JPH11502101A

JPH11502101A - 電気化学発光検定

Info

Publication number: JPH11502101A
Application number: JP8521217A
Authority: JP
Inventors: マークティー．マーチン
Original assignee: イゲン，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-01-04
Filing date: 1996-01-04
Publication date: 1999-02-23
Anticipated expiration: 2016-01-04
Also published as: EP0801687A4; AU711795B2; DE69630775D1; EP0801687A1; US5641623A; KR100444250B1; WO1996021039A1; US6120986A; AU4746696A; DE69630775T2; EP0801687B1; JP3122468B2; ATE254665T1; CA2209546A1

Abstract

(57)【要約】本発明はβ−ラクタム抗生物質およびβ−ラクタマーゼの検出または定量化のために適当である迅速なシングルステップの分析に関する。本分析は、ミルクおよび食肉のような食品、血液または血清のサンプルについて直接に行なわれることが出来、また特定の細菌感染を治療するにあたって特定の抗生物質の適合性を決定するため、また細菌感染を診断するのに有用である。下図はベンジルペニシリンのβ−ラクタマーゼ触媒作用加水分解を例示する。本分析はIGENのOrigenアナライザー上で行なわれることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】電気化学発光検定発明の分野本発明は、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼの検出および定量的測定のための電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく検定(分析、assay)の開発に関し、この検定は細菌感染の診断および治療の監視のために適している。発明の背景ＥＣＬに基づく検定は当業界に周知でありそしてそれらの正確さ、使用の容易性および放射性物質の不存在の故に拡大した適用を見出している。特に有用なＥＣＬシステムはBio/Technologyに第１９３頁〜第１９４頁（１９９４年２月）のYang等による論文に記載されている。またBiomedical Products １９９２年１０月号におけるMasseyによる論文ならびに米国特許第５，２３５，８０８号および同第５，３１０，６８７号（これらの論文および特許の内容を参照することにより本明細書に組み入れる）を参照。ＥＣＬ法は、幾つかの異なるメカニズムにより多くの異なる分子について示されて来た。Blackburn 等（１９９１）のClin．Chem．３７／９第１５３４頁〜第１５３９頁において、その技術を示すためにその著者はトリプロピルアミン（ＴＰＡ）とのルテニウム（II）トリス（ビピリジル）（Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺）のＥＣＬ反応を使用した（Leland等（１９９０）のJ.Electrochem．Soc．１３７：３１２７〜３１３１）。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の塩はビピリジル配位子の１つの上の反応性基で化学的に変性されて、たんぱく質、ハプテンおよび核酸が容易に標識化されることが出来る、活性化種(Species)を形成することが出来る非常に安定な水溶性化合物である。Blackburn 等により使用されたＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の活性化形はＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺−ＮＨＳエステルであった。感受性のペニシリンおよびセファロスポリンのβ−ラクタム環のアミド結合を加水分解するベータ−ラクタマーゼは微生物の中で広く分布しておりそしてβ− ラクタム抗生物質に対する微生物耐性においての役割を果している。ベータ−ラクタマーゼは多数の細菌種(species)によって同化されるがしかし哺乳動物の組織によっては同化されなくそして基質特異性において変化できる１群の関連酵素を構成する。一般にPayne D.J.のJ.Med．Micro（１９９３）３９第９３頁〜第９９頁；Coulton,S.およびFrancois,I．のProg．Med．Chem.（１９９４）３１，第２９７頁〜第３４９頁；Moellering,R.C.,Jr．のJ.Antimicrob．Chemother.（１９９３）３１（増補版Ａ）第１頁〜第８頁；およびNeu,H.C.のScience（１９９２）２５７第１０６４頁〜第１０７２頁参照。体液中のβ−ラクタマーゼ活性の検出は最近または現在の細菌感染の表示であると長い間考えられて来た。ペニシリンおよびセファロスポリンのような抗生物質に対する発現している微生物の耐性はしばらくの間重要な問題であった。最近、新しい抗生物質の数がだんだん少なくなって来ていることおよび既知である抗生物質が過剰に使用されていることからみて、この問題は徐々に上昇して来ている。特定の感染を治療するために最適の抗生物質を選択することそして有効な代用物質が存在するときに最も最近の抗生物質を処方することを避けることが一層絶対に必要になって来ている。最適の抗生物質を選ぶためのこの能力は抗生物質の耐性が次第に増大して問題になっている長期間治療施設を包含する施設において特に重要である。抗生物質の現在の族群の有効期間は、最適な抗生物質の選択により延長されることが出来る。一般にScience Vol．257（１９９２年８月１１日）第１０６４頁〜第１０７２頁のHarold C.Neuの“The Crisis in Antibiotic Resistance”参照。抗生物質に対する細菌耐性に対する上昇する抵抗は、ペニシリンまたはセファロスポリンのような特定のβ−ラクタム抗生物質に対する耐性の程度を定量的に迅速に測定することが出来そして次に特定の感染症状のための最も適当な抗生物質を選択することの出来る試験の必要性を高めた。微生物β−ラクタマーゼの検出のために幾つかの方法が現在存在する。若干の代表的な例は下記のとおりである。 J.Appl．Bacteriol.（１９９２）Vol.７３，No．１，第１４頁〜第２２頁におけるW.L.Baker の“Co-existence of β-lactamase and Penicillin acylase in bacteria; detection and quantitative determination of enzyme activities ” は、単一の基質上の酵素の作用により下記両方の物質が生成される場合にペニシロエート類(penicilloates)の検出のための銅−減少性検定および６−アミノペニシラン酸濃度を検出するためのフルオレサミン検定を開示している。米国特許第５，２６４，３４６号は種々の適用性を有する、β−ラクタマーゼについての比色検定を開示している。その検定はｐ−フェニレンジアミンのＮ− アルキル誘導体またはベンジジンの３，３′，５，５′−テトラアルキル誘導体のいずれかの酸化により形成された発色団の脱色に基づいている。その脱色はセファロスポリンまたはペニシリンの加水分解から生ずる開いたβ−ラクタム環生成物の存在に起因している。