JPH11506761A

JPH11506761A - トリテルペン

Info

Publication number: JPH11506761A
Application number: JP9501049A
Authority: JP
Inventors: ゴーツ，マイケル・エイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0840737A4; AU6251296A; AU695729B2; CA2223592A1; EP0840737A1; WO1996040688A1; US5631282A

Abstract

(57)【要約】強力で選択的な免疫抑制薬である、（式中の「−−−」が単結合又は二重結合であり且つＲがＨ又は酢酸塩である）次式（１）の４つのトリテルペンが開示される。これらの化合物をＳｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａの根から単離した。

Description

【発明の詳細な説明】トリテルペン発明の背景免疫調節異常が、全身性紅斑性狼蒼、慢性リウマチ性関節炎、Ｉ型及びII型真性糖尿病、炎症性腸疾患、胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症、並びに、クローン病、潰瘍性大腸炎、水胞性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、グレーブス眼疾患及び喘息のような他の疾患を含む、様々な種類の「自己免疫性」及び慢性の炎症疾患に存在することが実証されている。これらの疾患の内在的病因は各々に全く異なっている可能性もあるが、これらの疾患では共通して様々な自己抗体及び自己反応性リンパ球が出現する。こうした自己反応性は、正常な免疫系の働きを制御する恒常性制御の減少に部分的に起因している可能性がある。同様に、骨髄移植又は器官移植の後に、ホストのリンパ球が、外来性組織抗原を認識し、移植片拒絶を引き起こす抗体を生産し始める。自己免疫又は拒絶プロセスの最終結果の１つは、炎症性細胞と、炎症性細胞が放出する媒介物質とによって引き起こされる組織破壊である。ＮＳＡＩＤのような抗炎症剤は、原理的に、こうした媒介物質の影響又は分泌を阻止することによって作用するが、疾患の免疫学的原因の変更に関しては何も行わない。一方、シクロホスファミドのような細胞毒薬剤は非特異的に作用して、正常反応と自己免疫反応の両方を阻止する。実際には、こうした非特異的免疫抑制薬による治療を受ける患者は、自己免疫疾患で死亡する可能性が高いのと同程度に感染症で死亡する可能性が高い。ＵＳＦＤＡが１９８３年に認可したシクロスポリン（ＣｓＡ）は、移植器官の拒絶を防止するために使用される、現時点の主要な薬剤である。ＵＳＦＤＡは、１９９３年に、ＦＫ−５０６（Ｐｒｏｇｒａｆ）を肝臓移植における拒絶の防止に使用することを認可した。ＣｓＡとＦＫ−５０６は、移植片の外来タンパク質を拒絶する天然の保護薬の厖大な蓄積を体の免疫系が動員することを防止することによって作用する。１９９４年にはＵＳＦＤＡによってＣｓＡを重度の乾癬の治療に使用することが認可され、一方、ＣｓＡをアトピー性皮膚炎の治療に使用することが欧州の公的規制機関によって既に認可されている。これらは移植片拒絶を抑制するのに有効であるが、ＣｓＡとＦＫ−５０９が、腎毒性、神経毒性、及び、胃腸不快感を含む望ましくない副作用の原因となることが知られている。Ｔ細胞のチミジン取り込みを阻害し且つ人間を含む動物の免疫抑制薬として有効であるスパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の４つの活性成分が、今同定された。発明の要約本発明は、次の構造式１の化合物に係わり、前式中で「−−−」が二重結合の存在又は非存在を表し、ＲがＨ又はＡｃである。式１これらの化合物は、人間を含む動物の免疫抑制薬として有効である。本発明は、更に、Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａの根から上記化合物を得るプロセスと、活性免疫抑制薬として１つ以上の上記化合物だけを含む、又は、これらの化合物を免疫抑制能力を有する他の薬剤と組み合わせて含む医薬製剤と、上記化合物又はその製剤の１つ又は全てを移植器官の拒絶の防止を必要とする患者に対して投与することによって移植器官の拒絶を防止するための免疫抑制をもたらす方法とに係わる。図面の簡単な説明図１は、化合物１（ａ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。図２は、化合物１（ｂ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。