JPH11501046A

JPH11501046A - タンパク質の製造法

Info

Publication number: JPH11501046A
Application number: JP8526799A
Authority: JP
Inventors: アイエランド，ハンス; ロマンデル，レナ
Original assignee: フアーマシア・アンド・アツプジヨン・アー・ベー
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-03-01
Publication date: 1999-01-26
Also published as: US5990081A; US6506879B1; DE69628148T2; ES2199284T3; EP0813541A1; CA2212125A1; SE9500778D0; US5834596A; WO1996027608A1; NZ303325A; PT813541E; EP0813541B1; DK0813541T3; IL117320A; DE69628148D1; AU694623B2; IL117320A0; ATE240348T1; ZA961679B; AU4960796A

Abstract

(57)【要約】本発明は、実質的にエンドトキシンを含まないアポリポタンパク質Ａ（Apo Ａ）またはアポリポタンパク質Ｅ（Apo Ｅ）に関し、およびApo ＡもしくはApo Ｅまたはそれらの変異種もしくは混合物からエンドトキシンを分離することによるそれらの製造法に関し、該方法は、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスと接触させた後、その固定化化合物を含むマトリックスを界面活性剤を含む第二水溶液で処理することにより、あるいは、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を陰イオン交換マトリックスと接触させた後、その陰イオン交換マトリックスを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含有する第二水溶液で処理することにより行う。本発明はさらに、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む固定化化合物を含むマトリックスおよび界面活性剤含有溶液、あるいは、陰イオン交換マトリックスおよび炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含有する溶液の、Apo ＡもしくはApo Ｅまたはそれらの変異種もしくは混合物を含む水溶液からエンドトキシンを除去するための使用に関する。こうして製造されるApo ＡまたはApo Ｅは、アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療における薬物の製造に使用でき、ならびに治療的に有効な量で投与するアテローム硬化症および心臓血管疾患の治療法において使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の製造法発明の分野本発明は、実質的にエンドトキシンを含まないアポリポタンパク質Ａ（Apo Ａ）またはアポリポタンパク質Ｅ（Apo Ｅ）、およびApo ＡもしくはApo Ｅまたはそれらの変異種（variants）もしくは混合物からエンドトキシンを分離することによるそれらの製造法に関し、該方法は、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスと接触させた後、固定化化合物を含むマトリックスを界面活性剤を含む第二水溶液で処理することにより、あるいは、該Apo Ａまたは Apo Ｅを含む第一水溶液を陰イオン交換マトリックスと接触させた後、その陰イオン交換マトリックスを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含む第二水溶液で処理することにより行う。本発明はさらに、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む固定化化合物を含むマトリックスおよび界面活性剤含有溶液、あるいは、陰イオン交換マトリックスおよび炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含む溶液を、エンドトキシンをApo ＡもしくはApo Ｅまたはそれらの変異種もしくは混合物を含む水溶液から除去するために使用する方法に関する。こうして製造されるApo ＡまたはApo Ｅは、アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療における薬物の製造、ならびに治療的に有効な量で投与した場合のアテローム硬化症および心臓血管疾患の治療法に使用できる。発明の背景血清コレステロールの高められたレベルと冠動脈性心臓疾患（ＣＨＤ）の発症との間の明らかな相関関係が、疫学的研究および追跡研究に基づいて、繰り返し確認されている。しかし、血漿におけるコレステロール輸送の複雑なメカニズムが明確になったことで、ＣＨＤの危険性の決定における循環リポタンパク質の選択的機能が認識されている。実際には、主に４種類の循環リポタンパク質がある。すなわち、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。これらのうち、ＨＤＬは、コレステロールの末梢組織からの除去に直接関係しており、「逆コレステロール輸送」（ＲＣＴ）として知られるメカニズムにより、肝臓または他のリポタンパク質に運んで戻している。ＨＤＬの「保護的」役割は、多くの研究で確認されている。ＨＤＬの保護的メカニズムに関する最近の研究は、ＨＤＬの主要成分であるアポリポタンパク質Ａ −Ｉ（Apo Ａ−Ｉ）が中心となっている。Apo Ａ−Ｉの血漿レベルが高いことは、ＣＨＤの危険性の低下および冠状動脈の病変の存在と関係する。血漿Apo Ａ−Ｉは、243 個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、その主な配列は公知である(Brewer ら、（1978）Biochem．Biophys．Res．Commun．80:62 3-630)。Apo Ａ−Ｉは、細胞では、267 個のアミノ酸の前駆体として合成される。Apo Ａ−Ｉ分子の構造上の主な要件は、11 または 22個のアミノ酸の繰り返し単位が存在することであると考えられ、両親媒性のらせん状立体配置で存在すると推定される(Segrest ら、FEBS Lett．(1974)38:247-253)。