JPH11500128A

JPH11500128A - 抗トランスフォーミング増殖因子β遺伝子治療

Info

Publication number: JPH11500128A
Application number: JP8525079A
Authority: JP
Inventors: エイ．ボーダー，ウェイン
Original assignee: ザユニバーシティーオブユタ
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 1999-01-06
Also published as: ATE221788T1; AU4922096A; EP0809517A1; CA2213198A1; US5824655A; AU694621B2; ES2179933T3; WO1996025178A1; CA2213198C; DE69622846D1; DE69622846T2; EP0809517B1; KR19980702268A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸を被験者の細胞に導入することにより、組織におけるＴＧＦ−β誘導性細胞外マトリックスの有害な蓄積を特徴とする被験者の病変を軽減する方法を提供する。ある態様においては、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸を、注入により、例えば、骨格筋において、in vivo で細胞に導入する。もう一つの態様においては、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸をex vivo で細胞にトランスフェクションして、その物質を発現する細胞を得、次いでその細胞を治療すべき被験者に投与する。本発明のＴＧＦ−β特異的阻害剤としては、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカンのようなプロテオグリカンのデコリンファミリーのメンバーまたはＴＧＦ−βに特異的な抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。本発明により軽減できる病変には、種々の線維症疾患および状態がある。

Description

【発明の詳細な説明】抗トランスフォーミング増殖因子β遺伝子治療本発明は米国 National Institute of Diabetes and Digestinal and Kidney Diseasesからの補助金 DK43609によって部分的に援助された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。発明の背景発明の属する技術分野本発明は増殖因子の調節に関し、より具体的には、増殖因子ＴＧＦ−βによって影響される過剰な細胞外マトリックスの生成および細胞増殖の制御に関する。背景技術腎臓、肝臓、肺、心臓、骨髄、および皮膚の進行性線維症は、罹患と死の主要な原因であるばかりでなく、ヘルスケア費用の大きな部分を占める。細胞およびサイトカイン生物学の進歩により、組織線維症の土台をなす分子現象の新たな知見が得られている。線維症の発症は、もはや独特の病理学的プロセスと見なされるのではなく、正常な組織修復に関与する同じ生物的現象の過剰と見なされることが明らかとなった。組織修復における中心的現象は、傷害に応答してのサイトカインの放出である。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、細胞増殖および細胞外マトリックス物質の生成を刺激することにより組織修復の開始および終止において重要な役割を果たす始原的サイトカインである。細胞外マトリックスは、フィブロネクチン、コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの自己凝集性巨大分子からなる複雑な超構造体（superstructure）であり、細胞は表面レセプターによりここに結合する。インテグリンは特定のマトリックス成分に結合することが知られている表面レセプターの１クラスである。細胞を取り囲むマトリックスは、既存マトリックスの分解ならびに新たなマトリックスの合成および再形成という動的なプロセスによって維持される。ＴＧＦ−βは、新しいマトリックスの合成を刺激し、マトリックス分解を抑制するという両面において、マトリックス蓄積の調節に関与する一因子である。組織線維症は、細胞外マトリックスの有害な蓄積を特徴とする病的状態である。例えば、腎臓の進行性糸球体疾患においては、細胞外マトリックスがメサンギウム内または糸球体基底膜に沿って蓄積され、遂には末期疾患および尿毒症を引き起こす。同様に、成人または急性呼吸促進症候群(ARDS)は、肺におけるマトリックス物質の有害な蓄積を伴う。また肝硬変は、肝臓の瘢痕(scarring)によって立証される有害なマトリックス蓄積を特徴とする。細胞外マトリックスの有害な蓄積を特徴とする他の病気は糖尿病で、これは進行性腎不全の現在最もよくみられる原因である。ＴＧＦ−βの制御されない合成は、組織線維症発症の土台をなす細胞外マトリックスの有害な蓄積を引き起こす一因子である。ＴＧＦ−βの作用を制御する方法は、組織線維症の治療および予防、ならびにヘルスケアの全般的費用に対し、重大な影響を及ぼすであろう。したがって、ＴＧＦ−βによって誘導される細胞外マトリックス蓄積により生じる組織線維症の治療に対する新しいアプローチを提供する必要がある。本発明はこの必要を満たすものであり、またそれに関連する利点をも提供するものである。発明の概略本発明は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性断片をコードする核酸を被験者の細胞に導入することによる、組織における有害なＴＧＦ−β誘導細胞外マトリックス蓄積を特徴とする被験者の病状を軽減する方法を提供する。１つの実施態様において、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸は、例えば骨格筋への注射によって細胞にin vivoで導入される。別の実施態様においては、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸をex vivo で細胞にトランスフェクトし、上記阻害剤を発現する細胞を得た後、次にこの細胞を治療すべき被験者に移植(transplant)又は移植(graft)する。ＴＧＦ−β特異的阻害剤を発現することができる細胞としては、骨格筋、腎臓、肝臓、肺および皮膚由来の細胞が挙げられる。本発明のＴＧＦ−β特異的阻害剤としては、例えば、プロテオグリカンのデコリン(decorin)ファミリーのメンバー〔デコリン、バイグリカン(biglycan)、フィブロモジュリン(fibromodulin)およびルミカン(lumican)等〕、ＴＧＦ−β特異的レセプター〔βグリカン(betaglycan)およびエンドグリン(endoglin)等〕、およびＴＧＦ−βに特異的な抗体が挙げられる。本発明により軽減されうる病状としては、以下のものが挙げられるがそれらだけに限定されない。すなわち、糸球体腎炎、ARDS、硬変、線維症性癌、肺線維症、動脈硬化、心筋梗塞後の心臓線維症、血管形成後の再狭窄症、腎間隙線維症、瘢痕、および糖尿病関連病態、等の線維症性疾患および病気である。本発明により治療することができる組織としては、腎臓、肝臓、肺または皮膚が挙げられる。本発明はまた、ＴＧＦ−βにより誘導される組織の有害な増殖を特徴とする被験者の病状を軽減する方法を提供する。この方法は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性断片をコードする核酸の被験者の細胞への導入からなり、ここで上記特異的阻害剤またはその活性断片は細胞中で発現され、組織の有害な増殖の抑制をもたらす。ＴＧＦ−β特異的阻害剤の発現は、該阻害剤をコードする核酸を in vivoで直接注射することにより、または細胞をex vivo でトランスフェクトし、その細胞を被験者に移植(transplant)又は移植(graft)することにより、達成することができる。図面の簡単な説明図１は、デコリン発現ベクターを用いてトランスフェクションした後に培養したマウス筋細胞から、ラットデコリンが合成および分泌されうることを示すオートラジオグラフである。デコリン発現ベクターは、センダイウイルス(hemagglut inating virus of Japan)を組み込んだリポソーム（ＨＶＪ−リポソーム：レーン１）またはリポフェクタミン(lipofectamine)^TM（レーン２）に封入した。レーン３は、ＨＶＪ−リポソームに封入したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現ベクターを用いたトランスフェクションを表す。デコリンの位置を左側のマーカーで示す。kD: キロダルトン。図２は、免疫蛍光法マイクログラフであり、これはデコリン発現ベクターの筋肉内注射後のラット腎糸球体におけるデコリンの増加を示す。デコリン発現ベクター（デコリンと表示）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現ベクター（ＣＡＴと表示）を筋肉内注射して５日後に殺したラット由来の腎臓切片を用いて、デコリンに関する免疫蛍光法を実施した。図３Ａおよび３Ｂは、デコリン発現ベクターを筋肉内に注射した糸球体腎炎ラットにおけるＴＧＦ−βの発現低下を示す。図３Ａは、ラットデコリン発現ベクター（レーン１）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現ベクター（レーン２）を注射して６日後に屠殺した糸球体腎炎ラットの腎臓より単離した糸球体ｍＲＮＡのノーザンブロットである。2.5 キロベース(kb)マーカーは、デコリン特異的プローブとのハイブリダイゼーションを表し、他方、1.3 kbマーカーはグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)特異的プローブとのハイブリダイゼーションを表す。図３Ｂは、デコリン発現ベクター（デコリンと表示）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現ベクター（ＣＡＴと表示）を筋肉内注射して７日後に殺した腎炎ラット由来の糸球体におけるＴＧＦ−β免疫反応性細胞の概略を示す。数値は平均±標準偏差である。図４Ａから４Ｆは、デコリン発現ベクターの筋肉内注射後の、腎炎を患った腎糸球体における細胞外マトリックス成分の蓄積の減少を示す。図４Ａおよび４Ｂは、デコリン発現ベクター（デコリントランスフェクションと表示）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現ベクター（ＣＡＴトランスフェクションと表示）を６日前にそれぞれ注射した腎炎ラット由来の腎臓切片の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を示す。切片の暗い部分はＰＡＳ染色を示す。図４Ｃから４Ｆは、正常なラットおよび前もってデコリン発現ベクターまたはＣＡＴ発現ベクターを注射しておいた腎炎ラットにおける、糸球体細胞の免疫反応性ＥＤＡ⁺フィブロネクチン（４Ｄ）、Ｉ型コラーゲン（４Ｅ）またはテナスシン(tenascin)（４Ｆ）の発現、または過ヨウ素酸シッフによる染色（ＰＡＳ；４Ｃ）の概要を示す。６日目および14日目は、腎臓を摘出した時点における、疾患誘導後の時間を示す。数値は平均±標準偏差である。発明の詳細な説明本発明は、組織におけるＴＧＦ−βにより誘導される細胞外マトリックスの有害な蓄積を特徴とする病状を軽減する方法を目的としている。このような方法は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸を被験者の細胞に導入し、被験者における該阻害剤の発現をもたらすことを包含する。このような方法は他の投与方法よりも有利である。なぜなら、内因性の細胞を修飾して上記阻害剤をコードする核酸を発現させることにより、該阻害剤の持続的産生が達成できるからである。１つの実施態様において、ＴＧＦ−β特異的阻害剤デコリンをコードする核酸は、発現ベクターの形で利用可能である。デコリンをコードするベクターを、糸球体腎炎等の線維増殖性疾患を有する被験者の筋肉内に注射する。