JPH11507914A

JPH11507914A - Ｍｈｃ−ペプチド複合体の安定な処方物

Info

Publication number: JPH11507914A
Application number: JP9501969A
Authority: JP
Inventors: ナグ，ビシュワジット; エル．ウィンケルヘイク，ジェフリー
Original assignee: アナージェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-07-13
Also published as: WO1996040194A1; US20030118594A1; CA2223605A1; EP0855914A1; KR19990022639A; AU6165196A; EP0855914A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、MHC-ペプチド複合体およびアルキルグリコシド界面活性剤を含む安定な薬学的組成物を提供する。この組成物は、自己免疫およびアレルギーのような種々の疾患に関連したＴ細胞媒介免疫応答を阻害するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 MHC-ペプチド複合体の安定な処方物発明の背景本発明は、MHC-ペプチド複合体を含む薬学的組成物の調製および使用に関する。特に、本発明は、増大した溶解性を有する新たな薬学的組成物に関する。主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスII抗原は、ヘテロダイマーの細胞表面糖タンパク質であり、抗原ペプチドをCD4陽性Ｔ細胞に与えることに関与する。自己免疫疾患、アレルギーなどのような多くの免疫病理に、特定のMHC対立遺伝子が関連していることが知られている。30以上の自己免疫疾患が知られており、それらには、例えば、慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、全身性エリテマトーデス(SLE)、インシュリン依存性真性糖尿病(IDDM)、および多発性硬化症(MS)が含まれる。アレルギー状態の例には、腹腔疾患およびクローン病のような食物過敏症、ならびにブタクサ、ダストマイト(dust mite)、ネコ、蜜蜂毒、および花粉に対するアレルギー応答が含まれる。特定のMHC対立遺伝子と種々の自己免疫疾患とアレルギーの間の関連は同定されている。さらに、これらの疾患についての自己抗原およびアレルギーは、広範に研究されている。抗原性ペプチドと複合体を形成したMHC分子を用いて、所望でないＴ細胞媒介免疫応答を担う免疫系のこれらの局面を同定および阻害するための方法は、以下に記載されている。例えば、米国特許第5,130,297号、同第5,194,425号、および同第5,260,422号を参照のこと。この複合体は、（１）MHCでコードされた糖タンパク質の有効部分；および（２）処置されるべき疾患状態に関連する抗原のフラグメントを表現するペプチド（例えば、自己抗原性ペプチド）、を含む。これらの複合体は、Ｔ細胞レセプターに結合し、そして標的Ｔリンパ球に非応答性を生じ、その結果その疾患を改善させることが示されている。さらに、この複合体は、一般的には毒素または標識であるエフェクター成分を含み得る。このエフェクター部分は、MHCにコードされた糖タンパク質または抗原性ペプチドのいずれかに結合し得る。多くの場合、複合体のMHC成分は、MHC-ペプチド複合体の水溶液中での凝集の原因となる疎水性領域(例えば、膜貫通領域)を含む。膜糖タンパク質を含むトランスメンブランの薬物開発のための可溶化は、種々の臨床的適用のために解決されるべき挑戦的な問題として未だに残る。FDAによって承認されるかまたは試験中であるかのいずれかである２つの一般的に用いられる静脈内注射可能な界面活性剤は、SDSおよびポリオキシエチレン(Tween-20またはTween-80)である。SDSは変性作用を有するカチオン界面活性剤であるのに対し、Tween-20またはTween-80 はラウリン酸側鎖またはオレイン酸側鎖を含む非イオン性ポリオキシエチレンである。MHC-ペプチド複合体を含む薬学的組成物を調製するための改善された方法は、それらの活性を改善するのに有用である。本発明は、これらおよび他の必要性を提示する。発明の要旨本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、治療有効量のMHC-ペプチド複合体( 予め選択された抗原性ペプチドおよび単離されたMHCクラスII成分からなる)およびアルキルグリコシド界面活性剤を含む薬学的組成物を提供する。アルキルグリコシド界面活性剤は、約６と約14個の間の炭素原子のアルキル鎖、およびドデシルβ-Dマルトシド(maltoside)(DM)のような二糖類を含み得る。薬学的に受容可能なキャリアは、通常はリン酸緩衝化食塩水のような水性のキャリアである。MHC-ペプチド複合体は、代表的には長さが約８と20アミノ酸の間である予め選択された抗原性ペプチドからなる。