JPH11509728A

JPH11509728A - バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体タンパク質

Info

Publication number: JPH11509728A
Application number: JP9504915A
Authority: JP
Inventors: テイラー，ピーター，ウィリアム; ルジオ，ジョーン，ポール; ブライアン，ジョナサン，マーク
Original assignee: エンドジムリミテッド; ケンブリッジユニヴァーシティーテクニカルサーヴィシスリミテッド
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 1999-08-31
Also published as: NZ311738A; NO980021L; WO1997002351A1; CN1191572A; KR19990028642A; US6331425B1; CA2226258A1; CZ421397A3; EP0842284A1; GB9513683D0; AU6311696A; HUP9900323A2; MX9800097A; SK1398A3; AU718184B2; NO980021D0

Abstract

(57)【要約】バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体タンパク質またはこのタンパク質の類縁体であって、組み換え体タンパク質が組み換え体ベクターからの形質発現によって得られ、この組み換え体ベクターは、形質発現ベクターのＤＮＡ配列に連結するバクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有しており、この形質発現ベクターは、エンドシアリダーゼのＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現するものであり、前記タンパク質の類縁体が、エンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である。

Description

【発明の詳細な説明】バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体タンパク質本発明は，バクテリオファージエンドシアリダーゼ活性を有する組み換え体タンパク質、その生産方法およびその生産に使用するための組み換え体形質発現システムに関するものである。バクテリオファージＥは、ＰＫ１Ａ−ＰＫ１Ｅ族のファージの一種である。これらのファージは、新生児の髄膜炎の場合に高い死亡率をもたらし得る大腸菌Ｋ１への感染を臨床的に同定するのを補助するために、ヨーロッパの下水から最初に分離された。バクテリオファージＥエンドシアリダーゼ(Ｋ１Ｅエンドシアリダーゼ)は、Ｋ１グリコカリックスのα−２，８−結合ポリ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ポリシアル酸／ＰＳＡ）カーボハイドレートポリマーを特異的に認識し、加水分解することによって、宿主となる細菌への最初の結合を担う酵素であると考えられている。また、α−２，８−結合ＰＳＡは、種々の他の病原性細菌、および他の腫瘍細胞や細胞系の細胞表面上で形質発現する。米国特許第４，６９５，５４１号において、Ｋ１Ｅエンドシアリダーゼが、この酵素の α−２，８−シアロシル結合を高度に特異的に加水分解することから、Ｋ１髄膜炎、敗血症または細菌症の診断や治療に使用できるかもしれないという提案がある。ＰＳＡは、腎臓および神経内分泌組織のヒト腫瘍において癌発生マーカーであると示唆されており、またある種の腫瘍の攻撃能力と転移能力に寄与しているものと考えられている。「Ｊ.Ｂacteriol」1993年、175 、4354-4363 頁において、関連するＫ１Ｆファージに由来するＤＮＡ構成体からの形質発現によって酵素的に活性のタンパク質を得る試みが記載されている。これらの試みは成功しなかった。今回発見したところによれば、バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有するタンパク質、即ち、α−２，８−ポリシアル酸に特異的に結合し、または開裂させるタンパク質を、ＤＮＡ構成体からの形質発現によって得ることができ、このＤＮＡ構成体は、Ｋ１Ｅエンドシアリダーゼ遺伝子に由来しており、エンドシアリダーゼ配列のＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現する形質発現ベクター中へとクローニングされている。従って、本発明の一態様においては、バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体タンパク質を提供し、この組み換え体タンパク質は組み換え体ベクターからの形質発現によって得られるものであり、この組み換え体ベクターは、エンドシアリダーゼのＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現する形質発現ベクターのＤＮＡ配列に連結するバクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有し、またエンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である前記タンパク質の類縁体を提供する。例えば、この変異体は、一箇所以上の場所で置換または欠損したアミノ酸を有しているタンパク質であってよい。