注射部位における十分なトランスフェクション効率を確保するため、デコリンをコードするベクターをセンダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム構築物に封入する。注射後、デコリンは循環器系中に発現され分泌されて、腎臓に蓄積する。ＴＧＦ−β特異的阻害剤として、デコリンは疾患部位でＴＧＦ−βに結合し、そして細胞外マトリックスの有害な蓄積を阻害することができる。本明細書に用いる「ＴＧＦ−β特異的阻害剤」という用語は、線維増殖性疾患に関連するＴＧＦ−βの活性を阻害することができるタンパク質またはその活性断片を意味するものとする。線維増殖性疾患に関連するＴＧＦ−β活性の１つは、細胞外マトリックスの誘導または蓄積である。そのような疾患に関連する別のＴＧＦ−β活性は、細胞増殖の誘導である。したがって、ＴＧＦ−β特異的阻害剤はこれらの活性の片方または両方を阻害することができる。デコリンは、線維症性疾患および病気を治療するのに用いることができるＴＧＦ−β特異的阻害剤の一例である。ＴＧＦ−β特異的阻害剤の他の例としては、以下のものが挙げられるがそれらだけに限定されない。すなわち、バイグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカン等のデコリンファミリーの分子、βグリカンおよびエンドグリン等のＴＧＦ−βレセプター、それらの可溶性形態のもの及び活性断片、ならびにＴＧＦ−βに特異的な抗体である。ＴＧＦ−β特異的阻害剤はまた、特定のＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸をも含む。ＴＧＦ−β 特異的阻害剤がこのような核酸である場合、ＴＧＦ−βの活性は例えばコードされた阻害剤を被験者の細胞中で発現させることにより阻害される。本明細書に用いる「デコリン」という用語は、Krusius およびRuoslahti（Pro .Natl ．Acad．Sci．(USA)，83:7683-7688(1986)、参考として本明細書中に含まれる）に定義されている構造的特徴を実質的に有するプロテオグリカンおよびその機能的等価物を言う。Krusius およびRuoslahti（前出）に示されるアミノ酸配列を実質的に有するヒト線維芽細胞デコリンとは、天然の構成物および該分子の機能的特徴（例えばＴＧＦ−βの活性を阻害する能力）を実質的に保持しているその改変物の両方を言う。デコリンのコアタンパク質（これはグリコサミノグリカンが結合していないデコリンポリペプチドである）もまた、ここに定義するデコリンの意味に含まれる。酵素処理、突然変異、または他の手段によって、デコリンをグリコサミノグリカンを含まないものにすることができる。他の手段とは、例えば、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質に結合することができない組換えデコリンを細胞中で産生させることである。上記のように、デコリンおよびデコリンコアタンパク質は両方ともＴＧＦ−β特異的阻害剤の例である。デコリンの機能的等価物としては、ＴＧＦ−βの活性を阻害する能力等のデコリンの機能的特徴を保持しているデコリンの改変物が挙げられる。改変としては、例えば、デコリンコアタンパク質のＴＧＦ−β特異的阻害活性を妨害しない、１またはそれ以上のアミノ酸の置換または付加が挙げられる。さらに、デコリンの機能的等価物としては、デコリンとの構造的および機能的関係が共通するプロテオグリカンのデコリンファミリーのメンバー（バイグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカン等）が挙げられる(Funderburghら，J ．Biol．Chem. 268:118 74-11880(1993); Takahashiら，J ．Histochem．Cytochem．41:1447-1457(1993); Yamaguchiら，Nature 346:281-284（1990）およびBlochbergerら，J ．Biol．Ch em. 267:20613-20619(1992)、これらはそれぞれ参考として本明細書中に含まれる)。本明細書で用いる「活性断片」という用語は、全長のＴＧＦ−β特異的阻害剤の一部を意味するものとする。ただし、この一部は対応する全長タンパク質のＴＧＦ−β活性特性を有するものである。したがって、活性断片は組織における細胞外マトリックスの誘導または有害な蓄積を阻止することが可能である。ＴＧＦ −βのデコリンまたは細胞との結合を阻害することができるデコリンの活性断片は当技術分野で公知である（参考としてその全体をここに組み入れるWO 93/2020 2参照）。例えば、デコリンのアミノ末端45残基（システイン残基26からチロシンへの突然変異を含む）を包含する融合タンパク質は、ＴＧＦ−βの活性を阻害することができる(WO 93/20202参照)。デコリンの他の活性断片または他のＴＧＦ−β特異的阻害剤は公知であるか、または当業者が突き止めることが可能である。本発明は、細胞外マトリックスの有害な蓄積を特徴とする病状を軽減するのに用いることができる。種々の疾患がコラーゲン、フィブロネクチンおよび他のマトリックス成分を含む細胞外マトリックスの有害な蓄積によって特徴付けられる。これらの疾患としては、例えば、糸球体腎炎、成人または急性呼吸促進症候群 (ARDS)、糖尿病性腎臓疾患等の糖尿病関連疾患、肝臓および肺の線維症性疾患、および心筋梗塞後の心臓線維症が挙げられる。また、線維細胞疾患、線維硬化、ならびにフィブロイド、線維腫、線維腺腫および線維肉腫を含む乳房、子宮または膵臓等の線維症性癌も含まれる。さらに、コラーゲン、フィブロネクチンおよび他のマトリックス成分の増加を伴う細胞外マトリックスの有害な蓄積に関連した種々の病状がある。このような病状は、例えば、心筋梗塞後の心臓線維症、血管形成後の再狭窄症および腎間隙線維症；ケロイド痕跡および傷害、火傷または手術による痕跡等の過剰な痕跡を含む。本明細書に用いる「病状を軽減する」という表現は、病状に関連した少なくとも１つの特徴の軽減を意味する。例えば、糸球体腎炎は、細胞外マトリックスの増加または細胞過多により引き起こされ、腎機能の喪失をもたらす硬化等の病状によって特徴付けることができる。本発明による糸球体腎炎の治療の結果として起こる硬化の減少は、本明細書で定義される病状の軽減の一つである。本発明を用いて病状を軽減することが可能なので、したがって本発明は疾患の治療に有用である。細胞外マトリックスの有害な蓄積をもつものとして本明細書に開示される疾患および状態は、線維症性疾患または線維症状態として知られている一般的カテゴリーに含められる病状において十分に類似している。現在、ＴＧＦ−βがこのような疾患および状態の重要な原因因子であるという、ヒト疾患の動物モデルおよびヒト疾患の両方に由来する圧倒的な証拠が存在する（総論については、Border およびRuoslahti，J．Clin．Invest.，90:1-7(1992)ならびにBorderおよびNoble ，New Engl．J．Med．331:1286-1292（1994）参照。これらの両方を参考として本明細書中に組み込んである）。ＴＧＦ−βは、コラーゲン、フィブロネクチンおよび他のマトリックス成分の産生を刺激することにより、そして部分的には組織における間葉細胞の増殖を刺激することにより、これらの病状を媒介する。間葉細胞の増殖は、膨張する細胞によって産生される細胞外マトリックスの有害な蓄積をもたらし、これは実質組織を遮断し、それによって器官機能を破壊する。本発明の方法は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤を被験者に発現させることにより、被験者のこのような病状を治療または予防するのに用いることが可能である。したがって、本発明の方法はこのような病状を治療するための薬剤として有用である。本発明はＴＧＦ−β特異的阻害剤を用いてＴＧＦ−βを阻害することによる細胞外マトリックスの有害な蓄積を減少させる方法に関するが、そのような阻害剤が働く作用機構は重要ではない。例えば、ＴＧＦ−β特異的阻害剤は、例えばＴＧＦ−βに結合しＴＧＦ−βがそのレセプターと結合するのを阻止することにより、ＴＧＦ−βを直接抑制することができるし、あるいは、例えばＴＧＦ−β の合成若しくは分泌を阻害することにより、またはＴＧＦ−βを標的細胞から隔離することにより、ＴＧＦ−βの活性を間接的に阻害することができる。さらに、本明細書に１つグループとして開示される病状は単に代表的なものであって、当業者であれば本発明の方法は細胞外マトリックスの有害な蓄積に関連する任意の病状に有用であることが容易に認識されるであろう。ＴＧＦ−βは、通常は組織損傷の結果おこる修復および再生を調節する多機能性サイトカインである。正常な組織修復の間、ＴＧＦ−βの産生は増大して修復プロセスを刺激し、そして修復が完了するとＴＧＦ−βの発現は減少する。正常な組織修復の後にＴＧＦ−βの発現が減少しない場合は、線維症が起こりうる。したがって、持続的なＴＧＦ−β産生を引き起こす組織傷害の繰り返しまたはＴＧＦ−β調節における欠陥は、組織線維症の土台をなす細胞外マトリックスの有害な蓄積をもたらす(Border およびNoble、前出）。ＴＧＦ−βは391アミノ酸の前駆体分子として合成される。この分子はタンパク質加水分解的に開裂され、ペプチド断片および112アミノ酸サブユニットを生じる。活性ＴＧＦ−βは、ジスルフィド結合によって結合された２個の112 アミノ酸サブユニットからなる25キロダルトン(kD)の二量体タンパク質である。ＴＧＦ−βは、活性化を必要とする不活性な、または潜在的な形態で分泌された後、生物学的効果を発揮できるようになる。ＴＧＦ−βの潜在的形態は、ＴＧＦ−β 二量体と前駆体ＴＧＦ−βの開裂断片（潜在性関連ペプチドとして知られている）との間で形成された高分子量複合体である。潜在性ＴＧＦ−βは細胞表面および細胞外マトリックス中に保存され、そして未知の作用機構によって活性ＴＧＦ −βに変換される。この説明に拘束されることは望まないが、コラーゲン、フィブロネクチンおよび他のマトリックスタンパク質の産生を刺激するＴＧＦ−βの能力は、特異的細胞表面レセプターとの結合によって媒介される。ＴＧＦ−βは、事実上あらゆる型の細胞上に存在する、Ｉ型、II型およびIII 型レセプターと呼ばれる３つの膜タンパク質と結合することが立証された。Ｉ型およびII型レセプターは、相互に作用して細胞内シグナリングを容易にする膜貫通セリン-トレオニンキナーゼドメインを含んでいる。ベータグリカンとしても知られているIII 型レセプターは、Ｉ型およびII型レセプターによるＴＧＦ−βの認識を容易にする膜固定(membr ane-anchored)プロテオグリカンである。細胞外マトリックス成分の合成および沈着に及ぼすＴＧＦ−βの効果はＩ型レセプターによって媒介され、他方、細胞増殖に及ぼすＴＧＦ−βの効果はII型レセプターによって媒介される。細胞増殖に及ぼすＴＧＦ−βの効果は複雑であるが、有用な一般化は以下の通りである。すなわち、間葉に由来する細胞の増殖はＴＧＦ−βによって一般に刺激されるが、上皮細胞の増殖は阻害される。ＴＧＦ−βはまた間葉に由来する細胞における細胞外マトリックス生成を刺激し（参考として本明細書に組み入れる Okudaら，J．Clin．Invest．86:453-462(1990)）、そしてこれもまたデコリンによって阻害することができる(Borderら、前出)。数種類の癌細胞および腫瘍は、腫瘍増殖のためのＴＧＦ−β活性に依存する。この例としては、対応するヒト悪性腫瘍の特徴を忠実に再現するマウス中皮腫瘍(Fitzpatrickら，Growth Factors 11:29(1994))、線維肉腫(Spermanら，Gene 149:25(1994)）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞(YamaguchiおよびRuoslahti，Nature 336:244-246(1988))が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＴＧＦ−β活性を抑制することにより、これらのモデルにおける腫瘍増殖はＴＧＦ−βの上昇と結びついていることが示された。本発明のＴＧＦ−β特異的阻害剤を使用すると、動物モデルにおけるＴＧＦ− βによって誘導された急性メサンギウム増殖性糸球体腎炎の発現がうまく阻害された（実施例ＩおよびIV参照）。