ペニシリンの開いたβ−ラクタム生成物での脱色は水銀含有化合物のような脱色増進剤の存在を必要とする。その増進剤はセファロスポリンの開いたβ−ラクタム生成物での脱色のためには必要とされない。米国特許第４，４７０，４５９号は蛍光を発するようにその能力を反転する、 β−ラクタム基質のβ−ラクタマーゼ転換に基づいている、微生物源からのβ− ラクタマーゼの存在の検出のための迅速な方法を開示している。この性質を有するとして述べられた特定のβ−ラクタマーゼ類はアンピシリン、セファレキシン、アモキシリン、セファドロキシルおよびセファログリシンを含有する。蛍光を発するようにその能力の変化はβ−ラクタマーゼの存在に起因している。 β−ラクタマーゼ生産性物を確認するための微生物学的試験方法をＷＯ８４／０３３０３は開示している。その検定はクマリンのような指示薬の蛍光に影響する酸性度における変化に頼っている。酸性度におけるこの変化はβ−ラクタマーゼの存在により生成された転換生成物に起因している。 Eur．J.Clim．Microbiol．Infect．Dis（１９８９），Vol.８ No.１１第９６２頁〜第９６７頁におけるA.C．Peterson 等によるEvaluation of four qualita tive methods for detection of β-lactamase production in Staphylococcus and Micrococcus species”はβ−ラクタマーゼについての定性的検定を評価するのに使用された或る種のファクターを提供している。 The Journal of Pediatrics，Vol．９７，No．５、（１９８０年１１月）第７１５頁〜第７２０頁におけるRolert H.Yolken 等による“Rapid diagnosis of i nfections caused by β-lactamase-producing bacteria by means of an enzyme radioisotopic assay”は細菌感染の検出のための迅速な試験としてβ− ラクタマーゼの測定のための感受性酵素放射性同位元素検定を開示している。検定の試験計画（プロトコル；protocol）は溶離された分画の放射能の測定のまえに、サンプルでのインキュベーション工程、次の、ＤＥＡＥ−セファセル(DEAE- Sephacel)のような正に荷電されたカラム上での分離工程を包含する。β−ラクタマーゼ転換されたペニシリン系生成物は、正に荷電されたカラムにペニシリンよりもより強く結合することを確実にする追加のカルボキシル基を有する。溶離された分画値と元の値との間の放射能の差はβ−ラクタマーゼの存在に起因している。本明細書に開示される本発明の以前に、非常に迅速（１０分またはそれ以下）なそしてまた非常に感受性のある両方の性質を有する、β−ラクタムおよびβ− ラクタマーゼについての包括的な検定の必要性がある。この出願内に開示される本発明はβ−ラクタム類またはβ−ラクタマーゼ類の測定に電気化学発光方法論を適合させることによりこれらの必要性を達成する。本発明の他の目的はまた、次のとおりの本発明の記載から明らかとなろう。発明の概要広く述べれば、本発明は、β−ラクタマーゼ類またはβ−ラクタム部分の検出のための電気化学発光に基づく検定を意図している。本発明は迅速な（１０分またはそれ以下の）および感受性の高い（抗生物質のマイクロモルの濃度およびβ −ラクタマーゼのピコモルの濃度という低い濃度）、β−ラクタム抗生物質ならびにβ−ラクタマーゼについての包括的な検定を、その目的の１つとして有する。この検定は、β−ラクタム抗生物質およびβ−ラクタマーゼの検出ならびに定量化に適している。 β−ラクタマーゼ類およびβ−ラクタム類についての測定用システムとして電気化学発光の方法の使用の中心をなすものは、β−ラクタム抗生物質および（または）それらの加水分解生成物がＥＣＬ機器においてＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺に光を発生させることを出願人が認識したことによる。さらに、試験されたすべてのβ −ラクタム類に関して、この能力に関してもとのままの抗生物質とそれらの加水分解生成物との間に実質的な差がある。したがって、化学発光における変化はβ −ラクタマーゼ活性の存在と相関している。本出願人にとっての等しく驚かされたことは、種々のβ−ラクタム構造の測定に対して従って即ち酵素のβ−ラクタマーゼ族群の測定に対してこの検定が万能であることであった。これに対する重要なことは、もとのままの抗生物質構造の第三級アミン構造が加水分解生成物において第二級アミンの構造に転換することである。加水分解されたそして（または）加水分解されていない化合物は先行技術の化学発光検定においてトリプロピルアミンとしての機能を果している。必要とされるすべては興味のあるβ−ラクタム抗生物質を用いたサンプルをインキュベートしそして確立されたプロトコルおよび装置を用いて時間経過にわたって化学発光における変化を測定することである。当時出願人によってまた予期されなかったことは比較的に短かい時間（５分〜２時間）に結果が得られることそしてβ−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼの両方について達成された感度であった。Anal．Chem．６４（１９９２）第２６１頁〜第２６８頁におけるDowrey等による“Chemiluminescence Detection Using Regenerable Tris（２，２′bypy ridyl）ruthenium(II)Immobilized in Nafion”の第２６４頁の表１に示されるように、本発明以前にはペニシリンの加水分解構造物が認識出来る量のＥＣＬを生成することは、知られていなかった。図面の記載図面説明：図１はベンジルペニシリンの、β−ラクタマーゼ触媒作用された加水分解を例示する。図２はβ−ラクタム類の若干共通する化学構造を示す。図３は分光測光（黒い棒）およびＥＣＬ（灰色棒）の検定法を用いての抗生物質加水分解の定量化を示す。本明細書において詳細に記載されるように、分光測光法は加水分解されていないおよび加水分解された抗生物質の電子吸光スペクトルの特有の特性に関係するファクターに依存して多様であるが、一方、ＥＣＬ機器法は単一の方法がすべての抗生物質について用いられた。すべての場合において、各々の抗生物質の１．０ｍＭを４種の酵素の１つを用いて１０分間室温でインキュベートした。図３ＡはB.cereus β−ラクタマーゼＩ（１．３ｎＭ）を示す。図３ＢはB.cereus β−ラクタマーゼII（４２．６ｎＭ）を示す。図３ＣはEnterobacter cloacal Ｐ９９（１．９ｎＭ）を示す。図３ＤはE.coli RTEM（０．７３ｎＭ）を示す。ＥＣＬ実験のために、各サンプルの２７５μｌを１２０μＭＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺ および０．６％トリトン（Triton）Ｘ−１００の２５μｌと混合した。混合物をＥＣＬ機器（メリーランド州ロックビルのIGEN，Inc.のOrigen^Rアナライザー）を用いて分析した。図４はＥＣＬに対する加水分解されたおよび加水分解されていないβ−ラクタム濃度の標準曲線である。図Ａはアンピシリンの酵素触媒作用（B.cereus）β− ラクタマーゼ加水分解を示す。図ＢはセフォキシチンのＮａＯＨ加水分解を示す。Ａ）およびＢ）の両方において閉じた環はもとのままの抗生物質を表わしそして開いた環は抗生物質加水分解の生成物を表わす。