前記機能性フラグメントは、Ｃ−末端またはＮ−末端短縮フラグメント、またはエンドシアリダーゼ活性を有するポリペプチド鎖の内部からのフラグメントであってよい。前記誘導体は、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、ピロリン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、乳酸、パルミチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、またはクエン酸のような酸との薬剤学上許容される塩；塩基、通常は窒化ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはアンモニウム含有塩基のような窒素含有塩基との薬剤学上許容される塩；または経口塩であってよい。本発明の他の態様において提供する組み換え体ベクターは、エンドシアリダーゼのＮ−末端に付加されるポリペプチドを形質発現する形質発現ベクターのＤＮＡ配列に結合された、バクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有しており、この組み換え体ベクターは、生適合性の宿主細胞中に前記タンパク質を形質発現させる能力を有する。本発明の他の態様では、バクテリオファージＥエンドシアリダーゼ酵素活性を有するタンパク質を生産する方法を提供し、前に規定した組み換え体ベクターによって形質転換されている宿主細胞を、前記タンパク質を形質発現させるような条件下で培養し、こうして生産されたタンパク質を分離することを含んでいる。本発明の更に他の態様においては、前に規定した組み換え体ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。本発明による好適なタンパク質は、前に規定した組み換え体ベクターからの形質発現によって得られるタンパク質であり、ここでエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、バクテリオファージＥエンドシアリダーゼ遺伝子のヌクレオチド１７２−１７４４、即ち、後で規定するＳＥＱＩＤＮｏ．１のヌクレオチド１７２−１７４４によって暗号化されたアミノ酸残基を暗号化するＤＮＡ構成体に由来しており、またはエンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である。本発明による特に好適なタンパク質は、前に規定した組み換え体ベクターからの形質発現によって得られるタンパク質であり、ここでエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、バクテリオファージＥエンドシアリダーゼ遺伝子のヌクレオチド１−２４３６、即ち、後で規定するＳＥＱＩＤＮｏ．１のヌクレオチド１−２４３６によって暗号化されたアミノ酸残基を暗号化するＤＮＡ構成体に由来しており、またはエンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である。本発明のタンパク質は、一般的には、形質発現ベクター、即ち適当な宿主細胞中でのタンパク質の形質発現に使用されるベクターに由来するポリペプチドに対して、直接にまたはスペーサーを介して連結されたエンドシアリダーゼを有する融合タンパク質の形で形質発現し、こうした好適なポリペプチドはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。融合タンパク質のポリペプチド成分が分離可能であることが望まれる場合には、この融合タンパク質が、化学的にまたは酵素的に特異的に開裂しえる領域を自然には含んでいないものとすると、こうした領域を、通常の方法を用いて挿入することができる。融合タンパク質に対する選択的な開裂剤または開裂酵素の例としては、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン、トロンビン、因子Ｘ、ＣＮＢｒ、ペプチダーゼｙｓｃαおよびｙｓｃＦがある。本発明の特に好適な実施形態においては、本発明のタンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに結合されたバクテリオファージＥエンドシアリダーゼを有する融合タンパク質の形であり、この融合タンパク質は、好ましくは、約１００ｋＤａの分子量を有する。本発明によるタンパク質の形質発現に適したＤＮＡ構成体、即ち、組み換え体ＤＮＡ分子は、バクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化する分離されたＤＮＡフラグメントであって、例えばその暗号領域のみからなるか、または相同のまたは異種のＤＮＡ配列によって延長されたＤＮＡフラグメントであってよい。この構成体は、適切なクローニングベクター、好ましくはｐＢＲ３１７、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＳＦ２１２４または特にブルースクリプトＳＫ⁺のような細菌ベクター中にクローニングされたエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡフラグメントであってよい。こうしたクローンに、エンドシアリダーゼ読み取り枠だけを分離するための都合の良い制限部位がない場合には、必要とされるこの制限部位を含有するプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅できる。バクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡフラグメントは、ゲノムバクテリオファージＥＤＮＡ、またはこれに対して実質的に相同である、即ち、８０−１００％相同である合成ＤＮＡから得ることができる。