この構造によって、Apo Ａ−Ｉの主な生物学的活性、すなわち脂質の結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化が得られる。アポリポタンパク質Ａ−ＩMilano（Apo Ａ−ＩＭ）は、ヒト Apo Ａ−Ｉの最初に記載された分子変異種である(Franceschini ら、（1980）J ．Clin．Invest．66:892-900)。それは、Arg 173 が Cys 173 で置換されていることを特徴とする(Weisgraber ら、（1983）J．Biol．Chem．258:2508-2513)。突然変異体アポリポタンパク質は、常染色体優性形質として伝達され、８世代の保有者が確認されている(Gualandriら、(1984)Am．J．Hum．Genet．37: 1083-10 97)。Apo Ａ−ＩＭ保有者の個々の状態は、ＨＤＬ−コレステロールレベルの著しい低下を特徴とする。これにもかかわらず、その状態にある人は、動脈疾患の危険性の増加を明らかには示さない。実際、家系樹を調べると、このような人たちは、アテローム硬化症から「保護されて」いる可能性があると思われる。上記保有者におけるApo Ａ−ＩＭの可能性のある保護効果のメカニズムは、一つのα−らせんが欠如し、疎水性残基の露出の増加を伴う、突然変異体アポリポタンパク質の構造における変形と関係すると思われる。(Francheschini ら、（1 985）J．Biol．Chem．260:1632-1635)。多重α−らせんの密な構造の欠如は、分子の屈曲性を増加させ、正常なApo Ａ−Ｉと比較してより容易に脂質と結合する。 Apo Ａ−ＩＭの別の非常に特異的なと特徴は、自身との二量体形成能およびAp o Ａ−II との複合体形成能であり、どちらの場合も、Cys 残基の存在による。一般に、十分な量のApo Ａ−Ｉ、特にApo Ａ−ＩＭの製造を可能にするためには、例えば大腸菌(E．coli)での組換えＤＮＡ技術を使用する。すなわち、組換えによる製造ならびにApo Ａ−ＩＭ、モノマーおよび二量体の使用は、特許明細書 WO-A-88/03166（Farmitalia Carlo Erba(FICE)）、WO-A-90/12879(Sirtori ら)ならびに WO-A-93/12143 および WO-A-94/13819(共に Pharmacia AB (以前は、Kabi Pharmacia AB)に開示されている。例えば大腸菌(E．coli)を媒体として使用することは、ある種の欠点を招く。すなわち、エンドトキシンまたはリポ多糖類（ＬＰＳ）は、大腸菌(E．coli)、プロテウス(Proteus)およびサルモネラ(Salmonella)などのグラム陰性菌の外膜（細胞壁）と結合する高分子複合体である。エンドトキシンは、主な２つの部分、すなわち、リピドＡという脂質部分（外膜内に埋め込まれている）および環境に突き出る多糖類（Ｏ−抗原）から成る。リピドＡは、エンドトキシンの毒性効果を引き出す領域であり、必要条件は、リピドＡ部分全体が存在することである。多糖類は、Ｏ −特異的鎖およびコアから成る。Ｏ−特異的鎖はコアから突き出ており、エンドトキシンの最も外側の部分である。コアは、リピドＡとＯ−特異的鎖との間の結合として作用する。毒性効果を生じるためには、細菌の表面からエンドトキシンが放出されなければならないことが知られている。これは、細菌が増殖するとき、溶菌時およびストレス中に起こる。水溶液中では、遊離エンドトキシンが、約 5 kDa から＞10³ kDa までの分子量を有する凝集体、ミセルおよび小胞を形成する。いくつかのタンパク質は、エンドトキシンと複合体を形成することが文献から公知である。特に強い複合体は、ＨＤＬおよびアポリポタンパク質と形成される（Emancipatorら、(1992)Infect．Immun．60:596-601）。Ulevitchら、（1981） J．Clin．Invest．67:827-837 によれば、ＨＤＬとエンドトキシンとの間の複合体の形成は、次のように、２工程のメカニズムを含む。エンドトキシン（集合体）→エンドトキシン（解離体） (1) エンドトキシン（解離体）＋ＨＤＬ → エンドトキシン−ＨＤＬ (2) この挙動は、例えば、Munford ら、(1981)Infect.Immun.34:835-843 によって確認されている。リピドＡがその複合体の主要因子であり、相互作用はイオン力および疎水力の両方を含むことを示唆する指標がある(Freudenbergら(1979),Nat .Toxins,Proc．Int．Symp．Anim.，Plant Microb．Toxins.，6th，349-354)。上記ですでに述べたように、強い複合体は、一般にエンドトキシンとＨＤＬとの間で、特にアポリポタンパク質と形成される。このメカニズムは、US-A-5,128 ,318（Rogosin Institute）で使用されている。すなわち、US-A-5,128,318 は、再構成粒子を含むＨＤＬ関連アポリポタンパク質、およびエンドトキシンなどの脂溶性物質の細胞、体液などからの除去におけるその使用に関する。特に、US-A -5,128,318は、Apo Ａ−ＴまたはApo Ａ−II を含む再構成粒子を、コレステロールと共に、またはコレステロールを伴わずに投与することによる、エンドトキシンによって引き起こされる毒性に対して患者を治療するための方法に関する。該方法の目的は、当然のことながら、患者の体内においてエンドトキシンの放出を回避する為に、最強の可能な複合体を長期にわたり生成し且つ維持することである。自体強い複合体は、例えばある種の化学化合物の存在によってさらに強めることができる。すなわち、デオキシコール酸塩は、上記式（１）によりエンドトキシンを解離することが知られている(Munford ら、上記参照および Emancipator ら、上記参照)。次いで、デオキシコール酸塩が、式（２）に従って、エンドトキシンのＨＤＬへの結合を増加する。その結果、エンドトキシンとＨＤＬとの複合体が生じる。これは、分離が非常に困難である。エンドトキシンの効果を低下させ、または除去するための一般的方法は、すでに知られている。すなわち、EP-A-494848(Pharmacia)は、エンドトキシンに誘導される効果の阻害法を開示している。第一の態様は、エンドトキシンに誘導される効果（例えば熱）の治療のためのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む薬物の注入に関する。第二の態様は、水または水溶液を、固定化アルギニンまたはアルギニン誘導体を含む床により濾過して、その水または水溶液からエンドトキシンを除去する方法に関する。