サンプルは図３についての説明において記載されているとおりにして処理されそして分析された。図５は細菌のβ−ラクタマーゼ活性のＥＣＬ測定による菌細胞の定量化を示す。E.coli抽出物（遠心分離ペレット）の種々の量を１．０ｍＭアンピシリン中で一夜インキュベートした。β−ラクタマーゼ抑制剤６−β−Ｂｒ−ペニシラン酸を加えたものもある。インキュベートされた混合物は１．０ｍＭアンピシリンおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５ならびにAmpS E.coli（低水準のβ −ラクタマーゼ）（開いた三角形）；AmpS E.coli と６−β−Ｂｒ−ペニシラン酸（閉じた三角形）；AmpS E.coli（高水準のβ−ラクタマーゼ）（閉じた環）、あるいはAmpR E.coli と６−β−Ｂｒ−ペニシラン酸（閉じた環）のいずれかとからなった。一夜インキュベートされたサンプルを分別し、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ² ⁺ およびTriton Ｘ−１００をそれぞれ、１０μＭおよび０．０５％の最終濃度を与えるように加えた。ＥＣＬをＩＧＥＮのＥＣＬ機器を用いて測定した。図６に抗生物質についての可能なＥＣＬ反応メカニズムを例示した。或る場合において加水分解生成物は、この反応において光を引き出すように関与する。試験されたすべての場合において、抗生物質とその加水分解生成物との間には実質的な差がある。好ましい態様の記載ＥＣＬ励起のメカニズムは次のとおりである。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺および（加水分解されたおよび（または）加水分解されていない）抗生物質は金電極の表面で酸化されて、それぞれＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺および構成物質^+・を形成する。この記載において、「抗生物質」はもとのままのものであるかまたは加水分解されているものを示す。抗生物質^+・は自発的にプロトンを失い、抗生物質^・を形成する。強い還元剤である抗生物質^・は強い酸化剤であるＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺と反応して検出されるＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^2+*の励起状態を形成する。その励起状態は６２０ｎｍの波長を有する光量子を発する正規の蛍光メカニズムにより基底状態に減衰する。適当な電気化学検出剤である有機化合物は例えばルブレン(rubrene)および９，１０−ジフェニルアントラセンを包含する。多くの有機金属化合物は適当な電気化学検出剤であるが好ましく使用されるものの中にはルテニウムIIトリス−ビピリジンキレートのようなＲｕ−含有化合物およびＯｓ−含有化合物がある。ここに開示された発明において有用な検出剤は米国特許第５，３１０，６８７号（この特許の内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。これらの検出剤は長期間安定である。さらに、これらの検出剤は安全で比較的に安価である。これらは自然には起こらない高度に特徴的なシグナルを与える。このような検出剤の発光に基づく測定は感度が高く、速く、再現可能であり簡単な計器装備により実行できる。シグナルは検出剤の各分子により繰り返して生成させされ、これにより検出剤が検出される感度を増大させる。本発明の好ましい電気化学発光検出剤は、本明細書において便宜上Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺として以下記載する。この検出剤またはその均等物質を種々の量使用することが出来る。これらの検出剤は生物学的サンプルまたは食品サンプルにサンプルを予備処理することなしに、直接に使用することが出来ることにまた注目すべきである。励起状態の形成のために必要なエネルギーはＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺と抗生物質^・との電気化学的電位における大きな差から生ずる。励起した状態のＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^2+* は６２０ｎｍで光量子を発する、正常な蛍光メカニズムにより減衰する。これによりＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のもとの形を再生し、これは上記の反応順序を複数回繰り返すことが可能である。それ故に各ＥＣＬ−活性検出剤は各測定サイクル中に多くの光量子を発することが出来、検出感度を高めることができる。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺検出剤の定量化は比較的に複雑でない計器装備を用いて容易に自動化することが出来る。機器の重要部分はＥＣＬ反応の開始のための作用電極および対電極を含有する電気化学フロウセルである。両方の電極は金から造られるがしかし他の材料も使用されて種々の程度に成功している。ポテンシオスタットは電極に種々の電圧波形を適用し、単一の光電子増倍管（ＰＭＴ）はＥＣＬ反応中発せられた光を検出する。Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極はフロウセルから下流の流体通路に置かれ、フロウセル中に種々の流体を引き入れるためにぜんどうポンプが使用される。典型的には、検定流体は試験管から流動セル中に引き入れられ検出剤は、電極に傾斜電圧を適用し発した光を測定することにより定量化される。測定後に、電気化学清浄化処理のために、高い−ｐＨの清浄化用溶液が該セル中に引き入れられる。次に調節用溶液が該セル中に引き入れられ、電圧波形が適用され、電極の表面を高度に再現可能な状態とし、次の測定サイクルに供される。ＥＣＬ反応は多くの異なる電圧波形により効率よく開始することが出来る。作用電極電流およびＥＣＬ強度の測定は電極に三角波の適用により誘導される。示されるとおりの適用された電圧は実際に、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極で測定された電圧でありそして有意な非補償抵抗の作用を包含する；したがって、作用電極で適用された実際の電圧は記述された電圧より実質的に小さい。三角波形は７５０ｍＶ／秒の割合で５６５ｍＶから２８００ｍＶに上昇しそして次に同じ割合で１０００ｍＶに減少する。セル中を流れる電流は、本質的に、β−ラクタム抗生物質の酸化および水の加水分解の結果である。β−ラクタム抗生物質とＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺との両方の酸化は適用された電圧が〜１１００ｍＶに達するときに明白となり発光を生成する。発光の強度は、電極の表面での抗生物質が激減し、その結果減少した強度を生ずるまでは適用された電圧とともに増大する。観察された発光の強度は、光量子計数または電流モードのいずれかで操作する慣用のＰＭＴ（複数）（光電子増倍管）を用いて容易に測定することが出来るのに十分に大きい。興味のあるβ−ラクタムが加えられたサンプルは次に、初期値を得るために測定用セル中に置かれる。典型的には、興味のあるβ−ラクタムは１０ミクロモル〜１．０ミリモルの濃度で加えられる。電気化学発光検出剤は典型的には１０^-6 Ｍ濃度（１〜１５μＭの範囲）で存在する。次にサンプル含有セルはもし酵素β −ラクタマーゼが存在するならばその酵素の触媒作用の加水分解が起り得るのに十分な時間の間インキュベートされる。