抗胸腺細胞血清の静脈注射によって腎炎にさせたラット由来の糸球体は、ＴＧＦ−β ｍＲＮＡおよびＴＧＦ−βタンパク質合成の増加によって特徴づけられ、有意に多いフィブロネクチンおよびプロテオグリカンを分泌する(Okudaら、前出)。このラット腎炎モデルは、ヒト糸球体腎炎および糸球体硬化、そして特にヒトメサンギウム増殖性糸球体腎炎にあてはまる。なぜなら、上記モデルは、これらのヒト疾患の重要な特徴のすべてを再現するからである(YamamotoおよびWilson，Kidney Int．32:514-525(1987); Bagchusら，Lab．Invest．55:680-687(1986)およびBorder，Kidney Int．34:419-434(1988 ))。糸球体腎炎ラットの糸球体における細胞外マトリックス成分産生の抑制、およびメサンギウムマトリックスの有害な蓄積の阻害が、ＴＧＦ−βに特異的な中和性抗体の静脈内投与によって(参考として本明細書中に組み入れるBorder ら， Nature 346:371-374(1990))、または精製デコリンの投与によって（実施例Ｉおよび参考としてここに組み入れる Borderら，Nature 360:361-364(1992)参照）達成された。糸球体硬化は、例えば原発性糸球体腎炎、糖尿病性腎症およびループス腎炎を含む種々の疾患にとって、腎機能の進行性喪失に至る最終的な共通経路であると考えられている。これらの疾患は、ＴＧＦ−βの作用によって部分的に媒介されるメサンギウム細胞の増殖および／または細胞外マトリックスの膨張を伴うという共通の病状によって特徴付けられる。本明細書に記述するように、ＴＧＦ−β 阻害剤をコードする核酸の被験者の細胞への遺伝子導入を用いて、腎臓におけるＴＧＦ−β誘導メサンギウム細胞増殖および細胞外マトリックスの有害な蓄積を阻害することにより、糸球体硬化に関連する病状を軽減することができる。本明細書に記述するように、ここに開示する本発明の方法の実行可能性は、抗胸腺細胞抗血清によって誘導された糸球体腎炎の急性メサンギウムモデルにおいて実証された。例えば、ラットの骨格筋にデコリンをコードする核酸を注射することができる。骨格筋は高度に血管が分布しているので、筋肉細胞によって発現されたデコリンは血流に入り、身体の他の部位へ運ばれ、そこで細胞外マトリックスと結合し、ＴＧＦ−βの活性を阻害する。本明細書に用いる「ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸」という表現は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。デコリンｃＤＮＡはＴＧＦ−β阻害剤をコードする核酸の一例である。外因性遺伝子をin vivoで発現する方法は、本明細書では遺伝子導入という用語により定義される。遺伝子導入はＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸を in vivoで直接注射することによって、または細胞をex vivo でトランスフェクトして上記阻害剤を発現する細胞を獲得し、次にこれを治療すべき被験者に移植することにより、実施することができる。本明細書に用いる「ＴＧＦ−β特異的阻害剤を発現する細胞」という表現は、細胞に提供された核酸によってコードされる上記阻害剤を産生および分泌することができる細胞を意味する。ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードするヌクレオチド配列を、発現制御エレメントに機能を発揮できるように連結して、発現ベクター中にクローニングすることが可能である。構成プロモーターに機能を発揮できるように連結されたヒトデコリンヌクレオチド配列を含むpAct核酸発現ベクターは、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする核酸の具体例である。発現制御エレメントは当該技術分野で周知であり、例えばプロモーター、エンハンサー、並びに適切な開始および停止コドンを含む。デコリン遺伝子導入の方法は他のＴＧＦ−β特異的阻害剤の遺伝子導入にとっても有用である。本発明の種々の作用物質をコードするｃＤＮＡ配列またはゲノム配列は、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードするのに有用である。そのような配列は公知で、公衆が利用できるＤＮＡデータバンクから入手可能であり、またそれらの遺伝子はＰＣＲによってクローニングするか、または化学的に合成することができる。当該技術分野で公知のｃＤＮＡ配列は、例えばフィブロモジュリン (Antonssonら，Biochem．Biophys．Acta．1174:204-206(1993))、バイグリカン( Fisherら，J．Biol．Chem．264:4571-4576(1989))、ルミカン(Blochbergerら、前出、1992)、ベータグリカン(Fukushimaら，J．Biol．Chem．268:22710-22715( 1993)および Lopez-Casillasら，Cell 67:785-795(1991))およびエンドグリン(S t-Jacquesら，Endocrinology 134: 2645-267(1994))を含む。各参照文献を参考として本明細書中に組み入れる。本明細書に用いる「抗体」という用語は、完全な大きさの抗体分子、またはＴＧＦ−β等の免疫原との特異的結合性を保持するＦａｂ、Ｆ(ａｂ')₂、ＦｖおよびＦｄ断片等の断片を含む。天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体、並びに結合活性を保持する抗体断片もまた本明細書に開示する抗体である。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成法を用いて構築することができ、また例えば、参考として本明細書に組み入れるHuseら、Scinece 246:1275-1 281(1989)が記述するように、可変部Ｈ鎖および可変部Ｌ鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ＴＧＦ−βの活性を中和するＴＧＦ−βに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、本明細書に参考として組み入れるHarlowおよびLane，Antibodies: A labo ratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))が記述する周知のハイブリドーマ作製法を用いて、免疫感作した齧歯類または他の動物から調製することができる。天然の供給源から調製するか、遺伝子組換えによって産生するか、または化学的に合成することができるＴＧＦ−βまたはその一部を、免疫原として用いることができる。ＴＧＦ−β特異的阻害剤として機能するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する方法は、例えば、放射線標識化ＴＧＦ−βとＨｅｐＧ２細胞等の標的または精製デコリンとの結合の阻害剤を検出するアッセイを利用することができる（実施例ＩおよびWO 93/20202参照）。ＴＧＦ−βに特異的なモノクローナル抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、上記抗体を分泌するハイブリドーマ細胞由来の配列をクローニングすることにより得ることができる。抗体遺伝子をクローニングする方法は当該技術分野で周知である（例えば、参考として本明細書に組み入れるBorrebaeck，An tibody Engineering: A Practical Guide,(W.H Freeman and Co.，New York，19 91)）。ＴＧＦ−βの活性を阻害するヒト化抗体は、ＴＧＦ−βに特異的な齧歯類または他の動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン分子のＨ鎖およびＬ鎖可変部由来のヌクレオチドフレームワーク配列に移植することにより作製することができる。ヒト免疫グロブリン可変部フレームワークおよび定常部ヌクレオチド配列は当該技術分野で周知である。ヒト免疫グロブリン配列をコードするｃＤＮＡは、公衆が利用可能な遺伝子レポジトリー(repository)より入手可能であり、また、これも公的な細胞レポジトリーより入手可能なヒトリンパ様細胞系からクローニングすることができる（例えば、American Type Culture Collection，Rockville MD参照）。ＣＤＲ移植により抗体をヒト化する方法もまた当分野で周知である（例えば、Borrebaeck、前出、1991; Reichmannら，Nature 332:233(1988); Queenら，Proc．Natl．Acad ．Sci.(USA)86:10029(1989);これらを参考として本明細書に組み入れてある）。さらに、齧歯類または他の動物の抗体をヒト化形態に変換する際に最初の結合親和性及び特異性を維持するために、分子モデリングおよび突然変異誘発アプローチを使用する方法もまた当該技術分野で周知である（例えば、Borrebaeckら、前出、1991参照）。本明細書に開示する遺伝子導入によりＴＧＦ−β特異的阻害剤の発現を得るために有用な種々の発現ベクターおよび遺伝子導入法は、当該技術分野で周知である（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: A laboratory manual(Cold Spri ng Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M.，Gene Transfer and Express ion: A Laboratory Manual（W.H．Freeman and Co.，New York NY，1990）およびWu，Meth．in Enzymol.，(Academic Press，New York，1993)参照; これらを参考として本明細書に組み入れる）。ベクターまたは方法の選択は、特定のＴＧＦ−β特異的阻害剤およびある組織において病状の軽減を得るために必要とされる該阻害剤の量、等のいくつかの因子に依存する。例えば、特定のＴＧＦ−β特異的阻害剤の細胞における発現レベルは、細胞の性質、該阻害剤をコードするヌクレオチド配列に機能を発揮できるように連結した調節領域、および該阻害剤それ自体、等の多数の因子に依存し得る。さらに、in vivoで組織中で達成されうるＴＧＦ−β特異的阻害剤の発現レベルは、in vivoにおける産生部位および該阻害剤の薬物動態学的特性、等の他の因子にも依存し得る。本発明で開示される方法は、開業医の所望する組織中でTGF-β特異的阻害剤を必須レベルで発現させるために、ベクター、調節領域、トランスフェクトされた細胞型等のファクターと遺伝子送達方法との適当な組み合わせを選択する際の助けとなる点で有用である。本明細書中で開示されたin vitroトランスフェクション法により、特定の細胞での発現について、ベクター、調節因子及びTGF-β特異的阻害剤の属性等のパラメーターを評価することができる。例えば、実施例IIに記載されているベクター、すなわちpAct-Decベクターは、ニワトリβ-アクチン構成プロモーターに機能を発揮できるように結合しているデコリン(decorin)をコードする遺伝子を有しており、最初は培養筋細胞でin vitro トランスフェクションにより試験し、その後にin vivo で骨格筋への遺伝子導入を試みた（実施例II参照）。本明細書中で開示する結果から、骨格筋は、血液中に入り骨格筋から遠く離れた部位の病状を軽減することができるTGF-β特異的阻害剤の発現を得るための便利かつ有用な部位であることが分かる。また、本発明に適した遺伝子導入法は、筋細胞以外の細胞にも適用できる。このような細胞としては、例えば特定の器官の上皮細胞が挙げられる。TGF-β特異的阻害剤をコードする核酸を、特定の組織中又はその付近に位置する細胞型に向かわせることより、上記阻害剤の上記組織中での濃度をより高くすることができる。選択的細胞型発現を可能にする組織特異的発現制御因子は、当該技術分野で知られており、例えば、筋細胞又はリンパ球細胞に対して発現を制限する筋クレアチンキナーゼエンハンサーが挙げられる。様々な方法を用いて、TGF-β特異的阻害剤をコードする核酸を in vivo注入部位の細胞に導入することができる。