バクテリオファージＥを精製でき、全ゲノムＤＮＡを通常法を用いて抽出できる。次いで、この抽出したＤＮＡを、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＰｓｔＩのような適切な制限酵素によって消化できる。この消化産物は、低融点アガロースゲルを用いた分離電気泳動に供し、特定の長さのＤＮＡ画分を豊富化することによって、本発明のタンパク質を暗号化するＤＮＡフラグメントを豊富にすることができる。バクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するヌクレオチド配列、またはそのアミノ酸配列が既知である場合には、通常のＰＣＲ法またはインビトロ化学合成のような、所望のＤＮＡを直接にもたらす方法によって、エンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡも調製できる。本発明のタンパク質を形質発現させるためには、ＤＮＡ構成体を、エンドシアリダーゼのＮ−末端に付加するポリペプチドを形質発現する形質発現ベクター中へとクローニングし、本発明による組み換え体ベクターが得られる。この形質発現ベクターは、むろん、タンパク質を形質発現させるために選択された宿主細胞の性質に従って、選択する。こうした適切な形質発現ベクターは、商業的に入手できる。適切な形質発現ベクターがファージλまたは細菌プラスミドのような原核生物形質発現ベクターである場合には、形質発現は好ましくは原核生物の宿主中で実施し、一層好ましくは細菌宿主中、特に大腸菌中で実施する。特定の原核生物形質発現ベクターの例は、エンドシアリダーゼ−グルタチオンＳ−トランスフ−ラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の形質発現をもたらす、ｐＧＥＸベクター、例えばｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオテック社）、エンドシアリダーゼ−マルトース結合タンパク質融合タンパク質の形質発現をもたらすｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボ社）、形質発現したタンパク質をビオチニル化する「プロメガ社」からの「ピンポイント(pinpoint)」システム、形質発現したタンパク質上にストレプトアビジン結合ペプチドを位置させる「バイオメトラ社」の「ストレプ−タッグ(strep-tag)」システム、ニッケルに結合する形質発現したタンパク質へと６−ヒスチジンを付加させる「クイアジェン社(Ｑiagen)」のＮｉ−ＮＴＡシステム、およびＮｉ−ＮＴＡシステムと同様の原理で作動する「インビトロジェン社(invitrogen)」の「エックスプレス (Ｘpress)」システムである。好適な形質発現ベクターは、ｔａｃプロモーターを有するｐＧＥＸベクター、内部ｌａｃＩ^q遺伝子およびトロンビンまたは因子Ｘ_aプロテアーゼ認識部位、特にＬeu Ｖal Ｐro Ａrg Ｇly Ｓer Ｐro Ｇly Ile Ｈis Ａrg Ａsp ＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＧＡＧＣＴＡＣＧの配列を有するｐＧＥＸ−２Ｔである。前記ＤＮＡ構成体を形質発現ベクター中へとクローニングして、本発明の組み換え体ベクターを得ることは、通常の制限および連結技術を使用して実施できる。従って、ＤＮＡ構成体がＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいる場合には、これらはＰＣＲ増幅によって含有させることができたのだが、ＤＮＡ構成体および形質発現ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによって同時に消化することができ、生産者の指示に従ってＤＮＡリガーゼを使用して連結を実施できる。前述したように、本発明のタンパク質の形質発現に使用される宿主細胞は、好ましくは原核細胞であり、一層好ましくは微生物細胞であり、バチルスサチリス、シュードモナス、ストレプトコッカス、または特に大腸菌のような細菌の細胞を含む。宿主細胞に適した通常の技術を用いて、宿主細胞の形質転換を実施できる。従って、大腸菌細胞の形質転換法には、例えば、ＤＮＡの摂取を可能とするための細胞のＣａ²⁺による前処理、および組み換え体ベクターによる培養が含まれる。この形質転換された細胞の次の選択は、例えば、選択的な成長培地へと細胞を移すことによって達成でき、これは親細胞から形質転換された細胞の分離を可能とし、または培養された細胞から得られたミニプレパラートＤＮＡ試料の制限分析によって達成できる。形質転換された宿主細胞は、本分野において既知の方法によって、同化可能な炭素源、例えばショ糖またはラクトースのような炭化水素、同化可能な窒素源、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはペプトン、アンモニウム塩等のようなこれらの分解生成物、およびナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩のような無機塩を含有する液体培地中で培養できる。また、この培地は、例えば、痕跡元素、例えば、鉄、亜鉛またはマンガン等のような成長促進物質を含有していてよい。培養は、本分野において既知の方法によって実施できる。この培養条件、例えば温度、培地のｐＨ値および発酵時間は、本発明のタンパク質の形質発現の水準が最大となるように、選択される。