JPH11503111A

JPH11503111A - ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の局所塗布による、上皮過増殖症の治療法

Info

Publication number: JPH11503111A
Application number: JP8525201A
Authority: JP
Inventors: スタンウェル，キャロライン; ユスパ，スチュアート・エイチ; バーク，テレンス・アール，ジュニア
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 1999-03-23
Also published as: AU698414B2; CA2212888A1; DE69623595D1; AU4928696A; DE69623595T2; CA2212888C; DK0809493T3; ATE223715T1; US5610185A; EP0809493A1; ES2183938T3; WO1996025159A1; PT809493E; EP0809493B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、局所投与による過増殖性上皮病変の治療方法に関する。本方法は、これらの異常細胞の成長を妨げおよびこれらの細胞を活発に架橋結合して細胞を殺すのである。本発明は過増殖性上皮疾患、例えばＨＰＶ感染細胞病変、光線性角化症、黒色腫並びに悪性および前悪性癌の抑制および予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の局所塗布による、上皮過増殖症の治療法発明の分野本発明は、上皮過増殖症の新たな治療法に関する。特に、皮膚の損傷の局所的な治療に特定のクラスの化合物が用いられる。これらの化合物は概してヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物であり、広範な皮膚病に対して有用である。発明の背景非腫瘍性および腫瘍性皮膚過増殖性疾患は広く見られ、ヘルスケア提供者にとってより一層の負担となっている。近年、皮膚への紫外線照射量が増加したため、光線性角化症のような前悪性病変の発生が顕著に増加した。外表鱗状および基底細胞ガン数は、現在米国において年間70万件を超える（American Cancer Soci ety,1994）。同様の（足裏および生殖器の）イボおよび他の局所的な皮膚過増殖症例は極めて広く見られる。現在の所、臨床医の使用し得る効果的な治療法は十分には存在しない。これらの症例に対する治療方式には、変異細胞を破壊するための、組織の切除または凍結が含まれる。これらの方法は非選択的であり、過増殖細胞が残存して再発を引き起こし、または正常な細胞が損傷して組織に創傷を生じる為、常に得られる処置ではない。これらの方法は多く痛みを伴い、罹患者には耐え難い。（特に足裏のいぼの治療において）過増殖性の皮膚の病変を局所的に剥離させ細胞を直接的に殺すためには、サリチル酸のような剥離性の酸性化合物が用いられる。しかし、この治療法は過増殖性細胞に対して選択的であるわけではなく、常に効果的であるわけではない。前悪性および悪性病変の治療には、ブレオマイシンおよび5- フルオロウラシル（5FU ）のような細胞毒性試薬の局所的塗布が用いられ、生殖器のイボにはポドフィロトキシンが用いられる。これらの試薬は直接的な細胞毒性によって働き、種々の機構によって増殖中の細胞のDNA 合成を阻害するため、その毒性には多少の懸念が存在する。これらの試薬は正常な皮膚を完全に損傷させ得るため、正常な皮膚との接触を避けるように極めて細心に塗布されねばならず、これらの化合物を全身的に吸収することによっても患者は大きな危険にさらされ得る。腫瘍性皮膚病変の治療のために、ビタミンA 誘導体である各種レチノイドが近年導入された。しかしながら、これらの化合物は治癒性ではなく抑圧性であり、これらの薬剤の投与を停止すると再発につながる。上皮は皮膚の最も外側の層である。この器官は絶えず一連の再生を行っており、上皮細胞の内層である上皮角質細胞が常に増殖しながら、グルタミン転移酵素による細胞タンパク質の架橋によって、プログラムされた細胞死を引き起こす最終分化を行って角質化した外皮を形成し、これが角質層を形成する。この過程は過増殖性皮膚症、特にウィルス性病変、光線性角化症、および小腫瘍（ネオプラズム）、また他の過増殖症例においては変異を受ける（Yuspa S.H.,Cancer Res. ,54,1178-1189,1994,Molecular Biology of the Skin-the keratinocyte,eds Da rmon and Blumenberg,Chapter 7,207-243,1993）。本発明の目的は、ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性試薬である、あるクラスの化合物の局所的塗布による過増殖性上皮症の治療法を提供する事である。この方法によって治療され得る過増殖性上皮症には、増殖調整機構が破壊された多くの皮膚病が含まれる。このような疾病の例には、一般的にイボを引き起こす乳頭腫ウィルス感染細胞および、皮膚の前悪性および悪性外表腫瘍がある。さらに、子宮頚部過増殖症例が本発明の方法によって局所的に治療され得る。本発明の別の目的は、桂皮酸誘導体およびその類似分子（その飽和形態を含む）、特にメチル 2,5ジヒドロキシ桂皮酸を過増殖性上皮病変の治療において用いることである。メチル-2,5ジヒドロキシ桂皮酸は、本発明において有用な化合物のクラスの、好ましい1 つであり、過増殖性上皮病変の治療、特に基底または鱗状細胞ガンの治療において、局所用製剤として極めて有効である。本発明の更に別の目的は、足裏イボのようなより角質化した病変を伴う皮膚疾患の治療において、疎水性ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物を用いることである。これらの化合物は優秀な組織透過性を有し、角質層の下部の上皮疾病を治療するために用いられ得る。発明の概要本発明は、ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の局所的な塗布による、過増殖性上皮疾患の治療法に関する。このクラスの化合物は、次の一般式の化合物からなる：（式中、カリール）；Ｙ＝Ｈ、アルキル；アラルキル、アルカリール；アリール；ヘテロアリール； −アルカリール；またはＮ−アラルキル）；構造式Ｉ中の点線--は二重結合が存在しうることを表し、構造式II中の点線-- の円は、環が完全に飽和した状態を表す。）上の式は、アラルキルおよびアルカリール基の大きさが好ましくはC₇からC₁₃ であり、アリールが好ましくはC₆からC₁₂であり、ヘテロアリールがヘテロ原子( 例えばN 、O および/ またはS)を含み得るというようにさらに限定される。式II においては、各V およびW は炭素またはヘテロ原子(例えばN 、O および/ またはS)であり得る。本発明は、腫瘍性および非腫瘍性上皮過増殖症の治療において、ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物を用いることに関する。特に、本発明は広範な種類の局所的上皮過増殖疾患（いぼ、子宮頚部腫瘍、光線性角化症のような前悪性病変、良性および悪性腫瘍を含む）の局所的治療を提供する。１つの好ましい態様においては、メチル2,5-ジヒドロキシ桂皮酸（本明細書中ではMCと称する）が局所的塗布によって利用される。本発明は、ヒト腫瘍およびHPV 感染細胞の増殖を阻害するためのヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物に関する。本発明はまた、正常な皮膚形成に際して起きる変化と類似の細胞タンパク質の変化を誘導し、過増殖性細胞をより正常な型に変換する。本発明の化合物の毒性は、生体内試験系としてネズミの皮膚を用いて検査した。作用が二重機構である、即ち、増殖阻害およびタンパク質架橋作用のため、本発明の試薬はこれらの過増殖性皮膚疾患のための臨床設備に加えるに有用である。図面の簡単な説明図1.MCは上皮細胞系列の架橋タンパク質を増加させる。