図３は、化合物１（ｃ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。図４は、化合物１（ｄ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。全ての１ＨＮＭＲスペクトルを、２５℃ＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙ４００ＮＭＲ分光計によってＣＤ₂Ｃｌ₂中で４００ＭＨｚにおいて記録した。化学シフトは、内標準としてδ５．３２の溶媒ピークを使用して、ゼロｐｐｍのＴＭＳに対してｐｐｍで表している。発明の詳細な説明本発明は、次の構造式１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）、及び、１（ｄ）の化合物又はその調剤上許容可能な塩に係わる。これらの化合物は、人間を含む動物の免疫抑制薬として有効である。ブラジル産植物のＬｏｐｈａｎｔｈｅｒａｌａｃｔｅｓｃｅｎｓから得られる式１（ａ）の化合物が公知であるが、この化合物の生物学的活性に関しては本開示の以前には全く報告されていない。本明細書では「式１（ｂ）の化合物」と呼ぶ新規のΔ−１１，１２類似体と、式１（ｃ）及び式１（ｄ）で表す化合物も、現在まで開示されたことがない。これら４つの化合物全てを、Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａの根のエタノール抽出物から単離した。本発明は、更に、Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａの根から上記化合物を得るためのプロセスにも係わる。このプロセスを下記実施例で例示する。本発明の化合物は、免疫抑制薬に必要とされる調剤特性、即ち、Ｔ細胞増殖を抑制する能力を有する。これらの化合物の調剤上活性な結晶形態、水和物、溶媒和、及び、他の形態の全てが、本発明の範囲内に含まれる。免疫抑制をもたらす本発明の新規の方法では、本発明の化合物又はその調剤上許容可能な塩の１つ又は全てを、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇから約２０ｍｇの範囲内の量で、好ましくは、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約１０ｍｇの範囲内の量で、単一用量として、又は、２分割量から４分割量として、又は、連続静脈内注入によって投与する。本発明の化合物を単独の活性成分として投与することも、必要に応じて、他の免疫抑制薬又は他の治療と組み合わせて投与することも可能である。上記用量の本発明の化合物又はその調剤上許容可能な塩を、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、舌下投与、静脈内投与することが可能である。本発明の化合物を、例えば錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューイングガム等の形で経口投与することが好ましい。この製剤を投与するための別の好ましい手段は、例えば使用前に塩類液で希釈する１０％クレモホル及び５％ジメチルスルホキシド中溶液の形の、静脈内溶液又は懸濁液の形である。本発明の化合物を単独で又は組み合わせて投与することが可能であるが、更に、本発明の化合物を、単独で、又は、アザチオプリン、ブレキナールナトリウム（brequinar sodium）、デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin）、ミザリビン（mizaribine）、マイコフェノール酸モルホリノエステル、シクロスポリン、ＦＫ−５０６、ラパマイシン（rapamycin ）、又は、免疫抑制をもたらすために同時投与することが可能な他の化合物から成るグループから選択される抗増殖薬と共に投与することも可能である。式１（ａ）、式１（ｂ）、式１（ｃ）、及び、式１（ｄ）の化合物が免疫抑制薬として作用することが可能なので、こうした化合物は、対宿主性移植片病、自己免疫性疾患、炎症性疾患、増殖性皮膚疾患、高増殖性皮膚疾患、免疫仲介疾患の皮膚形質発現、男性又は女性パターン脱毛症、老人性脱毛症、呼吸性疾患、虚血に関連した肝損傷、眼病、粘膜又は血管の炎症、熱傷に関連した腸管病変、サイトメガロウイルス感染症、腎臓病、骨疾患、循環器系疾患、歯周病、ネフローゼ症候群、溶血性尿毒症症候群、筋ジストロフィー、腸管炎症／アレルギー、及び、肝臓病の治療を必要とする患者に対して、こうした化合物のいすれか１つ又は全てを投与することによって、上記疾患を予防又は治療するのに有効である。実施例１式１（ａ）及び式１（ｂ）の化合物をＳｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａから抽出するための方法Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ根のエタノール抽出物１ｇを、ヘキサン１００ｍＬ（２回）と９０％水性メタノール１００ｍＬとの間で分配した。