JPH11508042A - バイオポリマーの分析のためのナノ規模で造られた分離マトリックス、それを製造する方法および使用する方法 - Google Patents

バイオポリマーの分析のためのナノ規模で造られた分離マトリックス、それを製造する方法および使用する方法

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JPH11508042A JP9503252A JP50325297A JPH11508042A JP H11508042 A JPH11508042 A JP H11508042A JP 9503252 A JP9503252 A JP 9503252A JP 50325297 A JP50325297 A JP 50325297A JP H11508042 A JPH11508042 A JP H11508042A
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ケイ． スチーブンス，ジョン
ティー． ラーソン，マリナ
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Abstract

(57)【要約】 サンガージデオキシＤＮＡ塩基配列決定法あるいはマクサム・ギルバート化学的ＤＮＡ塩基配列決定法により生成された単一ストランドＤＮＡはしご型バンドの迅速な高い分解能分離のための固体状ｍｍ−規模〜ｃｍ−規模の装置の形成において有用な分離マトリックスはその第１の主要な表面上に配置された複数の支柱（４）を有して支柱（４）および孔（５）の障害物場を形成する、固体支持体（１）から形成される。該支柱は規則正しいＸ，Ｙ配列で配置されそして１００ｎｍまたはそれ以下、好ましくは１０〜３０ｎｍの距離によりお互いから分離されておりそして場合により通路２に分離されている。分離マトリックスはリソグラフィ技術を用いて、最初に型、好ましくは再使用可能な型を形成することにより製造されることが出来る。その型は障害物場の支柱および孔の所望のパターンの逆でありそして障害物場をキャスチングするために用いられる。次にキャスチングされた障害物場は固体支持体に融合されそして型から分離される。別法として分離マトリックスは選ばれた化学化合物の存在下に特定のそして定量化出来る膨潤を受けるポリマーから造られることが出来る。この場合において、マトリックスは１００ｎｍまたはそれ以下の所望の最終間隔より大きい、支柱間の間隔で、慣用の方法で型上にキャスチングされる。使用のため、膨潤を制御する特定の化学剤で飽和された緩衝剤溶液が加えられて、所望の分離を達成させるために規定された量に支柱を膨潤させる。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオポリマーの分析のためのナノ規模で造られた分離マトリックス、 それを製造する方法および使用する方法発明の背景 この発明はバイオポリマー、特に核酸ポリマーの分析のための分離マトリック スの新規な形式に関する。 バイオポリマーの分析のために分離マトリックスを使用することは十分に確立 されている。例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルおよび他のタイ プのゲルマトリックスが、寸法、重量および分子電荷のような性質に基づいてた んぱく質、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを下位クラスに分離するために 日常的に使用されている。分離された下位クラスのものの分析は、たんぱく質を 同定し且つ特徴づけるために、たんぱく質の突然変異体形を検出し且つ特徴づけ るためにそしてポリヌクレオチドを検出し且つ特徴づけるために使用される。例 えば分離されたポリヌクレオチド断片の分析は核酸配列の大部分の決定のための 方法の基本的部分である。 今日までにこれらの分離のために使用されたゲルマトリックスは有効でありそ して有用な分析結果を生成することが出来るけれども、それらはそれらの不完全 性がないものはない。これらの不完全性は（１）不ぞろいな構造および（２）形 成後に連続水和の必要性を包含する。両方のこれらの不完全性は、ゲルの固有の 変化の結果としてもまたは異なる貯蔵条件から生ずる変化の結果としても、１つ のゲルと他のゲルとの間で得られた結果における予期出来ない変化に導びく可能 性がある。また、ゲル構造物の不ぞろいから生ずる微小−不均質性はゲルの実際 の分別力を減少させる。バイオポリマーの分離において使用される既知のゲルの 別の不完全性はゲル材料自体の種類から生ずる。使用されるそれらの材料は、高 い電界により破壊に付され、かくしてさもなければ一層迅速な分離を得るために 使用されることが出来る電界強度を制限する可能性がある。また、促進剤のよう なゲルまたはゲルの形成に使用する材料は分離されたバイオポリマーの光学的検 出を妨げる可能性がある。 Ｎａｔｕｒｅ３５８：６００−６０２（１９９２）においてＶｏｌｋｍｕｔｈ 等は１００キロベースの程度の長さを有する大きなＤＮＡ分子の分析のために光 学ミクロリソグラフィを用いて造られるＳｉＯ2障害物場(obstacle course)の使 用を提案した。この障害物場は支柱間１μｍの分離を有する支柱の規則正しい配 列からなっている。その配列に供給されたＤＮＡは電界の適用により大きさで分 離されそしてエピ蛍光顕微鏡を用いて検出される。 しかしながら、大部分の診断的ＤＮＡ塩基配列決定用途、診断的ＲＦＬＰ（制 限断片長さ多型現象）法、等におけるＤＮＡ断片の全長は約２０ヌクレオチドと ３００〜４００ヌクレオチドとの間であるので、Ｖｏｌｋｍｕｔｈ等により記載 された障害物場は診断的用途において使用するためには十分に適していない。そ のようなものとして、Ｖｏｌｋｍｕｔｈにより観察されたＤＮＡの長いストラン ドのルーピング(looping)は分離のためのベースとして信頼することが出来ない 。さらにＶｏｌｋｍｕｔｈ等の製造方法は各々それぞれの装置を造るために電子 ビームリソグラフィを使用し、これは診断的用途にとっては手の出せないほど費 用がかかるだろう。 既知のゲルマトリックスのこれらの不完全性を克服しそして診断的適用におい て有用な小さなＤＮＡ断片の分析において有用である別の形式の分離マトリック スを提供することが本発明の目的である。 高度に規則正しい構造を有する、バイオポリマーの分離および分析のための分 離マトリックスを提供することが本発明の別の目的である。 非常に高い電界強度に耐えることが出来る分離マトリックスを提供することが 本発明のなお別の目的である。 分離されたバイオポリマーが非常に高い効率で光学的に検出されることを可能 にする分離マトリックスを提供することが本発明のなお別の目的である。 本発明の新規な分離マトリックスを製造するための方法を提供することが本発 明のなお別の目的である。 本発明の新規な分離マトリックスを用いて、バイオポリマーを分離するための そして特にＤＮＡ塩基配列を分析する目的のためにオリゴヌクレオチド断片を分 離するための方法を提供することが本発明のなお別の目的である。発明の概要 本発明はサンガー（Sanger）ジデオキシＤＮＡ塩基配列決定法あるいはマクサ ム・ギルバート(Maxam/Gilbert)化学的ＤＮＡ塩基配列決定法により生成された 単一ストランドＤＮＡはしご型バンドの迅速な高い分解能分離のための固体状ｍ ｍ−規模〜ｃｍ−規模の装置の形成において有用な分離マトリックスを提供する 。そのような装置は本明細書において“ＤＮＡ塩基配列決定用チップ”と云う。 分離マトリックスは、その第１の主要表面上に配置された複数の支柱を有して 支柱および孔の障害物場を形成する、固体支持体を含む。