第二の態様を説明するために、Arginine を含むカラム上で、大腸菌(E．coli)由来のエンドトキシンを用いて試験を行った。しかし、相互作用は弱く、従って、タンパク質とエンドトキシンとに分離することは、アポリポタンパク質とエンドトキシンとの間の強い複合体の場合よりもかなり容易である。陰イオン交換クロマトグラフィーが、ウロキナーゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼおよびアルブミンなどのタンパク質を含む溶液からのエンドトキシンの除去にしばしば使用される(Sharma（1986）Biotech．Applied Biochem．8:5 -22)。しかし、タンパク質とエンドトキシンとの間の相互作用は、アポリポタンパク質とエンドトキシンとの間の複合体よりもかなり弱い。 EP-A-333474（Mitsui Toatsu）は、エンドトキシンで汚染された、タンパク質を含む水溶液をタンパク質吸着剤と接触させ、その吸着剤をアミノ化合物を含む溶液で洗浄した後、タンパク質をその吸着剤から溶離することによる、エンドトキシンのタンパク質からの除去法に関する。ただ例示されたタンパク質は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ｐＡ）、ヒト血清アルブミンおよびインター−α−トリプシンインヒビターである。タンパク質吸着剤の例は、アフィニティー、吸着、疎水性および金属キレートクロマトグラフィーゲルである。ポリミキシンＢ硫酸塩は、リピドＡ部分との相互作用によりエンドトキシンの毒性効果を防ぐことができる、抗生物質ポリペプチドである。Karplus および共同研究者ら(Karplus ら、(1987)J．Immuno．Methods 105:211-220)は、この知識を使用 AB（ウプサラ、ウェーデン）から市販）に吸着させた。しかし、ポリミキシンは、それ自体が生物学的に活性であり、従って、静脈内注射用溶液からのエンドトキシンの除去には適さない(H．Matsumae ら、（1990）Biotechn．Biochem．12:1 29-140)。販）は、抗生物質、ビタミン、酵素、抗体および血液製剤などの低・高分子量物質からエンドトキシンを特異的に除去するために作製されたマトリックスである。ゲルは、低分子量の非タンパク質で非炭水化物の合成リガンドから成る。帯電フィルターは、エンドトキシンおよび他の負に帯電した分子を種々の溶液から除去することができる。例えば、Pall(イギリス)は、膜構造全体にわたって第四アンモニウム基を含む親水性ナイロン 66 フィルター媒体から成る、Posidy ne^TMフィルターを提案している。フィルターの保持能力は、温度に依存せず、ｐＨ５〜８および低い流速で最適である。現在、タンパク質溶液中のエンドトキシンの影響を低下させ、または除去するための方法は一般にいくつか知られている。しかし、エンドトキシンとApo ＡまたはApo Ｅとの間の強い相互作用を克服する既存の方法はない。本発明は、この問題を解決することが意図されている。発明の詳細な説明本発明の目的は、エンドトキシンの含量が非常に少ないApo ＡまたはApo Ｅを製造するための効果的な精製法を提供することである。本発明の別の目的は、Apo ＡまたはApo Ｅの活性が本質的に保持される、有効な方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、Apo ＡまたはApo Ｅを高い収率で製造する方法、すなわち生成物の損失が最少である方法である。上記目的は、アポリポタンパク質Ａ（Apo Ａ）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（Apo Ｅ）またはそれらの変異種もしくは混合物からエンドトキシンを分離するための方法に関する本発明によって達成され、該方法は、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスと接触させた後、その固定化化合物を含むマトリックスを界面活性剤を含む第二水溶液で処理することによる、あるいは、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を陰イオン交換マトリックスと接触させた後、その陰イオン交換マトリックスを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含む第二水溶液で処理することによる。本発明の発明者らは、驚いたことに、例えば固定化アルギニン、グアニジンまたはヒスチジンを含むマトリックスを使用すると、エンドトキシンをそのマトリックスに強く結合させ、それによってApo ＡまたはApo Ｅをそのマトリックスに強く結合させることができることを見いだした。次いで、界面活性剤含有溶液で溶離することにより、エンドトキシンはマトリックスに結合したままで、Apo ＡまたはApo Ｅ分子を遊離させることができる。また、Apo ＡまたはApo Ｅを陰イオン交換マトリックスに強く結合させ、それによってエンドトキシンをその陰イオン交換マトリックスに強く結合させることもできる。次いで、例えば尿素もしくはアルギニン、またはグアニジニンもしくはヒスチジンの塩を含む溶液で溶離することにより、Apo ＡまたはApo Ｅ分子はマトリックスに結合したままで、エンドトキシンを遊離させることができる。最後に、Apo ＡまたはApo Ｅ分子は、イオン強度を増加させることにより、マトリックスから遊離させることができる。本発明方法を行うための条件の選択は、エンドトキシンの濃度はできる限り低くすると同時に、Apo ＡまたはApo Ｅは許容され得る回収を達成するという要求に支配されるだろう。本発明方法により、実質的にエンドトキシンを含まないApo ＡまたはApo Ｅを製造することができる。本発明において、実質的にエンドトキシンを含まないとは、Apo ＡまたはApo Ｅ1 mg につき約 1 EU 以下の濃度であることを意味する。特に、実質的にエンドトキシンを含まないApo ＡまたはApo Ｅを得ることが可能であり、これは、組換えＤＮＡ法を特にグラム陰性菌、とりわけ大腸菌(E.col i)で行うことにより製造された。本発明方法により、エンドトキシン含量が低く、且つ、タンパク質の回収が少なくとも 70 %、適切には少なくとも 80 %、好ましくは少なくとも 90 %、より好ましくは少なくとも 95 % で、Apo ＡまたはApo Ｅを製造することができる。