この時間期間は典型的には５分〜２時間である。サンプルおよび試薬濃度に依存してより長い時間およびより短かい時間の期間であってもよい。包含されるパラメータはすべては経験実験的なものであるので、それらの値は慣用技術を用いて決定することが出来る。インキュベーションが起こった後に、第２の読み取りを行う。読み取りにおける差がもし存在するならば、それはサンプル中に存在するβ−ラクタマーゼ活性と相関する。これに関して図４参照。同様にして、特定のサンプルを小部分に分けあるいは特定の患者から得た一連のサンプルを順次一連のβ−ラクタム抗生物質で処理してサンプルまたは患者についてのプロフィルを作成することが出来る。このプロフィルは治療のために好ましい抗生物質を選択するために医者により用いることが出来、または存在する情報ライブラリーに基づいて含まれる微生物を同定確認するために用いることが出来る。感染を治療するのに使用するために好ましい抗生物質はほとんど加水分解されない抗生物質である。一連の代表的なβ−ラクタマーゼ類からのβ−ラクタマーゼを用いて一連の構成物質について上記の方法を繰り返すことによって１セットの標準を造ることがまた可能である。このような代表例が図３ａ〜図３ｄに示されている。未知のものについて決定した値を同定確認の目的のために、そのようなセットと比較することが出来る。この情報は取り扱いおよび比較を容易にするために電子形であってよい。サンプルをβ−ラクタム抗生物質で処理しそして（または）インキュベートした後に、作用電極に電位を適用することによりＥＣＬ測定が行なわれる。これは発生光からの特徴的シグナルを与える。サンプルまたは添加された緩衝剤中に存在する他の物質により提供されたバックグラウンドから生ずる比較的小さな干渉もほとんどない。したがって、この発明の方法を行なうために適当な装置および方法論は、前の方に記載したように、米国特許第５，０６８，０８８号、同第５，０６１，４５５号、同第５，０９３，２６８号、同第５，１４７，８０６号および同第５，２２１，６０５号（これらの特許を参照することにより本明細書に特に組み入れる）に示されるものを包含する。また、検出剤として測定用システムにおいて使用するための電気化学発光分子は、米国特許第５，３１０，６８７号（この特許を参照することにより本明細書中に特に組み入れる）に記載されたルテニウムおよびオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子を包含する。本検定を行なうために必要な材料を含有する試薬キットを組み合わして取り扱いを容易にし標準化を促進することが出来る。キットに包含されるべき材料は究極の目的にあわせて変化させてもよい。典型的にはキットは電気化学発光検出剤、必要な緩衝剤および標準を包含する。標準は化学試薬であってもよくあるいは検定を行なうために必要な較正に必要な印刷された形または電子形の（経験実験的）データであってもよい。例１： β−ラクタマーゼによるβ−ラクタム加水分解のＥＣＬ検定細菌β−ラクタマーゼ酵素はβ−ラクタム抗生物質を加水分解し不活性化する（図１）。多くの異なる種のグラム陰性菌およびグラム陽性菌（１）により生成された１００以上のβ−ラクタマーゼがある。各β−ラクタマーゼは限られた且つ特有“スペクトル”のβ−ラクタム抗生物質を加水分解する（若干のβ−ラクタム抗生物質について、図２参照）。したがってもし、或るβ−ラクタマーゼ生成性細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数また複数）の基質でない抗生物質で刺激されたら、その抗生物質は菌株にとって致死的である可能性がある。逆に、もし或る細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数または複数）に基質である或るβ− ラクタム抗生物質で刺激されたら、その菌株はその抗生物質を破壊し、その刺激に抵抗し生き残る。病原菌がβ−ラクタマーゼを生成するかどうか、そしてもし生成するとしてその特定の酵素が認識し且つ加水分解するのはどの抗生物質かを前もって知ることは困難である。もし、医者の決定を行なう方法の一部として、抗生物質投与の前に、その抗生物質を加水分解して且つそれを有効なものでないものにすることが出来るβ−ラクタマーゼが存在するかどうか決定するために患者の感染組織または生物学的液体のサンプルを候補抗生物質と混合することが出来るならば、そのような微生物感染の非常に有益な医療的処置であろう。１つの実験として、４種の異なるβ−ラクタマーゼの１種またはそれ以上による、６種の異なる市販のβ−ラクタム抗生物質（ベンジルペニシリン（１）；アンピシリン（２）；アモキシリン（３）；モキサラクタム（４）；セフォキシチン（５）；およびセファロスポリンＣ（６））の加水分解（または、加水分解なし）を電気化学発光（ＥＣＬ）に基く方法を用いて検出且つ定量化した。これらの抗生物質は化学構造においてかなり異なるけれども、各々は共通して四員のβ −ラクタム環を有する（図２）。各抗生物質を、１０μＭのルテニウム（II）トリス（ビピリジル）（Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺として略述される）および０．０５％のトリトンＸ−１００を含有する０．１Ｍリン酸塩（ナトリウム塩）のｐＨ７．５の溶液中に１．０ｍＭの濃度に溶解した。同様にして４種の市販のβ−ラクタマーゼ酵素の１種（Bacillus cereus からのタイプＩの１．３ｍＭ、Bacillus c ereus からのタイプIIの４２．６ｎＭ、E.coliからのRTEMの０．７３ｎＭまたは Enterobacter cloacae Ｐ９９の１．９ｎＭのいずれか）を含有する以外は同一である、抗生物質の他の溶液を調製した。室温（約２２℃）で１０分インキュベーションの後に、ＥＣＬ分析用機器（メリーランド州ロックビルの IGEN，Inc. のOrigen^Rアナライザー）を用いて、（各々の酵素を有するそしてそれを有しない）抗生物質溶液のＥＣＬ分析を行なった。ＥＣＬ強度上への酵素インキュベーションの影響を観察した。発生したＥＣＬのソースの確認のために、同じ６種の抗生物質の加水分解を分光測光的にモニターした（β−ラクタム抗生物質の加水分解の際、紫外領域でスペクトル変化が起こることが知られている）。６種の抗生物質のＵＶスペクトル性質が実質的に異なるので、抗生物質加水分解の分光測光的分析は実際には複数の方法からなった。各検定において監視される波長ならびにキューベット通路長は各抗生物質について各々最適化を必要とし、即ち；ベンジルペニシリンおよびアンピシリンは１０ｍｍのキューベットおよび２４０ｎｍの波長を必要とし；セファロスポリンＣ測定は２ｍｍキューベットおよび２６０ｎｍの波長を必要とし；セフォキシチンは２ｍｍキューベットおよび２６５ｎｍの波長を必要とし；モキサラクタムは２ｍｍキューベットおよび２７０ｎｍの波長を必要とし；そしてアモキシリンは２ｍｍキューベットおよび２４０ｎｍの波長を必要とした。対照的に、ＥＣＬ測定はすべて、同一のＥＣＬ機器セットを用いて行なわれた。図３ａ〜図３ｄに示されるようにβ−ラクタマーゼの低い濃度（ナノモル以下）によるβ−ラクタム加水分解は１０分でＥＣＬにより検出されることが出来ることがわかる。抗生物質モキサラクタムおよびセフォキシチンの加水分解は（塩基を用いての処理では、実質的なＥＣＬ変化がこれらの化合物の加水分解に伴なっているけれども：例２参照）、ＥＣＬおよび分光測光法の両方ではそれらが、実験において使用されたどの酵素によっても触媒作用されなかったことを示したので、抗生物質モキサラクタムおよびセフォキシチンは図３に示されていない。