支柱は規則正しいＸ， Ｙ配列で配置されておりそして１００ｎｍまたはそれ以下、好ましくは１０〜３ ０ｎｍの距離でおたがいから分離されている。 本発明の分離マトリックスはリソグラフィ技術を用いて型、好ましくは再使用 可能な型を最初に形成することにより製造されることが出来る。その型は障害物 場の支柱および孔の所望のパターンの逆でありそして障害物場をキャスチングす るために使用される。キャスチングされた障害物場は次に固体支持体に融合され そして型から分離される。 別法として、分離マトリックスは、選ばれた化学化合物の存在下に特定のそし て定量化可能な膨潤を受ける重合体から形成されることが出来る。この場合にお いて、１００ｎｍまたはそれ以下の所望の最終の間隔より大きい支柱間の間隔で 、マトリックスは慣用の方法で型上にキャスチングされる。使用のために、膨潤 を制御する特定の化学薬剤で飽和された緩衝剤溶液が加えられて、所望の分離を 達成させるために規定された量に支柱の膨潤を起こさせる。図面の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは本発明に従ってナノ規模で造られた分離マトリック スを示す。 図２は隣接ヌクレオチド残基について距離Ｌ＝０．３ｎｍと想定してオリゴヌ クレオチド断片長さの関数としてＤＮＡ鎖パラメーターＲおよびＳについての計 算値を示す。 図３は本発明の分離マトリックスを造るための型を形成するために有用な積層 複合体を示す。 図４は分離マトリックスを造るための装置を示す。 図５は本発明において有用な電極のレイアウトを示す。 図６は本発明において有用な電極のレイアウトを示す。 図７は本発明に従う装置を示す。 図８は本発明に従って分離マトリックスを装入するための装入装置を示す。 図９は本発明に従う統合されたＤＮＡ診断チップのレイアウトを示す。発明の詳細な説明 図１Ａは本発明に従う分離マトリックスを示す。図示されているように、上に 複数の通路（レーン：Lane）２が配置されている固体支持体１を、分離マトリッ クスは有する。図１Ａに示されている態様において、各々の通路２は約１０μｍ の幅および１μｍまたはそれ以下の深さでありそして幅において約１０μｍのセ パレーター３（図１Ｂ）により隣りの通路から分離されている。各々の通路の幅 および実際の全体での分離された通路の使用はデザイン選択の事項でありそして 本発明にとって臨界的ではないけれども、通路分離は、各々の通路が分離毛細管 として働くことを可能にすることに留意されるべきである。しかしながら、上記 寸法が、小さい面積において非常に高い処理能力を可能にする、１ｍｍ幅チップ において５０の通路の可能性を提供することが認識されるだろう。 各々の通路２は、図１Ｃにおける１つの通路２およびセパレーター３の部分上 面図において示されるように、バイオポリマーの分離のための障害物場を形成す る複数の支柱（post）４を含有する。支柱４は規則正しいパターンに配置されて 分離マトリックスを通る物質の通過のために開かれた孔５を残す。支柱４間の間 隔は、分離されるべきバイオポリマーの通過を可能にするのに十分な大きさであ って、なお分離を生ずる通過に対して障害物を提供するのに十分に小さくなけれ ばならない。適当な寸法の決定は装置の総括的大きさ、装置により達成されるべ き分離の程度および分離されるべきポリマーの大きさを包含する多くの要因を考 慮する必要がある。支柱４の各々の列は支柱の隣接する列に関して直線にあって もよくまたはオフセットであってよい。支柱の列間の間隔が、移動している分子 に配向の不ぞろいな分布を再専有することを可能にするのに十分であるように分 離マトリックスを形成することが有利であろう。もし間隔がより細くそしてＤＮ Ａが不ぞろいな再配向を達成しないならば、歩行の行動結果である。これは同様 な有用な性質を有する可能性がある異なる様式の電気泳動であろう。 第１の原理の事項として、支柱４間の孔５についての適当な寸法は、実験的（ 経験的）に、即ち一定の寸法範囲のバイオポリマー物質のの分離のための各々の 有効性を調べるために一連の間隔を試験することにより決定されることが出来る かあるいはそれは当該のポリマーの性質に基づいて理論的に決定されることが出 来る。例えば変性用溶媒中の単一ストランドＤＮＡはランダム−コイル形状を有 する線状ポリマーである。そのようなポリマーについて、連鎖幾何学の数種の統 計的測定が定義されることが出来る。変位長さＲは鎖の２つの末端基間のルート −平均−平方距離として定義される。このパラメーターは、ポリマーの重力の中 心からのポリマー内の要素ｉのルート−平均−平方距離として定義される、回転 の半径Ｓに直接に関係している。ランダム−コイル形状における線状ポリマーに ついて、１９５３年においてＦｌｏｒｙにより提供された誘導化によれば Ｒ＝Ｌ*（Ｎ）1/2および Ｓ＋２．４５*Ｒ （但し、Ｎは鎖中の要素の数（即ち単一ストランドオリゴヌクレオチド断片中の ヌクレオチド残基の数）でありそしてＬは鎖中の隣接要素の中心間の距離である ）。図２は隣接ヌクレオチド残基について距離Ｌ＝０．３ｎｍを想定して、断片 長さの関数としてＲおよびＳについての計算値を示す。 分離マトリックスのために適当な間隔を決定するためにこの情報を使用するた めに、これらのパラメーターを、障害物場を通過するポリマーの運動と結びつけ る仕方を理解することが必要である。ポリマー理論においての幾つかの最近の論 文は原動力の存在または不存在下の両方において障害物の固定された場（例えば 電気泳動界）を通過するランダム−コイルの拡散を考慮した。これらの研究から の一般的な結論は、変位長さＲまたは回転半径Ｓの重合体と同じ程度大きさであ る障害物間の間隔が、障害物を通過するポリマーの運動に対してエントロピー障 壁を課すだろうということである。これは、ポリマー鎖がギャップ中を移動する ことを熱力学的に疎外する（優先しない）低いエントロピーの立体配座を一時に 採らなければならないので、実例である。 塩基配列決定において使用されるオリゴヌクレオチド断片にこの結論を適用し て本発明者は、関連する単一ストランド断片が３０〜１，０００ヌクレオチドの 範囲の寸法を有すると想定した。これは１．６〜１０ｎｍのＲ値に相当する。し たがって第１の近似値として１〜１０ｎｍの障害物間の間隔がそのような断片の 分離を達成させるのに有効である筈である。この寸法範囲はポリアクリルアミド ゲルについて観察された０．５〜４ｎｍの中央孔半径と一致する。勿論より大き な間隔はいぜんとして分離に導き、小さな間隔が使用される場合よりも、効率が 低いけれども、一層容易に製造されるだろう。したがって、本発明の１つの面に 従えば、支柱間の間隔は１００ｎｍ未満、好ましくは１〜３０ｎｍが有利である 。支柱間の大きな間隔は、下に一層十分に論じられるように、混成障害物場にお いて特に有用であろう。 本発明に従う分離マトリックスは電子ビームリソグラフィを用いて所望のパタ ーンの障害物場を造る支柱および孔の逆である型を形成し、マスク中に障害物場 をキャスチングし、次に型から剥すためにキャスチングされた障害物場を固体支 持体に融合させて製造される。型は再使用可能であるのが好ましい。 型を形成するために、基体はパターン受容性層（単層または複数層）で被覆さ れる。例えば図３において概略的に示されるように、最終的に型を形成するタン グステン基体３１は、二酸化珪素３２のような誘電体の薄い層、アルミニウム３ ３のような低い断面の高度に導電性金属の薄い層および電子感受性レジスト３４ の層で被覆されてよい。ポジレジストは一般に最も高い解像度を提供するので、 好ましいレジストはポリメタクリル酸メチル誘導体のようなポジレジストである 。