黒い四角は、HPV18 ヒト上皮角質細胞を示す; 黒い丸は、SV40感染ヒト角質細胞を示す; 黒い三角は、 (SQCC-Y1)細胞を示す; 白い三角は、(SP-1)良性腫瘍マウス角質細胞を示す; 白い四角は(308細胞)良性マウス角質細胞を示す; 白い丸は、(I-7)細胞マウス鱗状細胞ガンを示す。図2.MCによって誘導された、架橋タンパク質エンベロープ構造のSP-1細胞形態。SP-1細胞を媒体(AおよびC)または250 μM のMC(BおよびC)で48時間処理した。 A およびB では、位相差対照顕微鏡写真を撮影した。C およびD では、細胞を2% SDS,20mM DTT中に回収し、10分煮沸し、生じた試料の写真を撮影して、架橋角質エンベロープの形成を示した。図3.A:MCに応答したマウス初代角質化細胞の角質化の時系列。四角は1.4 ｍＭＣa²⁺を表し、三角は100 μM MC、1.4mMCa²⁺を表し、塗りつぶされた丸は1mM MC 、１．４ｍＭCa²⁺を表す。B:MCはマウス初代角質化細胞において4 時間以内にMT T の減少を阻害する。細胞を1.4mM Ca²⁺およびMCを含む培地中で4 時間インキュベートし、次にMTT(培地中に0.5mg/ml)を加えてさらに4 時間インキュベートし、フォルマザン生産の決定をした。図4.マウス初代角質化細胞における架橋タンパク質の産生量と増殖阻害。細胞増殖は黒色の四角で表し、架橋タンパク質の産生量は白色の四角で表す。結果は 3 つの組を用いた1 つの実験の±標準偏差(n=3)である。図5.A431（ヒト子宮頚部ガン）細胞における架橋タンパク質の産生量と増殖阻害。細胞の増殖は黒色の丸により、架橋タンパク質の産生量は白色の丸で示す。結果は3 つの組を用いた1 つの実験の±標準偏差(n=3)である。図6.グルタン転移酵素阻害剤はMCによる蛋白質の架橋を阻害しない。ハッチング円柱はグルタミン転移酵素阻害剤で処理していないことを示し; 黒色の円柱は 100 μM のLTB2で処理したことを; 白色の円柱は100 μM のHPB2で処理したことを示す。結果は3 つの組を用いた1 つの実験の±標準偏差であり、2 つの独立の測定を行った。図7.MCはマウス初代角質化細胞におけるグルタミン転移酵素活性を増大させない。黒色の円柱は1.4mM Ca²⁺培地内での未処理細胞を表し; ハッチング円柱は１ｍＭ MC で処理した細胞を表す。細胞質は「C 」で、膜画分は「M 」で表す。結果は±標準偏差（n=2 ）であり、同様の実験において繰り返された。図8.MCは4 ℃および37℃においてマウス初代角質化細胞中に架橋タンパク質を誘導する。「C 」は対照の試料を表す。結果は2 つの組を用いた1 つの実験の± 標準偏差であり、独立の実験を行った。図9.胸腺欠損ヌードマウス皮膚へのMCの局所的投与。パラフィンに包埋した組織より組織学的切片を得、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。パネルa は媒体を用いた対照であり、パネルb は100 μM MC、パネルc は1mM MC、パネルd は10mM MC 、パネルe は100mM MCである。拡大率は200 倍である。図10.MC は移植されたSP-1細胞の腫瘍形成を阻害する。棒の上の数字は腫瘍を生じた個体数/ 母集団の個体数を示す。パネルA においてはMCは週に2 回2 週間投与された。パネルB においてはMCは週5 回で3 週間投与された。図11.MC 誘導体によるSQCC-Y1 細胞における架橋タンパク質の産生。図12．実施例9 および10に記載したヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の化学構造、結果は図11に示す。図13.MC をヌードマウスの皮膚に局所的に投与した場合、急性の炎症または壊死を起こさない。写真は実験終了と共に殺した後に撮影された。発明の詳細な説明本発明のヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物は高濃度において化学的蛋白質架橋活性をもつ特定の一群の化合物である。本明細書に記載したこの架橋効果は新規のものであり、上皮の過増殖性疾患に対して固有の重要性を有する。即ち局所的な投与によって薬剤を特定の作用部位に作用させ、上皮細胞の分化に類似した過程によって細胞を殺傷する。本発明は、効果的なタンパク質架橋性薬剤として働き、角質化細胞由来の細胞の内在的な最終分化の過程で生じるものに類似したタンパク質性エンベロープを産生する、ヒドロキシル化芳香族化合物を提供する。試験した全ての細胞型が本発明のヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物に対して架橋性の反応を示したことによって、いぼ、化学線角質化細胞腫のような前悪性病変および、良性および悪性腫瘍を含む広範な種類の局所的な過増殖性上皮疾患の局所的な治療の可能性が本薬剤には見込まれる。本明細書で用いる「病変」という用語は、境界を持った病理学的組織変化または、点または斑状の皮膚疾患として定義される。本発明のヒドロキシル化芳香族化合物の架橋効果は迅速であり、異常な細胞の除去のための細胞死をもたらす。低濃度においてはヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物は細胞増殖およびチロシンキナーゼを阻害する(Umezawa et al.,FEBS Lett.,314,3,289-292,1992,Hori et al.,J.Antibiot.,45,280-282,199 2,Umezawa et al.,FEBS Lett.260,198-200,1990)。これらの効果はまた過増殖性疾患の治療において有用である。これらの効果に必要な濃度と架橋に必要な濃度との違いは、架橋反応がMCのチロシンキナーゼを阻害する性質とは独立であることを示唆する。さらにチロフォスチン、ヘルビマイシンA およびラベンダスチン A を含む確立したその他のチロシンキナーゼ阻害剤は架橋を誘導することができない〔表II参照）。4 ℃においては細胞の諸過程および酵素活性が阻害される。しかし、ヒドロキシル化芳香族の蛋白質架橋性化合物、とくにMCは4 ℃および37 ℃において効果的に架橋されたタンパク質を誘導する。このことは生物学的ではなく化学的な過程が含まれることを明確に示す。MCを用いた生体内(in vivo)の研究によって、正常な上皮組織に対してMCが有害でないことが明らかになったが、特異的な病変への局所的な投与に際して正常な皮膚を回避することが、近年使用されている細胞傷害性の薬剤を用いた場合より重要ではなくなることが示唆される。これはMCが角質層を透過できないことを反映していると考えられる。基底細胞腫のようなあまり分化していない過増殖性疾患においては、MCが疾患領域の細胞を特異的に標的とするため、この効果は有用であると考えられる。魚の目のような、より角質化した過増殖性疾患においてはより高度の組織透過性が必要であろうし、また、より脂溶性の高いヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物が用いられ得る。より脂溶性の高いヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の例は67H-69A 、67H-98A 、67H-124A、67G-146Aである。これらの化合物は疎水性が増大しているため、より容易に皮膚を透過し、従って魚の目のようなより角質化した皮膚疾患の治療において有効となる。さらに、これらの化合物は増大した安定性を有する。本発明の方法において有用な一群の化合物は、特異的な機構で作用すると考えられる。オルトまたはパラヒドロキシル化芳香族は、容易に対応するキノンへと酸化されることが知られている。その結果得られるキノンは求核試薬の攻撃を受け易い。従ってヒドロキシル化芳香族の架橋ははじめ、反応性のキノン中間体への酸化によって起こり、求核成分（例えばタンパク質のSHまたはNH₂側鎖）のビス付加を受け、架橋を生じ得る。本発明の1 つのヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物、MCは、血清中で短い半減期を有する(Hori et al.,J.Antibiot.,45,280-282,1992)。