図３は分光測光（黒色棒）およびＥＣＬ（灰色棒）の検定方法による加水分解の定量化が同様の結果を提供することを示している。これらの結果はまた、試験された該４種の酵素の各々が、基質特異性の特有の“スペクトル”を有することを示している。臨床的には、治療に有効な抗生物質は微生物のβ−ラクタマーゼにより有意に加水分解されない抗生物質から選択することが有利である。したがってこの実験は４種の“模擬”感染の研究として考えられることが出来る。各模擬感染（酵素）はβ−ラクタマーゼ基質特異性、各抗生物質のインビボ有効性を予測するのに助けとなる情報を得るために６種の候補β−ラクタム抗生物質で刺激された。例２：塩基によるベータ−ラクタム加水分解のＥＣＬ検定 β−ラクタム抗生物質は酸類または塩基類によって加水分解されることが出来る。希釈水酸化ナトリウムを用いてのβ−ラクタム抗生物質の加水分解は一般に、それらがβ−ラクタマーゼにより加水分解されるときと実験的に同一のＥＣＬ検定結果を生成する（表１）。特定のβ−ラクタムが任意の既知のβ−ラクタマーゼによって認識され得ないかまたは加水分解され得ない或る場合、その抗生物質の塩基加水分解サンプルのＥＣＬ特性との比較により抗生物質のＥＣＬ定量化を行なうことが出来る。表２は図２において構造が示めされる１０種のβ−ラクタム類により生成されたＥＣＬ上へのＮａＯＨの影響を示す。０．２ＭのＮａＯＨを用いての一夜の処理はすべての場合においてβ−ラクタム環の完全な加水分解を生じた。すべての場合において、種々の程度であるけれども塩基加水分解はＥＣＬ性質を変化させることを見ることが出来る。（ペニシリンＧ、アンピシリンおよびアモキシリンのような）試験された抗生物質の或るものは加水分解後増大したＥＣＬを与え、一方では（セフォキシチンおよびセファロスポリンＣのような）他の抗生物質は加水分解後実質的により低いＥＣＬを与えた。この観察についてまたは各々の化合物が特有的に挙動する事実について明らかな化学構造的理由がないけれども、ペニシリン類は加水分解後より高いＥＣＬを提供しそしてセファロスポリン類は加水分解後により低いＥＣＬを提供する。ＥＣＬ挙動における差についての、下に存在する機械論的理由は、恐らくは、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺に電子を有効に移動させることが出来る安定なラジカルカチオンを形成する基質および反応の生成物の感受性における変化の結果である（提案されたＥＣＬメカニズムの体系を示す図６参照）。（セファロスポリンＣおよびセファクロールを用いての）或る場合において、抗生物質を加水分解するために用いられたＮａＯＨの濃度および加水分解時間の長さに依存して結果が変化したことに留意すべきである。これは、ＮａＯＨとこれらの特定の化合物との間で起るβ−ラクタム加水分解に加えて、他の反応によるものであると信じられる。酵素加水分解はβ−ラクタムを加水分解する化学的に、よりおだやかな方法でありそして或る場合においてＮａＯＨの使用より好ましい可能性がある。例３：ＥＣＬによるβ−ラクタム類の定量化 β−ラクタム抗生物質の濃度を測定することは治療薬剤の監視においてそしてまた抗生物質を投与された牛からの食肉およびミルクのような食品の品質の監視において重要である。任意の分析方法において、シグナルが分析物濃度の関数として変化することが重要である。ＥＣＬを用いたβ−ラクタム類の検出および定量化はそれらの濃度に依存していることが分かったので、未知のサンプルの濃度を適当な標準曲線との比較によって決定することが出来る。標準曲線（抗生物質濃度対ＥＣＬ）をペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシリン、セフォキシチン、セファロスポリンＣおよびモキサラクタムについて作成した。図４において普通に使用されるペニシリン、アンピシリンについての標準曲線（図４ａ）および広く使用されるセファロスポリン、セフォキシチンについての標準曲線（図４ｂ）が示される。アンピシリンの場合において、B.cereusからのβ−ラクタマーゼＩの７ｎｍの、不存在下または存在下に、室温で１０分間、ｐＨ７．５の０．１Ｍのリン酸ナトリウム中で、種々の濃度の抗生物質（０〜０．１ｍＭ）の２７５ μｌをインキュベートした（アンピシリン）。セフォキシチンについては、抗生物質の１．５ｍＭの溶液を室温で一夜、０．２ＭのＮａＯＨ中でインキュベートした。加水分解されたセフォキシチンの溶液の適当な希釈液（０〜１．０ｍＭの２７５μｌ）およびセフォキシチンの比較できる加水分解されていない溶液の適当な希釈液（０〜１．０ｍＭの２７５μｌ）を調製した。（加水分解されたおよび加水分解されていない）アンピシリンおよびセフォキシチン溶液の２７５μｌに１２０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺および０．６％のトリトン（Triton）Ｘ−１００の溶液の２５μｌを加えこれらのサンプルをIGENのOrigen^RＥＣＬアナライザー中で分析した。表２において提供されたデータと一般的に一致して、アンピシリン加水分解はＥＣＬにおいて増大を生じ、一方でセフォキシチン加水分解はＥＣＬにおいて減少を生じた。両方の場合において、適当な加水分解の前にそしてその後に、ＥＣＬを測定すればどのくらいの多くの抗生物質が存在するかを予測することを可能にする一般的な傾向が見い出された。例４：ＥＣＬによるβ−ラクタマーゼ類の定量化１００以上のタイプのβ−ラクタマーゼ酵素がある。各々は、ｐＨ、濃度、および他のファクターの規定された条件下、再現可能的に、その特定の酵素に特異的である基質触媒作用の速動定数（kinetic constant）を有する。特に重要である１つの速動定数は、酵素の分子当り一定の基質の触媒作用についての最大速度（V_max）として定義されたＫ_catである（例えば１０_s ^-1のＫ_catは１つの酵素分子がＶ_maxにおいて秒当り１０の基質分子を触媒作用することを意味する）。したがって酵素が（基質濃度が高いときに起る）Ｖ_maxで作用しているときは、酵素濃度を触媒作用の速度を測定することにより決定することが出来る。共通のβ −ラクタム基質を有するβ−ラクタマーゼの多くのＫ_cat値は既知であるので、 β−ラクタマーゼ酵素の濃度は（単位時間当りに形成された生成物濃度の単位において）高い基質濃度で基質の触媒作用の速度を測定することにより決定することが出来る。これらのタイプの測定はＥＣＬを用いて行なわれることが出来る。例えば、規定されたｐＨ、温度および他のファクターの溶液中のBacillus cer eusからのβ−ラクタマーゼＩの濃度を定量化したいならば、酵素がＶ_maxで働らくように十分に高い濃度（例えば１．０ｍＭ）を与えるようにペニシリンＧを加える。ペニシリンターンオーバーのＥＣＬ測定は２つより少なくない時間ポイントで行なわれ：例えば酵素触媒作用反応の開始後時間＝０、１．０、２．５、５．０、７．５および１０．０分でである。標準曲線（生成したＥＣＬに対する加水分解されたペニシリンＧの濃度）において生成されたＥＣＬの比較により、触媒作用加水分解の初期速度を決定することが出来、その値は最大速度であろう。この実験的に決定されたＶ_max（例えば、秒当り加水分解された２２００ｎＭのペニシリンＧ）を、文献に報告されたＫ_cat値（例えば、Martin,M.TおよびWaley,S.T の、Bioch em.J.（１９８８）２５４第９２３頁〜第９２５頁において確立された２２００秒^-1）により割り算することにより、酵素濃度（１ｎＭ）を提供するだろう。