本発明はまた、エンドトキシンを、Apo ＡもしくはApo Ｅ、またはそれらの変異種もしくは混合物を含む水溶液から除去するための、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスおよび界面活性剤含有溶液の使用、あるいは陰イオン交換マトリックスおよび炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含む溶液の使用に関する。本発明はさらに、アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療におけるApo ＡまたはApo Ｅを含む薬物を製造するための、本発明方法に従って製造したApo ＡまたはApo Ｅの使用に関する。本発明はさらに、本発明方法に従って製造したApo ＡまたはApo Ｅを治療的に有効な量で投与することによる、アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療法に関する。第一の態様では、Apo ＡまたはApo Ｅを含む水溶液を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化リガンドを有するマトリックス上にのせる。次いで、Apo ＡまたはApo Ｅとエンドトキシンとの複合体を、界面活性剤を含む水溶液で溶離して分離し、そうして、Apo ＡまたはApo Ｅは遊離させるが、エンドトキシンはリガンドに結合したままにする。最後に、マトリックスを、例えばＮａＯＨ、Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ、ＨＡｃおよびＮａＡｃの種々の組み合わせを含む１種以上の液体で洗浄することにより再生する。本発明で使用することができる末端基の例としては、グアニジル基を含むもの、例えばアルギニンおよびグアニジン、またはヘテロ環式基を含むもの、例えばヒスチジンが挙げられる。末端基は、適切には非ヘテロ環式で、好ましくはグアニジル基を含んで、末端基を強塩基にするものである。グアニジル基を含む末端基は、さらに好ましくはアルギニンまたはグアニジンであり、最も好ましくはアルギニンである。末端基は、マトリックスに直接結合することができる。しかし、一般には、末端基を、不活性であるか、さらに結合能を示し得るスペーサーによってマトリックスに結合させる。本発明方法に十分適するス第二の態様では、Apo ＡまたはApo Ｅを含む水溶液を、陰イオン交換マトリックス上にのせる。次いで、Apo ＡまたはApo Ｅとエンドトキシンとの複合体を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含む水溶液で溶離することにより分離する。このようにして、エンドトキシンを遊離し、Apo ＡまたはApo Ｅはリガンドに結合させたままにする。窒素含有化合物の適する例としては、尿素、アルギニンおよびグアニジン塩酸塩が挙げられる。最後に、Apo ＡまたはApo Ｅを、好ましくはＮａＣｌの添加により、適切には約 0.5〜約 2 Mまでイオン強度を増加させることによりマトリックスから遊離させる。従来、タンパク質の精製法において、例えば尿素およびグアニジン塩酸塩の濃度は、組織でのタンパク質の不可逆的変性を避けるために最小に保持する。驚くべきことに、本発明者らは、本発明を行う場合、濃度が通常よりも高い窒素含有化合物が有利であることを見いだした。なぜならば、それは、エンドトキシンと Apo Ａとの間の強い複合体の露出を容易にするからである。すなわち、尿素の濃度は、約 0.75 M 〜普通の温度での飽和までの範囲、適切には 2.5 M〜8 M までの範囲、好ましくは 4.5〜7.5 M までの範囲にあるべきである。例えばグアニジン塩酸塩およびアルギニンに対して対応する濃度を選択することは、当業者の能力の範囲内である。第三の態様では、第一および第二の態様を組み合わせて、エンドトキシンが非常に低レベルである物質を得る。すなわち、Apo ＡまたはApo Ｅを含む水溶液を陰イオン交換工程に負荷し、その後、エンドトキシンを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物で溶離することにより遊離させる。エンドトキシン濃度の低下したApo ＡまたはApo Ｅを陰イオン交換マトリックスから遊離させ、所望により脱塩工程などの１つ以上の中間処理工程の後、得られたApo ＡまたはApo Ｅを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を有するマトリックス上にのせる。最後に、Apo ＡまたはApo Ｅを非常に純粋な形で遊離させることができる。逆の順序、すなわち、固定化リガンドを含むマトリックスによる第一の工程および陰イオン交換マトリックスによる第二の工程を使用することも本発明には有利である。本発明のマトリックスは、通常の種々の溶媒に可溶であっても不溶であってもよく、例えばエタノールを含む、もしくは含まない水に可溶または不溶の有機ポリマーであってよい。また、マトリックスとしては、例えば、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含むリガンドが結合したフィルターをも包含する。炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物は、任意の無機または有機マトリックス上に支持されることができる。すなわち、マトリックスは、種々の強親水性マトリックス、例えば、Pharmacia Biotec h（ウプサラ、スウェーデン）によって市販されている広範囲の Corp．（東京、日本）によって市販されているＴＳＫ−ゲルなどの有機ポリマーマトリックス、または Per Septive Bio-systems（ボストン、米国）によって市販されている高多孔性有機ポリマーマトリックスから選択することができる。マトリックスは、好ましくは、アガロースマトリックスである。本発 Kem-En-Tec A/S（コペンハーゲン、デンマーク）によって市販ギー）によって市販されている Bio-Gel A である。好ましくは、マトリックスは架橋しており、速い流動(FF)及びそれによって高い生産能を可能とする。第二の態様による方法で有用な陰イオン交換マトリックスは、例えば、Pharma cia Biotech（ウプサラ、スウェーデン）によマトリックスなどのアガロースマトリックスである。本発明方法で使用できる陰イオン交換マトリックスのさらに別の例は、Toso Haas（東京、日本）によって市販されている Super Q-650 および Fractogel EMD DEAE-650 ならびに Biosep ra S.A.（フランス）によって市販されている Hyper D である。陰イオン交換マトリックスは、適切にはアガロースマトリックスである。好ましくは、陰イオン交換マトリックスが架橋しており、速い流動(FF)及びそれによる高い生産能を可能とする。