従って、大腸菌株は、好ましくは、好気性条件下で、液中培養によって、振とうまたは攪拌しながら、約２０℃−４０℃の温度、好ましくは３７℃で、４−８、好ましくは約７のｐＨ値で、約４−３０時間、好ましくは本発明のタンパク質の収率が最大に達するまで、培養する。形質発現したタンパク質は、大腸菌細胞や細胞培養物の上澄みのような微生物細胞から、通常法、例えば細胞の溶菌、イオン交換、疎水性またはサイズ排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、例えば硫酸アンモニウムまたは酸による沈降法、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または等電点電気泳動法等の分離電気泳動法を含む通常法によって、抽出できる。本発明の特に好適な実施形態におけるように、形質発現したタンパク質は、エンドシアリダーゼ−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質であり、これはスミスおよびジョンソン（１９８８年）「Ｇｅｎｅ」６７、３１−４０頁に記載されているように、グルタチオンビーズに対する結合によって精製できる。この精製後の融合タンパク質の開裂は、トロンビンを用いて、例えばｐＧＥＸ−２Ｔ形質発現ベクターの生産者である「ファルマシアバイオテック社」の指示に従って、実施できる。また、本発明によって提供する薬剤組成物は、活性成分として本発明のタンパク質またはその薬剤学上許容される塩を含有しており、必要に応じて薬理学的に許容される担体も含有しており、これは例えば賦形剤、希釈剤または薬剤組成物における他の通常の補剤であってよい。本発明のタンパク質は、医学的疾患、特に種々の疾病を含む人体の医学的疾患、特に腫瘍細胞の表面上でのポリシアル酸の形質発現を特徴とする髄膜炎および癌、例えばウイルム腎臓腫瘍、小細胞肺腫、神経葉細胞腫、骨髄質性甲状腺癌、尿路腫瘍、上皮性腫瘍、奇形腫、横紋筋肉腫、褐色細胞腫、ユーイング腫瘍、インスリノーマ、肺癌および下垂体腫瘍の診断と治療とに使用できる。このタンパク質は、腫瘍の転移、例えば手術後の転移を抑制するのに使用できる。また、このタンパク質は、大腸菌Ｋ１によって引き起こされる他の疾患、例えば敗血症および尿路感染、または細胞の表面上にポリシアル酸を形質発現する他の細菌によって引き起こされた疾患の診断と治療とに使用できる。従って、また本発明は、細胞表面上にポリシアル酸を形質発現する細菌によって引き起こされる疾患、腫瘍細胞の表面上のポリシアル酸の形質発現を特徴とする癌、または腫瘍の転移を治療する方法を提供しており、前に規定した本発明のタンパク質または類縁体を、前記治療を必要とする温血哺乳類へと投与することを含む。本発明の薬剤組成物、特に上記した用途のものは、非経口的に、例えば静脈内に、皮内に、皮下に、または筋肉内に投与できる。この用量は、主として、投与方法と治療目的とに依存する。個々の用量および投与計画は、特定のケースの疾病を個々に判断して決定することが最適である。通常は、本発明のタンパク質の治療上有効な量は、注射によって投与するときには、体重当たり約０．００５− 約０．１ｍｇ／ｋｇである。前記活性成分に加えて、本発明の注射可能な薬剤組成物には、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、塩化ナトリウム、マンニトールまたはソルビトールを含有させて等張性を調整することができ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチル− またはエチルエステルのような抗菌活性のある防腐剤を含有させることができる。また、本発明のタンパク質は、これらの酵素活性の観点から、糖タンパク質の分析に使用でき、例えば、糖タンパク質を修飾するオリゴ糖部分の検出と配列決定とに使用でき、なぜなら、本タンパク質は糖タンパク質から特定の糖残滓を選択的に除去できるからである。本発明を次の実施例によって説明するが、これらは特に好適な実施形態に関するものである。例１バクテリオファージＥエンドシアリダーゼ読み取り枠を有するＤＮＡ構成体の調製特に断らない限り、使用したすべての手順は、サムブルック等、「分子クローニング：実験の手引き（Ｍolecular Ｃloning:a Ｌaboratory Ｍannual）」第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス社、ニューヨーク（１９８９年）に記載されたようにした。同義性のオリゴヌクレオチドプローブを、大腸菌コドン用法表(ホルムズ（１９８６年）「Ｎuc.Ａcids Ｒes.」14、3075-3087 頁)を参照して設計し、自動化されたアプライドバイオシステムズ社の「ＰＣＲ-ＭＡＴＥ model 391 ＤＮＡ synthesiser」を使用して調製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して〔 γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（アメルシャムインターナショナルＰｌｃ．，アメルシャム，バックス，英国）によって５’末端を標識する。放射線標識したオリゴヌクレオチドプローブを、バクテリオファージＥＤＮＡの制限酵素消化物に対してハイブリッド形成し、アガロースゲル中で電気泳動させ、「ハイボンド（Ｈibond-Ｎ）」ナイロン膜(アメルシャムインターナショナル社)へと移す。このプローブと反応するバクテリオファージＥＤＮＡフラグメントを、オートラジオグラフィーによって同定し、ＮＡ級のアガロースゲル（ファルマシアバイオシステムズ社、ミルトン・ケインズバックス英国）から精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を使用して、ブルースクリプトＳＫ+ （ストラトジーン社、米国、カリフォルニア州ラジョラ）中へと連結させる。