例えば、上記核酸を単独で注入することができるし、リポソーム若しくは血球凝集を生じさせるセンダイウイルスと結合させたリポソーム中に封入でき、又はウイルスベクター中に封入することもできる。一つの態様において、上記核酸をpActベクター中にクローニングし、リポソーム HVJ 構築物中に、注入前にベクターを封入する。核酸分子を単独で又は封入（例えば、陽イオン性リポソームへ封入）して直接注入することにより、in vivo の非分裂細胞又は分裂細胞へTGF-β特異的阻害剤をコードする核酸を安定して遺伝子導入することができる(Ulmerら.,Science 25 9: 1745-1748（1993）、これを本明細書中に参考として組み入れる)。さらに、粒子衝撃法(particle bombardment method)を用いて、上記核酸をin vivo の様々な組織に導入することができる(Williams ら.,Proc ．Natl．Acad．Sci. USA 8 8: 2726-2730（1991）、これを本明細書中に参考として組み入れる)。細胞融合を促進させるセンダイウイルスをとり込んだリポソーム中に上記核酸を封入し、本発明の核酸の遺伝子送達に用いることができる。特に、the hemagg lutinating virus of Japan はセンダイウイルス(Z株)であり、ex vivo法及びin vivo 法によって細胞をトランスフェクトすることにより、TGF-β特異的阻害剤を発現させる効果的手段を提供する（実施例II及びIII参照）。HVJ-リポソーム法を用いる遺伝子導入の効率は、リポフェクアタミン（Lipofectamine^TM）によって産生されるリポソームを用いる場合よりも、驚くほど高い（実施例２及び３参照）。ウイルスベクターは、TGF-β特異的阻害剤をコードする核酸をin vivo 又はin vitroの特異的細胞中へ遺伝子導入するのに有用である。ウイルスは、特異的細胞型に感染し増殖できる特殊感染性病原体である。この特定の細胞型へ感染するための特異性は、TGF-β特異的阻害剤を選択された細胞にin vivo でターゲッティングするのに特に適している。ウイルスベクターの選択は、部分的には、ターゲッティングされる細胞型に依存しているであろう。特殊ウイルスベクターが特異的細胞型をターゲッティングできることは、当該技術分野でよく知られている。このようなベクターとしては、例えば、神経細胞をターゲットする単純ヘルペスウイルス由来のベクター(Battlemanら.,J.Neuros ci .13:941-951(1993)、これを本明細書中に参考として組み入れる)、造血細胞をターゲッティングする免疫不全ウイルス(Carrollら.,J.Cell ．Biochem. 17E: 24 1(1993)、これを本明細書中に参考として組み入れる)、及び一般的プロモーター又は組織特異的プロモーターを有する組換えアデノ関連ウイルスベクター(Lebko wskiら．米国特許第5,354,678 、これを本明細書中に参考として組み入れる)が挙げられる。組換えアデノ関連ウイルスベクターは、静止した非増殖性細胞であったもそのクロマチンへ安定して組み込まれ得るという別の利点をも有している (Lebkowskiら.,Mol ．Cell．Biol. 8: 3988-3996(1988)、これを本明細書に参考として組み入れる)。ウイルスベクターは、上記ベクター中に組織特異的プロモーター又はエンハンサーを組み込むことによって、コードされるTGF-β特異的阻害剤を発現する細胞型をいっそうコントロールするように構築してもよい(Daiら.,Proc ．Natl．Acad ．Sci．USA 89: 10892-10895（1992）、これを本明細書中に参考として組み入れる)。また、ウイルス又はその他のベクターは、構成プロモーターの制御下にあるTGF-β特異的阻害剤をコードするヌクレオチド配列を有していてもよい。本明細書中で開示されているpAct-Decベクターは、本発明において有用な構成発現ベクターの一例である（実施例II参照）。レトロウイルスベクターは、本明細書中で開示されている遺伝子導入方法に好適である。このようなベクターは、感染性粒子又は感染の単回の開始段階のみが進行する非感染性粒子のいずれかとして機能するように構築することができる。前者の場合、ウイルスのゲノムは修飾され、ウイルスは、必須遺伝子、調節配列及びパッケージングシグナルを保持し、新しいウイルスタンパク質及びウイルスＲＮＡを合成するようになる。しかし、これらのウイルスのがん遺伝子としての潜在性を付与する遺伝子は破壊又は除去される。上記ウイルスタンパク質が合成された後、宿主細胞は上記ウイルスＲＮＡを新しいウイルス粒子中にパッケージし、さらなる感染段階が進行し得る。また、上記ウイルスゲノムも所望の組換え遺伝子をコードし発現するように遺伝子操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ヘルパーウイルスゲノムは、ウイルスの構造タンパク質をコードするために必要不可欠な構造遺伝子を提供するために必要とされる。しかし、ヘルパーウイルスが突然変異すると、ヘルパーウイルスＲＮＡをウイルス粒子中に封入するために必要なウイルスパッケージングシグナルが損なわれるようになる。従って、上記の目的の遺伝子及び機能性パッケージングシグナルは包含するがウイルス構造遺伝子は欠損している上記組換えウイルスベクターのみが、ウイルス粒子中に組み込まれ得る。この新しいウイルスは、標的細胞に感染することはできるが、ウイルスの構造遺伝子を有していないので、さらなる感染性ウイルスを産生することはできない。ウイルスベクターを構築する方法及び使用する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えばMiller及び Rosman，Biotechniques 7: 980-990（1992）並びにDavison及びElliot，Molecul ar Virology: A Practical Approach (IRL Press，New York，1993)に記載されている。そして、これらの双方を本明細書中に参考として組み入れる。 TGF-β特異的阻害剤をコードする発現ベクターを作製するために、当該技術分野の様々なベクター及びプロモーターを利用することができる。重要な特徴は、プロモーターは所望の細胞型で発現するような機能を有していること、及びベクターは患者に治療効果を与えるのに十分な時間、細胞中に保持されることである。レセプター媒介ＤＮＡ送達アプローチを使用して、組織特異的リガンド又は架橋分子により対象の核酸分子と共有結合していない抗体を用いて組織特異的に、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードする前記核酸分子を細胞に送達することもできる（Curielら，Hum．GeneTher.，3:147-154(1992);Wu およびWu，J．Biol．Chem .，262:4429-4432(1987)，これらの文献はそれぞれ参考として本明細書中に含まれる。）。患者内でＴＧＦ−β特異的阻害剤を発現させるための遺伝子導入は、例えば、 ex vivo における自己細胞のトランスフェクションによっても行うことができる。このようなex vivo トランスフェクションに適した細胞としては、血球細胞が挙げられる。なぜなら、血球細胞は、当技術分野で公知の手法により、操作および患者中への再導入が容易だからである。同種異系細胞のような非自己細胞も、その組織適合性抗原が治療の対象となる患者のものと同じであれば、使用可能である。 ex vivo トランスフェクションによるＴＧＦ−β特異的阻害剤の遺伝子導入は、該阻害剤を発現する安定した細胞群を選択できるので、高レベル発現を得るのに有益である。さらに、適当な条件下でコード配列の増幅を生じ、ベクター中への薬物選択マーカーの取り込みにより、発現レベルを更に高めることができる。このような選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子またはグルタミンシンセターゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物中の遺伝子選択及び遺伝子増幅の手法は当技術分野で公知である（例えば、Sambrookら、前出、を参照）。ＴＧＦ−β特異的阻害剤の高レベル発現を得る別のアプローチは、異なる薬物耐性遺伝子を有する複数のベクターを用いてトランスフェクションおよび選択を多数回行うことである。 ex vivo での細胞のトランスフェクションによる遺伝子導入は、例えば、リン酸カルシウム沈降、ジエチルアミノエチルデキストラン、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはウイルス感染など、様々な手法によって行うことができる。このような手法は当技術分野で公知である（例えば、上述のSambrookら及びWu、、前出、(1993)参照）。いったん細胞をトランスフェクトしたら、次にそれらを治療の対象となる患者に移植（transplant）又は移植（graft）して戻す。いったん体内に導入された細胞はＴＧＦ−β特異的阻害剤を産生することができ、循環器系に進入して疾患又は病気の部位におけるＴＧＦ−βの活性を阻害することができる。遺伝子導入をin vivo トランスフェクションによって行うか、ex vivo トランスフェクションによって行うかは、特定のＴＧＦ−β特異的阻害剤の発現を得るために使用するベクターの選択に影響を及ぼし得る。例えば、ＴＧＦ−βへの中和抗体の遺伝子送達には、単鎖抗体デザインを使用しないかぎり、抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両方を別々に発現させることが必要である。遺伝子導入の手法としてex vivo トランスフェクションを選択し、ＴＧＦ−β特異的阻害剤をコードするためにゲノム配列を選択した場合には、抗体のそれぞれの鎖は別々のベクターによってコードすることができる。この場合は、２つのベクターの連続した別々のトランスフェクション若しくは両方のベクターを用いた同時トランスフェクション及び２元的薬物選択によって、完全抗体の発現を達成することができる。プロテオグリカンのデコリンファミリーのメンバーの、in vivo におけるコード核酸の直接注入による遺伝子導入は、単一ベクターデザインによって達成することができる。抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両方が同一のベクター中にコードされている単一ベクター（二重鎖(dual chain)ベクターとして知られている）を用いて、 in vivo でもex vivo でも遺伝子導入によって抗体を発現させることができる。抗体発現に適した二重鎖発現ベクターは、当業者に公知である（例えば、Borreb aeck、前出、（1991）及びPhelpsら，J ．Immunol.，145:1200-1204（1990）参照。これらの文献は両方ともに参考として本明細書中に含まれる。）。あるいは、 in vivo における核酸の直接注入による抗体の遺伝子導入は、それぞれが抗体の免疫グロブリンＨ鎖又はＬ鎖をコードする２つの発現ベクターの混合物を導入することにより達成できる。線維性疾患を有する様々な動物モデルは当技術分野で公知であり、本明細書に開示のＴＧＦ−β特異的阻害剤を用いる遺伝子導入の効力を試験するのに利用できる。これらの動物モデルの例としては、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の急性ラット抗胸腺細胞血清モデル（実施例III 及びIV参照）、および抗胸腺細胞血清を繰り返し注入することにより作製される、糸球体疾患の慢性モデル（Yamamoto ら、前出）が挙げられる。前記慢性モデルは、尿タンパク質、血中尿素窒素および細胞外マトリックスのレベルが上昇することを特徴とする進行性糸球体疾患を発症する。前記慢性糸球体腎炎疾患モデルは、細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする進行性管状間隙性疾患を有する点で、前記急性モデルとは区別される。アンジオテンシンIIの慢性投与により、動物中に腎症を誘発することもできる（Millerら，Amer ．J．Physiol．(Renal Fluid Electrolyte Physiol.)