抗原性ペプチドは、単離されたMH C成分、特にHLA-DR2のようなMHCクラスII成分と複合体を形成し得る。MHC-ペプチド複合体の１例は、DR2-MBP(83-102)Y⁸³である。薬学的組成物の代表的な処方物において、MHC-ペプチド複合体は、約0.001重量％と約５重量％の間の濃度で、pH7.5から8.5に調節された0.05％-nドデシルβ-Ｄ-マルトシド、0.008Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、0.002Ｍ一塩基性リン酸ナトリウム１水和物、0 .15Ｍ塩化ナトリウムを水中に含む希釈物中に存在する。別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、治療有効量のMH C-ペプチド複合体（例えば、予め選択された抗原性ペプチドおよび単離されたMH CクラスII成分）、およびアルキルグリコシド界面活性剤（例えば、DM）を含む薬学的組成物を（例えば、静脈内に）投与することにより、哺乳動物中のＴ細胞媒介免疫応答を阻害する方法を提供する。この方法は、例えば多発性硬化症のような自己免疫疾患に関連するＴ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有用である。例えば、DR2-MBP(83-102)Y⁸³およびドデシルβ-Ｄマルトシド（約0.01重量％から0 .2重量％）を含む薬学的組成物は、多発性硬化症を診断または処置するために患者に投与され得る。図面の簡単な説明図１は、MHC-ペプチド複合体を可溶化する能力を試験された界面活性剤の構造および物理的特性を示す。図２は、３つの非イオン性界面活性剤（ドデシルβ−Ｄマルトシド、オクチルグルコシド、およびTween-80）で調製されたMHC分子(HLA-DR2)のサイズ排除HPLC 分析の結果を示す。図３は、３つの非イオン性界面活性剤（ドデシルβ-Ｄマルトシド、オクチルグルコシドおよびTween-80）で調製されたMHC分子(HLA-DR2)のSDS-PAGE分析の結果を示す。図４は、種々の濃度のドデシルβ-Ｄマルトシドで調製されたMHC分子(HLA-DR2 )のサイズ排除HPLC分析の結果を示す。図５は、種々の濃度のドデシルβ-Ｄマルトシドで調製されたMHC分子(HLA-DR2 )のSDS-PAGE分析の結果を示す。図６は、ドデシルβ-Ｄマルトシドを含み、56日間まで貯蔵された処方物中のM HC-ペプチド複合体、HLA-DR2およびMBP(83-102)Y⁸³のサイズ排除HPLC分析の結果を示す。図７は、ドデシルβ-Ｄマルトシド、オクチルグルコシド、およびTween80中の MHC-ペプチド複合体に接触したＴ細胞中のγIFN生産を示す。好ましい実施態様の説明本発明は、MHC-ペプチド複合体を含む安定な薬学的組成物を調製するための方法を提供する。本発明の薬学的組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性応答、および移植拒絶反応のような免疫学的障害の処置において、Ｔ細胞の機能を調節するために使用され得る。自己免疫のような望ましくない免疫応答を担う免疫系のこのような局面を同定および阻害するために有用な複合体および方法は、以下に記載されている。米国特許第5,130,297号、同第5,194,425号、同第5,284,935号、および同第5,260,422 号を参照のこと。これらの複合体および方法は、MHCによりコードされる糖タンパク質に関連して特定の抗原を認識するＴヘルパー細胞を標的化するために設計される。この複合体は、効果的にＴ細胞レセプターに結合し、そして標的Ｔ細胞リンパ球および免疫系の他の細胞において非応答性をもたらす。本発明において用いられる複合体は、少なくとも２つの成分を含む：（１）自己抗原または処置されるべき疾患状態に関連する他の抗原性配列のフラグメントを代表するペプチド（すなわち、自己抗原性ペプチド）；および（２）抗原提示に関与するMHCでコードされた糖タンパク質の有効部分。MHC糖タンパク質の有効部分は、抗原結合部位を含む部分および適切なＴ細胞レセプターによるMHC-ペプチド複合体の認識に必要な領域である。MHC成分は、クラスＩ分子またはクラスI I分子のいずれかであり得る。ペプチド抗原とMHCタンパク質の間の抗原結合部位との結合は、共有結合または非共有結合であり得る。さらに、MHC-ペプチド複合体は、一般的には毒素または標識であるエフェクター成分を含み得る。このエフェクター部分は、MHCにコードされた糖タンパク質または抗原性ペプチドのいずれかに結合し得る。エフェクター成分を含む複合体は、米国特許第5,194,425号（前出）に開示および請求される。 MHC-ペプチド複合体の各成分は、以下に詳細に記載される。MHC から誘導された成分：通常、MHC成分は、天然の抗原を提示する細胞（例えば、Ｂ細胞、樹上突起細胞、またはマクロファージ）またはこのような細胞由来の不死化された細胞株から単離される。あるいは、MHC成分は組換え的に産生され得る。