本発明は、アポリポタンパク質Ａ（Apo Ａ）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（ Apo Ｅ）、またはこれらの変異種もしくは混合物からのエンドトキシンの除去に有利に使用される。本発明は、特に、Apo ＡまたはApo Ｅを、グラム陰性菌で組換えＤＮＡ法により産生する場合、および特に、大腸菌(E．coli)で産生する場合に適する。本発明において、Apo ＡおよびApo Ｅは、任意のプリフォーム（pr eform）もしくは断片、または任意の切断、伸長もしくは突然変異形態、またはこれらの任意の形態もしくは断片の任意の混合物を含む。プリフォームは、例えば、WO-A-88/03 166（Sirtori ら）に開示されているApo Ａ−Ｉの 249 アミノ酸 Met形態に関する。他のプリフォームは、US-A-5059528(UCB)ならびに EP-A-308336、JP 216988 /1984および JP 252048/1987(以上、Mitsubishi Chem．Ind.)に開示されているプロアポリポタンパク質（proapolipoprotein）Ａ−Ｉｓである。断片は、少なくとも１個のα−らせんを含むApo ＡまたはApo Ｅの一部に関し、例えば、WO-A -93/25581(Innogenetics S.A.（ベルギー）)に開示されている。切断および伸長形態は、各々、分子のＮおよび／またはＣ末端において１個以上のアミノ酸が欠けているか付加されているApo ＡおよびApo Ｅ分子に関する。適切には、２〜８個までのアミノ酸、好ましくは３〜６個までのアミノ酸が欠けているか付加されている。突然変異形態は、１個以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている Apo ＡおよびApo Ｅ分子、例えば、WO-A-93/12143 および WO-A-94/13819に開示されているApo Ａ−ＩＭに関する。他の突然変異形態は、Apo Ａ−ＩSeattle(De ebら（1991）J．Bio．Chem．266:13654-13660)、Apo Ａ−ＩYame(Takada ら（19 91）J．Lipid Res．32:1275 ff)およびApoＡ −Ｉのまだ名前のない突然変異形態(Matsunaga ら（1991）Proc．Natl．Acad．S ci．USA 88:2793-2797)である。ヒトApo Ｅおよびその変異種は、「ヒトアポリポタンパク質突然変異体 III 」C.R．Sirtori ら編（1993）Nato ASI Series，Springer Verlag，Berlin，II 73:81-96 に開示されている。本発明を使用すると、Apo ＡおよびApo Ｅからのエンドトキシンの除去に有利である。しかし、以下の説明では、Apo Ａを使用して本発明をさらに説明する。公知Apo Ａは、例えば、Apo Ａ−Ｉ、Apo Ａ−IIおよびApo Ａ−IV である。本発明では、適切には、Apo ＡはApo Ａ−Ｉまたはその変異種もしくは混合物である。天然のApo Ａ−Ｉは、243 個のアミノ酸で構成される一本のポリペプチド鎖である。より適切には、Apo Ａは、少なくとも１個の Cys 残基がArg 残基に代わって置換していて、ジスルフィド結合した二量体の形成を可能にするApo Ａ −Ｉの突然変異形態である。天然のヒトApo Ａ−Ｉのアミノ酸配列では、Arg 残基が、10、27、61、83、116、123、131、149、151、153、160、171、173、177、 188 および 215 の位置にある。これらのうち、置換は、160、171、173、177 および 188 の位置の１個以上、すなわち、同じα −らせん内の位置で生じるのが好ましい。より好ましくは、Arg 残基が、171 および／または 173 の位置で置換される。ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩMilano（Apo Ａ−ＩＭ）は、正常なApo Ａ−Ｉの天然の突然変異形態である(Weisgraberら（1980）J．Clin．Invest．66:901-9 07)。Apo Ａ−ＩＭでは、アミノ酸の１残基であるアルギニン(Arg 173)が、アミノ酸の１残基であるシステイン(Cys 173)によって置き換わっている。Apo Ａ− ＩＭは、１本のポリペプチド鎖につき１個のシステイン残基を含むので、モノマーとして、またはジスルフィド結合した二量体として存在し得る。モノマーの分子量は約28,000 Daであり、二量体の場合は約 56,000 Daである。これら２つの形態は、化学的に相互交換することができ、本明細書では、Apo Ａ−ＩＭは、その２つの形態間を区別するものではない。 Apo Ａを含む水溶液におけるエンドトキシンの初期濃度は、10⁶、さらには10⁷ 、とりわけ10⁸ EU/mg タンパク質より多い。エンドトキシンの最終濃度は、本発明を、Apo Ａを含む水溶液に適用することにより、約 100 EU/mg 以下に低下させることができる。適切には、エンドトキシンの最終濃度を約 10 EU/mg 以下、好ましくは約 1 EU/mg 以下に低下させて、Apo Ａを実質的にエンドトキシンを含まないものにすることができる。 Apo Ａを含む水溶液におけるエンドトキシンのレベルを低くするためには、溶液を再循環して、それが少なくとも２回、マトリックスと接触するようにすることが必要であると考えられる。また、もちろん、少なくとも２つの連続した工程で同じ、または異なるマトリックスを使用して、エンドトキシンのレベルを十分低くすることもできる。これらの方法のいずれにおいても、エンドトキシンの初期濃度は、その工程において、少なくとも10⁴、適切には少なくとも10⁵、好ましくは少なくとも10⁶倍だけ低下させることができる。マトリックスは、通常は、Apo Ａを含むサンプルをマトリックスに充填する前に第一の緩衝液で平衡にさせる。充填した後、マトリックスを第二の緩衝液で処理して、本質的にエンドトキシンを含まないApo Ａをマトリックスから溶離する。好ましい態様では、Apo Ａを含む第一の水溶液は、さらに、界面活性剤を含む。界面活性剤は、第一の水溶液をマトリックスと接触させる前にエンドトキシンとApo Ａとの間の複合体を少なくとも部分的に解離するために添加する。すなわち、界面活性剤を含む第一の水溶液を、該第一の水溶液をマトリックスと接触させる前に少なくとも５分間保持することにより、複合体と特定のリガンドとの間の相互作用を促進する。適切には、界面活性剤を添加し、得られた溶液を、マトリックスと接触させる前に、15分〜10時間、好ましくは30分から４時間までの時間保持する。