Cowie，J.M.G．によるPolymers:Chemistry and Physics of Modern Materials 第２版（１９９１年ロンドンのBlackie 発行）。レジスト層はスプレー蒸着によ り蒸着されるのが好ましいけれども、水上にラングミュア／ブロジェット(Langm uir/Brodjett)フィルムを形成し、次に固体表面に転移させることが５０〜８０ ｎｍの程度の解像度を有する型の形成のためにまた使用されることが出来る。Mi yashita 等によるProg．Polymer Sci.１８：２６３−２９４（１９９３）。 被覆された基体は所望の大きさの線を描く適当な解像度を有する電子ビームリ ソグラフィの器具のステージに置かれる。この目的のために適当な器具はＪＥＯ Ｌ ＪＢＸ−５ＤＩＩ（Ｕ）電子ビーム器具（２０ｎｍの解像度）およびLeica/ Cambridge ＥＢＭＦ １０／５ＣＳ電子ビームリソグラフィ器具（解像度１５０ ｎｍ）を包含する。所望の障害場の支柱および孔の（電子ビームに露光されたと き除去に抵抗するために硬化するポジレジストの場合において）ポジ画像である かあるいは（電子ビームに露光されたとき除去可能になるネガレジストの場合に おいて）ネガ画像であるかのいずれかであるレジストにパターンを描くために電 子ビームが使用される。露光されたレジストは次に現像されて基体上にパターン 化されたマスクを残す。 いったんマスクが形成されたならば、次の工程は特定の化学エッチング液を用 いての連続処理を用いて基体の層を通過させて下方にパターンを転移させ、基体 それ自体のエッチングにおいて最高点に到達させて、本発明の分離マトリックス の形成において使用するための再使用可能な型を形成する。 本発明の分離マトリックスは任意の多種の材料から造られることが出来そして 型内にマトリックスを形成する方法は大きな程度で、選ばれた材料の種類により 左右される。例えば、二酸化珪素または同様な材料から形成される分離マトリッ クスは型内に材料を蒸着するために化学蒸着法を用いて形成されることが出来る 。その後に、例えば成型されたマトリックスの寸法安定性を増大させそして型か らのその分離を容易にするために、例えば補助シリコンガラス融合分野の技術（ Wallis等によるJ.Appl.Phys.４０：３９４６−３９４９（１９６９））を用いて 、ガラスベースは蒸着された材料に融合されることが出来る。 マトリックスはポリメタクリル酸メチル、紫外線硬化性ポリウレタン、紫外線 硬化性エポキシ類および適当な物理的および化学的性質、即ち光学的透明性およ び関連波長で低い蛍光性、熱伝導率および電荷不存在の性質を有する他の重合体 を包含する種々の重合体材料からまた形成されることが出来る。これらの材料は 重合体キャスティングの技術（ｋｉｍ等によるＮａｔｕｒｅ ３７６：５８１− ５８４（１９９５））におけるような毛細管現象によりチャネルおよびセエパレ ータ中に形成されそして次に化学的にまたは光化学的に硬化される。 上記したような型はまた、Ｃｈｏｕ等によるＳｃｉｅｎｃｅ ２７２：８５− ８７（１９９６）に記載されているような刷り込みリソグラフィーの技術を用い て本発明の分離マトリックスを形成するために使用されることが出来る。この技 術において、ポリメタクリル酸メチルのような重合体レジストの薄い層が基体に 適用される。次に重合体レジストはそのガラス転移温度以上の温度にそれを加熱 することによりゲルに軟化されそして型は軟化されたレジストに対してプレスさ れて厚さコントラストのパターンを形成する。型は次に取り除かれそして反応性 イオンエッチングまたは湿式エッチングのような異方性エッチング法が、圧縮さ れた領域からレジストを取り除くために使用される。 膨潤可能なポリマーの場合において、支柱間の膨潤されていない間隔が大きく そしてかくして成型および分離技術に関して低いチャレンジ性を提供するので、 大きな出発用型が使用されることが出来る。この目的のための型は、より低い解 像度が必要とされるので、紫外光をベースとするリソグラフィ技術により造られ ることが出来る。この場合において、要点は、膨潤コントロール剤の飽和量の存 在下に一定のポリマーが膨潤しそして次に、下記量の膨潤が起ったときに最終の 所望の大きさが達成されるような寸法で支柱を造る、最大量を決定することであ る。 本発明において有用な適当な膨潤可能なポリマーは非ＤＮＡ物質に対して特定 の親和性を有するように変性されている不溶性架橋ポリマーである。そのような ポリマーはポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、 ポリスチレン、架橋デキストランおよびポリアクリル酸を包含する。変性剤は、 膨潤の量が選ばれた化学剤の添加により制御されることが出来るように、ポリマ ーに適当な特異性を提供するように選ばれる。電気泳動緩衝液中に選ばれた化学 剤の飽和量を包含させることにより、脱水および再水和のサイクルの後でさえポ リマーマトリックスの膨潤の程度が一貫して維持されることが出来る。このタイ プのポリマーの合成は国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ９１／１２６２６号（これを 参照することにより本明細書に組み入れる）を包含する、文献に記載されている 。 障害物場が形成された後、最終分離マトリックスの一部を形成し、最終製品に 対してそして型から分離中の障害物場に対して寸法安定性を提供する固体支持体 上にそれは置かれる。固体支持体のために適当な材料は、場−補助シリコンガラ ス融合により、二酸化珪素および同様な材料の、支柱に融合されることが出来る ファインクオーツまたはパイレックスカバースリップを包含する。 Wallis等によるJ.Appl.Phys.４０：３９４６−３９４９（１９６９）。 固体支持体が障害物場の支柱に融合された後に、分離マトリックス（支持体お よび支柱）は型から分離される。この段階で、本発明の分離マトリックスは、そ のマトリックスに緩衝剤溶液を充てんし、溶液電極と接触させてマトリックスの 対向する末端を置き、分離マトリックスの１端でサンプルを装入し、溶液電極間 で電界を適用しそして分離マトリックスの他の一端で分離されたオリゴヌクレオ チド断片を検出することにより、バイオポリマーの分離のために使用されること が出来る。しかしながら本発明の分離マトリックスの万能性および有用性を改良 するために使用されることが出来る種々の微妙な差異がある。 図４は、上に記載された方法を用いて型および光重合可能な材料を用いる、Ｄ ＮＡ塩基配列決定チップの多複製コピーを形成するために適当な装置を示す。図 示されてるように、中に配置された光重合を誘発するために適当な光を送るため のランプ４２を有する可動性ベース４１がハウジング４３内に配置される。ベー ス４１はハウジング内の注入口４５と一直線になって化学的に処理されたガラス カバースリップまたは他の基体４４を支持している。モノマーまたはプレポリマ ー溶液が基体４４の上面上に注入口４５を通して注入される。プラグまたは孔の パターンのための型４７を有するピストン４６は、基体４４の上面上の溶液中に 押し下げられる。次にランプ４２は型中の溶液を重合するために作動され、その 後に成型された重合体はピストン４６を上昇させそしてベース４１を下げること により型４７およびハウジング４３から分離される。 図４の装置の修正された形式は刷り込み平製版によりＤＮＡ塩基配列決定チッ プの多コピーを繰り返して造るために、代りに使用されることが出来るだろう。 この場合において、モノマーまたはプレポリマー溶液の代りに、重合体シートが 出発用材料として使用される。