大腸菌エピキュリアンＳＵＲＥ細胞（ストラトジーン社）のブルースクリプトＳＫ+ による形質転換を、エレクトロポレーション法（ダウアー等、１９８８年、「Ｎucleic Ａcids Ｒes.」16、6127-6145 頁）に従って、「Ｂio-Ｒad Ｇene Ｐulser and Ｐulse Ｃobtroller」を使用して実施し、または高能率大腸菌ＪＭ109 受容細胞（「プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン州、米国）を、熱衝撃によって、４２℃で６０秒間形質転換させる。２ＴＹ／アンピシリン寒天板上で成長させ、５０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル− β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）および０.１Ｍのイソプロピルβ− Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)との混合物を使用して、青白色の色彩のコロニーの選択を可能とすることによって、組み換え体プラスミドによって形質転換されたクローンを同定する。二本鎖ＤＮＡの配列決定は、米国オハイオ州クリーブランドの「ユナイテッドステーツスバイオケミカルコーポレーション」から入手した「Ｓequenase Ｖersion ２．０」配列決定キットおよび米国メリーランド州ゲチスバーグのＢＲＬライフテクノロジーズ社から入手した「ｍodel ＳＡ」配列決定機器を使用して実施する。欠失の重ね合わせの技術によって、または英国オクソン、アビンドンの「ブリテッシュバイオテクノロジープロダクツ社」が生産したかまたは上記のように生産された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配列決定を容易にした。同義性のオリゴヌクレオチドプローブである、プローブ１〔５’−ＴＡＣ（Ｔ）ＣＡＣ（Ｔ）ＣＡＧＧＧＴ（Ｇ）ＧＡＣ（Ｔ）ＧＴＧ（Ｔ）ＧＣＧ（Ｃ）ＣＣ −３’〕は、最も長い一義的なアミノ酸配列を有する、Ｋ１Ｅエンドシアリダーゼの臭化シアンフラグメントに由来しており、臭化シアンフラグメントから得られる部分アミノ酸配列を使用して設計された五つのプローブのうち最も同義性が低い。ゲノムバクテリオファージＥＤＮＡの１．９ｋｂのＢｇＩＩＩ制限酵素フラグメントを、エンドシアリダーゼ配列を暗号化している可能性を持つものとして、³²Ｐ−放射線標識プローブ１を使用して、サザンブロット分析によって同定する。ＢｇＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼは、これと同じ配列を有する付着突出端を生じさせ、これによって１．９ｋｂのＢｇＩＩＩフラグメントがブルースクリプトＳＫ+ クローニングベクター（プロメガ社）のＢａｍＨＩ部位に連結できるようになる。こうして得られた組み換え体ベクター（クローン１）によって形質転換されたクローンからのプラスミドミニプレパラートＤＮＡは、設計プローブ１に使用したＣＮＢｒフラグメントのものと同じ配列の伸長部を含む、推定されたタンパク質配列を暗号化するＤＮＡ配列をもたらす。非同義性のオリゴヌクレオチド１８−マーである、プローブ２〔５’−ＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＴＣＣＣＴ−３’〕を、クローン１の５’末端における配列を使用して合成する。このプローブによって、約３．３ｋｂに等しいシングレットとして延びるゲノムバクテリオファージＥＤＮＡの二種のＳｉｎｌ消化フラグメントのうちの一つを同定する。Ｓｉｎｌによってクローン１挿入ＤＮＡを消化することによって、クローン１の５’−末端のＤＮＡ配列の上流を、このフラグメントが暗号化していることを検証している。この消化の結果が示すように、クローン１の挿入ＤＮＡ中には少なくとも三種のＳｉｎｌ部位があり、最も大きなフラグメントは１．１ｋｂである。バクテリオファージＥＤＮＡの制限分析が示すところでは、全ゲノム中で二種のＢｇＩＩＩ部位だけがあり、このゲル精製されたＳｉｎｌフラグメントをＢｇＩＩＩによって消化し、プローブ２の認識配列およびＢｇＩＩＩ部位を含むフラグメントは、２．１ｋｂと１．１ｋｂの二種のフラグメントをもたらす。２．１ｋｂのＳｉｎｌ×ＢｇＩＩＩ消化物フラグメントを、ブルースクリプトＳＫ+ 中へと、ＢｇＩＩＩ末端のＢａｍＨＩ末端への連結によってクローニングし、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用して末端充填し、得られた付着端を共に連結してプラスミドを環状にする。こうして得られたクローン（クローン２）は、約７６ｋＤａ酵素サブユニットのＮ−末端アミノ酸配列と比較することによって、Ｋ１ＥエンドシアリダーゼのＮ−末端を暗号化する読み取り枠を含有していることを見いだした。５’および３’方向の双方において、クローン１と２とに対して、重複する配列が得られ、読み取り枠の位置を、コドン選択および位置塩基選択分析によって測定する（ステイドン等、１９８２年、「Ｎuc.Ａci ds Ｒes．」10、141-156 頁およびステイドン等、１９９０年、「Ｍeth.Ｅnzymol.」 183，163-180頁）。組み換え体プラスミドＤＮＡを、クローン２から精製し、固有のＥｃｏＲＩ部位の開裂によって直線状にし、５’キャップしたＲＮＡを、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼおよびｍＣＡＰｍＲＮＡキャッピングキット（ストラトジーン社）を使用して転写する。