本明細書において使用される用語「単離されたMHC成分」は、MHC糖タンパク質または天然の状態以外にある（すなわち、通常MHCを発現する細胞の細胞膜に結合していない）MHC 糖タンパク質の有効部分（すなわち、抗原結合部位または適切なＴ細胞レセプターによる認識に必要な部位および配列を含む部分）をいう。以下に詳細に記載されるように、MHC成分は適切な細胞供給源から可溶化され得るか、または組換え的に産生され得る。ヒトMHC分子にとって、ヒトリンパ芽球種細胞は、MHC成分の供給源として特に好ましい。 MHC糖タンパク質は、多様な細胞から、例えば、パパインを用いる処置、３M K Cl用いる処置、および非イオン性界面活性剤（例えば、NP-40、TWEEN 80など）を用いる処置による可溶化を含む種々の技術を用いて単離されてきた。次いで、 MHC分子は、所望のMHC分子に対して産生した抗体を含むカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。本発明は、特定の非イオン性界面活性剤、アルキルグリコシドが、単離された MHC-ペプチド複合体の改善された溶解性および活性を提供するという発見に一部基づいている。本明細書中で用いられるアルキルグリコシドは、単糖類または二糖類に結合した脂肪族の炭化水素鎖からなる両親媒性化合物のクラスをいう。これらの化合物は、温和で、非イオン性の界面活性剤であり、そして非毒性のアルコールおよび糖に代謝される。アルキルグリコシドの疎水性は、アルキル鎖の長さが増加するにつれ増加する。本発明の組成物中で使用されるアルキルグリコシドは、約４個と約24個の間の、代表的には約６個と約15個の間の、通常は約８個と約12個の間の炭素原子からなる飽和および不飽和の脂肪族鎖を含む。炭化水素部分は、任意の数の単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、フコース、フルクトースなど）からなり得る。二糖類は、スクロース、マルトースなどを含む。通常、二糖類を含む化合物は、単糖類を含む化合物よりも溶解性である。炭化水素部分の糖はまた、多様に置換され得る。例えば、炭化水素部分は、グルコサミン、ガラクトサミンなどのアミノ糖を含み得る。多くのアルキルグリコシドが市販されている。それらには、テトラデシルマルトシド、トリデシルマルトシド、ドデシルマルトシド、デシルマルトシド、オクチルマルトシド、ドデシルスクロース、デシルスクロース、ヘプチルグルコシド、ノニルグルコシド、およびヘキシグルコシドが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な市販の化合物には、例えば、デコニル-Ｎ-メチルグルカミド、ヘプタノイル-Ｎ-メチルグルカミド、ノナノイル-Ｎ-メチルグルカミド、およびヘプチルチオグルコシドが含まれる。好ましいアルキルグリコシドは、ドデシル β-Ｄマルトシド(DM)である。以下に示すように、DMを含む組成物中で調製されたMHC-ペプチド複合体は、増大した溶解性および活性を有する。アルキルグリコシドは、市販の供給源から容易に入手可能であるが、当業者に公知の方法に従っても合成され得る。糖のアノマー中心に結合した炭化水素鎖を有するDMのような化合物は、弱い酸性条件下で親糖を炭化水素アルコールで反応させることにより調製され得、付加した炭化水素鎖を有する所望の生成物を提供する。あるいは、アノマー炭素でのヒドロキシル基の官能性は、例えば、ドデシルヨウ化物のようなアルキルハライドでアルキル化され得る。これらのアルキル化は、いくつかの場合には、競合反応を防止するために残りのヒドロキシル基の官能性に関して保護基の使用を必要とする。アノマーのヒドロキシル基のアルキル化の後、保護基が除去され得る。本発明で用いられる保護基は、当業者に公知であり、そしてGreeneら、Protective Group In Organic Chemistry，第２版，J ohn Wiley&Sons，New York，NY．1991に記載される任意の基であり得る。アノマーのヒドロキシル基に結合した脂肪族鎖を有する炭化水素に加えて、この鎖は残りの任意の炭素原子においてヒドロキシル基に結合され得る。代表的には、炭化水素ヒドロキシル基の選択的アルキル化は、残りのヒドロキシ中心の保護を包含する。これはまた、所望の反応中心の最初の保護、その後の、残りの中心の引き続く保護、および目的の反応中心に結合した保護基の選択的除去を包含する。当業者はまた、アルキルグリコシドを調製するために使用される炭化水素鎖には、Ｃ₈〜Ｃ₂₄カルボン酸から誘導されたアルキル基および対応するアシル基の両方が含まれる。長鎖アシル基を有する糖部分の選択された部位のアシル化は、上記の方法と類似の保護/脱保護ストラテジーを用いて行われ得る。反応性アシル基は、代表的にはアシルハライドまたは他の活性化された脂肪酸エステル（例えば、パルミトイック(palmitoic)酸パラニトロフェニルエステル）である。さらに、アルキル基およびアシル基は、１つ以上の不飽和部位を有し得る。適切な基の例には、パルミトイル、ステアロイル、オレオイル、ミリストイル、カプロイル、デシル、ドデシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、ウンデシル、およびテトラデシルが含まれる。