例５：血液、血清、尿または咽頭ぬぐい液のような生物学的液体中のβ−ラクタム抗生物質のＥＣＬ検出および定量化生物学的材料中の抗生物質の検出は、ＥＣＬ法あるいは測定を妨げる可能性がある、存在しているかもしれないすべての細胞の除去後、容易行なわれることが出来た。細胞除去は、濾過または遠心分離のような周知の手段によって行うことが出来る。次にこの明細書に記載されているとおりにして、残留液体を抗生物質 −促進されたＥＣＬについて測定することが出来る。２つのサンプルがＥＣＬについて測定され；１つのサンプルは患者の処置された液体であり、他のサンプルは同じ患者の液体であるがしかしＥＣＬについて測定されるその抗生物質を加水分解することが知られている添加β−ラクタマーゼ酵素を含有する液体である（ＥＣＬは、存在する可能性があるすべての抗生物質を完全に加水分解するのに酵素のために十分な時間インキュベーション後に測定される）。非処理サンプルと酵素処理サンプルとの間のＥＣＬにおける差は抗生物質の存在の表示でありそしてＥＣＬ差の程度はその抗生物質の濃度の表示である。標準曲線は、患者の液体に既知量の抗生物質を加え酵素触媒作用加水分解の前およびその後にＥＣＬを測定することにより作成することが出来る。患者の液体は、その特定の患者に特有である、ＥＣＬ法または測定に影響する物質をその液体中に有する可能性があるので、既知の濃度の抗生物質が加えられた同じ患者の液体を用いて標準曲線は造られるべきである。例６：ミルクまたは食肉のような食品中のβ−ラクタム抗生物質のＥＣＬ検出および定量化ミルクのような液体食品中の抗生物質の検出は、その液体について直接に行なってもよいしあるいは、ＥＣＬ法または測定を妨げる可能性がある脂質およびたんぱく質のような成分または他の非抗生物質を除去するための処理の後に行なってもよい。そのような除去工程は通常の実験室処理であり高速度遠心分離を包含してもよい（例えば、３０分間標準の実験室遠心分離機中で１０，０００ｒｐｍ）。遠心分離はミルクのような液体の表面上に固体脂肪の層を形成させる。脂肪の層は例えばへらを用いることにより手で除くことが出来た。たんぱく質は硫酸アンモニウムを用いて沈澱させることによるかあるいは好ましくは限外ろ過により除去されることが出来た。限外ろ過は規定された公称の細孔寸法を含有する膜を通しての加圧ろ過により液体から高分子量物質を除去する方法である（限外ろ過装置および追加の情報についてAmiconカタログ（マサチューセッツ州ダンバーズ）参照）。（典型的には１０００Ｄａ（ダルトン）より小さい分子量を有する）抗生物質の場合において、１０，０００Ｄａの分子量カットオフを有する膜は最良であろう。そのような膜は、ろ液が抗生物質を含む、低分子量（＜１０，０００Ｄａ）物質のみを含有するように、１０，０００より高い公称分子量を有する分子を保持して除去する。より高分子量カットオフ膜（５０，０００〜１００，０００Ｄａ）はより速くろ過するかもしれないがしかし多くのＥＣＬを妨害する可能性がある物質を保持しないだろう。遠心分離および限外ろ過のような任意の必要な処理の後、次に規定量の液体をこの明細書に記載された標準の方法によりＥＣＬについて測定する。同一のサンプルを液体中に存在すると推測されるβ−ラクタム抗生物質を有効に加水分解すると知られているβ−ラクタマーゼで処理した。（温度、ｐＨおよび酵素濃度に依存して）加水分解のための十分な時間の後に、ＥＣＬについて第２のサンプルを測定する。β−ラクタマーゼはβ−ラクタム抗生物質を特異的に加水分解するがしかし触媒作用に必要とされる低い濃度（典型的にはナノモル）でＥＣＬをほとんど提供しないかまたは全く提供しないので、加水分解されたサンプルと加水分解されていないサンプルとの間のＥＣＬにおける差が液体中のβ−ラクタム抗生物質濃度の表示となるであろう。検出された抗生物質の濃度を定量化するための標準曲線は、存在すると推測される抗生物質（加水分解されたおよび加水分解されていない）の既知の量を用いて作成することが出来た。標準曲線を作成するにあたって、ミルクのような食品に既知の抗生物質を加えそして（例えば遠心分離および限外ろ過により）未知の溶液と同様に処理することが好ましい。異なる抗生物質についての試験は同様のサンプルで実験を繰り返すが各々異なる抗生物質を特異的に加水分解する異なるβ−ラクタマーゼを用いることにより行なった。異なる抗生物質を用いてのそのような繰り返えしの処理は、液体中に存在する抗生物質を同定確認するための助けとなった。食肉のような固体食品中の抗生物質の検出は抗生物質が固体食品から抽出（溶解化）されなければならない以外は同様に行なうことが出来た。始めに、食品のサンプルを緩衡液（好ましくは０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０）中に懸濁し滑めらかになるまでブレンダー中で細かく刻んだ。抗生物質は、存在する全ての細胞を破砕し、細胞内に存在するすべての抗生物質を放出する、氷上音波破砕によりさらに抽出されてもよい。細かく刻み音波破砕した後に、その材料を上記の液体食品と同様に処理した。即ち、その材料を遠心分離そして（または）限外ろ過した。食肉の場合、遠心分離は、（遠心分離が表面脂肪層を生ずるミルクとは異なって）細胞破片からなるペレットを主として生ずる。標準曲線を作成するにあたって、既知の抗生物質は本方法の早期に、好ましくは細かく刻むのに用いられる緩衝液に加えられるべきである。ベータ−ラクタム抗生物質がミルク(メリーランド州ワルドルフのEmbassy Dai ry 販売の低温殺菌され且つ均質化された等級ＡのVitamin D Mil)中で検出された。ベンジルペニシリン（２５０μｌのミルク、１０．０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺ 、１．０ｍＭのペニシリンＧ、＋／−１８ｎＭのB.cereusからのβ−ラクタマーゼＩを含有する３００μｌの合計容量）についておよびセファロスポリンＣ（２５０μｌのミルク、１０．０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、１．０ｍＭのセファロスポリンＣ、＋／−１８ｎＭのE.cloacae からのβ−ラクタマーゼＰ９９を含有する３００μｌの合計容量）について次の結果が得られた。ベンジルペニシリンサンプルＥＣＬ計数ミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋１８８０ペニシリンミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋１０，１００ペニシリン＋酵素セファロスポリンＣサンプルＥＣＬ計数ミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋７，９６０セファロスポリンＣミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋９，３４０セファロスポリンＣ＋酵素ＮａＯＨで加水分解された、ミルク中の抗生物質を用いて同様な実験を行なった；ベンジルペニシリンサンプルＥＣＬ計数ミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋１９，１００ペニシリンミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋６４，４００ペニシリン＋ＮａＯＨセファロスポリンサンプルＥＣＬ計数ミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋４１，２００セファロスポリンＣミルク＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＋３５，１００セファロスポリンＣ＋ＮａＯＨセファロスポリンＣについて上記表において見ることが出来るように、ＥＣＬ上への加水分解の影響は加水分解の方法によって左右される；酵素加水分解は計数を増大させ、一方ではＮａＯＨ加水分解は計数を減少させる。