相分離後に、脱脂メタノールを真空下で濃縮し、水性懸濁液を得た。この懸濁液を水で１００ｍＬに希釈し、塩化メチレン１００ｍＬで抽出した。生物活性塩化メチレン抽出物を脱水し残渣１２ｍｇを得た。これを、最初に、塩化メチレン−酢酸エチル１：１（ｖ／ｖ）を溶媒として使用した、２０ｃｍｘ２０ｃｍで厚さ１ｍｍのＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ₂₅₄プレート上で分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分画し、その次に、アセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）−１００％アセトニトリルの５０分勾配を溶離剤として１ｍＬ／分の割合で使用して、５０℃に維持したＺｏｒｂａｘＲｘＣ₈ ４．６ｍｍ×２５ｃｍカラムにおける高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分画し、式１（ａ）の化合物４ｍｇと式１（ｂ）の化合物１ｍｇを得た「Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ₂₅₄、塩化メチレン−酢酸エチル１：１、Ｒｆ１（ａ）０．４、Ｒｆ１（ｂ）０．３」、及び、「ＷｈａｔｍａｎＫＣ₁₈、メタノール−水９：１、Ｒｆ１（ａ）０．６５、Ｒｆ１（ｂ）０．７５」のような幾つかのＴＬＣ系によって、「ＺｏｒｂａｘＲｘＣ８カラム、アセトニトリル−水３：２、ｋ′１（ａ）４．１５、ｋ′１（ｂ）３．３０」を使用するＨＰＬＣによって、並びに、ＮＭＲによって、調製物の均一性を確認した。ＪＥＯＬＳＸ−１０２Ａ（電子衝撃、ＥＩ、９０３Ｖ）質量分析計及びＪＥＯＬＨＸ１１０（高速原子衝撃、ＦＡＢ）質量分析計で質量スペクトルを記録した。正確な質量測定を、内標準としてペルフルオロケロセン（ＰＦＫ）を使用して高分解能（ＨＲ−ＥＩ）質量分析計で行った。室温のＢＳＴＦＡ−ピリジンの１：１混合物を使用して、トリメチルシリル誘導体を調製した。ＦＡＢスペクトルを、ジチオトレイトール／ジチオエルトリトール（２０／８０）のマトリックスにおいて得た。非誘導体化した式１（ａ）の化合物をＥＩで分析する。分子イオンをｍ／ｚ７８８で検出し、酢酸の３つの連続した損失を検出する。基準ピークをｍ／ｚ３３４で検出する。この化合物はシリル化しない。走査型ＨＲ−ＥＩは、Ｃ₄₀Ｈ₅₂Ｏ₁₆の分子式を示した。臨界ＨＲ−ＥＩデータの表を次に示す。２００℃のＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙ４００ＮＭＲ分光計によってＣＤ₂ ＣＬ₂中で１００ＭＨｚにおいて式１（ａ）の化合物の¹³ＣＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトを、内規準として５３．８ｐｐｍの溶媒ピークを使用するゼロｐｐｍのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するｐｐｍで示す。次のデータを得た。１５．０、１５．２、１６．８、１７．１、２０．７^*、２０．９、２１．１、２１．６、２１．８、２２．２、３５．６、４０．８^*、４２．１、４３．６、４５．１、４７．５、４９．３^*、５３．５、５９．１、６２．６、６３．５、６６．１、６６．７^*、６８．４^*、６９．９、７３．９、７５．０、７５．６、７７．１^*、１１９．４、１２３．７、１３８．９、１４３．０、１６７．７、１６９．２、１６９．３^*、１７０．２５、１７０．３１、１７０．８、１７１．３ｐｐｍ（＊は広幅共鳴としての検出を表す）。４０の炭素カウントは、走査型ＨＲＥＩ−ＭＳによって得られた分子式Ｃ₄₀ Ｈ₅₂Ｏ₁₆に一致している。式１（ａ）の化合物の１ＨＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルを、２５℃のＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙ４００ＮＭＲ分光計によってＣＤ₂ＣＬ₂中で４００ＭＨｚにおいて記録した。化学シフトを、内規準としてδ５．３２の溶媒ピークを使用するゼロｐｐｍのＴＭＳに対するｐｐｍで示す。式１（ｂ）の化合物の質量スペクトルを上記手順と同じ手順で得た。次の結果を得た。上記手順を使用して式１（ｂ）の化合物の１３ＣＮＭＲスペクトルを記録した。次の結果を得た。１４．８、１４．９、１７．３、２０．８、２０．９、２１．３、２１．７、２１．８、２１．９、２７．１、３５．１、４０．６、４２．３、４５．４、４８．１、５０．４、５３．