本発明の複合体において用いられる特定のMHC分子は、処置されるべき疾患に依存する。多くの自己免疫疾患が特定のMHC型に相関する。どの対立遺伝子が、およびそれに続いてどのMHCでコードされたポリペプチドが自己免疫疾患に関連しているかを同定する方法は、当該分野において公知である。例えば、インシュリン依存性真性糖尿病に対する感受性は、DR3ハプロタイプおよびDR4ハプロタイプに関連する。ハプロタイプDR2W2は、重症筋無力症に関連する。いくつかのクラスII血清型(DR4(Dw4)、DR4(Dw14)およびDR1を含む）は、慢性関節リウマチに関連してきた。DR2およびDR3の個体は、一般の人々よりも全身性エリテマトーデスを発生する危険性が高い。DR2ハプロタイプは、多発性硬化症に関連する。抗原性ペプチド： MHC糖タンパク質による抗原提示細胞(APCs)の表面への抗原の提示は、より小さいペプチドユニットへの抗原性タンパク質の加水分解に引き続いて起こると考えられている。抗原性タンパク質中でのこれらのより小さなセグメントの位置は、経験的に決定され得る。これらのセグメントは、約８と約18残基長の間であり、アグリトープ（MHC分子によって認識される）およびエピトープ（Ｔヘルパー細胞上のＴ細胞レセプターによって認識される）の両方を含むと考えられている。しかし、MHC分子に結合し得るペプチドの長さは変化し得る。従って、より長いペプチド（例えば、100残基まで）もまた、複合体中で使用され得る。通常、ペプチドは、約50残基長よりも短く、好ましくは30残基長よりも短く、最も好ましくは、約８と20残基長の間である。多くの自己免疫疾患および自己免疫アレルギーのための抗原性タンパク質または抗原性組織が公知である。標準的な手順を用いて、当業者は、多くの免疫障害に関連する抗原の関連する抗原性ペプチドを容易に決定し得る。例えば、中枢神経系のミエリン鞘の破壊をもたらす多発性硬化症において、ミエリン基本タンパク質(MBP)(すなわち、ミエリンの主要タンパク質成分)およびプロテオリピドタンパク質(PLP)は、主要な自己抗原であることが知られている。MSの処置のための自己抗原ペプチドは、MBPのアミノ酸84-102および148-162を含む。以下の実施例は、DR2およびMBP 83-102（ここで、残基83は、チロシンによって置換されている）を含むMSの処置のための好ましい複合体を記載する。この抗原ペプチドは、MBP(83-102)Y⁸³と命名されている。MBP(83-102)Y⁸³の式は、Tyr-Asp-Pro-Val- Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro-Pro-Serである。好ましい実施態様において、チロシンは、Ｎ-アセチルチロシンである。全身性エリテマトーデスは、複雑な総体的症状を有し、赤血球に対する自己免疫応答から生じることが知られている。この疾患の抗原性エフェクターであるペプチドは、赤血球表面上のタンパク質に見出される。慢性炎症疾患である慢性関節リウマチ(RA)は、滑液中に見出されるタンパク質に対する免疫応答から生じる。インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)は、インスリンの分泌を担うランゲルハンス島内のβ細胞に対する自己免疫発作から生じる。島細胞表面抗原およびインスリンに循環している抗体は、IDDMに先行することが知られている。IDDMにおける免疫応答の誘発において決定的なペプチドは、インスリン配列およびβ細胞膜表面タンパク質の一部であると考えられている。一旦決定されると、関連の抗原性ペプチドサブユニットは、ペプチド合成のための標準的な自動化された方法を用いて容易に合成され得、それらは、比較的長さが短い。あるいは、単離されたまたは合成のDNA配列を用いて組み換え的に作製され得るが、これはこの長さのペプチドについて最も効率的なアプローチではない。エフェクター成分：さらに、本発明の複合体は、問題のペプチドに対する免疫応答を破壊するように設計され得る。この場台、MHC-ペプチド複合体は、エフェクター成分を含む。 MHCペプチド分子のエフェクター部分は、例えば、毒素、化学療法的薬剤、細胞傷害性Ｔ細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、または「硬」放射線（例えば、 β放射線）を放射する放射性同位元素であり得る。多くのタンパク質毒素が当該分野において周知であり、そして例えば、リシン、ジフテリア、ゲロニン(gelon in)、シュードモナス毒素、およびアブリンを含む。化学療法的薬剤には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、サイトトキシン、およびアンチセンスRNAが含まれるが、これらに限定されない。さらに、抗生物質もまた、エフェクター成分として用いられ得る。抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞表面分子に単離されており、従ってこれらは、毒素として作動し得る。