溶離緩衝液が界面活性剤、適切にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤を含むことは、第一の態様の必要条件であり、第二の態様では好ましい。界面活性剤は、恐らく、エンドトキシンとApo Ａとの間の強い複合体を露出させた後、エンドトキシンをApo Ａから分離することにより、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物の効果を高める。分離は、恐らく、反応動力学によって制御され、その理由のために、平衡に達するまでの時間がかなりあると考えられる。本発明に有利にするために使用することができる界面活性剤の例は、種々の胆汁酸またはその塩、例えばデオキシコール酸ナトリウムおよびコール酸ナトリウムである。また、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ブロックコポリマーおよびアルキルエトキシレートなどの正味電荷ゼロの界面活性剤も、本発明に有利に使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリオキシ−エチレン−（２０）−ソルビタンモノラウラ（イギリス）から市販）である。ブロックコポリマーの例は、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールとの組み本発明において、界面活性剤は、１個以上の脂肪酸が結合し得るアシル担体（グリセリド、スフィンゴシン、コレステロールまたはそれらの誘導体もしくは混合物など）から成る天然または合成化合物であり得る種々の脂質も含む。脂質は、その極性に応じて、非極性、極性および両親媒性脂質に分けることができる。非極性脂質の例は、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドおよびコレステロールである。極性および両親媒性脂質の例は、リン脂質および糖脂質である。適切には、極性および両親媒性脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたはそれらの混合物など、二層を形成するものである。天然の脂質は、例えば大豆油、トウモロコシ油、大豆レシチンおよび卵レシチンから得ることができる。他の適する例は、合成の飽和または不飽和ＰＣ、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジミリスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）などである。溶離緩衝液における界面活性剤の濃度は、約 2 mM 〜約 200mM まで、適切には 10 mM〜100 mM までの範囲にすることができる。界面活性剤の濃度は、好ましくは、15 mM 〜50 mM までの範囲である。溶離緩衝液のｐＨは、適切には約５〜約９までの範囲、好ましくは６〜８までの範囲である。溶離緩衝液の全イオン強度は、約 0.1〜20 mS/cm の範囲、適切には１〜８ mS /cm、好ましくは２〜５ mS/cm の範囲である。平衡緩衝液、前処理緩衝液、サンプル洗浄緩衝液および溶離緩衝液は、同じでも異なっていてもよい。界面活性剤の濃度、ｐＨおよび全イオン強度は、溶離緩衝液の場合の値と同じでも異なっていてもよい。工程は連続式（例えば、カラム上で行う）でもバッチ式でもよい。本発明を行う際は、高温を使用するのが有利である。なぜならば、高温は、エンドトキシンとApo Ａとの間の強い複合体をより容易に露出するからである。しかし、温度は、タンパク質の不可逆的変性が生じない範囲に制限される。すなわち、本発明を行う際の温度は、約２〜約 95℃、適切には 15〜90℃、好ましくは 30〜85℃、より好ましくは40〜75℃の範囲である。以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。実施例材料部分的に精製したApo Ａ−ＩＭ／20 mM リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を、行った全試験の出発材料として使用した。それは、Pharmacia AB（ストックホルム、スウェーデン）によって、大腸菌(E．coli)で産生したものである。分離試験は、種々のゲルで行った。ここで、ゲルは、固定化化合物が結合したマトリックスを示す。すなわち、試験は、ル（Bioprocessing Ltd.（イギリス）から市販）およびフィルターディスクを有する N66 Posidyne^TM帯電フィルター（Pall（イギリス）から市販）上でも試験を行った。分析試験は、Coatest エンドトキシンおよびエンド−ＬＡＬを用いて行った。分析方法 Apo Ａ−ＩＭの量は、RP-HPLC を使用して測定した。その方法を使用して、Ap o Ａ−ＩＭをクロマトグラフィーで同定し、種々の方法で収量を計算した。その方法の相対的標準偏差（ＲＳＤ）は 11 % である。ＵＶ−分光光度法を使用し、クロマトグラフィー法でタンパク質の検出を行った。吸光度は 280 nm で測定した。カブトガニ変形細胞分解産物試験（Limulus amebocyte lysatteSt: ＬＡＬ試験）は、エンドトキシンの濃度を測定するための特異的方法である。その試験は、カブトガニ（Limulus polyphemus）における初期血液凝固メカニズムに基づく。結果は EU 単位で示す。これは、種々のエンドトキシンの平均の 0.1ng に等しい。エンド−ＬＡＬ（Endo-LAL）として知られるゲル凝血終点試スウェーデン）から市販されている。この試験では、同容量のＬＡＬ試薬（溶解したカブトガニの変形細胞から調製）および試験溶液を混合し、37℃で１時間インキュベートする。 Coatest エンドトキシンとしても知られ、Chromogenix 試験（chromogenic substrate test）は、比較的新しい定量法であり、マイクロタイタープレート上で行い、分光光度法（405 nm）によって読み取る。この方法は、エンドトキシンの存在下で活性化される特定の酵素を含む。活性化酵素は、合成基質からパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を分離する。遊離したｐＮＡは、反応混合物に存在するエンドトキシンの量に比例して黄色を呈する。標準曲線を作成し、エンドトキシンの量を読み取る。発色は、酢酸の添加により停止する。その方法の相対的標準偏差（ＲＳＤ）は25 % であることが記録されている。実施例実施例１試験１ａ〜１ｇ（ゲル）行った（試験１ａ〜１ｅ）。