，30:F54 9-F465（1991）、この文献は参考として本明細書中に含まれる。）。このモデルでは、0.01Ｎ酢酸溶液としてアンジオテンシンIIを100ng/min で送達するポンプ（Alza Corp．Palo Alto CA）をラットの頸部に外科的に埋め込んで、アンジオテンシンIIを送達し、対照ラットには0.01Ｎ酢酸の入っている同じポンプを埋め込むことができる。１週間の処理の後、アンジオテンシン処理ラット糸球体では、細胞外マトリックスの蓄積を伴うコラーゲンＩ型ｍＲＮＡ発現及びＴＧＦ−β の特異的及び実質的な増加が見られた。このマトリックスの蓄積は、精製ヒトデコリンの静脈内投与により抑制することができる。ヒト糖尿病性腎症用のストレプトゾトシン（streptozotocin）ラットモデルを使用して、ＴＧＦ−β特異的阻害剤を用いる遺伝子導入の効力を試験することができる。糖尿病は、文献（Velasquez ら，FASEB 4:2850(1990)，Mauerら，Diabe tes 25:850(1976)，及び米国特許出願第07/885,674号、これらの文献はそれぞれ全ての内容が参考として本明細書中に含まれる。）の記載に従って、ストレプトゾトシン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を6.5mg/100g体重でクエン酸緩衝液溶液として、単回静脈注射することにより、150gの雄のSprague-Dawleyラット中に誘導することができる。以下の実施例は、本発明を例示によって説明するものであり、何ら限定するものではない。実施例Ｉ精製デコリン(Decorin)の静脈内投与本実施例は、精製デコリンを用いて、糸球体腎炎の実験モデルにおける細胞外マトリックスの有害な蓄積を減少させる使用のための方法を提供する。糸球体中に存在するフィブロネクチンの量は、デコリンの糸球体腎炎においてマトリックスの沈着を阻害する能力を定量的に評価するために使用した。Ａ．デコリンの精製デコリンの発現デコリンを、以下のデコリン発現CHO 細胞を用いて産生した。Krusius とRuos lahti(前出，1986)の論文に記載された1.8kb の全長デコリン cDNA を、デコリン発現ベクターの構築に使用した。デコリン・コアタンパク質の発現のためにcD NAを突然変異させ、４番目のコドンであり、かつセリンをコードするTCT をトレオニンをコードするACT 、またはアラニンをコードするGCT に変化させた。これを、Kunkel(Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 82:488(1985))の方法に従い、部位特異的突然変異によって遺伝子操作した。Kunkelの論文は、参考文献として、本明細書中に取り込まれるものとする。適当な突然変異の存在は、DNA 配列決定によって証明した。デコリン cDNA または突然変異させたデコリン cDNA を、pSV2の3.4kb Hind I II-Bam HI 断片(Mulligan とBerg，Science 209:1423(1980)、この論文は参考文献として本明細書中に取り込まれているものとする)中にライゲーションして、哺乳類の発現ベクターである、pSV2-decorinおよびpSV2-decorin/CP-thr4 corep rotein(cp)を構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)−陰性CHO 細胞(CHO-DG44)を、pSV2-decorin またはpSV2-decorin/CP と、pSV2dhfrとを用いて、リン酸カルシウム法にて同時トランスフェクションした。pSV2-decorinでトランスフェクションしたCHO-44DG 細胞を、受託番号ATCC No．CRL 10332として、American Type Culture Collecti onに寄託した。トランスフェクションした細胞を、９％の透析ウシ胎児血清、２ mMのグルタミン、100 ユニット/mL のペニシリン及び100 ttg/mLのストレプトマイシンを添加したヌクレオシド不含α−修飾最小必須培地(α−MEM，GIBCO，Lon g Island)で培養した。トランスフェクトした細胞から生じたコロニーを、クローニング用シリンダー(cloning cylinders)で拾って拡げ、³⁵SO₄-標識培養上清から免疫沈降によってデコリンの発現をチェックした。その後、実質的な量のデコリンを発現しているクローンを、メトトレキセート(MTX)の濃度を段階的に0.6 4μM まで増加させる遺伝子増幅に供した(KaufmanとSharp，J ．Mol．Biol. 159: 601(1982)、この論文は参考文献として本明細書に取り込まれているものとする) 。すべての増幅された細胞系を、限界希釈法またはMTX 耐性のシングルコロニーを拾う方法のいずれかでクローニングした。これらの確立された細胞系の保存培養物は、MTX-含有培地中で維持した。タンパク質の産生に使用する前に、細胞を保存培養物からMTX-不含培地で予備培養し、この培地中で少なくとも１回継代し、可能性のあるMTX の影響を除いた。また、デコリンの大規模産生を、マイクロキャリアービーズに付着させたCHO 細胞を用いて行った。上記のようなデコリン−発現CHO 細胞がマイクロキャリアービーズに付着したのちに懸濁培養した。デコリン−発現細胞の種培養が確立された後に、培養反応槽に種培養を植え込み、所望の細胞密度となるまで対数増殖期の培養を続けた。このときに、新鮮な培地をゆっくりと反応槽中で灌流させ、反応槽容量の約80〜85％の割合で、毎日、馴化培地を集めた。デコリン産生細胞が失われないように、灌流液から細胞含有マイクロキャリアーを分離するよう注意した。収穫した培地を、濾過前に、４℃で24時間インキュベートし細胞破砕物を除去した。マイクロキャリアー培養で産生された40ＬのCHO 細胞培養液からデコリンを精製した。ベンズアミジンとNa₄EDTA の溶液を、１倍の終濃度となるように培地に加えた(100倍の溶液は100mM のベンズアミジンと500mM のNo₄EDTA である)。ワットマン#1の濾紙で培地を濾過し、NaCl濃度を0.4Mに調整した。デコリンの精製 Q-セファロースカラムを、エタノールを除去するためカラムの10倍容の脱イオン水を入れた溶融ディスクガラスロート中で、300mL の樹脂(Q-Sepharose fast flow gel; Pharmacia，Piscataway NJ))を洗浄することにより、Q-セファロースカラムを調製した。このQ-セファロースを脱気し、フローアダプターをつけた10 cm×30cmのカラム中に入れた（内径9.6mm のチューブをつけたWatson/Marlow ペリスタチックポンプ）。気泡トラップ及びポンプをカラムにつなぎ、ついでカラムの10倍容のバッファーＡ(25mM Tris，pH7.8，0.4 M NaCl)を用いて200mL/分の流速で平衡化した。280nm におけるUV吸収、1.0 AUFS(吸光度単位、フルスケール))を測定した。検出器はバッファーＡを用いてゼロに合わせた。細胞培養用培地を流速200mL/分でカラムにロードし、通過液を集めた。カラムをバッファーＡ（１Ｌ）で洗浄した。このカラムをバッファーＢ((1.5L)25mM Tr is，pH7.8，１M NaCl)で溶出し、１分の画分を集めた。溶出されたピークをプールし、容量を記録し（普通１〜1.5 リットル）、280nm および260nm の吸光度を測定した。後者の読み取り値を、Q-セファロースカラムでデコリンと同時溶出された核酸の検出のために使用した。１容量（プールされた容量に等しい）の２Ｍグアニジン塩酸(GuHCl)を添加し、サンプルをオクチルセファロースカラムにロードした。焼結ガラスロート中でカラムの10倍容の脱イオン水を用いて、60mLのオクチルセファロースゲル(Pharmacia)を洗浄してエタノールを除き、オクチルセファロースカラムを調製した。このゲルを脱気し、２つのフローアダプター(Pharmacia )をつけた2.6cm ×30cmのウォータージャケット付きカラム（これは、正しい位置にゲルがきっちり詰められ、維持されている。）に入れた。カラムを、冷却循環器を用いて25℃で維持した。UVモニター(280nm)をつなぎ、バッファーＣ((カラムの10倍容または600mL)0.1M NaOAc，pH6.3，1M GuHCl;0.2μM のアセテートフィルターで濾過し脱気した)を用いてゼロに合わせた。 Q-セファロースカラムから集めた画分を３ mL/分の流速でオクチルセファロースカラムにロードし、サンプルを２分／画分（６mL／チューブ）で集めた。ベースラインが安定するまでカラムをバッファーＣで洗浄し、ついで同じベースラインが安定するまでバッファーＤ(0.1M NaOAc，pH6.3，2M GuHCl;0.2μM のアセテートフィルターで濾過し脱気した)で洗浄した。デコリンをバッファーＥ((200mL)0.1M NaOAc，pH6.3，3M GuHCl)を用いて３ m L/分の流速で溶出した。少量のタンパク質の夾雑物が、デコリンとともに溶出された。280nm と260nm とでの吸光度を測定することにより、溶出プロファイリングを行い、O.D.280 の吸光度のほとんどがデコリンによるものであり、核酸によるものではないことが示された。その後、カラムをバッファーＦ((150mL)0.1M N aOAc，pH6.3，4M GuHCl;0.2μM のアセテートフィルターで濾過し脱気した)で溶出し、未同定の200kDaのタンパク質とかなりのヒストンタンパク質とを除去した。このカラムをバッファーＧ((150mL)0.1M NaOAc，pH6.3，8M GuHCl;0.2μM のアセテートフィルターで濾過し脱気した)でストリッピングし、さらに多くの宿主細胞の夾雑タンパク質を除去した。デコリンを含む３ＭのGuHCl 画分を、50mM NaPO₄を含む溶液で、pH7.4 にて1: 10に希釈した。Q-セファロースカラム(Pharmacia)を、50mM NaPO₄(pH7.4)，0.4M NaClを含むバッファーで平衡化し、希釈したデコリン溶液に３ mL/分の流速でカラム上でポンプで圧をかけた(内径1.52mmのPVC マニホールドチューブをつけたMinipuls 2ペリスタルチックポンプ; Gilson; Middleton，WI)。このカラムをカラムの５倍容の同じバッファーで洗浄し、ついでデコリンを別のバッファー(5 0mM NaPO₄(pH7.4)/1.0M NaCl)で溶出した。溶出液を限外濾過(Amicon Inc.，Bev erly，MA)によって濃縮／濾過(diafiltered)した。デコリンのアッセイ上記の組換えおよび精製手順によって産生されたヒト組換えデコリンを、下記の直接デコリン ELISAを用いて検出し、定量した。Immulon-2 平底プレートをデコリン標準品と未知サンプルの希釈物とでコートした。希釈は、0.1M HCO₃((500 mL)1.38g Na₂CO₃; 3.11g NaHCO₃;容量はddH₂O で合わせた; pHを9.6 に合わせた; 溶液を濾過し、滅菌し、４℃で保存した)でホウケイ酸ガラス試験管中でpH9 .6 で行い、各セットを希釈後速やかにプレートした。デコリン標準品の濃度を開始時19ng/mL にセットし、順次1:1.5 で1.7ng/mLまで希釈した。デコリン濃度未知のサンプルは、標準曲線に沿ってどこかで一致するように希釈した。精製デコリンの希釈濃度範囲は、通常、２倍希釈で１×10⁵〜16×10⁵とした。使用された容量は100 μL/ウェルであった。プレートを４℃で終夜インキュベートし、シールした。コーティング溶液を振り落とし、200 μL の１×PBS ＋１％のBSA((100mL)90m LのddH₂O;10mLの10×PBS(1L)80g のNaCl; 2gのKCl;6.1gのNa₂HPO₄;2gのKH₂PO₄; 容量はddH₂O で合わせた);1gのウシ血清アルブミン; アッセイの日に用時調製した）をウェルごとに添加し、37℃で0.5 〜１時間インキュベートした。その後、ウェルを１×PBS ＋0.1 ％ Tween-20 で３回洗浄した。 100 μL/ウェルのウサギ抗デコリン抗体（抗-PG40(La Jolla Cancer Reserch Foundationから入手し、WO 91/10727 に記載した）を1:1000希釈で）のアリコートを加えた。