さらに、イットリウム 90、リン32、鉛212、ヨウ素131、パラジウム109のような放射性同位元素が、用いられ得る。放射された放射線は、標的Ｔ細胞の破壊をもたらす。いくつかの場合において、エフェクター成分の活性な部分が、リポソームまたはデキストランキャリアのような送達系に包括される；これらの場合、活性な成分またはキャリアのいずれかが複合体に結合され得る。エフェクター分子が、標識であると意図される場合、テクネチウム99またはインジウム111のようなガンマ放射放射性同位元素が用いられ得る。さらに、例えば、フルオレセインを用いた蛍光標識のような他の型の標識。エフェクター成分は、MHC糖タンパク質、またはその性質が適切であれば、ペプチド部分に結合され得る。ヨウ素131または他の放射性の標識は、例えば、しばしばペプチド決定基配列に含まれ得る。エフェクター成分を含む複合体は、米国特許第5,194,425号（前出）に開示され、そして請求される。MHC- ペプチド複合体の形成：一旦MHC成分が単離され、そして抗原性ペプチドが合成されると、これら２つの要素は、米国特許第5,130,297号（前出）に記載されるように、当該分野で公知の手段によって、MHC-ペプチド複合体を形成するために互いに会合し得る。抗原性ペプチドは、MHCタンパク質のポケット部分に、例えば、２つの成分を混合することによって非共有結合的に会合され得る。過剰のペプチドは、任意の多くの標準的な手順（例えば、限外濾過または透析）により除去され得る。ペプチドはまた、例えば、光親和性標識による標準的な手順を用いて共有結合され得る( 例えば、Hallら、Biochemistry 24:5702-5711(1985)を参照のこと)。MHC- ペプチド複合体の処方および投与：本発明の複合体の投与は、通常全身性であり、そして当業者に公知の標準的な方法により行われ得る。投与の種々の形態のための標準的な処方物は、Remingto n's Pharmaceutical Sciences,(Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985))に見出される。本発明の複合体および薬学的に有効なキャリアを含む種々の薬学的組成物が調製され得る。 MHC-ペプチド複合体を含む薬学的組成物の調製において、それらの薬物動態学および体内分布を変化させるために複合体を改変することが頻繁に望ましい。薬物動態学の一般的な議論については、Remington's Pharmaceutical Sciences、前出、第37〜39章を参照のこと。薬物動態学および体内分布を変化させるための多くの方法は、当業者に公知である。薬学的組成物は、予防および/または治療的処置のために、非経口投与、局所投与、経口投与、または局部投与（例えばエアロゾルによるか、もしくは経皮による）が意図される。薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位容量形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位用量形態には、粉末、錠剤、丸剤、およびカプセルが含まれる。好ましくは、薬学的組成物は、静脈内に投与される。従って、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解または懸濁されたMHC-ペプチド複合体の溶液を含む静脈内投与のための組成物が提供される。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのpH調節剤および緩衝剤、等張性調節薬剤、湿潤剤など）を含み得る。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化された水、0.4％生理食塩水、PBSなど）が用いられ得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術（通常は、濾過滅菌）により滅菌され得る。得られた水溶液は、凍結乾燥されたか、またはされ得た状態で、パッケージ化され得る。凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水溶液と混合され得る。複合体の濃度は、大きく変化し得る。すなわち、約0.05重量％未満（通常約１重量％または少なくとも約１重量％）から、10重量％から30重量％ほどまで、そして主に液体容量、粘度などによって、選択された特定の投与の様式に従い選択される。静脈内投与のための好ましい濃度は、適切な水性のキャリア中で約0.02 ％から約0.1％またはそれ以上である。好ましい処方物は、水性キャリアおよび非イオン性界面活性剤、好ましくはアルキルグリコシドを含む。アルキルグリコシドは、好ましくはその臨界ミセル濃度(cmc)を超える濃度において存在する。好ましいアルキルグリコシドは、DM(SA F(Sigma/Aldrich/Fluga)Bulk Chemicals，3050 Spreuce Street，St．Louis，M0 63103から入手可能である）である。