５、５４．１、５７．８、６３．７、６６．２、６７．８、６８．６、７１．４、７３．３、７３．８、７４．４、１１９．５、１２１．１、１２４．３、１３７．１、１３８．９、１４３．３、１６７．６、１６８．６、１６９．３、１６９．５、１６９．９、１７１．０、１７１．７ｐｐｍ。４０の炭素カウントは、走査型ＨＲＥＩ−ＭＳによって得られた分子式Ｃ₄₀ Ｈ₅₀Ｏ₁₆に一致している。式１（ｂ）の化合物の¹ＨＮＭＲスペクトルを図３として示す。このスペクトルを上記の通りに記録した。実施例２式１（Ｃ）及び式１（Ｄ）の化合物をＳｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａから抽出するための方法実施例１のプロセスをより大きな規模で行った時に、式１（ａ）の化合物の類似体と式１（ｂ）の化合物の類似体を、粗抽出物とその画分との中に検出することが可能だった。この場合、各段階で各溶媒９００ｍＬを使用して、実施例１で説明した通りにエタノール抽出物５０ｇを分配した。塩化メチレン抽出物の部分精製を、塩化メチレン中の酢酸エチルの段階勾配を溶離剤として使用して、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（１２０ｍＬ）上でのカラムクロマトグラフィーによって得た。この段階勾配を、カラムを最初に１００％塩化メチレンで洗浄し、その後で９：１、８：２、３：２、２：１、１：１、１：２、２：８、及び、１：９の塩化メチレン−酢酸エチル混合物で洗浄するように設定した。最後に、カラムを１００％酢酸エチルで洗浄した。塩化メチレン−酢酸エチル３：２によって溶離させた画分を、式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物との中で濃厚化した。これらを、アセトニトリル−水１：１ｖ／ｖを溶離剤として４ｍＬ／分の割合で使用した、５０℃に維持したＺｏｒｂａｘＲｘＣ₈ ９ｍｍ×２５ｃｍカラムを用いるＨＰＬＣによって分離した。最終的に、３回の同一の溶離によって、メタノールからの結晶化の後に式１（ａ）の化合物１００ｍｇと式１（ｂ）の化合物２０ｍｇを得た。紫外スペクトルとＴＬＣプレート上での色反応とに基づいて、上記シリカゲルカラムからのより遅い溶離画分が、少なくとも２つの関連化合物を含むことを発見した。塩化メチレン−酢酸エチル１：１による洗浄と塩化メチレン−酢酸エチル１：２による洗浄とによって得た材料を組み合わせて、蒸発させた。水中の３０％−５０％アセトニトリル５０分勾配を溶離剤として使用する上記ＨＰＬＣカラムと同じＨＰＬＣカラムによって、分離を行った。２回の同一の溶離から、精製された式１（ｃ）の化合物６ｍｇを得た。式１（ｄ）の化合物を含む画分を、無勾配の形のアセトニトリル−水３：７を使用してＨＰＬＣ（上記カラムと同じカラム）によって同様に処理し、精製した式１（ｄ）の化合物２ｍｇを得た。これらの化合物の質量スペクトルを、ＦｉｎｎｉｇａｎＴＳＱ７００質量分析計（エレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩ）で記録した。４５％アセトニトリル／０．０１Ｍ水性酢酸アンモニウムの移動相を０．２ｍＬ／分で使用した、５０℃に維持した２．１ｘ１５０ｍｍＣ₈カラムにおけるＬＣ／ＭＳによって、試料を分析した。成分１（ｄ）は、１０．５分の保持時間と、ｍ／ｚ７４５（Ｍ＋Ｈ）、７６２（Ｍ＋ＮＨ₃）、及び、７８６（Ｍ＋Ｈ＋ＭｅＣＮ）で検出される分子量７４４とを有した。成分１（ｃ）は、１１．８分の保持時間と、ｍ／ｚ７４７（Ｍ＋Ｈ）、７６４（Ｍ＋ＮＨ₃）、及び、７８８（Ｍ＋Ｈ＋ＭｅＣＮ）で検出される分子量７４６を有した。上記条件を使用して得た式１（ｃ）の化合物の¹³ＣＮＭＲスペクトルは、次の通りである。１５．１（２ｘ）、１６．９、１９．８，２０．８、２０．９１、２０．９４、２１．９、２２．３、３５．６、４０．６、４２．２、４３．９、４５．０、４７．７、５０．８、５３．５、５５．６、６１．８、６３．５、６６．０、６７．６（２ｘ）、６９．８、７０．０、７３．９、７５．０、７５．６、１１９．３、１２３．７、１３９．０、１４４．４、１６７．８、１６９．２、１６９．５、１７０．１、１７０．４、１７１．４ｐｐｍ。３８の炭素カウントは、走査型ＨＲＥＩ−ＭＳによって得られた分子式Ｃ₃₈ Ｈ₅₀Ｏ₁₆に一致している。式１（ｃ）の化合物の¹ＨＮＭＲスペクトルを図３に示し、式１（ｄ）の化合物の¹ＨＮＭＲスペクトルを図４に示す。実施例３ＨＰＬＣによる分離５０℃に維持し且つアセトニトリル−水３：２（ｖ／ｖ）で１ｍＬ／分の割合で溶離させたＺｏｒｂａｘＲｘＣ₈４．６ｍｍ×２５ｃｍカラム上でのＨＰＬＣ分離の際の次の通りの挙動によって、本発明の化合物をキャラクタリゼーションした。化合物１（ａ）：ｋ′＝４．１５、化合物１（ｂ）：ｋ′＝３．３０、化合物１（ｃ）：ｋ′＝２．