この化合物がその局所的な架橋効果を迅速に作用させ(図3)、血流中で希釈され、分解されることで不活化し、全身的な副作用を防止することが出来る点で有利であり得る。芳香環のオルトまたはパラ位に置換基を持つ化合物は特に重要である。細胞への透過性の増大のため、薬剤前駆体の形としてヒドロキシル基を分解から保護してもよい。そのような薬剤前駆体の誘導の例はエステル化である。細胞内に入るとエステル分解酵素によって活性型の遊離のヒドロキシル化合物が遊離する。一般構造式中のY 置換基の形もまた細胞の透過性に影響すると予想される。例えば脂溶性のエステル基が細胞膜の透過性を増大させると期待される。ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物がタンパク質の架橋を誘導する能力が細胞種特異的であることは、この化合物が過増殖条件下でなんらかの特異性を発揮することを示唆する。架橋効果に対するマウス初代角質化細胞の増大した感受性は、正常な形質と関連がない。例えば包皮由来のヒト上皮角質細胞の初期培養細胞は、MCが250 μM 以下でMCの架橋効果に反応しなかった。移植モデルを用いた研究では、1 および100mM の濃度におけるMCの腫瘍形成阻止作用が示された。ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物は、細胞タンパク質を架橋し、角質化したエンベロープ構造を形成し、上皮角質化細胞の正常な分化のプログラムを引き起こす非生物学的機構による細胞死を誘導する。その増殖阻害活性に加えて、本明細書に記載された一群の化合物の特異的な架橋能は、皮膚の過増殖疾患の局所的な治療に対して新規の機構を提供する。本発明の1 つの態様は、エルブスタチン類似物であり、チロシンキナーゼの阻害とは独立な機構によって正常および悪性の上皮細胞中に架橋タンパク質のエンベロープを形成するメチル2,5-ジヒドロキシ桂皮酸を用いる。メチル2,5-ジヒドロキシ桂皮酸（MC）はチロシンキナーゼ阻害剤である。その上皮細胞分化誘導能を評価するため、薬剤と共に48時間インキュベートされた後に架橋タンパク質性エンベロープを測定した。試験した全ての細胞（初代角化細胞、マウスSP-1、３０８（乳頭腫）、1-7〔癌腫〕細胞およびヒト細胞株SQCC-Y1（鱗状腫瘍）、A431 （上皮腫瘍）およびHPV18 またはSV40感染角化細胞）において、MCは架橋タンパク質を投与量〔0.1-1mM ）に依存して増大させた。分化を確認する為に、MC処理したマウス初代角質化細胞のグルタミン転移酵素（ＴＧアーゼ）活性、TGアーゼ阻害剤LTB-2 およびHPB-2 による蛋白質の架橋の阻害、および蛍光性のTGアーゼの基質であるダンシルカダベリンのエンベロープへの取り込み量を調べた。その結果、本薬剤の作用機序へのTGアーゼの関与が否定された。MCは4 ℃において、リン酸緩衝塩水中でインキュベートしたNIH3T3繊維芽細胞にもタンパク質性エンベロープを誘導したが、このことは非生理学的な過程であることを示唆する。ジチオスレイトール（DTT 、20mM）を3T3 細胞に同時に投与することで、37℃ および4 ℃におけるMCによる架橋が防がれた。EGF 受容体を用いた試験管内(in vitro)試験のウエスタンブロット解析によって、DTT はMCによるチロシンキナーゼの阻害を妨げないが、MCによって誘導されるEGF 受容体の可動性の妨害が阻害されることが示されたが、これは薬剤または受容官能基の酸化は架橋形成に影響しないことを示唆する。本発明は、MCが上皮細胞の分化を誘導しないが、高濃度においてタンパク質の化学的な架橋を引き起こすことを示すものである。この効果は増殖阻害性と共に、皮膚のいぼまたは外表腫瘍の局所的な治療において臨床的に有用であると考えられる。さらなる利用方法において、本発明は、癌誘発性の刺激に暴露された身体の特定の部位に対して、MCのようなヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物を含む組成物を予防薬として利用することによって、良性、前悪性および悪性細胞の増殖を妨げる方法を含む。本発明はまた、腫瘍を除去することまたは治癒させることのみでなく、予防薬として利用して発病を防ぐということに効果的であることが見いだされた。腫瘍の確立を防ぐために、本発明のヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性薬剤は、毎日好適には局部的に使用されるようにクリームおよび軟膏または化粧品の形態で製剤化することが可能である。本発明の方法において使用されるヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の有効な量は、さまざまで広い範囲にわたる。本発明の方法におけるヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の典型的な量の範囲は、およそ0.0001 wt% ないし5wt%の間であり、好適には本発明に従って利用したヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物の量は、およそ0.001wt.% から2wt.% の範囲にわたる。本明細書中において使用する、製剤の重量パーセントは、処置を行う部位に効果的に運搬される物質濃度のことである。一般的には、利用される化合物の有効な量および濃度とは、組成物を使用する処置、すなわち抗腫瘍治療において必要な特性を示すような組成物中の量および濃度のことである。特に、本発明の化合物は、タンパク質の架橋および細胞死を引き起こす。この現象は、上皮過増殖病変の処置において正常な細胞の特性へ促す利点がある。好適な量は、処方部位の特定の条件、処置を行う部位への有効成分の運搬の速さ、および使用す製剤の適用回数に依存する。特定の利用における好適な量は、当該技術分野において使用されている通常の薬剤的なスクリーニング方法によって決定される。もし望むならば、治療部位の特定の条件に適用するように、過剰量の化合物が使用可能である。皮膚ネオプラズムの増殖阻害を観察するためには、少なくとも域値量の本発明の化合物を腫瘍細胞に接触させることが必要であることが見いだされた。この最小量は、腫瘍細胞１ミリリットルあたり化合物がおよそ１０ナノモル以上であるということがわかっている。キャリヤー物質は薬学的製剤の技術分野において既知のものであり、溶媒または賦形剤と呼ばれる物質を含む。キャリヤーは、無機質または有機質を含み、化合物を拡散させるために必要な十分な粘性を保持し、局部的に適用される組織に対して十分な接着力を提供するものでなければならない。このようなキャリヤーの例には、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（好適には分子量がおよそ400 からおよそ8000のあいだである）のようなポリオール、それらの適切な混合物、植物油、および当業者に既知の他の物質が含まれるが、これに限られない。製剤の粘性は、例えば、高分子量のポリエチレングリコールの使用といった、当該技術分野において既知の方法で調節することが可能である。ヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物およびキャリヤーに加えて、製剤は、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸並びに、例えばパラヒドロキシ安息香酸のメチル、エチル、プロピル、およびブチルエステルといった抗微生物剤のような薬剤的に受容可能な添加物または調整物を含むことが可能である。製剤はまた、増粘剤またはゲル化剤、乳化剤、潤化剤、色素、緩衝剤、安定剤および当該技術分野において既知の技術に従ってブチルヒドロキシアニソールのような酸化防止剤を含む保存剤も含むことが可能である。製剤はまた、ジメチルスルフィキシドのような浸透促進剤、ノノキシノールのような長鎖アルコール、長鎖カルボン酸、プロピレングリコール、N-(2- ヒドロキシエチル)ピロリドン、1-ドデシル- アザシクロヘプタン-2- オンなどを含むことが可能である。