適切な対照実験はこのことが酵素の存在の結果でないことを示した。この明細書に記載されているように、この化合物のＮａＯＨ加水分解は例外的に方法依存性であり、この現象は別のＥＣＬ活性加水分解生成物の形成によるものと推測される。これらの結果は加水分解の任意の一定の方法において再現可能であり、矛盾しない。脂肪を除去するためにミルクの遠心分離を用いての他の実験から、ベンジルペニシリンおよびセファロスポリンＣの両方についても同様の結果を得た。標準曲線は２５ μＭ未満のベンジルペニシリンおよび２５０μＭ未満のセファロスポリンＣがＥＣＬを用いてミルク中で検出されることが出来たことを示した。例７：血液、尿、血清または咽頭ぬぐい液のような生物学的材料中のβ−ラクタマーゼのＥＣＬ検定生物学的材料中のβ−ラクタマーゼの決定は例４に記載された方法と同様な方法で行なわれる。本質的に、既知の抗生物質は既知の濃度（例えば１．０ｍＭ）に、生物学的液体と混合される。即時のＥＣＬ読み取りが行なわれ或る時間のあとに他の読み取りが行なわれる（もしβ−ラクタマーゼの濃度が高ければ５分であることが出来またはβ−ラクタマーゼの濃度が低ければ一夜ほどの長さであることが出来る）。ＥＣＬにおける変化はβ−ラクタマーゼによる抗生物質加水分解を表示する。抗生物質ターンオーバーの程度は加水分解された抗生物質濃度対生成ＥＣＬの標準曲線に比較されることが出来た。例５において記載したように生物学的液体中の抗生物質の測定に関して、ＥＣＬ法および測定を妨げる可能性があるすべての非β−ラクタマーゼ基質を除くために既知手段により液体を処理することが望ましい。咽頭ぬぐい液に存在する酵素は緩衝液の添加により溶解化されることが必要であろう。例８：ミルクおよび食肉のような食品中のβ−ラクタマーゼのＥＣＬ検定（ミルクのような）液体および（食肉のような）固体の食品中のβ−ラクタマーゼの検出および定量化はＥＣＬを用いて行なわれることが出来る。液体食品の場合において、ＥＣＬ法または測定を妨げる可能性がある非β−ラクタマーゼ物質を除去するために適当な既知の方法が必要とされる。例えば普通のろ紙を通過させてのろ過はミルクから粒状物を除くのに有用であろう。またミルクの遠心分離は測定を妨げる可能性のある脂質を除去する。食肉のような固体食品の場合において、添加緩衝液（例えば０．１Ｍりん酸塩、ｐＨ７．０）を有するワリング（Waring）ブレンダー中での均質化、次に４℃での音波破砕そして遠心分離（３０分間１０，０００×ｇ）は酵素溶解化の助けとなるであろう。これらの処理の後、１００，０００Ｄａ以上の分子を除くための限外ろ過工程を追加することはまた有用であろう。限外ろ過のろ液は一般に約３０，０００Ｄａの分子量を有する任意のβ−ラクタマーゼを含有する。これらの食品由来の溶液中のβ−ラクタマーゼのＥＣＬ検出は最初に選択されたβ−ラクタム抗生物質（例えば１．０ｍＭの濃度のペニシリンＧ）を加えそして即時のＥＣＬ測定を行い、次に遅れた或る時間（その時間は５分ほどの短かい時間または一夜ほどの長い時間であることが出来る）に、少なくとも１回以上の測定を行なうことからなる。ＥＣＬの何らかの変化は添加抗生物質のβ−ラクタマーゼ触媒作用加水分解の存在の表示であろう。加水分解の程度は、比較出来る条件下で造られた標準曲線（加水分解された抗生物質の濃度対ＥＣＬ）との比較により決定されることが出来た。例９：細菌培養におけるβ−ラクタマーゼのＥＣＬ検定広範な単離工程なしに、（規定された実験室培地におけるようなあるいは血液、尿またはミルクにおけるような）細菌培養液中のβ−ラクタマーゼを検出することは好ましくそしてときには必須である。１つの応用において、病原菌で感染した患者の血液中のβ−ラクタマーゼのその場での検出はその個人の医療的治療に関する決定に有益に影響することが出来る。そのような応用において、β−ラクタマーゼを検出するためにβ−ラクタマーゼを精製することは時間を浪費するものであり許されないかあるいはさもなくば実際的でない。したがって、β−ラクタマーゼを生成する微生物の存在下にそして細菌が増殖した培養液体中でβ−ラクタマーゼを検出することが出来ることが重要である。ベータ−ラクタマーゼはグラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方により生成される。グラム陰性菌（例えばE.coli）の場合において、β−ラクタマーゼはペリプラスム間隙に隔離される。グラム陽性菌（例えばB.cereus）において、酵素は細胞を囲む培養液中に分泌される。グラム陰性菌培養およびグラム陽性菌培養の両方においてβ−ラクタマーゼ活性を検出することが出来ることは価値がある。酵素は該２つのタイプの細菌において物理的に異なる状態（隔離された対分泌された）で存在するのでβ−ラクタマーゼ検出はある程度異なった実験計画を必要とするかもしれない（またはそれを必要としないかもしれない）。グラム陰性菌、E.coliの２種の菌株が、各１０ｍｌのＬＢ培養液中の一夜増殖された。１種の菌株は、それがβ−ラクタマーゼの生成に起因してアンピシリンに耐性であるので、E.coli AmpR（ＡＴＣＣ：ＤＨ５αＦ’ＩＱｐＤｓｕｂＥ．Ｆ４）と称される。E.coli AmpS（ＡＴＣＣ：Ｊｍ１０５）と称される他種の菌株は高水準のβ−ラクタマーゼを生成しないそして対照（アンピシリン感受性）菌株として使用された。細胞は、Sorvall RT 6000 D 遠心分離機中で２８００ｒｐｍでの遠心分離そして次に傾瀉による上澄み液溶液の除去により遠心分離ペレットとして培養液から単離された。試験は傾瀉された上澄み液を用いて行なわれたがしかし少なくともE.coliに関して、ずっと多くのβ−ラクタマーゼ活性はペレットに検出された。ペレット化された細胞は、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート緩衝液の９．５μｌ中に再懸濁され、次に氷冷ビーカー中で１５分間音波破砕された。典型的には得られた懸濁液の部分（９．５〜１０．０μｌ）は５００μＭのアンピシリン、１０．０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、および０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液の３００μｌに加えられた。種々のインキュベーション時間（時間なし〜一夜）の後、懸濁液は、ＩＧＥＮのＥＣＬアナライザーを用いて電気化学発光を生成するそれらの能力について試験された。或る場合において、β−ラクタマーゼ抑制剤、６−β−Ｂｒ−ペニシラン酸の１．０ｍＭ溶液の５．０μｌが、生成したＥＣＬのソースの対照として加えられた。同様な実験計画がグラム陽性菌B.cereusで使用された。１種の菌株は比較的に高い量のβ−ラクタマーゼを分泌する（B.cereus AmpR と称される）（ＡＴＣＣ：２７３４８）そして他種の菌株はほとんどβ−ラクタマーゼを分泌しない（B. cereus AmpS と称される）（ＡＴＣＣ：９１３９）。増殖の条件および実験方法は、或る場合において、下に記載されるように、上澄み溶液がＥＣＬ実験のために用いられた以外は、E.coliについて上記したのと同一であった。 E.coliについての結果は、細胞培養を伴なうβ−ラクタマーゼ活性が、広範囲の精製なしに、ＥＣＬを用いることにより事実測定されることが出来た。５００ μＭアンピシリン溶液を用いてのE.coliサンプルの１．