３０、化合物１（ｄ）：ｋ′＝２．１０このＨＰＬＣ系を使用する分析を、波長２２０ｎｍにおけるＨＰＬＣピークの吸光度を、（重量測定した）既知量の純粋基準の注入によって生じさせられるそれと比較することによって、粗抽出物又は他の混合物に含まれる上記化合物を定量するために使用することが可能である。実施例４別の精製手順単純化した精製プロセスによって、更により多い量の粗抽出物の迅速な分画と、式１（ａ）及び式１（ｂ）の化合物のグラム量の調製とが可能になる。最初にエタノール抽出物をメタノール中に１５０ｍＬ当たり２０グラム溶解する。この溶液を水１５０ｍＬで希釈し、１回毎に塩化メチレン１５０ｍＬを使用して塩化メチレンで３回抽出する。プールした塩化メチレン抽出物を蒸発させ、シリカゲル上での反復カラムクロマトグラフィーによって分画を進行させる。第１の段階で塩化メチレン−メタノール９７：３を使用する。こうして得た式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物の混合物を、塩化メチレン−酢酸エチル３：１を溶離剤として使用して新鮮なシリカゲル上のクロマトグラフィーによって分離する。式１（ａ）の化合物の溶離体積は約２溶媒カラム体積から約３．５溶媒カラム体積の範囲内である。式１（ｂ）の化合物の溶離体積は約３溶媒カラム体積から約４．５溶媒カラム体積の範囲内である。最後に、これらの化合物の低溶解度を利用して、クロマトグラフィーによる全分離の後で、式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物を沈殿させることが可能であり、又は、濃縮メタノール溶液から結晶化することが可能である。実施例５Ｔ細胞ＩＬ−２検定ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ，ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）による密度遠心分離と、その後でのノイラミニダーゼ処理ＳＲＢＣでリセットすることによって、健康なドナーからの末梢血液単核細胞を分離した。更に別のＬＳＭ遠心分離の後に、リセットしたＴ細胞のＳＲＢＣを塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）で溶解した。こうして精製したＴ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と１００ｍＭグルタミンと１ｍＭピルビン酸ナトリウムと０．１ｍＭ非必須アミノ酸と１％ｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）とを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に、３×１０⁶個／ｍＬの割合で再縣濁した。細胞縣濁液を直ちに９６穴丸底ミクロ培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の中に２００ｕＬ／穴の割合で配分した。様々な希釈度の試験化合物を２５ｕＬ／穴の割合で三つ組の穴の中に加え、３７℃で１５分間インキュベートした。イオノマイシン（１２５ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８（１００ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＰＭＡ（イオノマイシンと共に添加する場合には１ｎｇ／ｍＬ、又は、抗ＣＤ２８と共に添加する場合には５ｎｇ／ｍＬ）を、適切な穴に加えた。その後で、５％ＣＯ₂−９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃で培養プレートを２４時間インキュベートした。上清液を取り除き、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ．ＭＡ）でＩＬ−２に関して検定した。培養穴の平均ＯＤとＩＬ−２単位を算出し、その結果をＴ細胞のＩＬ−２生産を５０％阻害するのに必要な化合物濃度として表した。式１（ａ）、式１（ｂ）、式１（ｃ）、及び、式１（ｄ）の化合物の全てが、１０ｕＭ以下の濃度でＩＬ −２分泌を阻止する。即ち、これらの化合物は全て免疫抑制薬である。上記の詳細な説明は、単に例示を目的とするだけの上記実施例と共に、本発明の原理を明らかにするが、本発明の実施は、下記のクレームとその同等物の範囲内に含まれる本明細書で説明した手順とプロトコルの任意の変形、適合化、変更、削除、又は、追加の全てを含むことを理解されたい。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月１５日【補正内容】これらの化合物は、人間を含む動物の免疫抑制薬として有効である。