利用方法および治療する病気に応じて、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収遅延剤の使用が望ましい場合もありうる。製剤の組成物は、ゲル、クリーム、軟膏、固形、液体、準固形などの薬学的な製剤を提供するために製剤の技術分野において既知の成分を使用して調製することが可能である。製剤の特定の物理的形態は、望ましい処置方法および処方される患者に依存する。本発明の薬学的組成物の典型的な製剤は、表Ｉにおいて説明する。記載した態様において、好適な濃度範囲は、1mg/100ml-2g/100mlまたは0.0001%-5%w/w である。水性の環境において不安定な誘導体には、局所的な利用を行うために以下の製法が提供される。好適な軟膏を、ヒドロキシル化芳香族化合物を1ml の100%エタノール中に混合し、それから白色ワセリンまたはラノリンと混合することによって調製することが可能である。ローション用の単純な製法は、本発明のヒドロキシル化芳香族化合物を100%エタノール中に単に混合することによって調製される。あるいは、コレステロール以外の成分をすべて混合して（表１参照）融解するまで加熱することによって、親水性のワセリンを調製することが可能である。融解したところで、コレステロールを添加する。この混合物は、すべての化合物が溶解するまで撹拌する。冷却してから、ヒドロキシル化芳香族化合物を1ml の 100%エタノール中に予め溶解したものを混入する。水性の環境において安定な誘導体には、さらに以下の製法が好適である：水（20% まで）を上述の親水性のワセリンに添加して油中水性の乳濁液を作成することが可能である。コールドクリーム用には、ホウ酸ナトリウム及び水以外のすべての成分（表Ｉ参照）を70℃で溶解する。この非水性成分へ、ホウ酸ナトリウムを水に溶解して添加し、冷めるまで撹拌する。特定の用量を提供するのに必要な特定の製剤における活性成分の濃度は、キャリヤーの特性および製剤に導入される特定の添加物に基づいて薬学的製剤の技術分野に従事する者によって決定される。有意に高濃度で本発明の化合物を含む製剤も、使用するキャリヤーおよび添加物によっては調製できると考えられる。もし、キャリヤーが化合物を実質的に保持し続けてゆっくりとした割合で放出する場合には、製剤中の化合物の濃度を実際に増加させることができ、効果的な処置を行うために実際に増加が必要となるかもしれない。実用上、製剤は活性成分を最小濃度で含むことが好ましく、これは望ましい数の処置法で病気を効率的に処置するため、すなわち多数回投与を使用するためには、薬剤の有効量が少ない方が受け入れ易いためである。この低濃度の限界は、キャリヤー媒体の輸送効率に依存する。好適には、本発明の化合物は、製剤のおよそ0.0001からおよそ5 重量パーセント含まれる。本発明の好適な態様は、MCすなわちメチルジヒドロキシ桂皮酸を含む組成物を含む。この組成物は、動物実験により、皮膚癌の腫瘍を治療するのに特に効果的であることが知られている。治療部位に運搬されるMCの効率的な濃度は、とりわけキャリヤーおよび製剤に含まれる他の添加物に依存し、通常、製剤に含まれる MCの濃度はおよそ0.0001からおよそ5 重量パーセントの範囲である。こうした範囲は、本明細書において上述したように、濃度は、キャリヤー物質、使用する適用数などに応じて幅広い範囲にわたって調節されるということがわかっているとおり、説明的なものであって限定的なものではない。局所的な利用において、本発明の組成物は、患者の病気の範囲または苦しむ部位に利用される。”局所的な”という言葉は、本明細書において、特に皮膚のような上皮組織表面、固体状の腫瘍を皮膚から除去した部位のみならず、切除または何らかの変化を受けた皮膚の腫瘍表面のことである。あるいは、”局所的な” は、子宮頚腫に対する製剤の利用についても含む。局所的な利用に適した製剤の調製において、本発明の組成物は、通常適切な溶媒と混合する。この目的に効果的な溶媒の例には、エタノール、アセトン、酢酸、アルカリ水溶液、ジメチルスルホキシド、グリセリン、グリセロール、プロピレングリコール、ノノキシノール、エチルエーテル、ポリエチレングリコールなどが含まれる。さらに、アスコルビン酸（好適には0.1%）、ヒドロキシキノン、亜硫酸塩ナトリウム、メタ亜硫酸塩などの酸化防止剤を製剤に添加することが可能である。以下の実施例は本発明を説明するために特定の方法について実験を行ったものである。こうした実験は、本発明の非限定的な例である。他の態様は当業者には容易に想定され、本発明の範囲内に含まれる。実施例１試薬。メチル2,5-ジヒドロキシ桂皮酸(MC)および表IIに記載したチロシンキナーゼ阻害剤は、LC Laboratories,Woburn,Mass より入手し、MCに関連した化合物（図10）はT.R.バーク博士、NCI,ベテスダの研究室において合成された。 3-(4,5- ジメチルチアゾール-2- イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT)はSigma より入手した。細胞培養。初代マウス角質細胞（ケラチノサイト）を、BALB/c新生マウスの皮膚より単離した。初代角質細胞である良性ネオプラズマ角質細胞系列308 および SP-1（ストリックランドら、Cancer Res.,48,165-169,1988 ）およびマウス鱗状細胞ガン細胞系列1-7(グリーンハルら.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87,643-647,1990) を、8%ウシ胎児血清(FCS)（chelexed）およびペニシリン20iu/ml,ストレプトマイシン20μg/ml(P/S)を含むイーゲルの最小培地で生育させた。特に明示しない限り、培地中のCa²⁺濃度は0.05mMに調整した(ヘニングら.,Cells,19,245-254,19 80)。A431ヒト表皮状ガン細胞は、ATCC，ロックバイル、ミズーリ州より入手し、常法のとうり10%FCS,P/S，グルタミン(2mM)およびピルビン酸(1mM)を含むDMEM 中で継代した。SQCC-Y1 ヒト鱗状細胞ガン細胞および発ガン性のないHPV18 およびSV40を感染させたヒト角質細胞は、それぞれハーバード大学、ボストン、マサチューセッツ州のジェームズレインワルド博士およびジョージタウン大学、ワシントンD.C.のリチャードシュレーゲル博士の好意により贈与された。ヒト細胞は、DMEM/Ham's F12 1:1,10%FCS,P/S および上皮細胞増殖因子10ng/ml の中で培養した。 MC は上皮細胞系列において架橋タンパク質を増加させる。細胞を48時間MCと共にインキュベートし、それから架橋タンパク質を単離し実施例１に記載したように測定した。結果は一度の実験で±SD(n=3)であり、図１に示したように2-3 の個々の決定因子を示す。MCは、正常な表現型の細胞（マウス初代角質細胞）、過増殖細胞（SV40感染）、いぼ状細胞（HPV18 感染）、光線性角化細胞(SP-1,308) ,およびがん細胞（A431,SQCC-Y1,1-7）を含むヒトおよびマウス角質細胞由来の細胞系列において架橋性エンベロープ産物を誘導した(図1-5)。実施例２ MC に応答した初代マウス角質細胞の角質化時間経過。初代マウス角質細胞を0, 0.5,1,4 および48時間MCとともにインキュベートし、以下のように処理した。角質化したエンベロープの測定。本測定は、以下の改変を伴い、文献に記載されたように不溶性の架橋タンパク質エンベロープを測定する（ホウ- モンローら .,Analytical biochem.,199,25-28,1991）。角質化したエンベロープは、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS),20mM ジチオスレイトール(DTT)を含むリン酸緩衝液(P BS)中に単層細胞を集めることによって調製した。付着しなかった細胞は培養液中から沈澱させ、これを再びSDS/DTT 中に懸濁し、付着した細胞と共に保存した。試料は10分間煮沸した。角質化したエンベロープ試料を、光学位相差を用いて顕微鏡下で調べ、真空ポンプにつながっている96穴ドットブロット装置上にてRC メンブレン（シュライヒャーおよびシェル、キーン、ニューハンプシャー州）に適用した。