比較のために、一つの試験は、界で行った（試験１ｆ）。さらに、界面活性剤を含む溶離緩衝液験１ｇ）、二つを Posidyne^TM帯電フィルター上で行った（１ｈ〜１ｉ）。種々の方法間で比較し得る結果を達成するために、試験１ａ〜１ｇは、各々１サイクルで、同じ方法で行った。しかし、い。従って、試験１ｇでの消毒（sanitation）プログラムは変更し、ＮａＯＨの濃度を 0.1 Mとする。全試験は、室温（約 20℃）で行った。充填流速：1 ml／分床の高さ：7.5 〜 9.5 cm ゲルの体積：6 〜 7 ml 平衡方法：平衡緩衝液（緩衝液１）：0.1 M のトリス−ＨＣｌ＋約 20 mM のデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ＝８平衡状態での流速：0.5 ml／分緩衝液の全体積：５カラム体積サンプルの処理：約 20 mM のデオキシコール酸ナトリウムをサンプルに添加し、その溶液を 30 分混合した後、カラムに充填した。充填方法：サンプルの充填：約 1 mg のApo Ａ−ＩＭ／mlゲル流速：0.2 ml／分溶離方法：溶離緩衝液（緩衝液１）：0.1 M のトリス−ＨＣｌ＋約20 mM のデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ＝８溶離における流速：0.2 ml／分消毒方法：を、50 %のＣ₂Ｈ₅ＯＨおよび 5 %のＨＡｃを含む 4.5 カラム体積の第一洗浄液、次いで 0.5 M のＮａＯＨを含む 4.5 カラム体積の第二洗浄液で洗浄した（試験１ａ〜１ｇ）。洗浄は３回行った。試験１ｈ〜１ｉ（帯電フィルター）：２つの試験を、本発明による方法と比較するために、Posidyne^TM帯電フィルター上で行った（試験１ｈ〜１ｉ）。試験を各１サイクルで行った。２つの試験では、フィルターをフィルターディスクにおき、ポンプを接続して、空気をその系から除去した。平衡方法：流速：1 ml／分時間：40分試験１ｈにおける平衡緩衝液（緩衝液１）：0.1 M のトリス− ＨＣｌ、ｐＨ＝８試験１ｉにおける平衡緩衝液（緩衝液２）：0.1 M のトリス−ＨＣｌ＋約 20 mM のデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ＝８サンプルの処理：試験１ｈでは 4 ml の緩衝液１、試験１ｉでは 4 ml の緩衝液２をサンプルに添加し、その溶液を 3 0 分混合した後、フィルターの系に充填した。充填方法：サンプル：1.2mgのApo Ａ−ＩＭ／mlサンプル溶液、全体積 1ml 充填：サンプルをフィルターの系で 30 分循環させ、生成物を集めた。各試験の後、フィルターは廃棄した。エンドトキシンの値を、ＬＡＬ色素原性基質法で分析した(試験１ａ〜１ｉ)。本発明による処理前のエンドトキシンの濃度は、全試験において、10⁶〜10⁷ EU/ mg であった。結果は、下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明方法は、Apo Ａに結合したエンドトキシンの濃度の低下に有効である。また、表から明らかなように、溶離緩衝液に界面活性剤が存在しないと、回収が悪く、最終生成物におけるエンドトキシンの濃度がより高い。実施例２試験２ａ〜２ｄにおける条件は、実施例１の試験１ａ〜１ｇと一致させたが、トリス−ＨＣｌの濃度は 20 mM とした。流速は 10 cm／時であった。試験は全て、室温（約 20℃）で行った。本発明による処理前のエンドトキシン濃度は、全試験において、10⁶〜10⁷ EU/ mg であった。回収は、少なくとも 90 % であった。結果は下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明方法の第一の態様は、Apo Ａに結合したエンドトキシンの濃度の低下に有効である。実施例３ｂ）。ゲルの体積は約 0.37ｌであり、全工程での流速は 36cm／時であった。流速は工程１〜６では下降したが、工程７では上昇した。工程１．消毒方法：含む 4 lの洗浄液（溶液１）で洗浄した。工程２．前平衡方法：ａ）前平衡緩衝液（緩衝液２）：0.2MのＮａ₂ＨＰＯ₄ｘ 12Ｈ₂Ｏ、ｐＨ＝8.0 緩衝液の全体積：3 l ｂ）蒸留水：水の全体積：5 l ｃ）残留エンドトキシンの濃度は、ＬＡＬゲル凝血終点試験に従って測定した：＜0.125 EU/ml 工程３．平衡方法：平衡緩衝液（緩衝液３）:0.01MのＮａ₂ＨＰＯ₄ｘ 12Ｈ₂Ｏ、6 M の尿素、ｐＨ＝ 8.0 緩衝液の全体積：10 l 工程４．充填方法：サンプルの全体積：2.55 l 工程５．サンプルの洗浄方法：サンプル洗浄緩衝液（緩衝液３）：0.01MのＮａ₂ＨＰＯ₄ ｘ12 Ｈ₂Ｏ、6 M の尿素、ｐＨ＝8.0 緩衝液の全体積：0.5 l 工程６．溶離方法：溶離緩衝液（緩衝液４）:0.01MのＮａ₂ＨＰＯ₄ ｘ 12Ｈ₂Ｏ、0.1 M のＮａＣｌ、6 M の尿素、ｐＨ＝8.0 緩衝液の全体積：8 l 直線勾配 0〜100 %（蒸留水および緩衝液４）により、200 分で溶離工程７．再生方法：再生緩衝液（緩衝液５）：2 M のＮａＣｌ緩衝液の全体積：0.75 l 結果は下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明方法の第二の態様も、Apo Ａに結合したエンドトキシン濃度の低下に有効である。実施例４上で２サイクルで行った（試験４ａ）。別の試験は、やはり本試験４ａおよび４ｂの条件は、実施例１および３と適宜一致させた。試験は全て、室温（約 20℃）で行った。結果は下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明による２工程方法は、Apo Ａに結合したエンドトキシン濃度を非常に低レベルに低下させる手段を提供する。実施例５試験５ａおよび５ｂ（尿素を使用）よび５ｂ）。試験５ａでは、ゲルの体積が約 114ｌであり、カラムの高さが 15 cmであり、流速は全工程において約 50 cm／時であった。試験５ｂでは、ゲルの体積が約 85ｌであり、カラムの高さが 30 cmであり、流速は全工程において約 50 cm／時であった。試験５ａおよび５ｂは、室温で行った（約20 ℃）。工程１．消毒方法体で洗浄した（溶液１）。ｂ）蒸留水ｃ）残留エンドトキシンの濃度は、ＬＡＬゲル凝血終点試験に従って測定した：＜0.125 EU/ml 工程２．平衡方法：平衡緩衝液（緩衝液２）：0.03 Mのトリス、8 M の尿素、1 mMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ＝7.5 工程３．充填方法：工程４．