ブラジル産植物のＬｏｐｈａｎｔｈｅｒａｌａｃｔｅｓｃｅｎｓから得られる、式１（ａ）の化合物に類似した化合物が公知であるが、この化合物の生物学的活性に関しては本開示の以前には全く報告されていない。本明細書では「式１（ｂ）の化合物」と呼ぶ新規のΔ−１１，１２類似体と、式１（ｃ）及び式１（ｄ）で表す化合物も、現在まで開示されたことがない。これら４つの化合物全てを、スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根のエタノール抽出物から単離した。本発明は、更に、Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａの根から上記化合物を得るためのプロセスにも係わる。このプロセスを下記実施例で例示する。本発明の化合物は、免疫抑制薬に必要とされる調剤特性、即ち、Ｔ細胞増殖を抑制する能力を有する。これらの化合物の調剤上活性な結晶形態、水和物、溶媒和、及び、他の形態の全てが、本発明の範囲内に含まれる。免疫抑制をもたらす本発明の新規の方法では、本発明の化合物又はその調剤上許容可能な塩の１つ又は全てを、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇから約２０ｍｇの範囲内の量で、好ましくは、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約１０ｍｇの範囲内の量で、単一用量として、又は、２分割量から４分割量として、又は、連続静脈内注入によって投与する。本発明の化合物を単独の活性成分として投与することも、必要に応じて、他の免疫抑制薬又は他の治療と組み合わせて投与することも可能である。上記用量の本発明の化合物又はその調剤上許容可能な塩を、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、舌下投与、静脈内投与することが可能である。本発明の化合物を、例えば錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューイングガム等の形で経口投与することが好ましい。この製剤を投与するための別の好ましい手段は、例えば使用前に塩類液で希釈する１０％クレモホル及び５％ジメチルスルホキシド中溶液の形の、静脈内溶液又は懸濁液の形である。Ｃを塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）で溶解した。こうして精製したＴ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と１００ｍＭグルタミンと１ｍＭピルビン酸ナトリウムと０．１ｍＭ非必須アミノ酸と１％ｐｅｎｎ− ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）とを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に、３Ｘ１０⁶個／ｍＬの割合で再縣濁した。細胞縣濁液を直ちに９６穴丸底ミクロ培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の中に２００μＬ／穴の割合で配分した。様々な希釈度の試験化合物を２５Ｌ／穴の割合で三つ組の穴の中に加え、３７℃で１５分間インキュベートした。イオノマイシン（１２５ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８（１００ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＰＭＡ（イオノマイシンと共に添加する場合には１ｎｇ／ｍＬ、又は、抗ＣＤ２８と共に添加する場合には５ｎｇ／ｍＬ）を、適切な穴に加えた。その後で、５％ＣＯ₂−９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃ で培養プレートを２４時間インキュベートした。上清液を取り除き、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ．ＭＡ）でＩＬ−２に関して検定した。培養穴の平均ＯＤとＩＬ−２単位を算出し、その結果をＴ細胞のＩＬ−２生産を５０％阻害するのに必要な化合物濃度として表した。式１（ａ）、式１（ｂ）、式１（ｃ）、及び、式１（ｄ）の化合物の全てが、１０μＭ以下の濃度でＩＬ− ２分泌を阻止する。即ち、これらの化合物は全て免疫抑制薬である。上記の詳細な説明は、単に例示を目的とするだけの上記実施例と共に、本発明の原理を明らかにするが、本発明の実施は、下記のクレームとその同等物の範囲内に含まれる本明細書で説明した手順とプロトコルの任意の変形、適合化、変更、削除、又は、追加の全てを含むことを理解されたい。請求の範囲１．