試料をSDS/DTT で３回洗浄し、RC60メンブレン上に得られたタンパク質のスポットを固定し、記載されたように染色した。スポットを切り出しし、1% 濃NH₃OH溶液、66% メタノール(200μl)で一晩かけて溶出した。溶出物の吸光度を600nm にてタイターテックプレートリーダーにて測定した。角質化は、細胞を1mM で処理して4 時間以内に起こった。48時間後には、1mM および100 μM の量はどちらも初代角質細胞を角質化するのに効果的であった（図3A）。 MTT 細胞毒性測定。MTT は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によって還元されて青いホルマザン産物になる色素である。細胞のMTT 還元能力は、細胞の生存度(viability)を測定するのに使用可能である（モスマンT.,J.Immunol.Me thods,65,55-63,1983）。示した時間のあいだMCと共にまたはMCを加えないで細胞を96穴プレートにてインキュベートし、それから0.5mg/mlのMTT とともにさらに4 時間インキュベートした。培地を除去し、88.9%DMSO,11.11%グリシン緩衝液 (100mM グリシン、100mM NaCl pH10.5)を個々のウェルに加えた。ホルマザンが分解されるように20分間プレートを振とうさせ、それから吸光度を570nm にてプレートリーダーにて測定した。実施例３マウス初代角質細胞における架橋タンパク質の生産と増殖の阻害。細胞を低密度にて培養し、3 日間MCで処理した。それから、細胞の数を数えて、細胞数の増加を未処理のコントロールと比較し、または細胞を架橋タンパク質測定用に処理した（図４）。タンパク質の架橋はマウス初代角質細胞において1mM で4 時間以内に開始して急速に起こり（図3A）、MTT 測定によって測定したところ、細胞死をともなっていた（図3B）。 A431 ヒト表皮状がん細胞における架橋タンパク質の生産と増殖の阻害。細胞を低密度にて培養し、3 日間MCで処理した。それから、細胞の数を数えて、細胞数の増加を未処理のコントロールと比較し、または細胞を架橋タンパク質測定用に処理した（図５）。これらの結果は、細胞増殖に影響を与えるのに必要なMCの濃度はタンパク質の架橋を促進するのに必要な濃度よりも低いことを示唆している。例えば、初代マウス角質細胞において、細胞の20% のみが25μM のMCにおいて増殖を続ける一方で、タンパク質の架橋を形成するためには50μM 以上のMCが必要である。A431細胞において、75μM のMCは細胞増殖を有意に阻害するが、タンパク質の架橋への影響は250 μM 以下の濃度では明確ではない。それゆえ、タンパク質の架橋は、細胞増殖を阻害するのに必要な濃度よりも高い濃度が必要とされることが明らかになった（図4 および5 ）。実施例４グルタミン転移酵素阻害剤はMCによるタンパク質の架橋を阻害しない。初代マウス角質細胞を75μM または1000μM のMCまたは10nMのスタウロスポリン（stsp ）とともに、100 μM のグルタミン転移酵素(TGase)阻害剤であるLTB2およびHPB 2を添加または添加しないで、48時間インキュベートした。阻害剤はMCまたはsts p添加の30分前に添加した（図6 ）。架橋タンパク質は、実施例２に記載した角質化エンベロープ測定法によって測定した。図6 に示した結果は、MC架橋活性はスタウロスポリンの活性同様にグルタミン転移酵素阻害剤によって影響されないことを示している。 MC はマウス初代角質細胞においてグルタミン転移酵素活性を上昇させない。マウス初代角質細胞を示した時間のあいだ1.4mM Ca²⁺入りの培地中でインキュベートした。MCに誘導される架橋は4 時間以内に開始する（図3 参照）。細胞を細胞質（C ）とトライトン-X100 に可溶性の膜（M ）画分に分離した（図7 ）。それぞれの画分はタンパク量を標準化し、リヒチら.,J.Biol.Chem.,260,1422-1426(1 985)の方法を使用してグルタミン転移酵素活性を測定した。実験の結果は、未処理の細胞に比較して、架橋活性がみられる期間（4 時間）細胞をMCで処理してもグルタミン転移酵素は刺激されないことを示している。TGase 活性を上昇させるキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンによる誘導とは異なり、タンパク質の架橋はグルタミン転移酵素(TGase)阻害剤によって阻害されず(ドルゴスおよびイスパ、Cancer Res.,51,4677-4684,1991)（図6 ）、細胞内のTGase 活性はMCによる架橋が開始するときにも上昇しない（図7 ）ことから、細胞内の架橋性酵素はこの効果に含まれないことが示唆された。実施例５ MC は4 ℃および37℃にて初代マウス角質細胞における架橋タンパク質を誘導する。細胞を48時間4 ℃または37℃にてMCまたはスタウロスポリン（stsp）と共に培地中でインキュベートし、それから架橋タンパク質を単離し、実施例２に記載したように角質化エンベロープ測定法によって測定した。MCによる架橋は4 ℃および37℃にておこり、これにより温度依存的であるスタウロスポリンとは異なり、非生物学的な過程（むしろ、化学的過程）であることが示唆された。実施例６ある範囲のチロシンキナーゼ阻害剤について、308 およびSQCC-Y1 細胞において架橋タンパク質のエンベロープを作成するための能力を試験した。すべての阻害剤は、LC Laboratories,Woburn,Mass より市販品として入手された。使用した濃度はチロシンキナーゼを阻害する範囲内であった。チロホスチンの濃度は、37 ℃における培地への溶解度のために限定された。表ＩＩ．チロシンキナーゼ阻害剤はタンパク質の架橋を誘導しない本発明のヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物でみられたタンパク質の架橋活性は、どのチロシンキナーゼ阻害剤においてもみられなかった。この発見は、本発明のヒドロキシル化芳香族のタンパク質架橋性化合物は、チロシンキナーゼ阻害活性としては実質的に機能していないということを示している。実際に、これら２つの活性の間にはなんの関係もみられない。実施例７無胸腺ヌードマウスの皮膚への局所的なMCの塗布。無胸腺マウスの皮膚へ塗布し、毎週５回、２週間にわたって塗布した後にその毒性について、炎症、潰瘍または他の兆候を観察することによって、およびMCを塗布した後に無胸腺マウスの皮膚のパラフィン埋包切片を顕微鏡を用いて観察することによって、MCの急性局所毒性を測定した。８週齢のオスnu/nu マウスを５つの処置グループに分け、アセトン媒体中の10% DMSO中にてMCを局所的に投与した。マウスは、コントロール媒体、100 μM MC,1mM MC,10mM MC または100mM MCで処理した。処理は１週間に５回、２週間行い、それから動物を犠牲にして背側の皮膚を4 ℃で24時間カルノイ溶液中において、それから100%エタノールにて固定した。組織学的切片をパラフィン埋包組織から採取し、ヘマトキシンおよびエオシンで染色した。図13には、ヌードマウスの皮膚に対するMCの効果を図示する。 MC はヌードマウスの皮膚に局所的に塗布した場合に、急性炎症または壊死を引き起こさない。8 週齢のオスnu/nu マウスを処置グループに分け、アセトン媒体（25μl ）中の10% DMSO中のMCを局所的に背側の皮膚に投与した。処理は１週間に５回、２週間行った。MCをヌードマウスの背側の皮膚に局所的に処理した２週間、塗布した部位における全身的な毒性の兆候または皮膚の変化について、動物を観察した。100mM におけるパッチ状の茶色のしみ以外は何の変化も観察されなかった（図13）。MCそのものは黄茶色なので、高濃度の薬剤の蓄積のためになんらかの変色がおこったと予想される。顕微鏡を使用しての観察では、MCは10mMまでなら正常な無胸腺マウスの皮膚に急性毒性または炎症を引き起こさない。試験に使用した一番高い濃度である100mM では、上皮細胞の空胞が生じ、局所的な炎症浸潤が観察されたが、明らかなネクローシスは観察されなかった（図9 ）。実施例８皮膚移植およびin vivo における処置。