これはガラス転移温度以上に加熱されそして次に 型４７を有するピストン４６が軟化した重合体シート中に押し下げられて複製を 生成する。温度はガラス転移点以下に再び下げられそして次にピストン４６およ び型４７は取り除かれる。ランプ４２の代りにこの装置は加熱用要素を有する。 分離マトリックスに造られる支柱に加えて、本発明に従うＤＮＡ塩基配列決定 用チップは、マトリックスにおいて物質の移動を誘発させるための電界を生成す るために、底部基体または上部基体上に配置された電極を含む。これは、分離マ トリックス内の物質に一方向で電界を課するために分離マトリックスの対向する 末端で配置された単一の対の電極であることが出来る。しかしながら、好ましく は延長された直列の微小電極が基体上に配置され、装置の各々の通路内に多電極 がある。 図５は明確に示すために支柱および孔が省略されている、基体上の微小電極お よび導電性ワイヤの１つの配置を例示する。微小カソード１０２および微小アノ ード１０３が通路２に配置されている。導電性リード１０５は基体１０１を横切 って直接に形成されることが出来るかまたはもし微小孔が基体を通過してカット されているならば、図６に例示されるように、基体１の下側にワイヤ接続１１６ を構成することが可能である。微小電極およびリードは任意の比較的に高い導電 率の物質の組成物であってよい。好ましくは電極は、貴金属白金または金のよう な被覆されたまたは耐腐食性材料から形成される。分離に使用される緩衝液シス テムへの露出に耐えるのに十分な耐腐食性が必要であるけれども、装置が使い捨 て可能であるならば、貴金属は必要ない。 基体上の微小電極のパターンは、本発明が使用される適用の必要性に従って選 ばれることが出来る。２つのタイプのレイアウトが一般に有効である。図５にお いて例示される第１のものは各々の微小電極が別々に活性化されることが出来る 、空間的に分散された配列である。かくして或る適用のために必要とされる電極 は作動化されていることが出来る一方、不必要な電極は単に作動を止められてい てもよい。第２の選択は既知の分離距離および電圧が有効である適用のために使 用される専用パターンである。この場合において電極は所望の適用のために満足 すべきであることが知られている固定されたパターンにレイアウトされることが 出来る。 ＤＮＡ塩基配列決定用チップとして本発明の分離マトリックスを使用するため に、分離マトリックスの孔は分離液体で最初に充てんされる。これは緩衝液、膨 潤剤を含有する緩衝液であってよく、あるいはそれは混成分離マトリックスを形 成するために分離マトリックスの支柱と協力して働く第２障害物の分散液であっ てよい。一般に第２障害物は分離されるべきポリマーの回転の半径と同じ程度の 大きさ、即ち回転の半径の約０．５〜５倍の大きさを有する構造体の均一な大き さのそして均一に分散された懸濁液である。第２障害物はまた使用される検出シ ステムと適合性でなければならない。したがって、蛍光検出のために、関連波長 で、蛍光をほとんど有しないかまたはまったく有しない透明または半透明である べきである。第２障害物として使用されることが出来る材料はPolym．Int．３０ ：５０５−５１１（１９９３）においてHosaka等によりそしてJ.Microencaps． １０：１８１−１９４（１９９３）においてSanghvi 等により記載されたような 単分散微小球、Diederich 等によりScience ２７１：３１７−３２３（１９９６ ）において記載されたような水溶性フラーレンス（fullerenes）（Ｃ６０）、そ してNewkome 等によるJ．Org．Chem．５８：３１２３（１９９３）およびZimmer man 等によるScience ２７１：１０９５−１０９８（１９９６）において記載さ れたような自己集合性デンドリマー(self-assembling dendrimer)を包含する。 評価されるべきサンプル、特にサンガー（Sanger）法またはマクサム・ギルバ ート(Maxam/Gilbert)法により造られた核酸塩基配列決定用混合物のサンプルは 次に例えば図７に概要的に示されるように統合された装置において分離マトリッ クスの一末端で装入される。好ましくは、分離マトリックスの各々の通路に１つ のサンプルで、複数のサンプルが装入される。 市販の微小ピペットを用いての実際の最小装入量は約１００ｎｌ（Hamilton， １９９３）である。対照的に、（図１の毛細管チャネルへの流入路におけるよう な）１０μｍ幅×１μｍ深さ×１０μｍ高さのスタックされた(stacked)電気泳 動帯域は０．１ｐｌの容量を占める。それ故に、容量において非常に実質的な減 少（１６6−倍まで）が初期のスタッキング（stacking）処理中必要とされる可 態性がある。初期相の電気泳動中のそのような高い効率のよいスタッキングは図 ８において一層詳細に示される装入用装置３０１を用いて達成されることが出来 る。 図８の装置は、垂直配向にあるＤＮＡ塩基配列決定用チップ２０３のチャネル 中にサンプルを装入するために適当な配向で示される。装入器は、第２のより小 さな長方形チャネル２０２に直角で取り付けられた大きな長方形のチャネル２０ １からなる。大きな長方形のチャネル２０１の上面は開いておりそして分離され るべき容量（例えばＤＮＡ混合物を含有する非濃縮サンプルの１００ｎｌ）を受 容する。より小さな長方形のチャネル２０２の下面はまた開いておりそしてＤＮ Ａ塩基配列決定チップ２０３の機能的チャネルの１つ中に濃縮サンプル（約１ｐ ｌ）を放出する。大きなチャネルと小さなチャネルとの間に制限のない通路があ り、第１濃縮工程後であって、且つ第２濃縮工程前の時点で、サンプルがこれら の間を流れることを可能にする。 第１濃縮工程において、大きなチャネル２０１の上面に装入されたサンプルは 、電極２０５ａおよび２０５ｂの間に生成された電界を用いて電気泳動される。 ＤＮＡの通過を防止するのに十分に低くカットオフされた分子量を有するがしか しサンプルからの溶媒の通過を可能にし、それにより半透膜２０４ａ上のサンプ ルの第１の濃縮を行なう半透膜２０４ａ上にＤＮＡが集められる。 次に、第２セットの電極２０６ａおよび２０６ｂが作動されて、半透膜２０４ ａからの最初の移動に垂直な方向で、濃縮サンプルを小さなチャネル２０２中に 移動させることを生じさせる。第２の半透膜２０４ｂは小さなチャネル２０２内 にサンプルを保持する一方で、溶媒の通過を可能にする。最後に第３の電極セッ ト２０７ａおよび２０７ｂは小さいチャネル２０２からの二重に濃縮されたサン プルをＤＮＡ塩基配列決定チップ２０３の機能的チャネルの１つに電気泳動させ るために用いられる。 ペルチェ効果により、大きなチャネル中の緩衝液の局所化冷却を達成させるこ とが、大きなチェネル２０１の周囲のまわりに配置された熱電対ストリップの手 段により、また可能である。この戦略は、ガラス転移温度以下にグリセロール含 有緩衝液の温度を低下させ、かくして第１濃縮工程の後に大きなチャネル内の垂 直方向での濃縮ＤＮＡの逆拡散を防止する半透膜２０４ａに近くに粘度トラップ を作成するために使用されることが出来る。 単一のスタッキング操作だけが使用される、図６の装置の単純化形式を使用す ることがまた可能である。この単純化された装置はチャネル２０１、半透膜２０ ４ａ、電極セット２０５ａと２０５ｂ、および２０６ａと２０６ｂおよび場合に よりペルチェストリップ２０８からなる。電極セット２０６ａと２０６ｂは、濃 縮されたサンプルを第２濃縮チャネルよりもむしろ、ＤＮＡ塩基配列決定チップ 中に直接に電気泳動させることを生じさせる。 