この抗体を１×PBS ＋0.1% BSA＋0.1% Tween 20((100mL)90mLのddH₂ O; 10mL の10×PBS;0.1gのウシ血清アルブミン;0.1mLのTween-20; 溶液は、アッセイの日に新たに調製した)で希釈し、37℃で60分間インキュベートした。ウェルを、１×PBS ＋0.1 ％ Tween-20（(１Ｌ)900mL のddH₂O; 100mLの10×PBS; １mLのTween-20溶液は、アッセイの日に新たに調製した）で３回洗浄した。１×PBS ＋0.1% BSA＋0.1% Tween 20 で1:3000に希釈した100 μL/ウェルのヤギ抗αRb−西洋ワサビペルオキシダーゼ((BioRad(Richmond，VA)またはPromega( Tustin，CA)を37℃で60分間インキュベートした。ついで、ウェルを、１×PBS ＋0.1 ％ Tween-20 で５回洗浄した。200 μL/ウェルの用時調製o-フェニレンジアミンジ塩酸(OPD)溶液(25mL，0.1M のクエン酸リン酸バッファー((500mL)5gのクエン酸; 7gのNa₂HPO₄(無水);容量はddH₂O で合わせ、pHを5.0にした; 濾過して滅菌し、４℃で保存した);ついで、1(10mg)錠のOPD(Sigma) ６μL の30% H₂O₂ を加え、遮光して室温にて15分間インキュベートした。50μL/ウェルの7.8M H₂ SO₄(55mL の36M H₂SO₄;200mL の蒸留水)を加えて反応を停止させた。OD 490nmでデータを読み取り、データの直線フィッティングを用いて分析した。アッセイが「上限の範囲を越えた」場合には、曲線の最高点を除いた。上記の組換えおよび精製手順で調製された３ロットのデコリンサンプルは、0. 82mg/mL、1.23mg/mL 、および1.43mg/mL のデコリンを含んでいた。Ｂ．TGF-β特異的阻害剤の活性測定のための結合アッセイ HepG2 細胞への¹²⁵I-TGF-βの結合約2.5 ×10⁴個のHepG2 細胞(ATCC #HB8025)を、組換えヒトデコリン(DC-12)またはPT-71(マルトース結合タンパク質)の存在下で、250pM の¹²⁵I-TGF-βとともに２時間室温にてインキュベートした。結合した放射活性カウント(cpm)/分を測定する前に、細胞を洗浄バッファー(128mM NaCl，5mM KCl，5mM Mg₂SO₄，1.2mM CaCl₂，50mM HEPES，pH7.5)で４回洗浄した。表Ｉには、HepG2 細胞へのTGF-βのデコリン(DC-12)結合阻害の数値データを示す。「変化％」は、培地（陰性対照）のcpm と比較した試験サンプルの平均cp m の相違を表す。α-TGF−β抗体は、TGF-βレセプターを担持している細胞への標識TGF-βの結合を阻害し、陽性対照とした。固定化デコリンへの¹²⁵I-TGF-βの結合 96ウェルのLimbroマイクロタイタープレートを0.5 μg/mLの組換えデコリンで、50μL/ウェル濃度でコーティングした。このプレートを37℃のインキュベーター中で終夜静置し、その後、200 μL のPBS(0.15M NaCl)/ウェルで洗浄し、未結合のデコリンを除去した。¹²⁵Iで標識したTGF-β(400pM，New England Nuclear ，Bolton-Hunter Labeled)を、拮抗剤を含む200 μL のPBS/0.05% Tween-20中で、拮抗剤とともに又は拮抗剤なしで、室温で１時間45分プレインキュベートした。拮抗剤には、組換えヒトデコリン調製物DC-12 、およびデコリン断片、陰性対照であるPT-712が含まれる。 50μL/ウェルのプレインキュベートしたTGF-β混合物または対照を加え、０℃ で終夜インキュベートした。インキュベートの次に、50μL の遊離TGF-βの上清を、ラベルを貼った試験管に移した。プレートを、0.05% のTween-20を含むPBS( 200 μL/ウェル)で３回洗浄した。還元したサンプルバッファー（２×Laemmli サンプルバッファー）を100 μL/ウェルで加え、37℃で30分間インキュベートした。この溶液にそっとパルスをかけながら100 μL の結合¹²⁵I-TGF-βを各ウェルから取り、ガンマカウンターでカウントするために試験管に移した。50μL の遊離TGF-βサンプルを100 μL の結合TGF-βと並行してカウントし、結合体：遊離体の比を得た。表Ｉに示す結果から、TGF-β、抗TGF-β1 またはデコリンが、 HepG2 細胞上のTGF-βレセプターへの放射標識TGF-βの結合を阻害することが示された。Ｃ．組織染色フルオレセイン・イソチオシアネート結合ヒツジ抗ヒトフィブロネクチンを、 Binding Site，Inc.(San Diego，CA)から入手した。フィブロネクチンのための免疫蛍光染色を、各動物から調製し、番号をつけた切片の中でランダムに選択した20個の糸球体において、これらの組織がどの動物から得られたものであるかを見ずに０〜４のスケール（０＝染色されない、４＝最も強く染色される）を用いて点数付けした。群間の差を、Okudaら（前出）が記載した試験によって分析した。糸球体を抗体で染色し、EDA⁺フィブロネクチンとテナスチン(tenascin)を検出した。これらのマトリックス成分はTGF-βによって比較的特異的に誘導される。細胞外ドメインＡ(EDA⁺)を含むヒトフィブロネクチンに対して調製したマウスモノクローナル抗体は、Zardi 博士(Instituto Nazionale per la Ricerca sul Ca ncro，Italy)から提供されたものである。ウサギ抗ヒトテナスチンは、Telios P harmaceuticals Inc.(La Jolla，CA)から入手した。フロレセイン・イソチオシアネート結合ラットF(ab')₂抗マウスIgG およびロバF(ab')₂抗ウサギIgG(Jackso n Immunoresearch Lab，West Grove，PA)を、第二抗体として使用した。マトリックス点数付けの方法および EDA⁺フィブロネクチンとテナスチン染色の統計分析は、上述したフィブロネクチンと同様にして行った。Ｄ．糸球体腎炎ラットのデコリンによる治療 Okuda ら（前出）によって記載された抗胸腺細胞血清を静脈注射することによって、糸球体腎炎をSprague-Dawleyラット（４〜６週齢）に誘導した。週齢が合致するラットを正常対照とした。８匹のラットを各群２匹ずつ４群に分け、抗胸腺細胞血清を注射した。１時間後、0.5mL のPBS に溶解した0.45mgの組換えヒトデコリンまたはウシデコリン、対照として0.5mL のPBS のみを、単回、静脈投与して治療を開始した（ラットは拘束したが、麻酔はしなかった）。以下のように、デコリンまたはPBS の１日１回の注射によって治療を継続した。デコリンは第１群に２日投与し、第２群には４日投与し、第３群には６日間投与した。第４群にはPBS のみを６日間投与した。第１群および第２群へのデコリンの投与を中止したときには、代わりにPBS を投与するのですべての動物は６日間注射を受けた。すべての治療を７日目に終了し、24時間尿を集め、その後動物を殺して腎を摘出した。実験は上記のプロトコルに従って行い、以下のように対照調製物を試験した。８匹のラットに抗胸腺細胞血清を注射し、各群２匹のラットとなるように群分けし、６日間毎日、0.5mL のPBS のみまたはアクルカン(aggrecan)、オバルブミン、ウシ血清アルブミンを含むPBS を注射した。アグレカンとデコリンの炭水化物含量を決定し、PBS に溶解したアグレカンをデコリンと同様の炭水化物含量で注射した。別の４匹のラットには、抗胸腺細胞血清の代わりにPBS を単回注射し、正常対照とした。上記のように24時間尿を集めた後にすべての動物を殺し、尿タンパク質とクレアチニンとをOkuda ら（前出）が記載したようにして測定した。すべての技術のために腎をin situ で冷PBS で灌流し、その後摘出した。腎組織を光学顕微鏡と免疫蛍光顕微鏡用に、Okuda ら（前出）が記載したようにして調製した。組換えデコリンまたはウシデコリンの４日間または６日間の注射により、正常ラットで見られるレベルと有意差はないレベルに、フィブロネクチンの沈着が抑えられることが示された。対照の注射はバッファーのみ、異なるプロテオグリカン及び２種のタンパク質を含む。軟骨のプロテオグリカンであるアグレカンを、負の電荷を有する分子としてデコリンのグルコサミノグリカン鎖の対照に使用した。アグレカンは、Yamaguchiら（前出、1990）によって記載されたように、TGF -βを阻害しない。オボアルブミンはデコリンのコアタンパク質とほぼ同じ分子サイズを有するために、デコリンのコアタンパク質の対照として使用した。血清アルブミンは、未処理タンパク質の対照として使用した。プロテオグリカンとタンパク質の対照とは、バッファーのみを注射した糸球体腎炎ラットでは区別がつかなかった。疾病過程で早期に投与された２種の注射物は、フィブロネクチンの蓄積に対して効果がなかった。 EDA⁺フィブロネクチンとテナスチンとは、正常ラットの糸球体では痕跡量でのみ検出が可能であった。しかしながら、EDA⁺フィブロネクチンとテナスチンとは、治療をしなかったラットまたは２種のデコリンを注射して治療したラットにおいては腎炎を起こしている糸球体中で大幅に増加した。しかしながら、全フィブロネクチンの場合と同様に、４日間または６日間デコリンを注射することによって、TGF-β活性のこれら２つのマーカーの沈着は、大幅に減少した。過ヨウ素酸−シッフ染色した同一の腎切片の組織学的分析により、疾病中に生じる糸球体の細胞外マトリックスの増加および関連する糸球体の肥大を妨げる上で、デコリンの効果に匹敵することが示された。４日間または６日間投与されたデコリンはまた、タンパク尿の進行を抑制した。クレアチニンの尿中濃度に対する尿タンパク濃度または比を、タンパク尿を評価するために使用した。その理由は、Ginsbergら（前出）に記載されたように、タンパク排泄値に対する尿量の影響を最小にすることができるためである。正常、疾病対照、低用量のデコリン（２種類の注射物）および高用量のデコリン処理ラット（４日間または６日間の注射）の平均値は、各々、0.7、15.2、14.8および2.4 であった（高用量デコリンラットと疾病対照とを比較したとき、p<0.01であった）。これらの結果から、腎炎ラットの障害された糸球体における細胞外マトリックスの沈着を妨げる上で、デコリンの静脈内投与が劇的な効果を有することが示された。糸球体腎炎における細胞外マトリックスの蓄積はTGF-βの産生過剰に起因することがすでに報告されている（Okuda ら、前出、Boederら、前出、1990）。このモデルにおけるマトリックスの蓄積がデコリンの注射によって妨げられるということによって、TGF-β抑制におけるデコリンのin vivo 活性が証明された。実施例 II 培養筋細胞におけるデコリンの発現本実施例は、in vitroにおける筋細胞中でのデコリンの発現を評価するための方法を提供する。ラットのデコリン発現ベクターであるpAct-Decは、pGEM4-RNDCN ベクター(Aun diとDreherら，Eur ．J．Cell．Biol．59:314-321(1992)およびDreherら，Eur ．J ．Cell．Biol ．53:296-304(1990)、いずれの文献も参考文献として本明細書中に取り込まれている)からの完全長のデコリン cDNA を含むEcoRI 断片を、発現ベクターpAct-CAGGS（Niwaら，Gene，108:193-199(1991)、この文献は参考文献として本明細書中に取り込まれている）にクローニングすることにより構築した。発現ベクターpAct-CATは、デコリンのcDNAがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードする細菌の遺伝子と置換されている点を除いてpAc t-Decと同一のベクターであるが、前述のようにして作製した（Kanedaら，Scien ce 243:375-378(1989)およびIsakaら，J ．Clin．Invest. 92:2597-2601(1993)、いずれの文献も参考文献として本明細書中に取り込まれている）。 