文献に記載されたように（ストリックランドら.,Carcinogenesis,14,205,1993）、8X10⁶個の新生SENCARマウス皮膚繊維芽細胞とともに0.5X10⁶個のSP-1細胞を使用して、無胸腺症のマウスに皮膚移植を行った。ドーム（皮膚移植を行った部位に覆い被せるプラスチックのカバー）を移植の一週間後に外し、それから一週間後に、局所的なMCの塗布を開始した。薬剤は90% アセトン、10% DMSO媒体25μl を使用して適用した。週に一度、移植の５週間目まで腫瘍の測定を記録した。 MC は移植したSP-1細胞の腫瘍形成を阻害する。移植は上記に記載したように行った。ひとつのマウスグループでは、MCを１週間に２回、２週間塗布した（図10 A に示した）。第２のグループでは、MCを１週間に５日、３週間塗布した（図 10B に示した）。腫瘍は実験の終わりにカリパスを使用して測定し、腫瘍の表現型を顕微鏡にて確認するために腫瘍を固定して切片を採取した。MCは、1mM および100mM の濃度でヌードマウスの背中に移植された腫瘍細胞系列であるSP-1由来の腫瘍の増殖を阻害した。実施例９いくつかのヒドロキシル化芳香族タンパク質架橋試薬の合成石油エーテルは沸点が３５〜６０℃のものであり、溶媒の除去は減圧下での回転蒸発によって行った。シリカゲル濾過はＴＬＣグレードシリカゲル（５〜２５μアルドリッチ）を用いて行った。融点はＭｅｌＴｅｍｐＩＩ融点装置で測定し、未補正である。元素分析はジョージア州ノークロスのアトランティクマイクロラボ社から得たものであり、断りがなければ理論値の０．４％以内である。迅速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢＭＳ）はＶＧ２０３５データシステム制御下のＶＧアナリティカル７０７０Ｅ質量分析計で得た。¹ＨＮＭＲデータはブルッカーＡＣ２５０（２５０ＭＨｚ）計測器で得た。桂皮酸類似体の合成桂皮酸類似体の合成は、文献に記載の技術の直接的応用によって行った。”方法Ａ”および”方法Ｂ”とする２つの一般的な方法を用いた：方法Ａ：カフェー酸 β−フェニルエチルエステル（ＣＡＰＥ、６７Ｈ− ４２−Ａ）の合成１．８０ｇ（１０mmol）のカフェー酸、１７．９ｍＬ（１５０mmol）のβ−フェニルエチルアルコールおよび１００ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸のベンゼン（１００ｍＬ）中の溶液をディーンスタークトラップで還流しながら一晩撹拌した。溶媒および過剰のアルコールを蒸留によって除去し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＣＨＣｌ₃）によって精製した。生成物を結晶化（エーテル／石油エーテル）して、６７Ｈ−４２−Ａを純白の結晶１．０ｇ（３５％）として得た：融点１２８．０℃ １２６〜１２８ ℃）（Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ，（１９８８）４４：２３０−２）。３，４−ジフルオロ桂皮酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｊ−１７−Ａ）方法Ａに記載のように３，４−ジフルオロ桂皮酸とβ−フェニルエチルアルコールとを反応させて、６７Ｊ−１７−Ａを純白の結晶（収率３８％）として得た：融点５３〜５７℃；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．３０−７．０５（ｍ，８Ｈ），６．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），４．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ，＋ＶＥ）ｍ／ z ２８９（Ｍ＋Ｈ）。分析（Ｃ₁₇Ｈ₁₄Ｏ₂Ｆ₂）Ｃ，Ｈ。方法Ｂ：２，５−ジヒドロキシ桂皮酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ−１２４−Ａ）の合成２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド（１３８ｍｇ、１．０mmol）、４３０ｍｇ（０．９３mmol）の（カルボキシメチル）−トリフェニルホスホニウムクロリド、β−フェニルエチルエステル［融点１６２〜１６５℃（分解）；１４８〜１５１℃］（Ｂａｎｋｏｖａ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．（１９９０）５３：８２１−４）および粉末の無水Ｋ₂ＣＯ₃（５８６ｍｇ、４．２４mmol）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の混合物を周囲温度で一晩撹拌した。次に、粗反応混合物をブライン（５０ｍＬ）中の０．５ＮＨＣｌ／酢酸エチル（３×５０ｍＬ）の間で分配し、ブライン（５０ｍＬ）中の０．５ＮＨＣｌ、ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を除去して黒っぽいシロップ（５７７ｍｇ）を得た。粗生成物をまずＣＨＣｌ₃、次いでＣＨＣｌ₃中の５％酢酸エチルを用いてシリカパッドに通した。得られた淡黄色結晶をエーテル（石油エーテル）から再結晶して、純粋な６７Ｈ−１２４−Ａをベージュ色の結晶（１１５ｍｇ、収率４３％）として得た；融点１２３〜１２５℃；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．３０−７．１７（ｍ，５Ｈ），６．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），６．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ＆８．６Ｈｚ），６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），４．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＡＢＭＳ（ＮＢＡ， −ＶＥ）ｍ／ｚ２８３（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₁₇Ｈ₁₆Ｏ₄）Ｃ，Ｈ。２，３，４−トリヒドロキシ桂皮酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ −８０−Ｃ）上記方法Ｂに記載のように２，３，４−トリヒドロキシベンズアルデヒドと（カルボキシメチル）−トリフェニルホスホニウムクロリド、β− フェニルエチルエステルとを反応させて粗生成物を得、これをシリカパッドに何回も通し、エーテル：石油エーテルから最終的に結晶化することによって精製して、純粋な６７Ｈ−８０−Ｃを１９％の収率でベージュ色の結晶として得た：融点１４４℃ 軟化１４７〜１５０℃；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：９．７７（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．３６−７．１８（ｍ，５Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），６．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ２９９（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₁₇Ｈ₁₆Ｏ₅・１／４Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ。２，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ −９８−Ａ）反応を周囲温度で２時間行った以外は上記方法Ｂに記載のように３，４，５−トリヒドロキシベンズアルデヒドと（カルボキシメチル）−トリフェニルホスホニウムクロリド、β−フェニルエチルエステルとを反応させた。何回もシリカゲルクロマトグラフィーに通すことによって精製して淡黄色泡状物を得た。