次式１の化合物、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形：（前式中で、ＲがＨである時に「----」が単結合又は二重結合であり、ＲがＡｃである時に「----」が二重結合である）。２．免疫系の抑制を必要とするヒト以外の動物に対して、免疫抑制量の次式１（ａ）の化合物、次式１（ｂ）の化合物、次式１（ｃ）の化合物、又は、次式１（ｄ）の化合物から選択する化合物、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形を投与することを含む、前記動物において免疫系を抑制するための方法：３．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：４．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：５．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：６．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：７．調剤上許容可能な坦体と治療有効量の請求項１に記載の化合物又はその調剤土許容可能な結晶形もしくは水和物を含む医薬製剤。８．更に、アザチオプリン、ブレキナールナトリウム、デオキシスペルグアリン、ミザリビン、マイコフェノール酸モルホリノエステル、シクロスポリン、ＦＫ−５０６、及び、ラパマイシンから成るグループから選択される抗増殖剤も含む請求項１に記載の化合物の医薬製剤。９．抗増殖剤の同時投与を含む請求項２に記載の方法。１０．器官又は組織の移植に対する抵抗性又は移植拒絶を防止又は治療することを必要とするヒト以外の動物に対して請求項１に記載の化合物又はその調剤土許容可能な結晶形もしくは水和物を投与することを含む、前記移植抵抗性又は前記移植拒絶を防止又は治療するための方法。１１．請求項１に記載の化合物を投与することを含む、ヒト以外の動物の対宿主性移植片病、自己免疫性疾患、炎症性疾患、増殖性皮膚疾患、高増殖性皮膚疾患、免疫仲介疾患の皮膚形質発現、男性又は女性パターン脱毛症、老人性脱毛症、呼吸性疾患、虚血に関連した肝損傷、眼病、粘膜又は血管の炎症、熱傷に関連した腸管病変、サイトメガロウイルス感染症、腎臓病、骨疾患、循環器系疾患、歯周病、ネフローゼ症候群、溶血性尿毒症症候群、筋ジストロフィー、腸管炎症／アレルギー、及び、肝臓病を防止又は治療するための方法。１２．スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）から請求項１に記載の化合物を抽出するための方法であって、（ａ）スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根をエタノールによって抽出する段階、及び、（ｂ）ヘキサンと９０％水性メタノールとの混合物で前記段階（ａ）のエタノール抽出物のアリコートを抽出する段階を含む前記方法。１３．スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根のエタノール抽出物から請求項１に記載の化合物を分離するための方法であって、（ａ）スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根をエタノールによって抽出する段階、（ｂ）ヘキサンと９０％水性メタノールとの混合物によって前記段階（ａ）のエタノール抽出物のアリコートを抽出する段階（ｃ）メタノール相を取り除き、更に、前記メタノール相を真空下で濃縮して水性縣濁液を生じさせる段階、（ｄ）前記段階（ｃ）の前記水性縣濁液を水で希釈し、水性溶液を生じさせる段階、（ｅ）塩化メチレンで前記段階（ｄ）の前記水性溶液を抽出する段階、（ｆ）塩化メチレン中の酢酸エチルの段階勾配を溶離に使用してシリカゲル上で前記段階（ｅ）の塩化メチレン抽出物をクロマトグラフィー分離し、ここで溶離が、１００％塩化メチレンを使用し、その後で、少なくとも３：２、１：１、及び、１：２の塩化メチレン−酢酸エチル混合物を含む、塩化メチレン−酢酸エチル９：１混合物から１００％酢酸エチルまでの塩化メチレン−酢酸エチル混合物の組合せを使用することを含む段階、（ｇ）式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物を含む、約３：２の塩化メチレン−酢酸エチル比率を有する画分を収集する段階、（ｈ）前記段階（ｇ）の前記画分から、式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物をＨＰＬＣによって分離する段階、（ｉ）式１（ｃ）の化合物と式１（ｄ）の化合物を含む、約１：１と約１：２の塩化メチレン−酢酸エチル比率を有する画分を収集する段階、及び、（ｊ）式１（ｃ）の化合物と式１（ｄ）の化合物をＨＰＬＣによって分離する段階を含む前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．