０時間のインキュベーションの後、次のＥＣＬ結果が得られた。これらのデータはβ−ラクタマーゼ活性がグラム陰性菌においてその場で検出されることが出来ることを示している。同様な結果がグラム陽性菌、B.cereusを用いてだがしかしペレットよりも遠心分離上澄み液を用いて得られた。もう一度、それらの結果は５００μＭのアンピシリンを用いての１．０時間インキュベーション後に得られた。これらの結果はグラム陽性細胞により分泌されたβ−ラクタマーゼがＥＣＬにより１時間で検出されることが出来ることを示している。或る適用において、β−ラクタマーゼの迅速な検出は、サンプル中に存在する可能性がある小数の細菌細胞の検出ほど重要でない。使用される条件下に、それらのβ−ラクタマーゼ活性により検出することが出来る細胞の最も低い数を決定するために実験が行なわれた。標準の（ＬＢ）増殖媒地中で一夜増殖されたE.co liの培養を用いて、培養物遠心分離ペレットの徐々に大きくした希釈液が、上記と同様な方法論でアンピシリンを用いての一夜インキュベーションにより試験された。細胞培養におけるE.coli濃度が６００ｎｍでの分光測光的吸光度および次の平板培養の吸光度に対する比較により決定された。図５において見られるように、一夜インキュベーションはおけるE.coli細胞の検出低限は２４４０であった。例１０：細菌のベータ−ラクタマーゼのＥＣＬ検定による細菌の同定確認多くの異なるタイプのβ−ラクタマーゼ酵素がある。構造（アミノ酸配列）は酵素間でならびにそれらの基質特異性間で実質的に異なる可能性がある。多くの異なるβ−ラクタム抗生物質および多くの異なるβ−ラクタマーゼがあるので、ほとんどすべてのβ−ラクタマーゼが一連の異なるβ−ラクタム抗生物質基質の加水分解の相対的程度により（即ち基質特異性のその個々の“スペクトル”により）、理論的には同定確認されることが出来る。一定の細菌菌株がその特有のβ −ラクタマーゼ基質特異性により同定確認されることが出来た（図３ａ〜図３ｄ参照）。提供された未知の細菌株を同定確認するにあたって、その菌株の適当に処理された分別量（例９において記載された様なペレットまたは上澄み液）は（セファロスポリン類およびペニシリン類の両方を含む）一連の適当に異なる抗生物質と混合されることが出来た。適当な長さの時間（５分〜一夜）の後に、異なるインキュベーション混合物のＥＣＬが読み取られそして異なる抗生物質のターンオーバーの相対的速度を決定するために適当な標準と比較されることが出来た（０〜１００％のターンオーバーが酵素濃度および個々の抗生物質／酵素対に依存して予測される）。既知の細菌株についての既知の基質特異性に基づいて、問題になっている細菌種が同定確認されることが出来た。それらの例は、本発明の種々の変更を例示するけれども、他の変更が上記開示から見て、それ自体当業者に示唆されるだろう。したがって、それらの変化は上記特定の態様においてなされることが出来、それらは、特許請求の範囲に規定されるとおりの本発明の完全に意図される範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ０７Ｆ 15/00 Ｃ０７Ｆ 15/00 ＡＤＣ０９Ｋ 11/07 Ｃ０９Ｋ 11/07 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．予かじめ測定された量のルテニウムまたはオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬およびβ−ラクタムまたはラクタマーゼ標準を含み、該予かじめ測定された量が単一のサンプル測定を行なうのに十分である、β−ラクタム抗生物質またはβ−ラクタマーゼを測定するためのキット。２．キットが、中に予かじめ測定された量の試薬を有する一連の容器を含有する、請求項１に記載のキット。３．一連の容器が、自動化様式で検定が行なわれることが可能にするように造られている、請求項２に記載のキット。４．標準がβ−ラクタム標準である、請求項１に記載のキット。５．標準がβ−ラクタマーゼ標準である、請求項１に記載のキット。６．標準が化学試薬である、請求項４または５に記載のキット。７．標準がβ−ラクタム抗生物質に対する微生物耐性のプロフィルである、請求項１に記載のキット。８．標準がβ−ラクタマーゼについての特定のβ−ラクタム基質特異性のプロフィルである、請求項１に記載のキット。９．ルテニウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子がＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺である、請求項１に記載のキット。１０．（ａ）β−ラクタマーゼを含有すると推測されるサンプルを、β−ラクタムおよびルテニウムまたはオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬と接触させ；（ｂ）工程（ａ）の接触サンプルを、電気化学発光を生ずる条件に付し；（ｃ）得られた電気化学発光を測定して読み取りを得；（ｄ）混合物をインキュベートし；（ｅ）工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、電気化学発光を生ずる条件に付し；そして（ｆ）得られた化学発光を測定しそしてそれを予かじめ測定された値と比較して、測定値において差が存在するならばその差を決定し、それによりβ−ラクタマーゼの存在を表示する、ことを含むβ−ラクタマーゼの存在を測定する方法。１１．サンプルが尿、膿、分泌物、咽頭ぬぐい液、血液または血清から選ばれる生物学的材料である、請求項１０の方法。１２．（ｇ）該差を標準値と比較してサンプル中に存在するβ−ラクタマーゼの量を決定する、ことをさらに含む、請求項１０の方法。１３．（ａ）β−ラクタムを含有するサンプルを、β−ラクタマーゼおよびルテニウムまたはオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬と接触させ；（ｂ）工程（ａ）の接触サンプルを、電気化学発光を生ずる条件に付し；（ｃ）得られた電気化学発光を測定して読み取りを得；（ｄ）混合物をインキュベートし；（ｅ）工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、電気化学発光を生ずる条件に付し；（ｆ）得られた化学発光を測定しそしてそれを予かじめ測定された値と比較して測定値における差の存在を決定し；そして（ｇ）その差を標準値と比較してサンプル中に存在するβ−ラクタムの定量的量を決定する、ことを含むβ−ラクタムの存在を測定する方法。１４．サンプルが尿、膿、分泌物、食品、血液、咽頭ぬぐい液または血清から選ばれる生物学的材料である、請求項１３の方法。１５．諸工程が連続様式で行なわれる、請求項１０または１３の方法。１６．諸工程が単一の容器で行なわれる、請求項１３の方法。１７．本方法が添加ラジカル形成性還元剤試薬の不存在下に行なわれる、請求項１０または１３の方法。１８．還元剤試薬がＴＰＡである、請求項１７に記載の方法。１９．標準が化学試薬である、請求項１０または１３の方法。２０．標準が電子記録である、請求項１０または１３の方法。２１．ルテニウムまたはオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子がＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺試薬またはＯｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のそれぞれである、請求項１０または１３の方法。