石油エーテル：エーテル中で粉砕して、６７Ｈ−９８−Ａを２１％の収率で淡黄色の固体として得た：融点１４６〜１４９℃；¹ＨＮＭＲ９．６２（ｓ，１Ｈ），９．５２（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．３７−７．１８（ｍ，５Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｓ，１Ｈ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），４．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ２９９（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₁₇Ｈ₁₆Ｏ₅・１／４Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ。カフェー酸２−（２−ナフチル）エチルエステル（６７Ｈ−７２−Ｂ）反応時間を３日に延長した以外は上記方法Ａに記載のように、カフェー酸と２ −（２−ナフチル）エタノールとを反応させて、生成物を白色固体として得、その後、クロマトグラフィーを行った。エーテル中で粉砕して純粋な６７Ｈ−７２ −Ｂを純白な固体として３％の全体収率で得た：融点１７４．５〜１７６．５℃ ；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：９．６１（ｂｒｓ，１Ｈ），９．１４（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９３−７．７８（ｍ，５Ｈ），７．５２−７．４２（ｍ，３Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ），４．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ３３３（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₂₁ Ｈ₁₈Ｏ₄・１／４Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ。カフェー酸２−（１−ナフチル）エチルエステル（６７Ｈ−１４８−Ａ）反応時間を６日に延長した以外は上記方法Ａに記載のようにカフェー酸と２ −（１−ナフチル）エタノールとを反応させて、生成物６７Ｈ−１４８−Ａを純白な固体として２１％の全体収率で得た：融点１６５〜１６８℃；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．９７−７．９４（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ），７．６４−７．３９（ｍ，５Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），６．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ＆８．１Ｈｚ），６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ），４．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ３３３（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₂₁Ｈ₁₈Ｏ₄・１／４Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ。３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ−６９−Ａ）２（２８４ｍｇ、１．０mmol）のエタノール（２５ｍＬ）中の溶液をパル装置中、４０ｐｓｉのＨ₂の下、１０％Ｐｄ−Ｃ（１００ｍｇ）上で水素添加した（２．５時間）。反応混合物をセライトに通して濾過し、エーテル：石油エーテルから結晶化して、生成物６７Ｈ−６９−Ａをオフホワイト色の結晶（１７５ｍｇ、収率６１％）として得た：融点７２．５〜７３．５℃；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：８．７５（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．１８（ｍ，５Ｈ），６．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），６．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ＆８．０Ｈｚ），４．２１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．４９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ） m／z ２８５（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₂₁Ｈ₁₈Ｏ₄）Ｃ，Ｈ。６．７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ−４６−Ａ）６ＮＨＣｌ（２０ｍＬ）中の３４６ｍg（１．５mmol)の６，７−ジメトキシ−２−ナフトイルアミド（Ｂｕｒｋｅ、Ｔ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９３３）３６，４２５−４３２）の全体を還流しながら撹拌し（２４時間）、次に、冷却し、そして６，７− ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を紫色の固体（２６０ｍｇ）として集めた。方法Ａに記載のように２２５ｍｇ（１．１０mMol）部をフェニルエチルアルコールでエステル化した（反応時間２日）。クロマトグラフィー精製（ＣＨＣｌ₃、その後、酢酸エチル）して固体を得、これをＣＨＣｌ₃に懸濁し、濾過により集めて、６７Ｈ−４６−Ａを純白の針状結晶（１００ｍｇ、全体収率２５％）として得た：融点１７５〜１７６℃；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：８．３３（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｓ，２Ｈ），７．３８−７．１７（ｍ，６Ｈ），４．５０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．０７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ３０７（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₁₉Ｈ₁₆Ｏ₄・１／４Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ。５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸 β−フェニルエチルエステル（６７Ｈ−５２−Ａ）２４０ｍｇ（１．０mmol）の５，６−ジメトキシ−２−ナフエ酸（Ｂｕｒｋｅ、Ｔ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（１９３３）３６，４２５−４３２）の全体をそのままピリジン・ＨＣｌ（５．０ｇ）と共にアルゴン下、１８０〜２００℃で加熱した（４０分）。過剰のピリジン・ＨＣｌを高真空下で留去し、残留物を１ＮＨＣｌ（２０ｍＬ）と混合して、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を淡黄色固体として得、これを濾過によって集めた（１６０ｍｇ）。１４０ｍｇ（０．７mmol）部を、化合物６７Ｈ−４６−Ａの場合に記載したように、β−フェニルエチルアルコールと反応させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃）によって精製して、生成物６７Ｈ−５２−Ａを白色固体（１２００ｍｇ、全体収率３６％）として得た：融点１６４〜１６６℃；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），８．