次式１の化合物、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形：（前式中で、ＲがＨである時に「−−−」が単結合又は二重結合であり、ＲがＡｃである時に「−−−」が二重結合である）。２．免疫系の抑制を必要とするヒト以外の動物に対して、免疫抑制量の次式１（ａ）の化合物、次式１（ｂ）の化合物、次式１（ｃ）の化合物、又は、次式１（ｄ）の化合物から選択する化合物、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形を投与することを含む、前記動物において免疫系を抑制するための方法：３．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：４．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：５．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：６．前記化合物が次式を有するか、又は、その調剤上許容可能な塩、水和物、もしくは、結晶形である請求項２に記載の方法：７．調剤上許容可能な坦体と治療有効量の請求項２に記載の化合物又はその調剤上許容可能な結晶形もしくは水和物とを含む医薬製剤。８．更に、アザチオプリン、ブレキナールナトリウム、デオキシスペルグアリン、ミザリビン、マイコフェノール酸モルホリノエステル、シクロスポリン、ＦＫ−５０６、及び、ラパマイシンから成るグループから選択される抗増殖剤も含む請求項５に記載の医薬製剤。９．抗増殖剤の同時投与を含む請求項２に記載の方法。１０．器官又は組織の移植に対する抵抗性又は移植拒絶を防止又は治療することを必要とするヒト以外の動物に対して請求項２に記載の化合物を投与することを含む、前記移植に対する抵抗性又は前記移植拒絶を防止又は治療するための方法。１１．請求項１に記載の化合物を投与することを含む、ヒト以外の動物の対宿主性移植片病、自己免疫性疾患、炎症性疾患、増殖性皮膚疾患、高増殖性皮膚疾患、免疫仲介疾患の皮膚形質発現、男性又は女性パターン脱毛症、老人性脱毛症、呼吸性疾患、虚血に関連した肝損傷、眼病、粘膜又は血管の炎症、熱傷に関連した腸管病変、サイトメガロウイルス感染症、腎臓病、骨疾患、循環器系疾患、歯周病、ネフローゼ症候群、溶血性尿毒症症候群、筋ジストロフィー、腸管炎症／アレルギー、及び、肝臓病を防止又は治療するための方法。１２．スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）から請求項２に記載の化合物を抽出するための方法であって、（ａ）スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根をエタノールによって抽出する段階、及び、（ｂ）ヘキサンと９０％水性メタノールとの混合物で前記段階（ａ）のエタノール抽出物のアリコートを抽出する段階を含む前記方法。１３．スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根のエタノール抽出物から請求項２に記載の化合物を分離するための方法であって、（ａ）スパケアコレア（Ｓｐａｃｈｅａｃｏｒｒｅａ）の根をエタノールによって抽出する段階、（ｂ）ヘキサンと９０％水性メタノールとの混合物によって前記段階（ａ）のエタノール抽出物のアリコートを抽出する段階（ｃ）メタノール相を取り除き、更に、前記メタノール相を真空下で濃縮して水性縣濁液を生じさせる段階、（ｄ）前記段階（ｃ）の前記水性縣濁液を水で希釈し、水性溶液を生じさせる段階、（ｅ）塩化メチレンで前記段階（ｄ）の前記水性溶液を抽出する段階、（ｆ）塩化メチレン中の酢酸エチルの段階勾配を溶離に使用してシリカゲル上で前記段階（ｅ）の塩化メチレン抽出物をクロマトグラフィー分離し、ここで溶離が、１００％塩化メチレンを使用し、その後で、少なくとも３：２、１：１、及び、１：２の塩化メチレン−酢酸エチル混合物を含む、塩化メチレン−酢酸エチル９：１混合物から１００％酢酸エチルまでの塩化メチレン−酢酸エチル混合物の組合せを使用することを含む段階、（ｇ）式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物を含む、約３：２の塩化メチレン−酢酸エチル比率を有する画分を収集する段階、（ｈ）前記段階（ｇ）の前記画分から、式１（ａ）の化合物と式１（ｂ）の化合物をＨＰＬＣによって分解する段階、（ｉ）式１（ｃ）の化合物と式１（ｄ）の化合物を含む、約１：１と約１：２の塩化メチレン−酢酸エチル比率を有する画分を収集する段階、及び、（ｊ）式１（ｃ）の化合物と式１（ｄ）の化合物をＨＰＬＣによって分離する段階を含む前記方法。