代表的には、DMは、約0.01重量％と約0.1 重量％の間の濃度、好ましくは約0.02％と約0.05％の間の濃度で存在する。特に好ましい処方物は、MHC-ペプチド複合体を以下の希釈物中に含む： n-ドデシルβ-Ｄ-マルトシド 0.05％ 0.5mg 二塩基性リン酸ナトリウム７水和物 0.008Ｍ 2.27mg 一塩基性リン酸ナトリウム１水和物 0.002Ｍ 0.25mg 塩化ナトリウム 0.15Ｍ 8.7mg 注射のための水 1.0ml 希釈物は、pHが約7.5と約8.5の間に調節され、そして透明で無色の液体である。固体組成物については、従来の非毒性の固体キャリアが用いられ得、それらには、例えば、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム(talcum)、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与については、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、前記に列挙したキャリアのような任意の通常使用される賦形剤（一般に、有効成分の10％〜95％）を組込むことにより形成される。エアロゾル投与については、複合体は、好ましくは微細に分割された形態において界面活性剤および噴霧剤と共に供給される。この複合体を含む組成物は、治療的、予防的、または診断的適用のために投与され得る。治療的適用において、組成物は、上記のように、すでに疾患を患っている患者に、治癒するのに充分な量またはその疾患およびその合併症の症状を少なくとも部分的に阻止するのに充分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、その疾患の重篤度ならびに患者の体重および一般的な状態に依存する。これは、代表的には、約0.1μg/kgと約10mg/kgの間、好ましくは約0.2μg/kgから約500μg/kgである。例えば、HLA-DR2/MBP(83-102)Y83複合体を投与するには、その用量は、代表的には約0.2μg/kgから約20μg/kgの間である。平均的な体重の患者については、用量は代表的には約16μgと約2000μgとの間である。組成物を投与するために特に好ましいスケジュールは、１日おきに投与されるゆっくりとした静脈内ボーラス（約0.1ml/秒で約10秒間）によるものである。予防的適用において、本発明の複合体を含む組成物は、特定の疾患に感受性の患者に、またはそうでなければ特定の疾患の危険に曝されている患者に投与される。このような量は、「予防的有効用量」であると定義される。この使用において、正確な量はさらに、患者の健康状態および体重に依存する。用量は、一般的に上記に示した範囲にある。診断的適用において、適切な複合体またはそのカクテルを含む組成物は、自己免疫疾患状態を有すると疑われる患者に、疾患に関連した自己反応性Ｔ細胞の存在を決定するために投与される。あるいは、特定の治療の効力は、モニターされ得る。これを達成するために十分な量は、「診断的有効用量」であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態などに依存するが、一般に１用量あたり、0.01mgから1000mgの範囲、特に１用量あたり約10mgから約100mg である。この発明は、特定の実施例によって、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示的な目的のために提供され、いかなる様式においても本発明を制限または規定するように意図されない。実施例いくつかの前臨床的研究は、アフィニティー精製されたMHCクラスIIおよび抗原性ペプチドの複合体が、種々の自己免疫疾患の防止および処置のために用いられ得るということを実証した。多くの界面活性剤を、そのヒトHLA-DR2およびMHC -ペプチド複合体を可溶化する能力について研究した。さらに、界面活性剤中に調製された複合体を、活性についてアッセイした。HLA-DR2の可溶化に用いられた種々の界面活性剤の構造的および物理的な特徴の要約を、図１に示す。Pluron ic F-127およびCHAPS界面活性剤が、Ｔ細胞にとって毒性であることを見出し、それ以上を研究しなかった。凝集アッセイ３つの非イオン性界面活性剤(DM、OG、およびTween-80)を試験した。実験を、米国特許第5,130,297号、同第5,194,425号、同第5,260,422号、および同第5,284 ,935号（これらすべてが、本明細書中で参考として援用される）に一般的に記載されるように実施した。簡単に述べれば、HLA-DR2を、National Institute of G eneral Medical Sciencesヒト遺伝子変異体細胞寄託物（repository）(Corinell Institute of Medical Research，NJ）から入手したEBV形質転換リンパ芽球腫細胞[GM03107]から精製した。TritonＸ-100細胞溶解物を調製し、L243が結合したsepharose-4Bカラムに適用し、そして結合したDR2を0.05％ｎ-ドデシルβ-Ｄマルトシド(DM)界面活性剤を含むリン酸緩衝液（pH11.3）で溶出した。