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ＆８．８Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３８−７．３３（ｍ，５Ｈ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ、 −ＶＥ）ｍ／ｚ３０７（Ｍ−Ｈ）。分析（Ｃ₁₉Ｈ₁₆Ｏ₄）Ｃ，Ｈ。５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸メチルエステル（６７Ｇ−１４６ −Ａ）この化合物は上記のように製造した。（Ｂｕｒｋｅ、Ｔ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（１９３３）３６，４２５− ４３２）。６，７−ジヒドロキシイソキノリン−３−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（６７Ｆ−６５−Ａ）この化合物は上記のように製造した。（Ｂｕｒｋｅ、Ｔ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ（１９９２）３４，７５４−７６４）。７，８−ジヒドロキシイソキノリン−３−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（６７Ｆ−３６−Ａ）この化合物は上記のように製造した。（Ｂｕｒｋｅ、Ｔ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９９２）２，１７７１−１７７４）。２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルアセトアミドエタン（６７Ｊ−２８−Ａ）チラミン・ＨＣｌ（９４８ｍｇ、５．０mmol）の水性ＮａＨＣＯ₃（１．６８ｇ、２５ｍＬＨ₂Ｏ中の２０mmol）およびＣＨＣｌ₃（２５ｍＬ）中の激しく撹拌した混合物に、フェニルアセチルクロリド（６６０μ Ｌ、５．０mmol）を滴加し、次に、反応混合物を周囲温度で撹拌した（１時間）。有機層を集め、水性層のＣＨＣｌ₃抽出物２５ｍＬと一緒にし、一緒にした有機層を１ＮＨＣｌ（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を蒸発させた。得られた泡状物を酢酸エチルと混合し、次に、エーテルで希釈し、白色固体（２２５ｍｇ）を取り出し、廃棄した。濾液を、まずＣＨＣｌ₃中の２５％酢酸エチルを、次いで１００％酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物６７Ｊ−２８−Ａは淡黄色シロップ（３６２ｍｇ、収率２７％）として得た；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：７．３８−７．２４（ｍ，５Ｈ），６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ＆８．０Ｈｚ），５．６３（ｂｒｔ，１Ｈ），３．１４（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ＆１３．０Ｈｚ），２．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）；高分解能ＦＡＢＭＳＣ₁₆ Ｈ₁₆ＮＯ₃（Ｍ−Ｈ）として計算した理論値２７０．１１３０、実測値２７０．１１１７、分析（Ｃ₁₆Ｈ₁₇Ｏ₃）Ｈ，Ｎ；Ｃ理論値６９．６９、実測値７０．１１。３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸 β−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチルアミド（６７Ｊ−３２−Ａ）先の反応に記載のように製造した３４８ｍｇ（１．０mmol）の３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸ペンタフルオロフェニルエステルの無水ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中の溶液に、チラミン・ＨＣｌ（２２７ｍｇ、１．２mmol）およびトリエチルアミン（２０９μ、１．５mmol）を加え、反応混合物を撹拌した。２時間後、溶媒を高真空下の蒸留によって除去し、残留物を先の反応に記載のようなシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、生成物６７Ｊ−３２−Ａを白色泡状物（３３８ｍｇ、定量収率）として得た； ¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ ：８．７５（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．６５−６．５７（ｍ，４Ｈ），６．４４−６．３９（ｍ，２Ｈ），３．２０−３．１１（ｍ，２Ｈ），２．５２−２．４６（ｍ，２Ｈ），２．２８−２．２２（ｍ，２Ｈ）；高分解能ＦＡＢＭＳＣ₁₇Ｈ₁₈ＮＯ₅（Ｍ−Ｈ）として計算した理論値３１６．１１８５、実測値３１６．１１４６、分析（Ｃ₁₇Ｈ₁₉Ｏ₅・１／２Ｈ₂Ｏ）Ｈ，Ｎ；Ｃ理論値６２．１４、実測値６２．５７。実施例１０ＭＣが架橋を誘導するという初めの観察に基づいて、一連の１５の芳香族化合物を同様な活性について調べた。これらの化合物はＯＨ基がフッ素で置換されている６７−Ｊ１７Ａ以外は、いずれもオルト−またはパラ−ヒドロキシル置換形を有していた。予備試験で、いくつかの化合物は架橋可能であるが、他の化合物は試験濃度において弱いかあるいは不活性であることが示された。最も有効な化合物のうちの４つを図１２に”６７Ｈ−６９Ａ”、”６７Ｈ−９８Ａ”、”６７Ｈ−１２４Ａ”および”６７Ｇ−１４６Ａ”として示す。これらの構造はタンパク質架橋活性を明らかに示し、従って、本発明のヒドロキシル化芳香族タンパク質架橋化合物に属する化合物である。これらの特定のヒドロキシル化芳香族タンパク質架橋化合物は、過増殖性皮膚疾患の治療における局所用薬剤として有用である。図１１に示す結果から、いくつかの構造的特異性が架橋プロセスにかかわっていることが分かる。例えば、活性化合物６７Ｈ−６９−Ａは不活性な６７Ｈ−４２−Ａとは、側鎖二重結合がないことのみが異なっている。さらに、単一ヒドロキシルを不活性６７Ｈ−４２−Ａに加えると、活性化合物６７Ｈ−９８−Ａとなる。構造的特異性の別の例は、環窒素の有無の点で異なる活性６７Ｇ−１４６− Ａと不活性６７Ｆ−３６−Ａとの比較によっても示される。本出願における引例はすべて参照することによって本出願に記載されたものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ユスパ，スチュアート・エイチアメリカ合衆国メリーランド州20817，ベセズダ，カリタ・コート 8013 (72)発明者バーク，テレンス・アール，ジュニアアメリカ合衆国メリーランド州20817，ベセズダ，レイクヴュー・ドライヴ 7400, ナンバー 410

Claims

【特許請求の範囲】１．式：（式中、カリール）；Ｙ＝Ｈ、アルキル；アラルキル、アルカリール；アリール；ヘテロアリール； −アルカリール；またはＮ−アラルキル）； −−−は二重結合が存在しうることを表す）の少なくとも１種の化合物を含有する組成物の有効量を、病変に局所的に施すことを含む、過増殖性上皮細胞病変の治療方法。２．上皮病変が皮膚病変である、請求項１に記載の方法。３．上皮病変がヒト乳頭腫ウイルス感染組織病変である、請求項１に記載の方法。４．上皮病変が腫瘍状病変である、請求項１に記載の方法。５．化合物が２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチルである、請求項１に記載の方法。６．化合物がである、請求項１に記載の方法。７．化合物がである、請求項１に記載の方法。８．化合物がである、請求項１に記載の方法。９．化合物がである、請求項１に記載の方法。