０．１μｇのＲＮＡ転写産物、２０μＣｉの〔³⁵Ｓ〕メチオニンおよびウサギ網状赤血球抽出液システムを使用して、インビトロ翻訳反応（２５μｌ）を、生産者（プロメガ社）の指示に従って実施する。ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼとインビトロ翻訳システムが機能することを、陽性の対照例を並べて行うことで確認する。対照例のプラスミドは、上流にＳＰ６プロモーター領域（フリッカー等、１９８９年「Ｍol.Ｅndocrin.」3,666-673 頁）を有する直線化されたＳＶ６４−カルボキシペプチダーゼＥ構成体である。完全なクローン１挿入物を含有する１８９２ｂｐのバクテリオファージＥＤＮＡのフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌを使用してクローン１から切除する。これをベクターｐＧＥＭ−１１ｚ（プロメガ社）中へと直接にクローニングし、これと同じ制限酵素で切断し、これによってクローン１挿入物のＳａｃｌ部位３’を置換する。７０７ｂｐのＳａｃｌ／Ａｖｒｉｌフラグメントをこの新しい構成体から切除する。この７０７ｂｐのフラグメントは、エンドシアリダーゼの予期されたＣ−末端の１１４のアミノ酸と、Ｋ１ＥＤＮＡの３’非翻訳領域とを暗号化する。これはクローン２のＳａｃｌ／Ａｖｒ１ｌ消化物の３２５３ｂｐの産物中へと連結される。こうして得られたプラスミド（クローン３）は、ブルースクリプトＳＫ+ ベクターの最初にクローニングされたＫ１ＥＤＮＡの高感度５’−および３’−領域だけを含有しており、予期されたエンドシアリダーゼ読み取り枠を暗号化する配列を含む、中央の２９７５ｂｐのＤＮＡ配列を有効に欠いている。全Ｋ１ＥＤＮＡのＡｖｒｌｌ消化物に由来する２９７５ｂｐのフラグメントを、Ａｖｒｌｌによって消化されたクローン３中へと連結させる。ブルースクリプトＳＫ+ （クローン４）中のこうして得られた構成体は、クローン１および２中に予め暗号化されている全長エンドシアリダーゼ遺伝子を含有しており、この遺伝子を、「Ｓequenase ２．０」配列決定キット(ＵＳＢコーポレーション)を使用して配列決定する。これはＳＥＤ．ＩＤ，Ｎｏ．１に示す配列を有する。例２バクテリオファージＥエンドシアリダーゼの形質発現用の組み換え体プラスミドの調製例１に記載したようにして調製した完全なエンドシアリダーゼ読み取り枠を有するＤＮＡ構成体であるクローン４を、プライマー５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＧＧＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡ−３’および３’− ＣＧＴＴＡＧＡＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＣＡＣ−５’を使用してＰＣＲに供し、エンドシアリダーゼ読み取り枠の増幅を容易にし、ＢａｍＨＩ制限部位およびＥｃｏＲＩ制限部位の読み取り枠の５’および３’末端へとそれぞれ移入する。２４８３ｂｐのＰＣＲ産物を、最初に、等容量のフェノール（２−アミノ−２ −ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオールによってｐＨ８．０で平衡にされた）と、２４：１のクロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物とからなる混合物を用いて抽出によって洗浄し、次いでクロロホルムとイソアミルアルコールとの混合物だけを用いて洗浄し、次いでエタノール中で沈殿させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオールヒドロクロリド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁させる。こうして洗浄されたＰＣＲ産物およびｐＧＥＸ−２Ｔ形質発現ベクター（ファルマシアバイオテック社）を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて同時に消化し、アガロースゲル電気泳動法およびクイアエックス抽出（クイアジェンコンポレーション）によって精製する。こうして切断されたＰＣＲ産物および形質発現ベクターを、生産者の指示に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）を用いて連結させ、組み換え体ベクターを生成させ、これをＵＳＢ社の「Ｓequenase2.0 」を使用して、二つのクローニング部位にわたって配列決定し、正確な読み取り枠が維持されていたことを確認する。例３形質転換および形質発現例２の連結産物を使用し、バイオラド社のエレクトロポレーション機器を使用して、電子受容性の大腸菌ＭＣ１０６１細胞を形質転換させ、形質転換された細胞を、この細胞から得たミニプレパラートＤＮＡ試料の制限分析によって選択する。この形質転換された細胞を培養し、ＯＤ６００が０．３に達したときに、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度となるように添加することによって融合タンパク質を形質発現させ、次いで更に４時間３７℃で２５０ｒｐｍで振とうしながら成長させる。こうして形質発現した融合タンパク質を、スミスおよびジョンソン（１９８８年）「Ｇene」６７、３１−４０頁に記載されているように、グルタチオンビーズに結合させることによって、培地から精製する。