装入操作中起る処理は以下のとおりに要約されることが出来る：（１）半透膜 上へのｚ−方向に沿っての電気泳動；（２）“粘度トラップ”を用いての膜に近 いサンプルの、場合による捕獲；（３）第２半透膜中へのｘ−方向の電気泳動； およびＤＮＡ塩基配列決定チップにおける機能的チャネル中へのｚ−方向の電気 泳動。 いずれかのスタッキング工程において達成されることが出来るサンプル濃縮の 程度は、方程式 （式中、Ｃ0＝電気泳動方向に沿っての任意の基準距離（Ｚ0）での濃度、Ｂ＝ 第２ビリアル係数そしてσ＝Ｅ・〔Ψ／ＫBＴ〕（但し、Ｅは電界強度（Ｖ／ｃ ｍ）、Ψ＝見かけのまたは有効正味の電荷（クーロン）、ＫB＝ボルツマン定数 そしてＴ＝絶対温度））を用いて平衡電気泳動の理論から計算されることが出来 る。任意の大きな程度のスタッキングまたは濃縮は十分な高い値に電界強度を単 に上昇させることにより達成されることが出来ることはこの方程式から明らかで ある。 いったんサンプルが装入されたならば、電力供給源３０５を用いて、ホルダー ３０３内に置かれた塩基配列決定用チップ３０２に電界が適用されて、分離マト リックス内でのサンプルの移動を誘発する。電界は一定であってもよくあるいは 周期的電界反転が単一ストランドＤＮＡはじご型バンドの解像度を増加させるの に使用されることが出来る。電流はまた、通路の長さに沿って連続する電極に適 用されることが出来るかあるいは通路内の電極の平行する列に適用されて通路内 で二次元分離を誘発することが出来る。 はしご型バンドにサンプルを分離した後に、ＤＮＡは検出部位で検出される。 検出器３０４は任意のタイプのものであってよくそして検出される物質の種類に 依存して変わるだろう。塩基配列決定反応が５′−蛍光性により標識化された塩 基配列決定プライマーであるならば、分離されたバンドは蛍光により検出される ことが出来る。３つの別のイルミネーションおよび検出方式が使用されることが 出来るシステムの例示である。 （ｉ）ダイオードレーザーイルミネーターおよびファイバーオプチック／フォ トトランジスター検出器（Sepamiak等によるJ.Microcol．Separations １：１５ ５−１５７（１９８１）；Foret 等によるElectrophoresis ７：４３０−４３２ （１９８６）；Hirokawa等によるJ.Chromatography ４６３：３９−４９（１９ ８９）：米国特許第５，３０２，２７２号）。 （ii）ダイオードレーザーイルミネーターおよび二次元ＣＣＤ検出器の配列。 二次元ＣＣＤ配列の検出器についてのデザインは他の場合に記載されていた（米 国特許第４，８７４，４９２号および同第５，０６１，０６７号（これらを参照 することにより本明細書に組み入れる）；Eggers等によるBio Techniques１７： ５１６−５２４（１９９４）；Lamture 等によるNucleic Acids Res.２２：２１ ２１−２１２５（１９９４））。そのようなシステムはボードにはりつけたＤＮ Ａ塩基配列決定チップを中に挿入した、固定配列として有利に構成される。これ は、費用のかかる検出システムから、量産されたそして比較的に費用のかからな い塩基配列決定チップを分離する。 （iii）エピフルオレセンス顕微鏡およびイメージ増倍用カメラ。 蛍光検出がＤＮＡ塩基配列決定断片の分析において現在使用されている最も普 通の技術でありそしてしたがって、本発明において好ましい方法であるけれども 、他の検出器のタイプが使用されることが出来る。例えば放射能部分で標識化さ れた対象分子は、Ｘ線フィルムまたはシンチレーションカウンターのような放射 線検出器を用いて検出されてよい。非修飾核酸はまた、米国特許出願シリアル第 ０８／３８７，２７２号（この出願を参照することにより本明細書に組み入れる ）に開示されているような入力放射線の偏りを変えることにより検出されること が出来る。 最も一般的な適用において、本発明は荷電された分子そして特に、たんぱく質 および核酸のような荷電された生体分子の種(species)を移動させそして（また は）分離するために使用される。さらに本発明は混合された分子の種のサンプル から１種の分子の種を精製するために用いられることが出来る。支柱および孔分 離マトリックスを、近くに配置された電極と組み合わせることの目的は分離マト リックス中に局所化された非常に高い密度の電界を作ることである。これらの局 所化された電界は非常に低いエネルギー力の供給によって支えられそしてそれ故 にエネルギー効率がよい。米国特許出願第０８／３３２，５７７号（この特許出 願を参照することにより本明細書に組み入れる）は核酸およびたんぱく質のよう な荷電された分子を分離するための高い密度の電界の有用性を示している。局所 化された面積（１〜５ｍｍ2）にわたって極度に高い電界（１００〜４００Ｖ／ ｃｍ）下に分離された核酸は、慣用の検出器、バイオセンサーおよび微小反応器 構成部品により検出されそして（または）使用されることが出来る。これらの小 形構成部品は装置上の１つの部位でまたは１つより多くの部位で配置されること が出来る。 ＤＮＡ塩基配列決定断片の単純な分離および検出が本発明のチップの好ましい 適用であるけれども、そのチップはまた一層複雑なそして完全な分析を行なうた めに使用されることが出来る。かくして本発明のチップは、統合されたＤＮＡ診 断チップにおけるような異なる処理のために１つのウェル（Well）から他のウェ ルにサンプルを移動させるように造られることが出来る。 公開されたＰＣＴ特許出願第ＷＯ９６／０７７６１号及び同第ＷＯ９６／０１ ９０８号（これらを参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されてい るように、ＤＮＡ診断の最も費用的に有効な手段は精度を増大させて行く一連の 分析が遺伝子の突然変異の存在および不存在を診断するために使用される診験の 階層的（hierarchical）方法を包含する。図９において例示されるように、一つ のチップの上に階層的工程のすべてを統合することが可能である。 図９は上記特許出願の診断方法を用いる統合されたＤＮＡ診断チップを示す。 階層的方法に包含される工程の非常に簡略化された説明が下に提供される。第１ の工程において、診断されるべき遺伝子のエキソンの１グループが挿入突然変異 および欠失突然変異について調べられる。反応管（図示せず）において、患者の 容疑エキソン(the suspect exons)は発蛍光団（図示せず）で標識化されたオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて多重化ＰＣＲにより増幅される。ＤＮＡの得 られた断片は、装入部位８０３で、装入器８０２を用いて分離マトリックス８０ １に装入される。１群の微小電極８０４を活性化させた際、サンプルは分離マト リックス８０１を通って移動しそして異なる種８０５、８０６および８０７の別 々のバンドに分割する。発蛍光団を励起するのに適当な波長のレーザー源８０８ は励起部位８０９に向けられる。バンド８０６が励起部位８０９を通過するとき 、その蛍光放射が検出器８１０により検出される。蛍光放射は記録されるかまた は表示されることが出来る（８１１）。もしバンドが正常な遺伝子に関連して挿 入または欠失を有するならばそれは予期された時間とは異なる時間に励起帯域を 通過する。そのような差はその断片中の突然変異の存在を示す。その差は患者の ファイルに直接に報告されることが出来る。しかしながら、もし挿入突然変異ま たは欠失突然変異が見い出されないならば、それは次に診断法の第２工程に移し そして点突然変異の存在または不存在を決定するためにＤＮＡの実際の配列を決 定することが必要である。この目的を達成させるために、分離されたＤＮＡ断片 は本発明の方法に従って、直列の微小電極８１２により、反応センター８１３に 移動される。 