに対して親和性を有する特異的構
造を有するヘパリン及びこのヘパリンが結合した新規ヘ
パリン結合担体が提供される。また、このヘパリン結合
担体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー
を、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ含
有物から該酵素の分離・精製に使用することにより、単
純な操作で、高度な精製を可能とする方法が提供され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 (a)未処理ヘパリン及び(b)選択的６−Ｏ−硫
酸化ヘパリンのゲルろ過ＨＰＬＣ溶出パターンを示す
図。
【図２】 (a)不飽和二糖標品、(b)未処理ヘパリン、
(c)選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの酵素消化物のイオ
ン交換ＨＰＬＣ溶出パターンを示す図。
【図３】 選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの13Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図。
【図４】 選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン結合アフィニ
ティー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー
の溶出パターンを示す図。
【図５】 ＭｏｎｏＱカラムを装着したＨＰＬＣにおけ
るイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示す
図。
【図６】 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ カラムを装着したＨＰＬ
Ｃによるゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図。

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘパリン骨格中のグルコサミン残基の５
    ０％以上が６−Ｏ−硫酸基を有するヘパリンが担体に結
    合していることを特徴とするヘパリン結合担体。
  2. 【請求項２】 ヘパリン骨格中のグルコサミン残基の５
    ０％以上が６−Ｏ−硫酸基を有し、且つＮ−硫酸基を有
    する該残基は多くても１０％であるヘパリンが担体に結
    合していることを特徴とする請求項１記載のヘパリン結
    合担体。
  3. 【請求項３】 ヘパリンの平均分子量が９，０００〜１
    １，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１又は２
    記載のヘパリン結合担体。
  4. 【請求項４】 グリコサミノグリカン分解酵素による分
    解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わ
    せた二糖分析により得られる下記構造式で表される二糖
    体組成において（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に規
    定する物性を有するヘパリンが担体に結合していること
    を特徴とするヘパリン結合担体。 （ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨ
    Ｓ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）
    Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、ΔＤｉＨ
    Ｓ−６Ｓのモル％が５０％以上である。（但し、ΔＤｉ
    ＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1、
    Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3 -であることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄ
    ｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ3 -で
    あり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ
    （Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2及び
    Ｒ3がＳＯ3 -であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ−６
    Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3 -であり、Ｒ2及びＲ3が
    Ｈであることを意味する。） （ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａであ
    る。 【化１】
  5. 【請求項５】 ヘパリンがその還元末端において共有結
    合を介して担体に結合していることを特徴とする請求項
    １〜４いずれか一項記載のヘパリン結合担体。
  6. 【請求項６】 ヘパリン結合担体がアフィニティークロ
    マトグラフィー用担体であることを特徴とする請求項１
    〜５いずれか一項記載のヘパリン結合担体。
  7. 【請求項７】 担体が、水不溶性担体であることを特徴
    とする請求項１〜６いずれか一項記載のヘパリン結合担
    体。
  8. 【請求項８】 フルクトース−１，６−ビスリン酸アル
    ドラーゼの含有物から、請求項１〜７のいずれか一項記
    載のヘパリン結合担体を用いたアフィニティークロマト
    グラフィーにより当該酵素を分離することを特徴とする
    フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離
    方法。
  9. 【請求項９】 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を包含する
    ことを特徴とする請求項７記載のフルクトース−１，６
    −ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。 （ａ） フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラー
    ゼの含有物を、コンドロイチンポリ硫酸固定化アフィニ
    ティークロマトグラフィーを行い分画すること及び
    （ｂ） 工程（ａ）で得られる吸着画分を、請求項１〜
    ７のいずれか一項に記載のヘパリン結合担体を用いるア
    フィニティークロマトグラフィーにより、該酵素を選択
    的に吸着させ、溶出すること。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の分離方法において、更
    に工程（ｂ）で得られる溶出物を分子ふるいにより精製
    することを特徴とする高純度フルクトース−１，６−ビ
    スリン酸アルドラーゼの分離方法。
  11. 【請求項１１】 フルクトース−１，６−ビスリン酸ア
    ルドラーゼの含有物は哺乳動物の組織から得られること
    を特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項記載のフル
    クトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方
    法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１記載の分離方法において、
    哺乳動物の組織が筋肉、肝臓、心臓、腎臓及び脳からな
    る群から選択される１つ以上の組織であることを特徴と
    するフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの
    分離方法。
  13. 【請求項１３】 ヘパリン骨格中のグルコサミン残基の
    ５０％以上が６−Ｏ−硫酸基を有し、且つＮ−硫酸基を
    有する該残基は多くても１０％であることを特徴とする
    ヘパリン。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載のヘパリンにおいて、
    更にヘパリン骨格中のウロン酸残基の５０％以上が２−
    Ｏ−硫酸基を有しないことを特徴とするヘパリン。
  15. 【請求項１５】 平均分子量が９，０００〜１１，００
    ０Ｄａであることを特徴とする請求項１３又は１４記載
    のヘパリン。
  16. 【請求項１６】 グリコサミノグリカン分解酵素による
    分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合
    わせた二糖分析により得られる下記構造式で表される二
    糖体組成において（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に
    規定する物性を有することを特徴とするヘパリン。 （ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨ
    Ｓ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）
    Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、且つΔＤ
    ｉＨＳ−６Ｓのモル％が５０％以上である。（但し、Δ
    ＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ
    1、Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3 -であることを意味し、ΔＤｉＨＳ
    −ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ
    3 -であり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−
    ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2
    及びＲ3がＳＯ3 -であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ
    −６Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3 -であり、Ｒ2及びＲ
    3がＨであることを意味する。） （ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａであ
    る。 【化１】
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の二糖体組成におい
    て、更にΔＤｉＨＳ−ＮＳのモル％が３％以下であるこ
    とを特徴とする請求項１６記載のヘパリン（但し、ΔＤ
    ｉＨＳ−ＮＳは、上記式中においてＲ1及びＲ3がＨであ
    りＲ2がＳＯ3 -であることを意味する。）。
  18. 【請求項１８】 フルクトース−１，６−ビスリン酸ア
    ルドラーゼ酵素に対する親和性を有することを特徴とす
    る請求項１４〜１７のずれか一項に記載のヘパリン。
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JP2000344674A (ja) * 1999-03-31 2000-12-12 Seikagaku Kogyo Co Ltd 血管内皮細胞増殖因子作用の抑制剤及び血管新生の抑制剤
JP2002020293A (ja) * 2000-06-29 2002-01-23 Seikagaku Kogyo Co Ltd クラミジア感染症処置剤
JP2013056932A (ja) * 2006-05-19 2013-03-28 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 新規なガレクチン−糖鎖結合体、ガレクチン活性調節剤
CN103157452A (zh) * 2013-03-30 2013-06-19 福州大学 脱硫酸化肝素衍生物亲和色谱材料的制备方法

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