画分を20 ％一塩基性リン酸で迅速に中和し、そしてDR2プールを、0.5Ｍ NaClおよび0.05 ％ DM(pH6.0)を含む20mMリン酸緩衝液中でのDEAEイオン交換カラムによって回収した。DEAEカラムからの流出液を、精製したタンパク質溶液を10％三塩基性リン酸ナトリウムにより中和し、180kDメンブレンにより濾過し、そして1mg/mlにまで濃縮した。最終DR2調製物を、13.5％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびその後の銀染色によって特徴付けした。 DR2ペプチド複合体を調製するために、精製DR2を、0.05％DMを含む100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に対して24時間、４℃において透析し、その後MBP(83-102)Y⁸ ³ ペプチドを添加した。反応混合物を37℃において96時間インキュベートし、そして遊離のペプチドをSephacryl S200ゲル濾過によって除去した。結果 0.05％DMを含む処方物は、サイズ排除HPLC分析（図２）により測定した結果、 HLA-DR2ペプチドおよびMBP(83-102)Y⁸³ペプチドの凝集した複合体の最小のレベルを生じた。類似の結果を、３つの界面活性剤中で調製したMHCI-ペプチドの複合体を非還元的条件下でSDS-PAGEで試験したときに観察した。これらの結果に基づいて、DM界面活性剤をさらなる研究（図３）のために選択した。 HLA-DR2を、凝集のレベルに関して完全な可溶化に必要とされる最小の濃度を決定するためにDM界面活性剤の濃度を増加させながら、上記の方法を用いて精製した。図４においてHPLCによって示されるように、DR2凝集のレベルは、DM濃度に依存する。HPLCの結果は、SDS-PAGE分析とよく相関する（図５）。DM濃度を0. 05％未満に減少させると、DR2の凝集レベルが増大した。これらの結果に基づいて、0.05％のDM濃度を、最終処方物のために選択した。DM 中でのMHC-ペプチド複合体の安定性凝集のレベルに関して0.05％DM処方物中で調製されたHLA-DR2およびMBP(83-10 2)Y⁸³の精製した複合体の安定性を、サイズ排除HPLCによって分析した。図６に表した結果は、４℃で８週間貯蔵された複合体が、精製の後、凝集する傾向がなかったことを示す。機能的アッセイ種々の界面活性剤中で調製された複合体の機能的活性を試験するために、Ｔ細胞レセプター(TCR)占有率アッセイを、H.Saimiriウイルス(HSV)形質転換クローン化ヒトＴ細胞(SS8T)（これは、用量依存的様式で、HLA-DR2およびMBP(84-102) ペプチドに制限されている）を用いて行った。DR2およびMBP(83-102)Y⁸³ペプチドの複合体を、DM、OG、およびTween-80界面活性剤中で調製し、そしてTCR占有率の基準としてのγ-IFNレベルの増加についてアッセイした。γIFN産生の増加が、特定のリガンドによるTCR占有の後に起こることが示された。特に、天然のD R2のMBP(83-102)Y⁸³ペプチドとの複合体は、IFN産生の増加を導くことが示された。Ｔ細胞を、２mM Ｌ-グルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清(Hyclone)および50単位/mlヒトIL-2(ABI)で補充されたRPMI 1640培地で37℃で培養した。一日おきに、細胞を新しい培地に移した。複合体調製物を、最終濃度10％v/vでマイクロタイター組織培養プレート中に添加し、そして細胞を、20,000/ウェルの密度で、IL-2を含まない200μl培地に添加した。37℃での48時間のインキュベーション後、上清を各ウェルから回収してγ-IFNのレベルの増加を試験した。 γ-IFNの検出のために、Nunc Maxisorb 96ウェルプレートを、抗ヒトγ-IFNモノクローナル抗体で0.5μg/ウェルの濃度で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを0.1％BSAでブロックし、そして試料を室温で２時間インキュベートした。1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1単位/ml(270単位/ml＝10.75n g/ml)の希釈範囲のヒトγ-IFNの使用によって、標準曲線を作製した。次いで、ウサギ抗ヒトγ-IFNを１μg/mlの濃度で添加し、そしてプレートを室温でさらに２時間インキュベートした。ウェルを十分に洗浄し、そしてHRP結合ヤギ抗ウサギと共に800ng/mlの濃度で37℃で１時間インキュベートし、その後TMBを基質として用いて発色した。反応を２Ｎ硫酸によって５分で停止し、吸光度を450nmで測定した。図７に示すように、DM処方物中で調製した複合体は、SS8Tクローン化Ｔ細胞に曝された場合、有意な増加したγ-IFNレベルを示した。