ＤＮＡ塩基配列決定酵素のような固定された酵素は、米国特許第４，９７５， １７５号および同第５，２８６，３６４号（これらを参照することにより本明細 書に組み入れる）に記載されているように反応プールに配置されてよい。第２毛 細管ピペット８１４により加えられることが出来る適当な試薬が用意されたとき 、塩基配列決定反応が診断チップ上でその場で行なわれることが出来る。適当な 長さの時間後に、反応が完了する。塩基配列決定されたＤＮＡサンプルは次に第 ３のグループの微小電極８１５の活性化により第３の方向で分離される。ＤＮＡ 配列が慣用の蛍光ＤＮＡ塩基配列決定法に従って得られる：レーザー源８０８が 励起部位８１６に向けられる。サンプルの蛍光放射が検出器８１７により検出さ れそして記録されるかまたは表示される（８１８）。次に点突然変異の存在また は不存在が記録されそして患者のファイルに報告される。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１０月６日 【補正内容】 その配列に供給されたＤＮＡは電界の適用により大きさで分離されそしてエピ 蛍光顕微鏡を用いて検出される。 しかしながら、大部分の診断的ＤＮＡ塩基配列決定用途、診断的ＲＦＬＰ（制 限断片長さ多型現象）法、等におけるＤＮＡ断片の全長は約２０ヌクレオチドと ３００〜４００ヌクレオチドとの間であるので、Ｖｏｌｋｍｕｔｈ等により記載 された障害物場は診断的用途において使用するためには十分に適していない。そ のようなものとして、Ｖｏｌｋｍｕｔｈにより観察されたＤＮＡの長いストラン ドのルーピング(looping)は分離のためのベースとして信頼することが出来ない 。さらにＶｏｌｋｍｕｔｈ等の製造方法は各々それぞれの装置を造るために電子 ビームリソグラフィを使用し、これは診断的用途にとっては手の出せないほど費 用がかかるだろう。 国際特許公開第ＷＯ９４／２９７０７号は巨大分子および細胞分別化のための ミクロリソグラフィ配列を開示している。その配列はフォトリソグラフィを用い て造られそして次に電気的、磁気的、流体力学的または光学的場の影響下に移動 する巨大分子または細胞の分離のために使用される。 既知のゲルマトリックスのこれらの不完全性を克服しそして診断的適用におい て有用な小さなＤＮＡ断片の分析において有用である別の形式の分離マトリック スを提供することが本発明の目的である。 高度に規則正しい構造を有する、バイオポリマーの分離および分析のための分 離マトリックスを提供することが本発明の別の目的である。 非常に高い電界強度に耐えることが出来る分離マトリックスを提供することが 本発明のなお別の目的である。 分離されたバイオポリマーが非常に高い効率で光学的に検出されることを可能 にする分離マトリックスを提供することが本発明のなお別の目的である。 本発明の新規な分離マトリックスを製造するための方法を提供することが本発 明のなお別の目的である。 本発明の新規な分離マトリックスを用いて、バイオポリマーを分離するための そして特にＤＮＡ塩基配列を分析する目的のためにオリゴヌクレオチド断片を分 離するための方法を提供することが本発明のなお別の目的である。発明の概要 本発明はサンガー（Sanger）ジデオキシＤＮＡ塩基配列決定法あるいはマクサ ム・ギルバート(Maxam/Gilbert)化学的ＤＮＡ塩基配列決定法により生成された 単一ストランドＤＮＡはしご型バンドの迅速な高い分解能分離のための固体状ｍ ｍ−規模〜ｃｍ−規模の装置の形成において有用な分離マトリックスを提供する 。 請求の範囲 １．その第１の主要な表面上に複数の支柱を配置して有する基体を含む分離マ トリックスであって、前記支柱が複数の平行な列において規則正しい間隔で配置 されており、１列中の隣接する支柱間の間隔が１００ｎｍまたはそれ以下であり 、支柱間の領域が、マトリックスを通って移動する荷電された分子に対して装わ れる(posed)チャレンジを増大する第２の障害物で充てんされていることを特徴 とする分離マトリックス。 ２．１列中の隣接する支柱間の間隔が３０ｎｍまたはそれ以下である、請求項 １に記載の分離マトリックス。 ３．支柱が、平行な列に直角な複数の通路中に分けられており、各々の通路が 、上に支柱を有しない基体の領域により隣接する通路から分離されている、請求 項１または２に記載の分離マトリックス。 ５．（ａ）基体； （ｂ）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な列に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （ｃ）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために、基体上に配 置された少なくとも２つの電極、 を含み、支柱間の領域が、マトリックスを通って移動する荷電された分子に対し て装われる(posed)チャレンジを増大する第２の障害物で充てんされていること を特徴とする、荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップ。 ６．１列中の隣接する支柱間の間隔が３０ｎｍまたはそれ以下である、請求項 ５のチップ。 ７．支柱が、平行な列に直角な複数の通路中に分けられており、各々の通路が 、上に支柱を有しない基体の領域により、隣接する通路から分離されている、請 求項５または６に記載のチップ。 ９．電極のＸ−Ｙ配列が基体上に配置されている、請求項５〜７のいずれか１ 項に記載のチップ。 １０．（ａ）電子ビームリソグラフィを用いて型を形成し、前記型は支柱およ び孔の所望の障害物場パターンの逆であり、 （ｂ）型の頁のインプレッション複製として、ポリマー基体中に障害物場をキ ャスチングまたはインプリントし、 （ｃ）キャスチングされた障害物場を固体支持体に融合させ、そして （ｄ）マスクから該キャスチングされた障害物場および固体支持体を分離する 、工程を特徴とする、固体支持体上に配置された支柱および孔の障害物場を含む 分離マトリックスを製造する方法。 １１．分離マトリックスが請求項１〜３、５〜７または９のいずれか１項に記 載のチップであることを特徴とする、分離マトリックス上に下記混合物を供給し そして電界を適用して下記混合物中の荷電されたバイオポリマーに移動および分 離を生じさせる工程を含む、バイオポリマーの複数の種(species)を含有する混 合物をバイオポリマーの下位のクラスに分離する方法。 １２．チップ内で分離されたバイオポリマーを検出する工程をさらに含む、請 求項１１に記載の方法。 １３．分離されたバイオポリマーが蛍光検出器を用いて検出される、請求項１ ２に記載の方法。 １４．分離マトリックスが請求項１〜３、５〜７または９のいずれか１項に記 載のチップであることを特徴とする、塩基配列決定反応からの生成物を含有する 混合物を分離マトリックスに供給し、電界を適用して混合物中の塩基配列決定反 応からの生成物に移動および分離を生じさせそして塩基配列決定反応生成物の分 離されたバンドを検出する工程を含む、核酸を塩基配列を決定する方法。 １５．分離されたバンドが蛍光検出器を用いて検出される、請求項１４の方法 。 １６．