サンプルの洗浄方法：サンプル洗浄緩衝液（緩衝液２）：0.03 M のトリス、8 M の尿素、1 mMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ＝7.5 工程５．溶離方法：溶離緩衝液（緩衝液３）：0.055 M のトリス、8M の尿素、1 mMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ＝7.5 工程６．再生方法：再生緩衝液（緩衝液４）：2 M のＮａＣｌ試験５ｃ（尿素は使用しない）本発明との比較のために、一つの方法を、尿素を存在させないで行った。残りの条件および濃度は、試験５ａのものと同じであった。結果は、下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明方法の第二の態様は、スケールを大きくしても、Apo Ａに結合したエンドトキシン濃度の低下において有効である。尿素の不在下では、Apo Ａの回収は検出できず、その理由により、エンドトキシン濃度の測定もできなかった。であるカラムに入れた。そのカラムを、試験５ａおよび５ｂに従って溶離緩衝液（緩衝液３）で平衡にした。サンプルをカラムに充填してまっすぐ通し、溶離緩衝液（緩衝液３）で溶離した。試験５ｂの第二工程は、室温（約 20℃）で行った。結果は、下記表から明らかである。表から明らかなように、本発明による２工程方法は、Apo Ａに結合したエンドトキシン濃度を非常に低レベルに低下させる手段を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/36 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/22 ＡＢＮＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．アポリポタンパク質Ａ（Apo Ａ）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（Apo Ｅ）またはそれらの変異種もしくは混合物からエンドトキシンを分離する方法において、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスと接触させた後、その固定化化合物を含むマトリックスを界面活性剤を含む第二水溶液で処理すること、あるいは、該Apo ＡまたはApo Ｅを含む第一水溶液を陰イオン交換マトリックスと接触させた後、その陰イオン交換マトリックスを、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含有する第二水溶液で処理することを特徴とする方法。２．第一水溶液がさらに界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。３．該第一水溶液を、固定化化合物を含むマトリックスまたは陰イオン交換マトリックスと接触させる前に、15 分〜10 時間までの範囲の時間、保持することを特徴とする請求項２に記載の方法。４．界面活性剤が陰イオン性であることを特徴とする前記請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．Apo ＡまたはApo Ｅをグラム陰性菌での組換えＤＮＡ法により製造することを特徴とする前記請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．Apo ＡがApo Ａ−Ｉまたはその変異種もしくは混合物であることを特徴とする前記請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．Apo Ａ−ＩがApo Ａ−ＩMilano であることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．末端基がグアニジル基を含むことを特徴とする前記請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．末端基がアルギニンまたはグアニジンであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．陰イオン交換マトリックスを、界面活性剤および尿素、アルギニンまたはグアニジンの塩を含む第二の水溶液で処理することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。１１．マトリックスがアガロースマトリックスであることを特徴とする前記請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。１２．固定化化合物を含むマトリックスおよび陰イオン交換マトリックスを順次、任意の順番に、所望により１個以上の中間工程を入れて使用することを特徴とする前記請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。１３．エンドトキシンの濃度を、該方法で少なくとも 10⁴倍だけ低下させることを特徴とする前記請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。１４．エンドトキシンの濃度を、該方法で少なくとも 10⁶倍だけ低下させることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．組換えＤＮＡ法によって製造される、実質的にエンドトキシンを含まない Apo ＡまたはApo Ｅ。１６．大腸菌(E．coli)での組換えＤＮＡ法によって製造される、実質的にエンドトキシンを含まないApo ＡまたはApo Ｅ。１７．請求項１〜１４のいずれかに従って製造される、実質的にエンドトキシンを含まないApo ＡまたはApo Ｅ。１８．エンドトキシンをApo ＡもしくはApo Ｅまたはそれらの変異種もしくは混合物を含む水溶液から除去するための、炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む末端基を有する固定化化合物を含むマトリックスおよび界面活性剤含有溶液あるいは、陰イオン交換マトリックスおよび炭素原子に結合した２または３個の窒素原子を含む化合物を含有する溶液の使用。１９．アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療における、Apo ＡまたはApo Ｅを含む薬物を製造するための、請求項１〜１４のいずれかに従って製造したAp o ＡまたはApo Ｅの使用。２０．請求項１〜１４のいずれかに従って製造したApo ＡまたはApo Ｅを治療的に有効な量で投与することを特徴とする、アテローム硬化症および心臓血管疾患の治療法。