C2C12 培養マウス筋細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD )を、１×10⁶細胞／ウェルで、６ウェル培養プレートにまき、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコの最小必須培地（培養用培地）中で、サブコンフルエント（70 〜80％集密）まで培養した。pAct-DecまたはpAct-CATを用いて、hemagglutinin virus of Japan(HVJ)-リポソーム法（Katoら，J ．Biol．Chem. 266:3361-3364(1 991)、この文献は参考文献として本明細書中に取り込まれている）またはリポフェクタミン^TM(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)を用いたリポフェクションによって、前述のようにトランスフェクトした（Takeshita ら，J ．Clin．Invest. 93: 652-651(1993)、この文献は参考文献として本明細書中に取り込まれている）。 HVJ はセンダイウイルスであり、膜の融合を促進する。HVJ の機能性を用いる方法はまた、レシピエント細胞を用いたリポソーム融合を促進するためにも使用することができる。HVJ-リポソームは、テトラヒドロフランと0.01M K₂PO₄，pH6 .8(9:1(v/v))中に、クロマトグラフィー的に純粋なウシ脳ホスファチジルセリン（ナトリウム塩;Avanti Polar Lipids Inc．）を溶解することによって作製した。ホスファチジルコリンおよびコレステロール（いずれもSigma，St．Louis，MO ）は各々、テトラヒドロフランに溶解した。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを1:4.8:2 の重量比で混合した。ロータリーエバポレーターで有機溶媒を留去することにより、脂質混合物(10mg)をフラスコの側壁に堆積させ、残渣を窒素気流下で−20℃にて保存した。 HVJ（Ｚ株）を有精卵の漿尿液で増殖させた(Nakanishiら，Exp ．Cell．Res．1 59:399-409(1991)、この文献は参考文献として本明細書中に取り込まれている）。27,000×ｇで40分間遠心してHVJ を回収し、BSS(-)に懸濁した。HVJ 懸濁液を、BSS(-)に60% 、40% および30% で溶解したショ糖(1:1:8，v/v)からなる不連続グラジエントに重層した。このグラジエントを、60,000×ｇ、４℃で４時間、遠心し、このHVJ を４℃で保存した。 HVJ を、使用直前に11J/m²・sec のUVを３分間照射して不活化した。HVJ の血球凝集活性を前述のように測定した（Salkら，J．Immunol．69:87-97(1994)この文献は参考文献として本明細書に取り込まれる）。HVJ 懸濁液のA₅₄₀が１であるときは、この懸濁液は1mg/mLのタンパク質を含み、これは15,000血球凝集単位(H AU)/mLに等しかった。リポソーム懸濁液(0.5mL、10mgの脂質を含む)を、総量４mLのBSS(-)中で、HVJ (64,000 HAU)と混合した。この混合物を４℃で30分間インキュベートし、その後、37℃で２時間穏やかに攪拌しながらインキュベートした。多核細胞の形成を妨げるために、遊離のHVJ をショ糖密度勾配遠心によってHVJ-リポソームから除去した。この懸濁液を不連続ショ糖グラジエント(60%のショ糖を含むBSS(-)溶液１ mL、40% のショ糖を含むBSS(-)溶液１mL、および30% のショ糖を含むBSS(-)溶液８mL)に重層し、60,000×ｇ、４℃で、正確に3.5 時間スウィングバケットローターで遠心した。各遠心管の最上層から４mLの画分を集めた。トランスフェクション７日目に、細胞を平衡塩溶液(BSS(-): 140mM NaCl，5.4 mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.6)で３回洗浄し、ついで、１mLのHVJ-リポソーム溶液(2.5mgの脂質および10μg の封入されたDNA)とともに、４℃で５分間インキュベートし、その後37℃で30分間インキュベートした。その細胞をBSS(-)で洗浄し、新鮮な培地を加え、37℃でさらにインキュベートした。リポフェクションのために、500 μg の無血清 Optimem^TM(BRL Life Technolo gies，Gaithersburg，MD)に溶解した50μg のプラスミドDNA を、あらかじめ250 μL の水に溶解したリポフェクタミン^TM(BRL Life Technologies)を250 μL 加えた。この混合物を室温(rt)で30分間インキュベートし、ついで筋細胞を含む２mLの無血清培地を含有する細胞培養ウェルに滴下した。この細胞を、37℃にて２時間インキュベートし、DNA を取込ませた。インキュベートの後、培地を除去し、細胞をBSS(-)で洗浄し、新鮮な培地を加えて、細胞をさらに37℃でインキュベートした。 HVJ 法およびリポフェクション法のいずれの場合も、トランスフェクションの翌日に培地を交換し、その後週２回培地交換を行った。ウェルから細胞を除去し、１週間の間隔で、新たなウェルにまいて継代した。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後、第３日、第７日、第 14日に生合成的に標識した。細胞を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 0.14M Na Cl，２mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.4)で３回洗浄し、ついでメチオニン、システイン、グルタミンおよび牛胎児血清を含まない培地を加えた。細胞を37℃で２時間インキュベートした。培地を除去して細胞を残し、100 μCi/m L の³⁵S-硫酸塩(New England Nuclear，Boston，MA)と培地交換し、細胞を37℃ で18時間インキュベートした。その後、培地を除去した。放射標識したプロテオグリカンを含む培地を、上述のように非還元条件下で、４〜12％アクリルアミドゲル上でドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動(SDS-PAG E)によって分析した(Okudaら，J．Clin．Invest 86:453-462(1992)、この文献は参考文献として本明細書中に取り込まれている)。SDS-PAGEの後ゲルを乾燥させ、標準的な方法（例えば、HarlowとLane，前出、1988を参照せよ）を用いて、Ｘ線フィルムを感光させた。オートラジオグラフの感光物を、デンシトメーター(L KB instruments Bromma，Sweden)を用いてスキャンし、トランスフェクト細胞によるデコリンの産生の相対的概算値を得た。 HVJ-リポソームとともにpAct-Decでトランスフェクトした筋細胞は、リポフェクタミン^TMとともにpAct-Decでトランスフェクトした筋細胞に比べて９倍多いデコリンを培地中に産生した。さらに、HVJ-リポソーム中のpAct-CATでトランスフェクトした後のデコリン発現は、pAct-Decとリポフェクタミン^TMとを用いて発現されたデコリンのレベルと同様の量であった（図１）。この結果より、pAct-Dec のトランスフェクションは、リポフェクタミン^TMを用いたリポフェクションによってトランスフェクションするよりも、HVJ-リポソーム法を用いて行ったときの方が、非常に効果的であることが示された。実施例III 骨格筋のトランスフェクションによる in vivoでのデコリンの発現この実施例は、デコリン発現ベクターの筋肉内注入の後の in vivoでのデコリンの発現の効率を評価するための方法を提供する。 in vivo でのトランスフェクションのため、HVJ-リポソーム溶液（脂質 5 mg および封入ＤＮＡ 20μg）２mlにBSS(-)８mlを添加し、この溶液を15,000 rpmで 30分遠心分離した。ペレット化したリポソームを、１mM ＣａＣｌ₂を含有する B SS(-)0.4 mlに再懸濁させることによって、濃縮した。プラスミドＤＮＡを含有するこの濃縮HVJ リポソーム約 0.2 ml を、メトキシフルラン（methoxyflurane ）で麻酔した 150 gの雄 Sprague-Dawley ラットの露出殿筋の４箇所に27ゲージ針によって注入した。各筋に0.1 ml注入を２回実施した。注入後３，５，７，10 および14日目に、ラットを殺し、腎臓、肝臓および肺組織を取り出した。組織を冷イソペンタン中で速やかに急速凍結し、クリオスタットを使用して約５ミクロンの切片を作った。ヒトデコリンを検出するための一次ウサギ抗体（Mannら、J. Biol.Chem. 265:5317-5323(1990)、ここに参考として引用する）を添加する前に、組織切片をアセトン中で10分固定した。ウサギIgG に特異的なフルオレセインイソチオシアネートに結合したロバ抗体（Jackson Labs,West Grove PA）で染色することによって、一次ウサギ抗体の結合を検出した。評価したすべての時点において、pAct-CAT対照ベクターで処置したラットに比較して、pAct-Decで処置したラットは腎臓、肝臓および肺において増大したデコリン染色を示した（図２の注入５日後参照）。pAct-Dec処置動物における免疫反応性デコリンの発現は、精製デコリンを静脈内投与した時に得られた結果と全体として同様であった（Borderら、上記、1992、参照）。この結果は、デコリン発現ベクターを骨格筋内に導入するとデコリンが発現され、これが血液中に入り、腎臓、肺および肝臓などの他の器官に入ることができることを意味する。デコリンをトランスフェクトしたラットの血液中の発現されたデコリンのレベルはデコリンELISA による検出以下であり、デコリンが循環系に入って各種の組織中に蓄積するためには、高い血清濃度を必要としないことが示された。実施例IV 実験用動物モデルにおける腎炎の発症に及ぼす in vivoデコリン遺伝子送達の影響この実施例は、TGF-βで誘導される細胞外マトリックス成分の異常蓄積が関与する線維症の実験用動物モデルにおける、病態の発症に及ぼすデコリン発現ベクターの影響を評価するための方法を提供する。Ａ．TGF-βｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に及ぼす影響実施例III の記載にしたがって、筋肉内注入によって、２つのグループそれぞれについて４匹のラットを pAct-Dec または pAct-CAT でトランスフェクトした。翌日、文献（Okuda ら、上記、および出願 WO 91/04748、この全部をここに参考として引用する）にしたがって、腎炎を発症させるため、ヒツジ抗ラット胸腺リンパ球血清 0.25 mlをラットに静脈内注入した。疾病誘導の６日後、ラットを麻酔し、腎臓を潅流し、続いてこれを取り出して、糸球体を単離する操作をし、各グループ毎にプールした。糸球体から全ＲＮＡを調製し、文献（Okuda ら、上記、およびYamamotoら、Kidney Inc.45:916-927(1994)、両者をここに参考として引用する）にしたがってノーザンブロッティングを実施した。マウスTGF-β1 ｃＤＮＡからの280 塩基対 Pvu II 断片（Derynck ら、J.Biol.Chem.261:4377-4 379（1986）、ここに参考として引用する）をHinc II で消化したpBluescript S KII+（Strategene,San Diego CA）中にサブクローン化することによって、TGF- β１のプローブを作成した。文献（Fortら、Nucl.Acid Res.13:1431-1443(1985) 、ここに参考として引用する）にしたがって、ラットGAPDH ｃＤＮＡを得た。レーザーデンシトメーター（LKB）を使用した標準デンシトメトリー走査によって、2.5 kbのデコリンｍＲＮＡおよび 1.3 kb のGAPDH ｍＲＮＡに相当するオートラジオグラフバンドの密度を測定した。文献（Yamamotoら、上記）にしたがって、GAPDH バンド密度をＲＮＡローディングに対する対照として使用した。疾病の誘導の６日後に取り出したラット腎臓の凍結切片について、実施例III の記載にしたがって、免疫蛍光顕微鏡検査を実施した。ヒトTGF-β1 に対するウサギポリクローナル抗体（King Brewing Co.,Ltd,Kakagawa,Japan）を使用して染色することによって、TGF-β免疫反応性細胞を同定した。