（ａ）荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップであって、 （１）基体； （２）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な列に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （３）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために基体上に配置 された少なくとも２つの電極； を含むチップ（このチップは該支柱間の領域に含有される液体媒体を有する）を 受容するためのホルダー；および （ｂ）混合物中の荷電されたバイオポリマーに、該チップ内での移動および分 離を起こさせるために該チップに電界を適用するための電力供給源； を含み、しかも該ホルダー内に配置されたチップに供給されるべきサンプルの容 量を減少させるための装入器（ローダー）をさらに含むことを特徴とする、バイ オポリマーの複数の種(species)をバイオポリマーの下位のクラスに分離するた めの装置。 １７．ホルダーに配置されたチップ内で、荷電された分離されたバイオポリマ ーを検出するための検出システムをさらに含む、請求項１６に記載の装置。 １８．検出システムが蛍光検出システムである、請求項１７に記載の装置。 ２０．装入器（ローダー）が、第１濃縮チャネル、第１の１対の電極、バイオ ポリマーを保持する一方で小さな分子の通過を可能にするのに有効な第１の半透 膜および第２の１対の電極を含み、しかも前記第１の半透膜が該第１の１対の電 極間に配置され、それにより該第１の１対の電極間で該第１濃縮チャネル内に生 成した第１電界において移動するバイオポリマーが該半透膜上に保持されそして 該第２対の電極は該第１半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるた めに、該第１電界に垂直な第２電界を生成する、請求項１６〜１８のいずれか１ 項に記載の装置。 ２１．第２濃縮チャネル、バイオポリマーを保持する一方で、より小さな分子 の通過を可能にするのに有効な第２半透膜および第３の１対の電極をさらに含み 、しかも前記第２の１対の電極は保持されたバイオポリマーに、第１半透膜から 第２濃縮チャネルを通過させて該第２半透膜への移動を起させそして前記第３セ ットの電極は、該第２半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるため に、第２電界に垂直な第３電界を生成する、請求項２０に記載の装置。 ２２．第１濃縮チャネルの１部における温度を低下させて粘度トラップを形成 するための手段をさらに含む、請求項２０または２１に記載の装置。 ２３．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させるための手段が熱電 対チップである、請求項２２に記載の装置。 ２４．第１濃縮チャネル、 第１の１対の電極、 バイオポリマーを保持する一方で低分子量の物質の通過を可能にするのに有効 な第１半透膜、および 第２の１対の電極、 を含み、しかも前記第１の半透膜が該第１の１対の電極間に配置され、それによ り該第１の１対の電極間で該第１濃縮チャネル内に生成した第１電界において移 動するバイオポリマーが該半透膜上に保持されそして該第２の１対の電極は該第 １半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるために、該第１電界に垂 直な第２電界を生成する、 低分子量の物質と組み合わせてバイオポリマーを含有するサンプルの容量を減少 させるための装置。 ２５．第１濃縮チャネルと接触しているがしかしそれに垂直である第２濃縮チ ャネル、バイオポリマーを保持する一方で、より小さな分子の通過を可能にする のに有効な第２半透膜および第３対の電極をさらに含み、しかも前記第２対の電 極は保持されたバイオポリマーに、第１半透膜から第２濃縮チャネルを通過させ て該第２半透膜への移動を起させそして前記第３のセットの電極は、該第２半透 膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるために、第２電界に垂直な第３ 電界を生成する、請求項２４に記載の装置。 ２６．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させて粘度トラップを形 成するための手段をさらに含む、請求項２４または２５に記載の装置。 ２７．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させるための手段が熱電 対チップである、請求項２６に記載の装置。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウオーターハウス，ポール カナダ国 エル０アール １ジェイ０ オ ンタリオ，コープタウン，ガバナーズ ロ ード 2145 (72)発明者 イズメイロブ，アレクサンドル エム. カナダ国 エム５エイ ４ジー３ オンタ リオ，トロント，ハーン プレイス ５, アパートメント 314 (72)発明者 マルゾ，ブルーノ カナダ国 オンタリオ，トロント，ブラン ズウィック アベニュー 492 (72)発明者 スチーブンス，ジョン ケイ. カナダ国 エム５アール ２アール７ オ ンタリオ，トロント，ヒューロン ストリ ート 540 (72)発明者 ラーソン，マリナ ティー. アメリカ合衆国 10598 ニューヨーク州 ヨークタウンハイツ，ビスタ コート 2322 【要約の続き】 ポリマーから造られることが出来る。この場合におい て、マトリックスは１００ｎｍまたはそれ以下の所望の 最終間隔より大きい、支柱間の間隔で、慣用の方法で型 上にキャスチングされる。使用のため、膨潤を制御する 特定の化学剤で飽和された緩衝剤溶液が加えられて、所 望の分離を達成させるために規定された量に支柱を膨潤 させる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．その第１の主要な表面上に複数の支柱を配置して有する基体を含む分離マ トリックスであって、前記支柱が複数の平行な列において規則正しい間隔で配置 されており、１列中の隣接する支柱間の間隔が１００ｎｍまたはそれ以下である 、分離マトリックス。 ２．１列中の隣接する支柱間の間隔が３０ｎｍまたはそれ以下である、請求項 １に記載の分離マトリックス。 ３．支柱が、平行な列に直角な複数の通路中に分けられており、各々の通路が 、上に支柱を有しない基体の領域により、隣接する通路から分離されている、請 求項１または２に記載の分離マトリックス。 ４．支柱間の領域が、マトリックスを通って移動する荷電された分子に対して 装われる(posed)チャレンジを増大する第２の障害物で充てんされている、請求 項１〜３のいずれか１項に記載の分離マトリックス。 ５．（ａ）基体； （ｂ）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な列に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （ｃ）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために、基体上に配 置された少なくとも２つの電極、 を含む荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップ。 ６．１列中の隣接する支柱間の間隔が３０ｎｍまたはそれ以下である、請求項 ５のチップ。 ７．支柱が、平行な列に直角な複数の通路中に分けられており、各々の通路が 、上に支柱を有しない基体の領域により、隣接する通路から分離されている、請 求項５または６に記載のチップ。 ８．支柱間の領域が、電界において移動する荷電された分子に対して装われる (posed)チャレンジを増大する第２の障害物で充てんされている、請求項５〜７ のいずれか１項に記載のチップ。 ９．