細菌培養物の試料と生成融合タンパク質画分の試料とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動によってニトロセルロース膜に移し、洗浄し、サムブルック等（１９８９年）「ｏｐ．ｃｉｔ．」に記載されている方法によってアンチエンドシアリダーゼポリクローナル抗血清へとハイブリッド形成し、アルカリホスファターゼへと結合されている第二の抗体を結合させ、（ａ）５０ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウムクロリドを７０：３０のジメチルホルムアミドと水との混合物中に溶解させた溶液と反応させ、(ｂ)５０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ −４−クロロ−３−インドイルフォスフェート二ナトリウム塩の水溶液と反応させることによって、免疫反応帯を検出する。この融合タンパク質の生成フラクションによるポリシアル酸からＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）の放出を、Ｈｏｒｇａｎ（１９８１年）の「Ｃlin．Ｃhim．Ａcta」116 、４０９−４１５頁のＴＢＡアッセイを用いて測定する。この測定の示すところでは、ＮＡＮＡの放出速度は、融合タンパク質の濃度に直接に比例している。融合タンパク質がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質のみによって置換されている場合には、ＮＡＮＡの放出は測定されなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月２６日【補正内容】請求の範囲１．バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体融合タンパク質またはこのタンパク質の類縁体であって、組み換え体タンパク質が組み換え体ベクターからの形質発現によって得られ、この組み換え体ベクターは、形質発現ベクターのＤＮＡ配列に連結するバクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有しており、この形質発現ベクターは、エンドシアリダーゼのＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現するものであり、前記タンパク質が、前記ポリペプチドに対して直接にまたはスペーサーを介して連結されているエンドシアリダーゼを含有しており、前記タンパク質の類縁体が、エンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である、タンパク質または類縁体。２．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列が、ＳＥＤ．ＩＤ．Ｎｏ．１のヌクレオチド１７２−１７４４によって暗号化されるアミノ酸残基を暗号化するＤＮＡ構成体に由来している、請求項１記載のタンパク質または類縁体。３．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列が、ＳＥＤ．ＩＤ．Ｎｏ．１のヌクレオチド１−２４３６によって暗号化されるアミノ酸を暗号化するＤＮＡ構成体に由来している、請求項１記載のタンパク質または類縁体。４．前記ポリペプチドが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、請求項１、２または３記載のタンパク質または類縁体。５．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに結合されているバクテリオファージＥエンドシアリダーゼを含有する、請求項４記載のタンパク質。６．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列がＤＮＡ構成体に由来しており、このＤＮＡ構成体が、細菌クローニングベクター中へとクローニングされているエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡフラグメントを含有している、請求項１−５のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質または類縁体。７．前記ＤＮＡフラグメントが、ゲノムバクテリオファージＥＤＮＡまたはこれに実質的に相同である合成ＤＮＡに由来する、請求項６記載のタンパク質または類縁体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者テイラー，ピーター，ウィリアムイギリス国，アールエイッチ14 ９エイッチエフウエストサセックス，ビリングシュレスト，マーリングディーンロード，マーリングディーンオーク (72)発明者ルジオ，ジョーン，ポールイギリス国，シービー３７エイッチジェイケンブリッジ，リトルエヴァースデン，ロウフィールズ，ピピンメドウ (72)発明者ブライアン，ジョナサン，マークイギリス国，イーエックス３０エイジェイエクゼター，トップシャーム，モンマウスストリート 23

Claims