図に示したように、MHC 分子の占有率（すなわち、ペプチドと複合体を形成している分子の割合）は、DM 中で90％、オクチルグルコシド中で40％、そしてTween-80中で76％であった。この実験は、DMが、MHC分子の凝集を減少させることに加えて、ペプチドの結合を促進することにより、MHC分子のロードを増加させること（すなわち、MHC/ペプチド複合体の形成）を示す。安全性および毒性の研究安全性および毒性の研究を、種々の動物モデルにおけるドデシルβ-Ｄ-マルトシドの静脈内投与について行った。表１に要約された結果は、DM界面活性剤の種々の試験用量での静脈内投与が、毒性効果を有しないことを示す。本明細書において示された結果は、0.05％ドデシルβ-Ｄ-マルトシドを含む処方物が、安定な相同のMHC-ペプチドの複合体を提供することを示す。0.05％DM中の処方物は、有害な毒性効果を有さず、そして種々の臨床的研究のためのMHC-ペプチド複合体の静脈内投与において使用され得る。上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定しない。本発明の他の変形は、当業者には容易に明らかであり、そして添付される請求の範囲に包含される。本明細書中で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、本明細書中で参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＰＡ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 51/00 43/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィンケルヘイク，ジェフリーエル. アメリカ合衆国カリフォルニア 94063, レッドウッドシティ，ペノブスコットドライブ 301，アナージェンインコーポレイテッド

Claims

【特許請求の範囲】１．薬学的に受容可能なキャリア、治療有効量のMHC-ペプチド複合体、およびアルキルグリコシド界面活性剤を包含する薬学的組成物であって、該MHC-ペプチド複合体は、予め選択された抗原性ペプチドおよび単離されたMHCクラスII成分からなる薬学的組成物。２．前記抗原性ペプチドが約８と約20との間のアミノ酸間からなる、請求項１に記載の薬学的組成物。３．前記MHC成分がDR2である、請求項１に記載の薬学的組成物。４．前記MHC-ペプチド複合体がDR2-MBP(83-102)Y⁸³である、請求項１に記載の薬学的組成物。５．前記アルキルグリコシド界面活性剤が約６個と約14個との間の炭素原子のアルキル鎖を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。６．前記アルキルグリコシド界面活性剤が二糖類を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。７．前記アルキルグリコシドがドデシルβ-Ｄマルトシドである、請求項１に記載の薬学的組成物。８．前記ドデシルβ-Ｄマルトシドが約0.01重量％と約0.1重量％との間の濃度で存在する、請求項７に記載の薬学的組成物。９．前記MHC-ペプチド複合体が約0.001重量％から約0.2重量％の間の濃度で存在する、請求項１に記載の薬学的組成物。１０．前記水性キャリアがリン酸緩衝化生理食塩水である、請求項１に記載の薬学的組成物。１１．本質的に、0.05％n-ドデシルβ-Ｄ-マルトシド、0.008Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、0.002Ｍ一塩基性リン酸ナトリウム１水和物、0.15Ｍ塩化ナトリウムおよび水ならびに約16と2000μg/mlの間のDR2-MBP(83-102)Y⁸³複合体からなる、請求項１に記載の薬学的組成物。１２．哺乳動物中のＴ細胞媒介免疫応答を阻害する方法であって、該哺乳動物に薬学的に受容可能なキャリア、治療有効量のMHC-ペプチド複合体、およびアルキルグリコシド界面活性剤を含む薬学的組成物を投与する工程を包含し、該MHC-ペプチド複合体は、予め選択された抗原性ペプチドおよび単離されたMHCクラスII 成分からなる方法。１３．前記組成物が静脈内に投与される、請求項１２に記載の方法。１４．前記Ｔ細胞媒介免疫応答が自己免疫疾患に関連する、請求項１２に記載の方法。１５．前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１４に記載の方法。１６．前記MHC-ペプチド複合体がDR2-MBP(83-102)Y⁸³である、請求項１２に記載の方法。１７．前記アルキルグリコシドがドデシルβ-Ｄマルトシドである、請求項１２に記載の方法。１８．前記ドデシルβ-Ｄマルトシドが約0.01重量％と0.1重量％との間の濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。１９．前記治療有効量が体重１キログラムあたり約0.015μgのMHC-ペプチド複合体と体重１キログラムあたり約20μgのMHC-ペプチド複合体の間である、請求項１２に記載の方法。