二次抗体としてフルオレセインイソチオシアネートに結合したロバ F(ab')²抗ウサギ IgGを使用した（Jackson Immunoresearch Labs）。文献（Okuda ら、上記、およびYamamotoら、上記）にしたがって、無作為に選択した30の糸球体を計測することによって、糸球体のTGF-β1 陽性細胞を計数した。疾病の誘導後６日目に、pAct-Decでトランスフェクトしたラットにおける糸球体 TGF-β1ｍＲＮＡレベルは、pAct-CAT対照ベクターでトランスフェクトした疾病誘導動物からの糸球体中のレベルの37％に抑制された（図３Ａ）。pAct-CAT対照ベクターの場合に比較して、pAct-Decでトランスフェクトした腎炎ラットにおいて、糸球体TGF-β1陽性細胞は有意に少数だった（2.5±1.6 vows.7.0±2.7；デコリン vows.CAT，p＜0.01；図３Ｂ）。Ｂ．細胞外マトリックス成分の蓄積および腎機能に及ぼす影響ラット骨格筋の in vivoでの pAct-Dec および pAct-CAT でのトランスフェクション、ならびに疾病の誘導は前記の通りである。疾病の誘導後６または14日目に、各条件について４匹のラットを殺した。この疾病モデルにおいて、対照レベルに戻る前に、TGF-β1 ｍＲＮＡ発現のピークが６日目までに、そしてマトリックス成分の蓄積のピークが14日目までに見られるので、これらの時点を選択した。６日目の時点には、疾病が誘導されずにPBS を１回注入された対照グループもまた含まれた。文献（Okuda ら、上記、および Yamamoto ら、上記）にしたがって、ホルマリン固定して凍結した腎臓組織切片を、過ヨウ素酸−シッフ染色並びに免疫反応性コラーゲンＩ型およびII型、フィブロネクチン EDA+ およびテナシンの同定のために処理した。記載したように組織切片をアセトン中で固定し、コラーゲンＩ型およびIII 型、フィブロネクチン EDA+ およびテナシンの存在について染色した。文献（Takaharaら、Lab.Invest.59:509(1988)、ここに参考として引用する）にしたがって、ラットコラーゲンＩ型およびIII 型（Dr.A.Ohshima,Wakayama Me dical College の好意によって提供された）に特異的な一次ポリクローナルウサギ抗体を製造した。テナシンに対するポリクローナルウサギ抗体は市販品を入手し（Gibco/BRL）、フィブロネクチン EDA+（Accurate Chemical Scientific Cor p.,Westbury NY）に特異的なマウスモノクローナル抗体は、文献（Balza ら、FE BS Letters 228:42-44(1988)、ここに参考として引用する）にしたがって製造した。二次抗体はマウスについては蛍光標識ラットF(ab')²抗マウス IgG（Jackson Imm unoresearch Labs.）であり、ウサギについては上述の通りである。文献（Yamamotoら、上記、1994）にしたがって、１サンプルについて無作為に選択した30の糸球体を０から４のスケールで計測することによって、全細胞外マトリックスプロテオグリカンについての PAS染色および個々の細胞外マトリックス成分を評価した。疾病誘導後６日目のデコリンでトランスフェクトした腎臓組織切片のPAS 染色は、CAT でトランスフェクトしたラットのものに比較して、全細胞外マトリックスプロテオグリカンの蓄積の減少を示した（図４Ａおよび４Ｂ）。個々の細胞外マトリックス陽性細胞およびPAS 陽性細胞の定量では、デコリンでのトランスフェクションが、対照のCAT でトランスフェクトしたラットに比較して、疾病誘導後の両方の時点において、EDA+フィブロネクチン、テナシンならびにコラーゲンＩおよびIII に関する細胞外マトリックス物質の蓄積を有意に減少させることが示された（p＜0.01;デコリン vows.CAT トランスフェクション；図４、コラーゲンIII のデータは示されていない）。デコリンでトランスフェクトしたラットにおける疾病誘導後14日目の、検出し得るPAS 、EDA+フィブロネクチン、テナシン陽性細胞の評点は正常なPBS 注入ラットと有意な差異はないが、CAT でトランスフェクトした動物における蓄積は有意に上昇したままだった（p＜0.01）。この結果は、その後急性腎炎を発症するラットの骨格筋へのデコリン発現ベクターの投与が、腎臓における線維症の結果を招く細胞外マトリックス成分の蓄積を防止することが出来ることを示している。糸球体腎炎の臨床上の重症度の証明となる蛋白尿症は、デコリンでトランスフェクトしたラットにおいて、６日目（mg/day、平均±SD；デコリン vows.CAT）（17.3±5.5 vows．118±52.4，ｐ＜0.01）および14日目（21.9±7.7 vows.89.5 ±19.6，ｐ＜0.01）に有意に減少した。このモデルにおいて１−３日目に発症する蛋白尿症は、糸球体のメサンギウム細胞の一部の溶解の原因となる抗胸腺リンパ球血清の注入によるものである。この初期の蛋白尿症は、疾病の誘導の24時間前（83.1±27.6 vows．102.2±23.1，N.S.）または24時間後（データは示されていない）のデコリンのトランスフェクションによって減少しなかった。この結果は、トランスフェクションは糸球体に対する免疫学的損傷に影響はしないが、TG F-β1 の過剰生産によって誘導される細胞外マトリックスの有害な蓄積を抑制することによって、作用するらしいことを意味している。本発明を、現在のところ好ましい態様に関して記載してきたが、本発明の精神から離れることなく各種の改変がなされるものと理解されるべきである。したがって、本発明は添付する請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＮＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＮ 38/00 ＡＤＳ 39/395 ＡＣＳＮ 38/22 ＡＣＤ 45/00 ＡＢＮ 39/395 ＡＣＳＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 45/00 ＡＢＮＡ６１Ｋ 37/24 ＡＣＤＣ１２Ｎ 15/09 37/02 ＡＤＳＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸を含有する医薬製剤を被験者に投与することにより、該物質またはそのフラグメントが被験者の細胞によって発現され、被験者の組織における細胞外マトリックスの蓄積が抑制される、被験者の組織における細胞外マトリックスのＴＧＦ−β誘導性蓄積の治療のための医薬製剤を製造するための、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸の使用。２．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ベータグリカンおよびエンドグリンから成る群より選択される請求項１記載の使用。３．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、ＴＧＦ−βに対する抗体である請求項１記載の使用。４．細胞が、骨格筋細胞、腎細胞、肺細胞、肝細胞および皮膚細胞から成る群より選択される請求項１記載の使用。５．病変が、糸球体腎炎、ＡＲＤ症候群、肝硬変、線維癌、肺線維症、心筋症後の梗塞、心臓線維症、血管形成術後の再狭窄、間質性腎線維症、瘢痕形成および糖尿病関連病変から成る群より選択される請求項１記載の使用。６．組織が、腎臓、肝臓、肺および皮膚から成る群より選択される請求項１記載の使用。７．デコリンまたはその活性フラグメントをコードする核酸を含有する医薬製剤を被験者に投与することにより、デコリンまたはその活性フラグメントが被験者の細胞によって発現され、被験者の腎臓にデコリンまたはその活性フラグメントが蓄積され、糸球体腎炎が抑制される、被験者の糸球体腎炎の治療のための医薬製剤を製造するための、デコリンまたはその活性フラグメントをコードする核酸の使用。８．デコリンまたはその活性フラグメントをコードする核酸をex vivo で細胞に導入して、デコリンまたはその活性フラグメントを発現する細胞を得、その細胞を含有する医薬製剤を被験者に導入して、被験者の腎臓においてデコリンまたはその活性フラグメントを発現および蓄積させ、糸球体腎炎を抑制する、被験者の糸球体腎炎の治療のための医薬製剤を製造するための、デコリンまたはその活性フラグメントを発現する細胞の使用。９．ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸を含有する医薬製剤を被験者に導入することにより、該阻害剤またはそのフラグメントを被験者の細胞によって発現させ、被験者の組織の有害な増殖を抑制する、被験者の組織のＴＧＦ−β誘導性の有害な増殖の治療のための医薬製剤を製造するための、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸の使用。 10．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ベータグリカンおよびエンドグリンから成る群より選択される請求項９記載の使用。 11．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、ＴＧＦ−βに対する抗体である請求項９記載の使用。 12．細胞が、骨格筋細胞、腎細胞、肺細胞、肝細胞および皮膚細胞から成る群より選択される請求項９記載の使用。 13．組織が、腎臓、肝臓、肺および皮膚から成る群より選択される請求項９記載の使用。 14．ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸をex vivo で細胞に導入して、該物質またはその活性フラグメントを発現する細胞を得、その発現細胞を含有する医薬製剤を被験者に導入して、被験者の組織における細胞外マトリックスの蓄積を抑制する、被験者の組織における細胞外マトリックスのＴＧＦ−β誘導性蓄積の治療のための医薬製剤を製造するための、ＴＧＦ −β特異的阻害剤またはその活性フラグメントを発現する細胞の使用。 15．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ベータグリカンおよびエンドグリンから成る群より選択される請求項 14記載の使用。 16．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、ＴＧＦ−βに対する抗体である請求項14記載の使用。 17．細胞が、骨格筋細胞、腎細胞、肺細胞、肝細胞および皮膚細胞から成る群より選択される請求項14記載の使用。 18．病変が、糸球体腎炎、ＡＲＤ症候群、肝硬変、線維癌、肺線維症、心筋症後の梗塞、心臓線維症、血管形成術後の再狭窄、間質性腎線維症、瘢痕形成および糖尿病関連病変から成る群より選択される請求項14記載の使用。 19．組織が、腎臓、肝臓、肺および皮膚から成る群より選択される請求項14記載の使用。 20．ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントをコードする核酸をex vivo で細胞に導入して、該物質またはその活性フラグメントを発現する細胞を得、該細胞を含有する医薬製剤を被験者に導入して、被験者の組織の有害な増殖を抑制する、被験者の組織のＴＧＦ−β誘導性の有害な増殖の治療のための医薬製剤を製造するための、ＴＧＦ−β特異的阻害剤またはその活性フラグメントを発現する細胞の使用。 21．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ベータグリカンおよびエンドグリンから成る群より選択される請求項 20記載の使用。 22．ＴＧＦ−β特異的阻害剤が、ＴＧＦ−βに対する抗体である請求項20記載の使用。 23．細胞が、骨格筋細胞、腎細胞、肺細胞、肝細胞および皮膚細胞から成る群より選択される請求項20記載の使用。 24．病変が、糸球体腎炎、ＡＲＤ症候群、肝硬変、線維癌、肺線維症、心筋症後の梗塞、心臓線維症、血管形成術後の再狭窄、間質性腎線維症、瘢痕形成および糖尿病関連病変から成る群より選択される請求項20記載の使用。 25．組織が、腎臓、肝臓、肺および皮膚から成る群より選択される請求項20記載の使用。