【特許請求の範囲】１．バクテリオファージエンドシアリダーゼ酵素活性を有する組み換え体タンパク質またはこのタンパク質の類縁体であって、組み換え体タンパク質が組み換え体ベクターからの形質発現によって得られ、この組み換え体ベクターは、形質発現ベクターのＤＮＡ配列に連結するバクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有しており、この形質発現ベクターは、エンドシアリダーゼのＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現するものであり、前記タンパク質の類縁体が、エンドシアリダーゼ酵素活性を有する前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である、組み換え体タンパク質または類縁体。２．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列が、ＳＥＤ．ＩＤ．Ｎｏ．１のヌクレオチド１７２−１７４４によって暗号化されるアミノ酸残基を暗号化するＤＮＡ構成体に由来している、請求項１記載のタンパク質または類縁体。３．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列が、ＳＥＤ．ＩＤ．Ｎｏ．１のヌクレオチド１−２４３６によって暗号化されるアミノ酸を暗号化するＤＮＡ構成体に由来している、請求項１記載のタンパク質または類縁体。４．前記形質発現ベクターに由来するポリペプチドへと直接にまたはスペーサーを介して連結されているエンドシアリダーゼを含有する融合タンパク質である、請求項１、２または３記載のタンパク質、または前記タンパク質の変異体、機能性フラグメントまたは誘導体である前記タンパク質の類縁体。５．前記ポリペプチドが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、請求項４記載のタンパク質または類縁体。６．前記エンドシアリダーゼを暗号化する前記ＤＮＡ配列がＤＮＡ構成体に由来しており、このＤＮＡ構成体が、細菌クローニングベクター中へとクローニングされているエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡフラグメントを含有している、請求項１−５のいずれか一つの請求項記載のタンパク質または類縁体。７．前記ＤＮＡフラグメントが、ゲノムバクテリオファージＥＤＮＡまたはこれに実質的に相同である合成ＤＮＡに由来する、請求項６記載のタンパク質または類縁体。８．前記ＤＮＡ構成体が、制限部位を移入するプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されている、請求項６または７記載のタンパク質または類縁体。９．形質発現ベクターのＤＮＡ配列に結合されているバクテリオファージエンドシアリダーゼを暗号化するＤＮＡ配列を有する組み換え体ベクターであって、前記形質発現ベクターが、エンドシアリダーゼのＮ−末端に結合するポリペプチドを形質発現し、前記組み換え体ベクターが、生適合性の宿主細胞中に前記タンパク質を形質発現させる能力を有する、組み換え体ベクター。１０．前記の暗号化するＤＮＡ配列が、請求項６−８のいずれか一つの請求項に記載のＤＮＡ構成体である、請求項９記載の組み換え体ベクター。１１．前記形質発現ベクターが、原核生物の形質発現ベクターである、請求項９または１０記載の組み換え体ベクター。１２．前記形質発現ベクターがｐＧＥＸベクターである、請求項９−１１のいずれか一つの請求項に記載の組み換え体ベクター。１３．前記形質発現ベクターがｐＧＥＸ−２Ｔである、請求項９−１２のいずれか一つの請求項に記載の組み換え体ベクター。１４．請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質を生産する方法であって、請求項９−１３のいずれか一つの請求項に記載の組み換え体ベクターによって形質転換された宿主細胞を、前記タンパク質を形質発現させる条件で培養し、これによって生産された前記タンパク質を分離する方法。１５．前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項１４記載の方法。１６．前記宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１４記載の方法。１７．請求項９−１３のいずれか一つの請求項に記載の組み換え体ベクターによって形質転換された宿主細胞。１８．形質転換された微生物細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。１９．形質転換された大腸菌細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。２０．請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質または類縁体、またはその薬剤学上許容される塩類を、必要に応じて薬理学上許容される担体と共に含有する薬剤組成物。２１．医学的疾患の診断または治療に使用する、請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質または類縁体。２２．髄膜炎、または大腸菌Ｋ１によって引き起こされる他の病気、または細胞表面上にポリシアル酸を形質発現する他の細菌によって引き起こされる他の病気、腫瘍細胞の表面上のポリシアル酸の形質発現を特徴とする癌または腫瘍の転移の診断または治療用の医薬品を調製する際に、請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質または類縁体を使用する方法。２３．糖タンパク質の分析に請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のタンパク質または類縁体を使用する方法。２４．細胞表面上にポリシアル酸を形質発現する細菌によって引き起こされる疾患、腫瘍細胞の表面上のポリシアル酸の形質発現を特徴とする癌、または腫瘍の転移を治療する方法であって、この治療を必要とする温血哺乳類に対して請求項１記載のタンパク質または類縁体を投与する方法。