電極のＸ−Ｙ配列が基体上に配置されている、請求項５〜８のいずれか１ 項に記載のチップ。 １０．（ａ）電子ビームリソグラフィを用いて型を形成し、前記型は支柱およ び孔の所望の障害物場パターンの逆であり、 （ｂ）型のネガのインプレッション複製として、ポリマー基体中に障害物場を キャスチングまたはインプリントし、 （ｃ）キャスチングされた障害物場を固体支持体に融合させ、そして （ｄ）マスクから該キャスチングされた障害物場および固体支持体を分離する 、工程を含む、固体支持体上に配置された支柱および孔の障害物場を含む分離マ トリックスを製造する方法、 １１．（ａ）（１）基体； （２）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な列に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （３）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために基体上に配置 された少なくとも２つの電極； を含む、荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップ（前記チップは該支 柱間の領域において含有される液体媒体を有する）上に下記混合物を供給し、そ して （ｂ）該チップに電界を適用して、下記混合物中の荷電されたバイオポリマー に該チップ内で移動させそして分離させるることを起こさせる、 工程を含む、バイオポリマーの複数の種(species)を含有する混合物をバイオポ リマーの下位のクラスに分離するための方法。 １２．チップ内で分離されたバイオポリマーを検出する工程をさらに含む、請 求項１１に記載の方法。 １３．分離されたバイオポリマーが蛍光検出器を用いて検出される、請求項１ ２に記載の方法。 １４．（ａ）（１）基体； （２）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な例に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （３）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために基体上に配置 された少なくとも２つの電極； を含む、荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップ（前記チップは該支 柱間の領域において含有される液体媒体を有する）上に、塩基配列決定反応から の生成物を含有する混合物を供給し； （ｂ）混合物中の荷電されたバイオポリマーを該チップ内で移動を起こさせる ために該チップに電解を適用し；そして （ｃ）塩基配列決定反応生成物の分離されたバンドを検出する； ことを含む核酸を塩基配列決定する方法。 １５．分離されたバンドが蛍光検出器を用いて検出される、請求項１４の方法 。 １６．（ａ）荷電されたポリマーの電気泳動分離のためのチップであって、 （１）基体； （２）複数の支柱（前記支柱は該基体の第１の主要表面上で複数の平行な列に おいて規則正しい間隔で配置されており、１列における隣接する支柱間の間隔が １００ｎｍまたはそれ以下である）；および （３）荷電されたポリマーの電気泳動分離のための電界を誘発するために、支 柱のまわりの領域に配置された液体媒体と電気的接触をするために基体上に配置 された少なくとも２つの電極； を含むチップ（このチップは該支柱間の領域に含有される液体媒体を有する）を 受容するためのホルダー；および （ｂ）混合物中の荷電されたバイオポリマーに、該チップ内での移動および分 離を起こさせるために該チップに電界を適用するための電力供給源； を含む、バイオポリマーの複数の種(species)をバイオポリマーの下位クラスに 分離するための装置。 １７．ホルダーに配置されたチップ内で、荷電された分離されたバイオポリマ ーを検出するための検出システムをさらに含む、請求項１６に記載の装置。 １８．検出システムが蛍光検出システムである、請求項１７に記載の装置。 １９．ホルダー内に配置されたチップに供給されるべきサンプルの容量を減少 させるための装入器（ローダー）をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１ つに記載の装置。 ２０．装入器（ローダー）が、第１濃縮チャネル、第１の１対の電極、バイオ ポリマーを保持する一方で小さな分子の通過を可能にするのに有効な第１の半透 膜および第２の１対の電極を含み、しかも前記第１の半透膜が該第１の１対の電 極間に配置され、それにより該第１の１対の電極間で該第１濃縮チャネル内に生 成した第１電界において移動するバイオポリマーが該半透膜上に保持されそして 該第２対の電極は該第１半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるた めに、該第１電界に垂直な第２電界を生成する、請求項１９に記載の装置。 ２１．第２濃縮チャネル、バイオポリマーを保持する一方で、より小さな分子 の通過を可能にするのに有効な第２半透膜および第３の１対の電極をさらに含み 、しかも前記第２の１対の電極は保持されたバイオポリマーに、第１半透膜から 第２濃縮チャネルを通過させて該第２半透膜への移動を起させそして前記第３セ ットの電極は、該第２半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるため に、第２電界に垂直な第３電界を生成する、請求項２０に記載の装置。 ２２．第１濃縮チャネルの１部における温度を低下させて粘度トラップを形成 するための手段をさらに含む、請求項２０または２１に記載の装置。 ２３．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させるための手段が熱電 対チップである、請求項２２に記載の装置。 ２４．第１濃縮チャネル、 第１の１対の電極、 バイオポリマーを保持する一方で低分子量の物質の通過を可能にするのに有効 な第１半透膜、および 第２の１対の電極、 を含み、しかも前記第１の半透膜が該第１の１対の電極間に配置され、それによ り該第１の１対の電極間で該第１濃縮チャネル内に生成した第１電界において移 動するバイオポリマーが該半透膜上に保持されそして該第２の１対の電極は該第 １半透膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるために、該第１電界に垂 直な第２電界を生成する、 低分子量の物質と組み合わせてバイオポリマーを含有するサンプルの容量を減少 させるための装置。 ２５．第１濃縮チャネルと接触しているがしかしそれに垂直である第２濃縮チ ャネル、バイオポリマーを保持する一方で、より小さな分子の通過を可能にする のに有効な第２半透膜および第３対の電極をさらに含み、しかも前記第２対の電 極は保持されたバイオポリマーに、第１半透膜から第２濃縮チャネルを通過させ て該第２半透膜への移動を起させそして前記第３のセットの電極は、該第２半透 膜からの保持されたバイオポリマーを移動させるために、第２電界に垂直な第３ 電界を生成する、請求項２４に記載の装置。 ２６．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させて粘度トラップを形 成するための手段をさらに含む、請求項２４または２５に記載の装置。 ２７．第１濃縮チャネルの１部分における温度を低下させるための手段が熱電 対チップである、請求項２６に記載の装置。
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